HU229001B1 - Polynucleotid encoding new rg1 polypeptide - Google Patents

Description

MEGADÁS ALAPÚUL SZOLGÁI/) VÁLTOZAT

RG1 kódoló DNS

Á jelen találmány tárgyát részben új onnan azonosított pofinukleotidok és polipeptidek képezik, valamint a polmukleotidok és polipeptidek variánsai és származékai; a találmány tárgyát képezi továbbá eljárás a polínukleotid és polipeptid, valamint vast van-

es származékainak: el ánsaik és származékaik elleni ellenanyag leotidok, polipeptidek, variánsok, származékok és ellenanyagok használata. Pontosabban, ezeknek, és más szempontoknak az alapján a találmány tárgyát űj humán extraceiluláris mátrix polipeptidek (jelzésük RG1), az ezeket a polipeptideket kódoló polínnkieoüdok, az ezek ellen a polipeptidek ellen készített ellenanv az expressziét blokkoló antíszensz

A prosztatarák gyakran előforduló betegség férfiakban, és a 45 év feletti férfiak egyharmadában megtalálható. Vannak bizonyítékok mind a genetikai mind a környezeti okokra, és az esetek többsége valószínűleg mindkét faktor kombinációjának eredménye. Á családi rákos megbetegedések tanulmányozása. azt sugallja, hogy az összes prosztatarákban a genetikai hajlam körülbelül 5-10%-ham játszik szerepet, és az esetek körülbelül 45%~ á.foan az SS évnél fiatalabb férfiakban.

φ » ’ „ 999 *<

X * ♦ ,

ΦΦ Φ ♦ 99

Van arra bizonyíték, hogy a prosztatarák több lépésben, kialakuló betegség, a prekurzorok léziók egyike a prosztata íntra-

ía néven ismert, gyakran jóindulatú, prosztata hípe ki kliníkailag, de valósa,™^ fokozata. Azonban gyakran prosztata rákos meg:

lassan növekedő és heterogén. A késői ál egy

gőcű, általában i es a oson?

A prosztatarákot általában, fizikai vizsgálat, valamint a prosztataspecifikus antigén (PSAJ alapján diagnosztizálják. A lokalizált betegség esetében a radikális prosztatairtás a választott kezelési mód. Az előrehaladott áttétes betegséget jelenleg androgén eltávolítással kezelik, amit hereeltávolítássai vagy GnRH (gonadotrőp felszabadító- hormon) kezeléssel, valamint anfi-androgén terápiával indukálnak. Azonban az előrehaladott betegség majdnem 100 százalékban, hormon-rezisztenssé válik, és nincs lehetőség a progresszív betegség kezelésére. Emellett súlyos méh c vannak, amik mind a radikális prosztatairtáshoz, z kapcsolódnak. Ezek mind az androgén eltávolításos közé tartozik a radikális prosztatairtáshoz és csonttöréshez kapcsolódó inkontinencía és impotencia magas kockázata.

Ennek következtében jelentős igény van az új terápiás megközelítésekre, a prosztataráknak mind a korai, mind a késői φ ♦.

* φ stádiumában. Emellett sí

Igény van új tnosztíkai

ce séget tenni a betegség stádiumai kozott, mivel ez szignifiká befolyásolja a kezelési opciókat, Ha például a betegség a. prosztatán túlra terjed, és átterjedt a nyirokcsomókra, akkor nem végeznek radikális prosztatairtást, mivel ennek nincs hatása a kifejlődésre, de szignifikáns nem-kívánt hatásai lehetnek. Jelentős értéke lenne egy olyan ágensnek, ami in iw képes kimutatni az áttétet.

Demonstrálták a specifikus fehérjék expressziójánák megváltozását prosztatarákban, beleértve a p53 abnormális expresszióját a késéi stádíumú prosztatarákban, a TGF-β receptorok csökkent szintjeit, az E-eadherin csökkent szintjeit, a C~Cam (sejttapadási molekulák) és számos integrin csökkent szintjeit, A bcl-2 onkogén expressziója jelentősen megnő a késői stádíumú androgén independens tumorokban, és a focl-2-t magas szinten expresszáló betegek prognózisa viszonylag rossz. Míg a génexpresszió előzőkben említett változásai jól dokumentáltak, az exp» resszíóban nem mutattak kí olyan változást, amiről demonstrálták, hogy a betegség okozója. Ezért hasznos lenne olyan új fehérjék azonosítása, amiknek az expressziója a. prosztatarák jevagy kifejlődéséhez kapcsolódik, és molekuláris szolgálhat a prosztatarák diagnosztizálásában és terápiájában.

A j elen találmány tárgyát az extraeeMáris mátrix fehérjék szupercsaládjának új homológja képezi. Ez a. homológ, neve RG1,

X φ 4 4 ♦

*.*

Φ*

X * ΦΦ* * « $ *

*Φ εοαη a prosztata szövetben expresszálódik, és a. y túlexpresszálódik.

Az extracelluláris mátrix a kollagén és az eiasztin komplex hálózata, proteoglikánokból és glikoproteinekből álló viszkoelasztikus alapanyagba ágyazva. A mátrix háromdimenziós hordozó állványként működik, ami izolálja a szöveti kompartmenteket, befolyásolja a sejtek tapadását és meghatározza a szövet archiés mtsai: J. Theor. Bioi. 99, 31

Carlson és mtsai: Proceedings of the National Academv of Sciences, USA 78, 2403-2406 (1981}j. A mátrix makromolekuláris szűróként működik [Hay, E.D.: Cell Biology of Extraeellular Mátrix, New York, Plenum Press (1982)1, és befolyásolja a. cltodiíferenciácíőt, mitogenezást és morfogenezist (Gospodarowiczs, D.: Caneer Research 38, 155-171 (1978)1. A normál sejtek és a ___ , 978) j.

mátrix közötti kölcsönhatások megváltozhatnak a és ez befolyásolhatja a tumor burjánzását, A tumorsejtek különböző módokon léphetnek kapcsolatba a mátrixszal. Először, a tumorsejtek specifikus plazma-membrán receptorokon keresztül kapcsolódhatnak a mátrixhoz (Terranova és mtsai: Caneer Research 42, 2265-2269 (1982)). Másodszor, a mátrix degradációját olyan enzimek kaszkádja. befolyásolja, amiket a tumorsejt és a gazdaszervezet biztosit (Eben és mtsai: Biochímica. et Biophysica Acta 151, 637-645 (1968)). Harmadszor, a tumor differenciálódott területein tumorsejtek szintetizálhatnak és akkumulálhatnak mátrixot, vagy arra indukálják a gazt fölöslegben akkumulálja a mátrixot (Brownstein és mtsai: Cancer 40, 2979-2986 (1977)1.

Az RG1 homológját mutat az extracelluláris mátrix fehérjék szupercsaládjával, amiket a Míndm/P-spondin gének kódolnak. A géncsalád egyesít két konzervált spondtn domént, az FSl-et és az PS2-t, az N~ternrináks közelében, és legalább egy thrombospondtn l-es típusú (TSRl) ismétlődést, a. C-terminálíson (Shimeld, S.M.: Mot Bioi. Evőt 15(9), 1218-1223 (1998)). A TSR motívumot eredetileg a gerincesek extracelluláris mátrix fehérjéiben találták meg (Rornstein, P„: Journal of Cél! Biology 130, 503-506 (1995)1, ezt követően számos más extracelluláris mátrix fehérjében is megtalálták. Számos bizonyíték van arra, hogy a TSR-ek befolyásolják a sejtek tapadását és kulcsszerepet játszanak a tumorigenezísben. Demonstrálták például, hogy a thrornhospondínnak a TSR-eket tartalmazó proteolítikus fragmensei elősegítik a tumorsejtek tapadását és az áttétek képződését [Práter és mtsai: Journal of Cell Biology 112, 10311040 (1991); Tuszynski és Nicosia: BioEssays 18, 71-76 (1996)), anti-angiogén aktivitásuk van [Toisma és mtsai: Journal of Cell Biology 122, 497-511 (1993)), és gátolják a vériemezkék aggregádóját valamint a melanóma áttétek képződését [Tuszynski és mtsai: Journal of Cell Biology 116, 209-217 (1992)].

Jelenleg ennek a szupercsaládnak a tagjai közé tartozik a CoonorhaMíÉís elegáns egyik génje, a Drosophila egyetlen génje és gerincesek több génje. Caenorimbdíbs elegpns-ban az F10E7.4 gén az PSI és FS2 domének mellett őt TSR-t kódol [Hígashijima

Φ X

X * ί

φφ φ φφ φ * * * φφ ** és mtsai: Dev, Biot 192, 211-227 (1997)]; Drosophilában a család M-spondin nevű tagja (snspo) tartalmazza az FS1 és FS2 doméneket, valamint egyetlen TSR-t [Umemíya és mtsai: Dev, Biot 186. 165-176 (1997)). Aa M-spondin gén egy szekretált fehérjét kódol, ami az izomtapadási pontokban lokalizálődik, és úgy tűnik, hogy extracelluláris mátrix fehéreként működik, ami támogatja az izom-apodéma kapcsolódást. Gerincesekben levő izoláltak (Mindinl és Mindin2, F-spondin 1 és F-spondin 2), a patkány F-spondin, a Xencpus F-spondin és a patkány Mindin. A

Mindin 1 és Mindín2 szoros rokonságban van, gén-struktúrájuk a Drosophila M-spondinhoz hasonló. Mind a Mindinl, mind a Míndín2 gén egyetlen TSR-t kódol az FS1 és FS2 domének mellett (Higashijima és mtsai: Dev. Biok 192, 211-227 (1997)}. A zebrahal F-spondinl és F-spondin2, a patkány F-spondin {Rlar és mtsai: Coll 69, 95-110 (1992)) és a Xenopns F-spondin fAltába és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 90, 8268-3272} géneknek hasonló struktúrájuk van, hat TSR az es a Mindin/F-spondin szupercsalád két csoportra osztható: az eredeti patkány F-spondin és Mindin génekkel szoros rokonságban levő génekre, valamint a Drosophila génnel szoros rokonságban levő génekre. A gerinces Mr spondin gén is olyan fehérjéket kódol, amiket e. neuráiis cső alaplemeze expresszál az embrionális és Fsen a es során.

φ® *« φ

φφ» * φ ♦ ♦ φ * φ φ «φ rokonságban levő gént, az

AmphiF

S.M

Bioi. Evet 1519L 1218-1223 (I998jj. A molekuláris filogenetika alapján az AmphiF'-spondin szoros rokonságban van a gerinces F-spondin gének egy bizonyos alcsoportjával, amik hat TSR-t kódolnák. Az AmphiF-spondin három. TSR-t és két fíbronektín 10as típusú ismétlődést kódol, amik közül az egyik szoros azonosságot mutat a kolorektalís rákból kivágott (DCC) fibronektin 10 ismétlődéssel. A fehérje expresszíőját a központi idegrendszer iágAUMLf iCísZrCUClA UlCgtCUtCUjUft, VCS nCili vonalra, amint azt a gerinces Mindin és F-spondin génekre leírták.

Ezek az adatok azt sugallják, hogy az extraceiluláris mátrix fehérjék, azaz például az új RG1 fehérje, ami homológ a Mindin/F-spondin szupercsaláddal, jó jelölt arra,, hogy a rák diagnosztizálásában. és a terápiás beavatkozásokban jő jelölt legyen.

A jelen találmány tárgyát egy olyan polínukleotid szekvencia képezi, ami egy, a továbbiakban RG1 néven említett új fehérjét kódol. Az RGl polipeptid homológiát mutat a patkány .Mindin extraceiluláris mátrix fehérjével, Tartalmaz egy hidrofób szignálszekvenciát az N-tenninálisán, valamint tartalmaz két spondin dóm ént (FS1 és FS2), valamint egy thrombospondm 1-es típusú ismétlődést a C-termínálísán. Az RG1 89,7%-os hasonlóságot mutat, a patkány Mindinnel. A polínukleotid szekvencia, amit a továbbiakban ral néven említünk, és az 1. ábrán mutatunk be **

φ.

φφ φφ * >

φ <·♦ φ Φ φ» »« (1. számú szekvencia) az RG1 aminosav szekvenciát kódolja, amit a 2. ábrán mutatunk be (2. számú szekvencia).

Ezen, valamint más okokból a jelen találmány tárgyát többek között olyan polipeptídek képezik, amiket olyan új fehérjékként azonosítottunk, amik az extraoelluláhs mátrix fehérjék Míndín családjával homolögiát mutatnak, amit a 2. ábrán bemutatott aminosav szekvenciát (2. számú szekvencia), és más extracelluláris mátrix fehérjék ismert aminosav szekvenciáit összehasonlítva mutatunk ki.

biztosítása, amik ilyen polípeptideket kódolnak, főleg azok a palinukleotidok, amiket a továbbiakban RG1 néven említett polipeptideket kódolják.

Á jelen találmány tárgyát tehát RGl-et kódoló izolált polinukleotidok képezik, beleértve a mRNS-eket, cDNS-eket és a jelen találmány ezen aspektusának további megvalósítási módja szerint ezek biológiailag, diagnosztikailag, kliníkailag vagy terápiásán használható variánsai, analógjai vagy származékai, vagy ezek fragmensei, beleértve a variánsok, analógok és származékok iragmenseít is.

A jelen találmány ezen aspektusa különösen előnyös megvalósítási módját képezik a továbbiakban RG1 néven említett polipeptid variánsait kódoló polinukleotidok természetes körülmények között előforduló allélvanánsai.

A jelen találmány ezen. aspektusa szerint a jelen találmány tárgyát humán eredetű, a továbbiakban RG1 néven említett új polipeptidek. képezik, valamint ezek biológiailag, díagnösztikallag vagy terápiásán használható fragmensei, variánsai és származékai, a fragmensek variánsai és származékai, és az előzőkben említettek analógjai.

A jelen taiálmány ezen aspektusa különösen előnyös megvalósítási módját képezik az rgd polinukleotid természetes körülmények között előforduló allélvariánsaí által kódolt RGI variánsok.

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás az előzőkben említett polípeptidek, polipeptid fragmensek, variánsok és származékok, a variánsok és származékok fragmensei, valamint az előzőkben említettek analógjai előállítására. A jelen találmány ezen aspektusa különösen előnyös megvalósítási módja szerint a jelen találmány tárgyát az előzőkben említett RGI polípeptidek előállítási módszerei képezik, amik abból állnak, hogy olyan gazdasejteket tenyésztünk, amik expresszálhatö módon tartalmaznak idegen eredetű, RGl-et kódoló polinukleotidot, olyan körülmények között, amik lehetővé teszik a humán RGI expresszióját a gazdasejtben» majd kinyerjük az expresszált polipeptidet.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá azok a termékek, készítmények, eljárások és módszerek, amik az előzőkben. említett polipeptideket és polinukleotidokat alkalmazzák, többek között kutatási, biológiai, klinikai és terápiás célokra.

A jelen találmány ezen aspektusa bizonyos előnyben részesített megvalósítási módjai szerint a találmány tárgyát olyan termékek, készítmények és módszerek képezik, amik többek ♦ φ között használhatók az RGI expressziójának megbecslésére a sejtekben, az RG1 polipeptidek, vagy az RGl-et kódoló mRNS meghatározásával; valamint a genetikai variációk és aberrációk, azaz például defektusok vizsgálatára az rpl génekben.

A jelen találmány ezen részesített

snasi sík, amik szerint a tál?

az rp./ sz

an e, vagy azok

pezik, amik nagyon szelektívek az RG1 fragmenseíre, és amik az esetleg a RG1 expresszié diagnosztizálási és kimutatási használhatók, A jelen találmány ezen. aspektusa Különösen éli nyos megvalósítási módjai szerint az ellenanyagokat úgy jelöljük meg, hogy kimutatható szignált adjanak. Különösen előnyös lehet egy radioaktív izotóppal, egy enzimmel, egy kromofórral vagy fluoreszkáló csoporttal jelzett ellenanyag,

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá az olyan ellenanyag, amik egy terápiás ágenshez vannak konjugálva, azzal a céllal, hogy beadjuk. Ebből a szempontból különösen ebből a szempontból különösen előnyös megvalósítási módjai közé tartozik az ilyen konjugált ellenanyagok beadása humán betegeknek, egy olyan kór-állapot kezelésére, amit RG1 aktivitás vagy- expresszié jellemez, mint például a prosztatarák.

φφ» χφφ φ * 4 φφ φφ az r (azaz antíA jelen találmány tárgyát képezik. továbbá azok a és antí-ídiotipusos ellenanyagok, amik arra immun vála szt stimulálj unk.

A jelen találmány tárgyát képezik tóvá'

Íeotiddal komplementer ríbozlmek és f szensz polinukleotidok), amiket in vitro sejtekbe, ex vivő sejtekbe vagy in vívó sejtekbe, vagy többsejtes szervezetbe adunk be. Ebből a szempontból különösen előnyős az antiszensz molekulák beadása humán betegeknek koros állapot, azaz például prosztatarák vagy jóindulatú prosztata híperplázia kezelésére, amit enyhít az csökkenő RG 1 aktivitás.

A jelen találmány további tárgyai, tulajdonságai, előnyei és szempontjai az alábbi leírásból nyilvánvalóak lesznek a szakterületen jártas szakember számára. Azt azonban meg kell érteni, hogy az alábbi leírást, és a specifikus példákat, miközben a á találmány előnyben részesített megvalósítási módjait csak illusztrálás céljából adtuk meg. Az alábbi leírás, ví ezen leírás egyéb részeinek olvasásával az ismertetett találmány szellemében és oltalmi körében számos változtatás és módosítás lesz nyilvánvaló a szakterületen jártas szakember számára, röviden ismertetjük a leírásban említett

I. ábra: az rgl polinukleotíd szekvenciája. (1, számú szekvenciái, ami az RG! biológiailag aktív formáját kódolja

1.2 * * * \*

Φ** ΦΦΦ **

Φ Φ * * ” «φ ΦΦ **

2. ábra: az RGl kikövetkeztetett aminosav szekvenciája (2, számú szekvencia), az F-spondin domének egyszer aláhúzva, a thrombospondíxi dómén kétszer aláhúzva.

3. ábra: az RG1 aminosav szekvenciájának illesztése a patkány Mindin aminosav szekvenciájával. Az RGl szekvencia van felül.

4. ábra: az RGl. polínukleotid szekvenciája és kikövetkeztetett aminosav szekvenciája.

5. ábra.: az rgJ mRNS expressziója humán szövetekben. Taqmam alapú polímeráz láncreakció elemzéssel. A humán szövetekből (tumor és normális} az RNS-t standard technikákkal izolálták. Az rgl mRNS expressziőjának kimutatásához a primereket és a próbát a Perkin Elmer's Primer Express szoftverrel terveztük, és a Syníhetic Genetícs szintetizálta meg. Az rgl m RNS-t a humán prosztata szövetekben mutattuk ki. Az rpl sokkal alacsonyab expressziős szintje mutatható ki más szövetekben, azaz például a májban.

6. ábra: az LNCaP sejtek álfal székre tált természetes RGl fehérje tisztítása. Western biot elemzés, egy szintetikus RGl peptíd-szekvencia (3C, 10. számú szekvencia, lásd 4. Példa) ellen készített an.tiszérumokat használva az LNCaP sejtek által szekretált természetes RGl fehérje kimutatására, A koncentrált LNCaP sejt kondicionált táptalaj Q-Sepbarose kromatográfiájának elűciós frakciói: (L) oszlopra felvitt, (F) oszlop átfolyó, (1-12} elnciös frakciók a sőgradiensen keresztül. Áz RGl megjósolt molekulasúlya körülbelül 36 kDa, azonban mind a bakteriális rend9 szerben expresszált RG1, mind a BHK-ban és LNCaP-ben expresszált RG1 fehérje körülbelül 45 kDa-nak megfelelő molekulasúly szerint vándorol poliakrilamíd géiriektroíorézis során (L, 6-9. frakció).

7, ábra; az RG1 ezpressziő xmmunhiszfokémíaí festése humán prosztata szövetekben. A prosztata szöveteket a University Sehool of Medieúie Urology Deparíment-től kaptuk. A festést a Vector ABC-AP kit (AR5002) használatával hajtjuk végre. A festést egy Vector Red szubsztrát kittel (SK-51Ü0) tesszük láthatóvá, és H.ematoxybn~nel ellenfestjük. Az eredmények erős peri-luminális membrán-festődést mutatnak a mirigy formációkban..

bán. hacsak külön nem ;s a az eltérést, az

zések jelentése az itt megadott.

Az „RGÍ szakkifejezés olyan poiipeptidre vonatkozik, aminek az aminosav szekvenciáját a 2. ábrán mutatjuk be (2, számú szekvencia.), valamint ezek variánsaira, analógjaira, származékaira és fragmenseire, valamint a variánsok, analógok és származékok fragmenseire. A „fragmens”, „származék” és „analóg” szakkifejezés, ha a 2, ábrán bemutatott poiipeptidre vonatkoztatjuk (2. számú ^?an lent, ami lényegében megtartja ugyanazt a biológiai és/vagy immunológiai aktivitást, amivel a 2. ábrán bemutatott polipeptid rendelkezik (2. számú szekvenciát

0* *00 ***

0 0 *0 **'

Az „r$f^s szakkifejezés olyan polinukleotidra vonatkozik, aminek a szekvenciáját az 1. ábrán mutatjuk be (1. számú szekvencia), valamint azokra a polinukleotidokra, amik olyan polipeptideket kódolnak, amik az ÉGI 2. ábrán bemutatott aminosav szekvenciájával rendelkeznek (2. számú -szekvencia); valamint az RG1 variánsokat, analógokat, származékokat és fragmenseket kódoló polinukleotidokra, és a variánsok, analógok és származékok íragmenseit kódoló polinnkleotidokra. Az rg! szakkifejezés vonatkozik ilyen RNS polinukleotid szekvenciákra, valamint olyan polinukleotidokra, amik komplementerei azoknak a polinukleotidoknak, amik a. 2. ábrán bemutatott polipeptid szekvenA „polínnkleötid(ok)^w szakkifejezés általánosan bármilyen pollribonukleotidra vagy polidezoxíríbonnkleotidra vonatkozik, amik. lehetnek módosítatlan RN-S-ek vagy DNS-ek, valamint módosított RNS-ek vagy DNS-ek. Tehát például a polinukleotídok szakkifejezés a továbbiakban többek között egyszálú és kétszálű DN'S-re vonatkozik, valamint olyan DNS-re, amí egyszálú és kétszálű régiók keveréke, hibrid molekulákra, amik DNS-t és RNS-t tartalmaznak, amik lehetnek egyszálüak, vagy típikusahban kétszálúak és egy, valamint kétszálű régiók keverékei. Emellett a polinukleotid szakkifejezés a. továbbiakban jelenthet háromszálú régiókat is, amik RNS-t vagy ÖNS~t tartalmaznak, vagy mind RNS-t, mind DNS-t tartalmaznak. Az ilyen régiókban, a szálak származhatnak ugyanabból a molekulából, vagy egy eltérő molekulákból. A régiók lehetnek mind ugyanabból a molekulából, φφ φφ ** * * φ χ φ ♦·#* φ φ ·♦ φ« φφ vagy több molekulából, de tipikusabb, ha a néhány molekulának csak egy régióját tartalmazzák- Egy tripla-helíkáhs régió egyik molekulája gyakran egy oligonukleotid.

A továbbiakban a ».poUnuldeotid^w szakkifejezés jelentése az előzőkben ismertetett DNS-ek vagy RNS-ek, amik egy vagy több módosított bázist tartalmaznak. így a stabilitási vagy más okokból módosított gerinccel rendelkező DNS-ek vagy RNS-ek is „polinukleotidok”, szándékaink szerint, Emellett a ritka bázisokat, azaz például inozmt, vagy módosított bázisokat, triciummal jelzett bázisokat tartalmazó DNS-ek azaz

úgy RNScsak hogy megnevezzünk két példát, is pohnukleotidok, szándékaink szerint.

Az nyilvánvaló, hogy a DNS~en és az RNS-en nagyszámú különböző módosításokat hajtottak végre, amik számos hasznos, a szakterületen jártas szakember számára ismert célokat szolgálnak. A „polinnkleotid” szakkifejezés jelentése a továbbiakban vonatkozik a polinnkleotídoknak az ilyen kémiailag, enzímatikusan vagy metabolikusan módosított formáira, valamint a vírusokra és sejtekre jellemző DNS és RNS kémiai formáira, beleértve többek között az egyszerű és komplex sejteket.

A „polípeptidek” szakkifejezés jelentése a továbbiakban azösszes, alábbiakban ismertetett polipeptidre vonatkozik- A poli·· peptidek alap-struktúrája jói ismert, és a szakterületen számtalan szakkönyvben valamint publikációban leírták. Ebben a szövegösszefüggésben a szakkifejezés bármilyen pepiidre vagy fehérjére vonatkozik, ami két vagy több aminosavat. tartalmaz, egyX* φφ φ * φ

X * φ ' ♦ * φ * * * * * φφ ' xx ΦΦ * mást peptídkotésekkel lineáris lánccá kapcsolva. A továbbiakban a szakkifejezés vonatkozik mind rövid láncokra, amiket a szakterületen általában, például peptídeknek, oligopeptideknek és oligomereknek neveznek, mind hosszú láncokra, amiket a szakterületen áltálában fehérjéknek neveznek, és amiknek számos típusuk van.

Az nyilvánvaló, hogy a polipeptidek gyakran tartalmaznak olyan aminosavakat ís, amik nem tartoznak azon 20 aminosav közé, amiket általában a 20 természetes aminosav néven említenek, és számos aminosav, beleértve a terminális aminosavakat is, módosítva lehetnek egy adott polípeptídben, vagy természetes eljárásokkal, azaz például glíkozílezéssel és más poszt-transzlációs módosításokkal, vagy kémiai módosítási technikákkal, amik jól ismertek, a szakterületen... Még az általános módosítások is·, amik gyakran előfordulnak a polípeptidekben, tűi sokan vannak ahhoz, hogy kimerítően felsoroljuk az alábbiakban, de ezek alapvetően le vannak írva. az alapvető szövegekben és a részletesebb monográfiákban, valamint a rendkívül nagykiterjedésü szakirodalomban, és ezek mind jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára. A jelen találmány szerinti polípeptidekben esetleg megtalálható ismert módosítások közé tartozik, csak hogy néhányat megnevezzünk, az acetílezés, az acilezés, az ADP-ribozilezés, az amídálás, a Havin kapcsolása kovalens kötéssel, egy hem egység kapcsolása kovalens kötéssel, egy’ polinukleotid vagy polinukleotid származék kapcsolása kovalens kötéssel, Iipíd vagy Iipíd-származék kapcsolása kovalens köja £φ φ > Φ * φφ 9 ♦

X# ** φ φ «ΑΦ 9&Φ « ♦

ΦΦ· ♦*

«·

Φ Φ «

Φ ·*·♦·* téssel, foszfatidd-inozitol kapcsolása kovalens kötéssel, keresztkötések, ciklizálás, díszulfíd-híd kialakulása, demetílezés, kovalens kötések kialakulása, císztín képződése, píroglutamát képződésé, íormnezés,.gamma-karooxjlezés, ghkaías, ghközilezes, rainszto:

5, racemizacio, transzfer-RNS által való hozz asa. a processzálás, foszforilezés, is, szulfatálás, amínosavak azaz arginilexes, és ubiquítinezés.

Ezek a módosítások jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára, és a tudományos irodalombaji nagy részletességgel ismertették. Számos különösen általános azaz min sav-csoport gamma-karboxilezését, a ríhozíiezést a legtöbb alapvető szövegben leírják Proteíns-Structure and Molecular Propertíes, 2.

, a és az ΑΒΡΕ. Creighton:

W.H. Preeman and Company, New York (1993)). Ebben a témában számos részletes összefoglalás olvasható [Wold, F.: Posttranslatíonal Covalent Modification of Protein», 1-12. oldal, szerku B.C. Johnson, Aeademic Press New York (1983): Seífter és mtsai: Methods in Enzymology 182, 626-646 (1990); Pattan és mtsai: Protein Synthesis: „Posttranslatíonal Modifícations and Aging”, Ann. NY Acad. Sci. 663, 43-62 (1992)).

Az nyilvánvaló, jól ismert, és a fentiekben is megjegyeztük, hogy a polipeptidek nem mindig teljesen lineárisak. A polipeptidek lehetnek például elágazóak, az ubiquibnezés következtefi ii «« ♦* V* * ,’ 5.» «

Λ fi » ♦ * fii »»« ben. és lehetnek cirkulárisak, elágazással vagy anélkül, általában poszt-transzlációs események következtében, beleértve a természetes processzálási eseményeket valamint a humán manipuláció által okozott eseményeket., amik nem fordulnak elő a természetben. A cirkuláris, elágazó és elágazó-cirkuláris polipeptideket szintetizálhatjuk nem-transzlációs természetes eljárásokkal. valamint teljesen szintetikus módszerekkel is.

A módosítás bárhol előfordulhat a polipeptidben, beleértve a peptid gerincét, az aminosav oldalláncokat és az N~ vagy C-terminálíst. Tény, hogy az amino- vagy karboxi-csoport, vagy mindkettő blokkolása egy kovalens módosítással, általános a természetes és szintetikus polipepíidekben, és az ilyen módosítások a jelen találmány szerinti polipeplidekben is előfordulhatnak. Például az Eschenckía cofí-ban előállított polipeptidek N-terminális csoportja a proteolítikus processzálás előtt majdnem mindig Niórmil-metionin,

A polipeptidben előforduló módosítások gyakran attól függenek, hogy hogyan állítottuk elő őket. A klónozott gén gazdaszervezetben való expresszálásával előállított pepfidekben például a módosítások természete és mértéke nagymértékben függ a gazdasejt poszt-transzlációs módosítási kapacitásától, valamint a polipeptid aminosav szekvenciájában levő módosítási szignáloktól. Amint az például jól ismert, a glikozüezés gyakran nem játszódik le bakteriális gazdaszervezetekben, azaz például Escberichia cok-bam Ezért, ha glíkozilezésre van szükség, akkor a polípepüdet egy glikozilező gazdaszervezetben expresszáltatjuk, *

$Φ» «Φ * » φ φ«$Φ «Φ

ΦΦ ί*

Φ«

Φ

Φ 9* «

*

99« általában eukarióta gazdasejtben. A rovarsejtek gyakran ugyanazt a poszt-transzlációs glikozdezést hajtják végre mint az emlős sejtek, ezért rovarsejt expressziós rendszereket fejlesztettek ki, amik, többek között hatékonyan expresszálják a természetes glíkozilezésí mintázattal rendelkező emlős fehérjéket. Hasonló megfontolások vonatkoznak más módosításokra is.

Az nyilvánvaló, hogy az ugyanolyan típusú módosítás egy adott polipeptidben több különböző pontban ugyanolyan, vagy eltérő mértékben lehet jelen. Emellett, egy adott különböző típusú módosítást kozik az összes ilyen módosításra, főleg azokra, amik azokban, a m találhatók, amiket a polínukleob'dnak egy gazdavaló expressziójával állítunk elő.

yezes a bíakban olyan polinukleotidokra vonatkozik, amik tartalmaznak egy, a jelen, találmány szerinti pokpeptidet, különösen az RG1 polipeptideí kódoló szekvenciát, aminek az aminosav szekvenciáját a 2, ábrán mutatjuk be (2, számú szekvencia). A szakkifejezés olyan polinukleotidokra vonatkozik, amik egyetlen folyamatos, vagy megszakított (például intronokkal megszakított), a polipeptidet kódoló régiót tartalmaznak, további régiókkal együtt.

A „biológiai aktivitás* szakkifejezés a természetes RG· 1 polipeptid strukturális, szabályozó vagy biokémiai funkcióira vonatkozik.

Φ*

Φ

Φ «ΦΦ

Φ* « φ «

φ φ»** φφ «* « φ φ φχφ »·♦* φ « #

ΦΦ ΦΦ

Φ*

S » ΦΦ $ « χΦ

Az- „immunológiai aktivitás szakkifejezés a természetes, rekombináns vagy szintetikus RG1, vagy annak bármilyen fragmense azon képességére utal, hogy specifikus immunválaszt indukál megfelelő állati vagy emberi sejtekben, és kötődik a specifikus ellenanyagokhoz.

Az ,_}olígonukleotid(ok) szakkifejezés viszonylag rövid polinukleotidokra vonatkozik. A szakkifejezés gyakran vonatkozik egyszálú dezoxíribonukleotklokra is, de ugyanígy vonatkozhat többek között egyszálú és kétszálü ribonukleotidokra, RNS: DNS hibridekre és kétszálü DNS-ekre is. Az oligonukleotidokat, azaz például az egyszálú DNS-próba oligonukleotidokat gyakran kémiai módszerekkel szintetizálják meg, például az automatizált oligonukleotid szintetizátorokra alkalmazott kémiai módszerekkel. Az oligonukleotidok azonban számos más, különböző módszerrel is előállíthatok, beleértve az in váró rekombináns DNS technikákat, és a DNS-ek sejtekben vagy szervezetekben, való expresszálását. Az „oligonukleotidok, „oligomerek, vagy polinukleotid „fragmens”, „rész vagy „szegmens szakkifejezés olyan, polinukleotid szekvenciára vonatkozik, ami legalább lö nukleotidból áll, körülbelül 60 nukleotidból áll, előnyösen körülbelül 15-30 öiígonukleoíídböl áll, és legelőnyösebben körülbelül 20-25 nukleo tidból áll.

A „természetben előforduló RGF szakkifejezés olyan humán sejtek által előállított RGl-re vonatkozik, amit nem változtattak meg génsebészeti módszerekkel, és specifikusan vonatkozik a különböző RG1 formákra is, amik a polípeptid poszt21 *4 ♦* «* * φ χ 9 9. * a 9 4 « β φ » X * * * _ν ♦ » 9 * · '* * *« *’ >* · ♦ * * * * transzlációs módosításaiból származnak, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az acetílezést, karboxilezést, L, lípidálást, acilezést és hasítást.

nukleofcidtől. Az ebben az értelemben vett variánsokat a jelen találmány leírásában az alábbiakban és máshol nagyobb részle·· tessegael is:

dk, referencia polínukleotidtót A különbőzért a referencia és a variáns polinukleotid szekvenciája általában nagyon hasonlít egymásra, és számos régióban azonos is.

Amint, azt az alábbiakban megjegyezzük, a variáns a

lehetnek. Azaz esetleg nem változtatják meg a lentid által kódolt amínosavakat. .Amennyiben a változások az ilyen típusú csendes változásokra korlátozódnak, úgy a variáns a referenciával azonos aminosav szekvenciával rendelkező nolíoeptídet kódol. Amint azt

az aiaomaRoan szinten megjegyezzük, a vanans leotíd szekvenciájának változásai megvj referencia polinukleotid által kódolt polipeptíd aminosav szekvenciáját. Az ilyen polinukleotid változások aminosav helyettesitéseket, addíciőkat, deléciőkat, fúziókat és csonkításokat eredményezhetnek a reterencia szekvencia

X X amint azt az al által kódolt

1, aminek az aminosav szekvenciája eltér y másik, referencia polipeptid szekvenciájától. A különbségek általában korlátozottak, ezért a referencia és a variáns szekvenciája nagyon hasonlít egymásra, és számos régióban azonos. Egy variáns és egy referencia polipeptid aminosav szekvenciája egy vagy több helyettesítésben, addícíőban, deléeiöhan, fúzióban és csonkításban tér el egymástól, amik bármilyen kombinációban jelen lehetnek. Az ezeket az azonos vagy hasonló polipeptideket kódoló rekombináns variánsokat megs hatjuk, vagy a genetikai kód „redundanciája⁵⁵ nálatával szelektálhatjuk. Bejuttathatunk különbőzó kosokat, amik különböző restrikciós hasítási helyeket generálnak, hogy optimalizáljuk az egy plazmid- vagy virális vektorba való klónozást, vágj’ az expressziöt egy adott lariőta vagy eukarióta rendszerben. Mutációkat ís bevihetünk, hogy módosítsuk a polipeptid tulajdonságait, hogy megváltoztassuk a lígandumkötő affinitásokat, a láncok közötti affinitásokat, vagy a polipeptid lebomlásának vagy tumoíverének sebességét.

Az „allélvaríáns” szakkifejezés az rgl polinukleotid egy alternatív formájára vonatkozik. Az allélek egy mutációból származnak., azaz például a polmukleotid szekvencia egy változásából, és általában megváltozott mRNS-eket vagy polipeptídeket eredményeznek, amiknek a struktúrája vagy funkciója esetleg nem változott meg. Bármelyik génnek lehet több vagy számos allélformája, de az is lehet hogy egy sincs. Az alléleket eredményező általános mutációs változásokat általában nukleotermészetes deleciojakent, addiciojakent vagy sütéseként írják le. A. változások összes ilyen típusa előfordulhat önmagában, másokkal kombinálva, illetve egy adott szekvencián belül egyszer vagy többször.

A „származék” szakkifejezés olyan poünukleotidokra vagy polipeptidekre vonatkozik, amik a természetben előforduló rplből vagy RG 1-ből származnak, kémiai módosítással, azaz például ubíquitínezéssel, jelöléssel (azaz például radioaktív izotópokkal végzett jelöléssel, különböző enzimatikus módosításokkal), pegilezéssel (polietilénglikoi származék előállításával), vagy olyan amínosavak, például ornítín inszertálásával, vagy helyettesítésével (vagy egy ilyen aminosavat kódoló nukleotídok helyettesítésével), amik egyébként normális körülmények között nem fordulnak elő az emberi fehérjékben.

A „deléeió” szakkifejezés a polmukleotid vagy aminosav szekvenciák olyan megváltozását jelenti, amikből egy vagy több polinukleotid vagy aminosav csoport hiányzik.

Az „ínszerciö” vagy „addíeiő” szakkifejezés a polinukleotid vagy aminosav szekvencia olyan megváltozása, ami egy vagy több polinukleotid vagy aminosav csoport hozzáadását eredményezi, a φ* ♦ * φ φ φ

Φ X X* Φ φφ φ φ φ X* φ φ φ

ΦΦ *

X XX

ΧΦ φφ ♦ φφ φφ természetes polínukleotíddal vagy aminosav szekvenciával összehasonlítva.

több polinukleotidot vagy aminosavat különböző

Az aminosav helyettesítések előnyösen annak a következményei, hogy egy aminosavat egy másik hasonló struktúrával és/vagy kémiai tulajdonságokkal rendelkező .aminosawal helyettesítünk, azaz például a leueint izoleucínnal vagy aszpariátot glutamátial, vagy treonin t szerinnel, ez a aminosav helyettesítés. Az ínszerciók és delécíók tipikusan körülbelül 1-5 aminosav méretűek. A végrehajtható variációkat kísérletesen lehet meghatározni, szisztematikusan aminosav inszerciökat, deléciökat 'vagy helyettesítéseket hajtva végre a polipeptídben, ehhez rekombináns DNS technikákat használva, és vizsgálva a kapott rekombináns variánsok aktivitását.

A „fragmens egy olyan polipeptid, aminek aminosav szekvenciája teljesen megegyezik az előzőkben említett RG1 üdék, variánsok vagy származékok aminosav egy részével, de nem a teljes egésszel.

Egy polipeptid „fragmens”, „rész” vagy „szegmens aminosavbói, gyakran legalább 7 aminosavbói, legalább 9-13 aminosavbói álló peptídrész, és különböző megváltási módok szerint legalább 17 vagy

peptídrész.

«« «« ββ Φ« * «»«««> «>· ·«** « «*♦ ** *

5f ♦ * JC * · * ♦ ♦♦ *·* ** **

A „rekombináns” vagy „rekombináns DNS molekula” szakkifejezés egy olyan polinukleotid szekvenciára vonatkozik, ami nem fordul elő a természetben, vagy két, egyébként szeparált szekvencia-szegmens mesterséges kombinálásával állítják elő. A „rekombínáns módszerrel előállított” szakkifejezés mesterséges kombinációt jelent, amit gyakran vagy kémiai szintézissel, vagy polinukleotidok izolált szegmenseinek mesterséges manipulálásával hajtunk végre, azaz például génsebészeti technikákkal. Az ilyen manipulációt általában úgy hajtják végre, hogy egy kodont egy azonos, vagy konzervatív aminosavai kódoló redundáns kodonnal helyettesítenek, miközben ezzel általában egy restrikciós hasítási helyet eltávolítanak vagy bevisznek. Egy másik változat szerint úgy hajtják végre, hogy a kívánt funkciókkal rendelkező polinukleotid szegmenseket kapcsolják össze, ezzel egyetlen etikai egységet hozva létre, ami a funkciók olyan kívánt komartalmazza, ami egyébként nem található .meg az általános természetes formákban. Tervezéssel restrikciós enzim, hasítási helyeket, szabályozó-szekvenciákat, kontroll szekvenciákat és más használható tulajdonságokat építhetünk be. A „rekombínáns .DNS molekulák” közé tartoznak a klónozó és expresszíós vektorok. A „rekombináns” szakkifejezés olyan polinukleotidra is vonatkozik, ami egy polípeptidei kódol, és rekombináns DNS technikákkal állítjuk elő.

Az „izolált” szakkifejezés azt jelenti, hogy természetes állapotából „emberi, kéz közbeavatkozásával” emeljük ki; azaz, ha előfordul a természetben, akkor vagy megváltoztattuk, vagy

Κ Φ Φ Φ ΦΦ Φ® Φ _# φ φ φ φ φ * ♦♦ φ ΦΦΦ ΦΧ* ΦΦ ♦ * φ φ φ \· φ ·®

ΦΚφφ β® Φ· *® **κ eltávolítottak az eredeti környezetéből, vagy mindkettő. Például egy természetes körülmények között élő állatban természetes állapotában előforduló polinukleotid vagy polipeptid nem de ugyanez a polinukleotid vagy polipeptid, ha elválasztjuk a vele együtt létező anyagoktól, akkor már „izolált”, ahogy a szakkifejezést az alábbiakban alkalmazzuk. Például a polinukleotidok esetében az izolált szakkifejezés azt jelenti, hogy el van választva a kromoszómától és sejttől, amiben természetes körülmények között előfordul·

A polinukleotidok és polipeptidek előfordulhatnak készítményben, azaz például közeg készítményekben, oldatokban a polinukleo ti dóknak vagy polipeptideknek például sejtekbe való an a kémiai vagy

enzimes reakciókhoz, amik a természetben elő nem forduló kéés megmaradnak az izolált polinukleotidok vagy poliaz itt alkalmazott szakkifejezés értelmének megfelelően.

A „lényegében tiszta* vagy „lényegében homogén” szakkifejezést egymás helyett is használhatjuk, és ezzel leírhatunk RG.1 polipeptidet, vagy annak fragmenseit, vagy ezeket kódoló polinukleotid szegmens!, aholis az ilyen polipeptid vagy polinukleotid el van választva azoktól a komponensektől, amik természetes körülmények között kísérik. Egy RG1 vazv fras mén se, vagy egy ezt kódoló DNS szegmens lényegében mentes a természetes körülmények között vele asszocíálődő komponensektől, ha elválasztjuk a. természetes szennyezőktől, amik természetes állapotában kísérik. Tehát egy olyan j amit »Φ *« * * * a, « φ Φ Φ Φ Φ ♦* χ ΦΧ* ΧΦΦ φ»· Φ

9J ® X Φ * * * *φφ« ΦΦ ** ** **^; lag szintetizáltak, vagy egy olyan celluiáris rendszerben szintetizáltak, ami eltér a természetes, cellulárís rendszerétől, lényegében mentes a természetes körülmények között vele együtt előforduló komponensektől. Hasonlóan, egy polinukleotíd, amit kémiailag szintetizáltak, vagy egy olyan cellulárís rendszerben szintetizáltak, ami eltér a természetes cellulárís rendszerétől, lényegében mentes a természetes körülmények között vele együtt előforduló komponensektőL

A „homológ” szakkifejezés, ha polínukleotid leírására használjuk, akkor azt jelzi, hogy két polínukleotid, vagy azok kijelölt szekvenciái, ha optimálisan egymáshoz vannak illesztve és össze vannak hasonlítva, akkor azonosak, a megfelelő nukleotid ínszereíokkal vagy deléciókkál, a nukleotidoknak legalább 70%-ában, általában körülbelül 75rülbelül 98-99%-ában.

A „hasonlóságot”, ha egy akkor úgy határozzuk meg, hogy az egyik aminosav és a konzerválódott aminosav helyettesítéseit egy m

pei sze & össze.

;zes olyan eljárást jelent, amiben a DNS specifikus darabjait sokszorozzuk, a 4,683.195 számú, 1987. július 28-á.n kibocsátott Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetett módon. Általában ismertnek kell lennie a. számunkra érdekes polípeptíd íragmens végeire vonatkozó, vagy azon tűi terjedő szekvencia-információnak, aminek alapján oligonuldeotid «κ «# 99 ** *

¢. φ > Φ Φ Φ ® 99 * ΚΦ* ΦΦΦ ΦΦ 9

- 9 9 9 4 4 ♦

ΦΦΦΦ Φ* *♦ »·* **

8' tervezhetők; ezek a primer egymás felé mutatnak, és szekvenciájuk azonos, vagy hasonlít az amplifikálandó templát másik szálához. A két primer 5 terminális nukleotidjai egybeesnek az t anyag végeivel. A polimer áz láncreakció arra használ/ specifikus DNS szekvenciákat amphfíkáljunk az összJNS-ből, a celluláris RNS-ről átírt cDNS-ből, plazmld szekvenciákból, stb. [Mullis és mtsai: Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biok 5b 263 (1987); PCR

Stockton Press, NY (1989$.

A „szigorúság tipikus esetben körülbelül a Tm pont)-5 °C (a próba olvadáspontja alatt 5 ^oC-szal) és körülbelül 20-25 °C-szal a próba olvadáspontja alatti tartományban van. Amint az a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, szigorú hibridizációs körülmények alkalmazhatók, ha azonos polinukleotíd szekvenciákat akarunk azonosítani vagy kimutatni, vagy hasonló vgy rokon poíínukleotid szekvenciákat akarunk azonosítani vagy kimutatni. Ahogy a továbbiakban alkalmazzuk, a „szigorú körülmények” szakkifejezés azt jelenti, hogy a hibridizáció csak akkor jón létre, ha legalább körülbelül 95%·,. előnyösen legalább 97% azonosság van a két szekvencia között.

A „hibridizáció* szakkifejezés jelentése a továbbiakban „minden olyan eljárás, amiben egy polinukleotíd szál bázlspárosodással kapcsolódik egy komplementer szálhoz* (Coombs,

J.: Dictíonary of Biotechnology, Stockton Press, New York, NY (1994)].

Φ

X 9 9

Φ « ##

Φ* * χ ♦ *

ΦΦΧ χ

ΦΦ XX

Φ Φ

Φ$Φ φφφ ί 9

ΦΦ ΧΦ

Φ Φ Φ

ΦΦ «

λ „terápiásán nateKony oozis szammejezes a ponpepun vagy ellenanyaga, antagonistája, inhibitora - beleértve az antiszensz molekulákat és ríhozímeket is - olyan mennyiségét jelenti, ami enyhíti egy kör tüneteit vagy állapotát. Az ilyen. ve| terápiás hatékonyságát és toxicítását standard k eljárásokkal lehet meghatározni sejttenyészetekben vagy állatokban, azaz az BDso-et (azt a dózist, ami terápiásán hatékony a populáció 50%-ában), és az LDso-et (azt a dózist, ami a populáció 50%-ában letálisj. A terápiás és közötti dózis-arány a terápiás index, és arányként EDso/LDsö.

akban egy kóros állapot kezelésére kóros állapot a prosztatarák növekedésével áll ide tartoznak azok a betegségek, .csökkent szintjére van szüksége.

A jelen találmány tárgyát többek között új RG1 tídek, ?p.Z polmukleotídok, és az RGI nyagok képezik, amint azt az alá tétjük, Pontosabban, a jelen találmány tídek, valamint az ezeket az RGI leotidok képezik, különösen azok az j amiknek az aminosav szekvenciáját a, 2. ábrán számú szekvencia), valamint azok az rgl-ek, amiknek a lentid szekvenciáját az 1. ábrán mutatjuk be (1. számú szekvenciák A jelen találmány tárgyát képezik az RGI variánsok is. Az tő ki;

a tov

részletesebben, is.me.r-új RGI

φφ φφ « « φ * « * »*** ΦΦ

ΦΦ φ« * « * $»« ΦΦ * « Φ Φ φ* ««

JC ««

Φ>:

Φ *♦* az RGl variánst részesítjük előnyben, ami legalább 70%-os hasonlóságot (előnyösen legalább 70%- os azonosságot) mutat a 2, ábrán bemutatott polipeptid szekvenciával (2, számú szekv< előnyösebben legalább 90%-os hasonlóságot (előnyösen 9G%~os azonosságot) mutat a 2, ábrán bemutatott szekvenciával (2. számú szekvencia), mén előnyösebben lem

95%-os hasonlóságot (előnyösen legalább 95%-os azonosságot) mutat a 2. ábrán bemutatott polipeptid szekvenciával- (2. számú szekvencia), és tartalmazza az ilyen polipeptidek részeit ís, .amely polipeptid rész legalább 30 aminosavat, előnyösebb legalább 50 aminosavat tartalmaz.

A kikövetkeztetett RGl polipeptid kódoló szekvenciája az 1. ábrán bemutatott nukleotld szekvencia (1. számú szekvencia) 5'

Vi

ns mátrix három -strukturális domént tartalmaz: két spondin domént (FS1 és FS2), ami a 31-138-as és a 138-221-es aminosavakat tartalmazza, valamint egy thrombospondín domént, ami a 278-330-as aminosavakat tartalmazza.

Min din-nek - ami az extracelluláris mátrix fehérje család egy másik tagja - a 3. ábrán bemutatott strukturális IwmolÖgiáján alapul. Az RGl aminosav szekvenciája körülbelül 89,7%-han hasonlít a patkány Míndinre.

A jelen találmány részben az RG 1 expressziős profiljára is alapul, amit uemonstral a prosztata szövet könyvtaradban való expressziója, és a prosztatarák könyvtárakban való túlexpresszíója. Ez a szövet-profil látható a normális és tumorszövetekből vett szövetmintákban való mRNS expressziő pofiméráz láncreakcióval végzett Taqman elemzéséből, Ez az: elemzési módszer azt demonstrálja, hogy az RGl-et kódoló mRNS a prosztata-szövetekben túlexpresszálódik. más szövetekkel összehasonlítva.

Polinukleotidok

A. jelen találmány egyik szempontja szerint a jelen találmány tárgyát olyan izolált polinukleotidok képezik, amik az RGlet kódolják, aminek a kikövetkeztetett aminosav szekvenciája megegyezik a 2. ábrán bemutatott aminosav szekvenciával. (2, számú szekvencia).

Az itt biztosított információ alkalmazásával, azaz például az

1. ábrán bemutatott polinukleotid szekvencia (1, számú szekvencia) használatával a jelen találmány szerinti, egy RG1 polipeptideí kódoló polinukleotid standard Idónozási és szűrővizsgálati módszerekkel kapható .meg, azaz például azokkal, amikkel cDNSt lehet klónozni, kiindulási anyagként humán szövetből származó sejtek mRNS-ét használva, Á jelen találmányt illusztrálja, hogy az 1, ábrán látható polinukleotid szekvencia (1. számú szekvencia) megtalálható humán prosztata szövetekből nyert cDRS klánokban, Az rg.I-et úgy azonosították, mint egy, a prosztatában expresszálődó gént, azután, hogy' átvizsgálták az Incyte Lifeseq adatbázist, A nuldeotid szekvenciát az adatbázis annotációs kutató* X φφ φ* **

φ. φ X · φ φ Λ ΦΦ Φ Φ» * Φ Φ φφΦ Φ Φ Φ *♦ φφ savai azonosították, a „Protein Function” eszköz használatával, amit az Incyte biztosít az adatbázis kutatásához. A nukleotíd

könyvtár-készletben való eloszlásának elektronikus Northern biot elemzéséből kiderült, hogy az rgl magas szinten expresszálódik a számos más szövet könyvtárában, beleértve a normális és tumorszövetekből származókat is

Az rgl klönok sorozatának egybefüggő polinukleotid szekvenciává való összeállítása, és az egybefüggő szekvencia editálása után teljes hosszúságit kódoló szekvenciát azonosítottak a kikövetkeztetett, összeállított, poknukleotidban. Ez a szekvencia olyan fehérjét kódol, ami a patkány míndínnel mutat homológíát.

Az Incyte 1640796-os, 1712252-es és 1.880265-ós klánjait az Incyte-től kaptuk a kísérleti munkához, és a 3360733-as kiönt úgy azonosítottuk, mint ami a legtöbb 5 nukleotíd szekvenciát tartalmazza, Ezt a klónt teljes hosszában szekvenáltuk, és kiderült, hogy a kikövetkeztetett RG1 fehérje teljes kódoló szekvenciáját tartalmazza. Ezt a szekvenciát az 1. ábrán mutatjuk he {1, számú szekvencia),

A jelen találmány szerinti polinukleotidok lehetnek RNS-ek, azaz. például mRNS-ek, vagy DNS~ek, beleértve például a cDNS-t és genomiális DNS-t, amit klónozással kaptunk, vagy szintetikus kémiai technikákkal, vagy a kettő kombinációjával kaptunk, vagy az aiaboiaköan ismertetett eharasokRah A Und íenet. ketszaln vagy egyszálú. Az egyszálú DNS lehet a kódoló szál, ami értelmes szálként is ismert, vagy lehet nem-kódoló szál, ami antiszensz szálként is ismert.

szekvencia lehet azonos az 1. ábrán bemutatott polinukleotid fi, számít szekvencia) kódoló szekvenciájával. Lehet egy eltérő szekvenciájú polinukleotid is, ami a genetikai kód redundanciája (degeneráció) miatt a 2. ábrán bemutatott polipeptídet (2, számú szekvencia) kódolja.

A jelen, találmány szerinti polínukleotidok - amik a 2. ábrán bemutatott polipeptídet kódolják (2. számú szekvencia) - közé tartozhat, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a polipeptídet magát kódoló szekvencia; a polipeptídet kódoló szekvencia további, nem-kódoló szekvenciákkal, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az intronokat és a nem-kódoló 5' és 3* szekvenciákat, azaz például az átírt, de le nem fordított a transzkripcióban, a az illesztésben és a

szanak szerepet, vagy további kódoló szekvenciák, amik további nak. Tehát a polipeptid például íúzíonáltathatő egy marker szekvenciához, azaz például egy pepiidhez, ami megkönnyíti a fuzionált polipeptid tisztítását. A jelen találmány ezen aspektusa bizonyos előnyben részesített megvalósítási módjai szerint a marker szekvencia egy hexahisztidin peptid, azaz például többek között a. pTrcHisB vektorban levő jelölés (Invítrogen, Carlsbad,

ΦΦ φφ #β ** * φ Φ X « Φ Κ 9 9« φ ««« ΦΦΦ ** * φ φ * « * « * φΦΦΦ ΦΦ 99 ♦* **

CA), amik közül számos kereskedelmi forgalomban beszerezhető. Amint azt Gentz és munkatársai publikálták, a hexahisztidín biztosítja a fúziós fehérje kényelmes tisztítását [Gentz és mtsai: Proceedmgs of the National Academy of Sciences, USA 8ó, 821824 (1989)).

A polínukleotidok egy olyan polipeptidet kódolhatnak, ami a polipeptíd, plusz további N-terminálís vagy C-terminális aminosavak» vagy a pepiid belsejében levő ammosavak (ha például az aktív forma egynél több polipeptíd láncot tartalmaz). Az ilyen szekvenciák szerepet játszhatnak a polipeptíd prekurzor formájáról a végső formára való processzálásában, elősegíthetik a polipeptíd vándorlását, meghosszabbíthatják vagy megrövidíthetik a polipeptíd felezési idejét, vagy többek között a polipeptíd vizsgálatához vagy előállításához megkönnyíthetik a manipulálását. Amint az általában az in sáu helyzet, a processzálás során az további, aminosavak proteolítíkus enzimekkel eltávolíthatók a pokpeptidröl.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá az előzőkben ismertetett polínukleotidok variánsai is, amik a 2. ábrán bemutatott kikövetkeztetett amínosav szekvencia (2; számú szekvencia) fragmenseit, .analógjait és származékait kódolják. A polinukleotid variáns lehet természetes variáns·, azaz például egy természetben előforduló alíélvaríáns, vagy lehet egy variáns, amiről nem ismert, hogy előfordul a természetben. A polinukleotidnak az ilyen, nem-természetes variánsait mutagenezis technikákkal φφ φφ φφ φ* * * φφφφ φ * *· φ φφφ φφφ φφ * φ φ φ ·» * φ * φφφφ ΦΧ φφ ** *♦

mutagenezis technikákat.

vagy szervanEbből a szempontból azokat a va előzőkben említett polinukleotidok

vagy addícíók egy vagy több polínukleotídra tér ki.

vanans 'te a

, a nem-

SVO VÍ nosav

A jelen találmánynak ebből a *y mindkettőben. A kódoló vagy nem-konzervatív amideiécíókat vagy addicíókat okozhatnak.

különösen előnyközé tartoznak azok a polinukleotidok, amik olyan nek a 2. ábrán bemutatott, aminosav köznek, illetve ennek variánsait, analógjait, menseít, valamint a variánsok, analógok és származó mense.it ke ' az RG1·’

és hágóén részesített megvalósítási módjai közé tartoznak azok a polinukleotidok, amik RG1 variánsokat, analógokat, származékokat analógjait és származékait, amik az RG1 polipeptidnek a. 2. ábrán bemutatott aminosav szekvenciájával rendelkeznek (2. szánni szekvencia),, amiben néhány, 5-10, 1-5, 1-3, 2, 1 vagy 0 aminosav helyettesítve van, ki van vágva, vagy inszertálva van, bármilyen kombinációban. Ezek. közül különösen előnyben részeX

Φ Φ4 φφ

X » Φ X φ sv Φ* X» nem

sítjük a csendes mutációkat, addíoíökat és változtatják meg az f

Ebből a szempontból különösen előnyben részesítjük a tív helyettesítéseket. Azokat a polmukleofidokat tartjuk legelőnyösebbeknek. amik olyan polipeptideket kódolnak, amiknek a szekvenciája megegyezik a 2. ábrán bemutatott aminosav szekvenciával (2. számú szekvencia), helyettesítés nélkül.

A jelen találmány előnyben részesített megvalósítási módjai közé tartoznak azok a polinukleotidok, amik legalább 70%-ban azonosak az RGI poupeptioet (aminek az aminosav ss a 2. ábrán látható, 2. számú szekvencia) kódoló valamint azok a polinukleotidok, amik komplementerek ezekkel a pölínukleolidökkat Egy másik változat szerint azokat a polínukleotidokat részesítjük leginkább előnyben, amik egy olyan régiót tartalmaznak,, ami legalább SG%~ban azonos az RG I polipeptidet kódoló polinukleotíddal, valamint az ezzel komplementer polínukleotídokkal. Ebből a szempontból azokat a polinukleotidokat részesítjük előnyben, amik legalább 90%-ba.n azonosak az RGI polipeptidet kódoló polínukleotiddal, valamint az ezzel menter polinukleotídokkal, és ezek közül a

előnyben, amik legalább 95%-os azonosságot mutatnak. Továbbá a legalább 95%-os azonosságot mutatók közül azokat részesítjük előnyben, amik legalább 97%-os azonosságot mutatnak, és ezek közül leginkább a legalább 98%-os és legalább 99%-os azonos#φ »φ φ * φφ ** φ φ φ φ φ φ * _# Φ*Χ φΧ» *Φ φ φ φ φ X Φ

ΦΦΦΧ ΦΦ φφ *♦ ságot mutatókat részesítjük előnyben, de ezek közül is ír legalább 99%-os azonosságot mutatókat részesítjük előnyben.

Ebből a szempontból a. különösen előnyős megvalósítási módok közé tartoznak azok a polinukleotidok, amik olyan polilényegében megtartják ugyanazt a biológiai aktivitást, mint amivel az· 1. ábrán bemutatott szekvenciájú (1. számú szekvencia) polínukleotíd szekvencia által kódolt polipeptid rendelkezik.

találmány tárgyát ké továbbá azok a leotidok, amik hibridizálödnak az előzőkben ismertetett szekvenciákhoz. Ebből a szempontból a jelen találmány olyan polinukleotídokra vonatkozik, amik szigorú körülmények között az előzőkben ismertetett polmukleotídokhoz hibridizálödnak.

Amint azt az előzőkben a jelen találmány szerinti leotíd esszékkel tárgyaltak szerint a polinukleotidok

próbaként eDNS-hez vagy genomiális DNS-hez, hogy teljes .hosszúságú, RGl-et kódoló cDNS-eket és genomiális kiönokat izoláljunk, és más gének cDNS-eít valamint genomiális klőnjait izoláljuk, amik nagy szekvencia-hasonlóságot mutatnak az rpl génnel. Az ilyen próbák általában legalább 15 bázist tartalmaznak. Az ilyen próbák előnyösen legalább 30 bázist tartalmaznak, és tartalmazhatnak legalább 50 bázist is.

tan az rpi kodolo régióját úgy szintetikus oiigonukíeotíd

V'Vvizsgálunk át,

CUliiiXC't ΑΛ4Ζ {.UiiiVi f A.*i.,W· 5Λ. Φ <U· í.\- AA. V OUt ΚΛχ.χ V V&íCUilUí

Φ Φ *» φ * Λ * * * ♦ φ X Jfr Φ Χ ΦΦ Φ* φ φ Φ * Φ Κ 9

Φ«ΦΦ Φ* * * ♦· **

Például egy jelzett oligonukleofidot, aminek a szekvenciája, komplementer a jelen találmány szerinti polmukleotiddal, arra használhatunk, hogy cDNS vagy genomiális DNS könyvtárakat vizsgáljunk át, hogy azonosítsuk azokat a klánokat, amik híbridizálődnak a próbához.

nukleotídokra, főleg azokra, amik szigorú körülmények között hibridizálődnak, és olyan polinukleotidokra, azaz polimeráz láncreakció primerekre, amiket a polipeptid fragmenseket kódoló polinukleoíidok amplifíkálására lehet használni. Ebből a szempontból azokat a polinukleotídokaf részesítjük előnyben, amik megfelelnek az előnyben részesített polipeptid fragmenseknek, amint azt az alábbiakban tárgyaljuk.

A jelen találmány tárgyát képezi továbbá egy RG! polipeptid, aminek a kikövetkeztetett aminosav szekvenciája a 2. ábrán látható (2. számú szekvencia).

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá ezeknek a polipeptídeknek a íragmensei, analógjai és származékai. Ha a 2. ábra szerinti polipeptidre (2. számú szekvencia) vonatkoztatva «« X β X φ '* * * * ♦.*' « 94« Χ*Φ XX Φ β 9 9 * * *

Φ«Χ« *« *< ^φφ ***

ΦΧ használjuk a firagmens, származék és analóg akkor ez olyan polípeptidet jelent, ami lényegében ugyanazt, a biológiai aktivitást tartja meg, mint egy ilyen polipeptid.

A jelen találmány szerinti polipeptid lehet egy π polipeptid, egy természetes polipeptid vagy egy peptld. Néhány előnyben részesített megvalósítási mód. szerint ez egy rekombínáns polipeptid.

A 2. ábra szerinti polipeptid (2. számú szekvencia) fragmense, származéka vagy analógja lehet

i) olyan, amiben egy vagy több amínosav csoport egy konzervatív vagy nem-konzervatív amínosav nyösen konzervatív amínosav csoporttal) van sítve, és az ilyen helyettesít amínosav csoportot vagy ,, vagy nem, vagy sítő csoportot tartalmaz, vagy iiij olyan, amiben a polipeptid egy másik vegyűlethez van füzíonáltatva, azaz például olyan vegyűlethez, ami megnöveli a polipeptid felezési idejét (ilyen vegyület például a poketíiénglikol), vagy ív) olyan, amiben további amínosav csoportok vannak a potva, azaz például vezérszekvencia vagy szekréciós szekvencia, vagy egy olyan szekvencia, amit a polipeptid tisztításánál lehet felhasználni.

♦ « * X X * * jí g ,# » * « * **

9«4 & 4 4 44 * « * ♦ Φ * λ λ ♦♦ w* ♦» x* *♦ «* *7 v'

Az ilyen fragmensek, származékok és analógok az leírás kitanítása alapján a szakterületen jártas szakember ismeretei közé tartoznak,

Ebből a szempontból a jelen találmány különösen előnyben részesített megvalósítási módjai közé tartoznak azok a polípepti dek, amiknek az aminosav szekvenciája az RG1 2. ábrán bemutatott aminosav szekvenciájával (2. számú szekvencia) egyezik meg, illetve ennek variánsai# analógjai, származékai és fraga fragmens variánsai, menseí szekvenciájával, és származékai szekvenciájával.

Az előnyben, részesített variánsok közé azok tartoznak, amik a referencia polipeptidtol konzervatív aminosav helyettesítésekben térnek el. Ezek olyan helyettesítések, amik egy poliegy aminosavat egy másik, hasonló jellemzőkkel rendelkező aminosawal helyettesítenek. Tipikusan konzervatív helyettesítésnek tartjuk az alifás amínosavak, azaz például az Alá, Val, Leu és He egymással való helyettesítését, a hidroxi csoportot. tartalmazó Ser és Thr egymással való helyettesítését, a savas Asp és Glu egymással való helyettesítését, az amid csoportot tartalmazó Asn és Gin egymással való helyettesítését, a bázikus csoportokat tartalmazó Lys és Arg egymással való helyettesítését, és az aromás részt tartalmazó Phe és Tyr egymással való helyettesítését.

Ebből a szempontból különösen előnyben részesítjük azokat a variánsokat, analógokat, származékokat, és fragmenseket, amik az RG1 2. ábrán bemutatott szekvenciájával (2. számú φφ «'-# φ κ φ χ*Φ «φφ Φ X Φ φφ φ* φφ * φ X φ* «φ φ φ * *

ΦΦ ΧΦ szekvencia) rendelkeznek., amiben néhány, 5-10, 1-5, 1-3, 2, 1 vagy 0 aminosav helyettesítve van, ki van vágva vagy inszertálva van, bármilyen. kombinációban. Ezek közöl különösen előnyben részesítjük a csendes helyettesítéseket, addíciőkat és deléciőkat, amik nem változtatják meg az RG1 polipeptid tulajdonságait és aktivitásait. Ebből a szempontból különösen előnyben részesítjük a konzervatív helyettesítéseket. Azokat a pohnukleotidokat tartjuk legelőnyösebbeknek, amik olyan polipeptideket kódolnak, amiknek a szekvenciája megegyezik a 2. ábrán, bemutatott aminosav szekvenciával (2, számú, szekvencia) helyettesítés nélkül.

A jelen találmány szerinti polipeptideket előnyösen izolált formában biztosítjuk, előnyösen homogenitásig tisztítva.

A jelen találmány szerinti polipeptidek közé tartozik a 2. ábrán bemutatott polipeptid (2.. számú szekvencia), ami legalább 70%-os hasonlóságot (előnyösen legalább 70%-os azonosságot) mutat a 2. ábrán bemutatott polipeptid szekvenciával (2. számú szekvencia), előnyösebben, legalább 90%-os hasonlóságot (előnyösen legalább 90%-os azonosságot) mutat a 2. ábrán bemutatott polipeptid szekvenciával (2. számú szekvencia), még előnyösebben legalább 95%-os hasonlóságot (előnyösen legalább 95%-os azonosságot) mutat a 2. ábrán bemutatott polipeptid szekvenciával (2. számú szekvencia), és tartalmazza az ilyen polipeptidek részeit is, amely polipeptid rész legalább 30 aminosavat tartalmaz, előnyösebb legalább 50 aminosavat tartalmaz,

A „hasonlóságot”, a szakterületen ismertetett módon úgy határozzuk meg, hogy az egyik aminosav szekvenciát és a kon42 zerválódott aminosav helyettesítéseit második

X φ

φφ

ν.Φ ♦'# Ο Φ φ φ Φ « « * Φ* φχφ ΦΦΦ «* Φ

Φ Φ Φ Φ -Φ * « ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ sze

A jelen tak részeit arra < össze.

a teljes hosszúsága F

Sír során.

Γ Γ Cllgt.K.

A jelen találmány előnyben részesített aspektusai közé tartoznak az RGi fragmensek tartalmazó polipeptidek, leginkább a 2, ábrán bemutatott RGI (2. számú szekvencia), valamint a 2.

származékainak fragmensei.

Ebből a szempontból a fragmens egy polipeptid, aminek az aminosav szekvenciája teljesen azonos az előzőkben említett RGI polipeptid, vagy annak variánsai vagy származékai aminosav szekvenciájának egy részével, de nem a teljes egészével.

Az ilyen fragmensek lehetnek „szabadon állók”, azaz nem részei más polípeptídeknek, vagy nincsenek aminosav fúzionáltatva hozzájuk, vagy lehetnek egy nagyobb részei, amiben egv⁷ régiót képeznek. Ha egy nagyobb tídben vannak, akkor az itt tárgyalt fragmensek legelonyc egyetlen egybefüggő régiót alkotnak. Azonban egy nagy pepiidben több fragmens is lehet. Például bizonyos előnyben részesített megvalósítási módok a jelen találmány szerinti RG 1 poφφ ♦·♦· ** Φ φ Φ ifi β Φ Φ ♦ *® χ ΦΦ* Φ** ** * * « Φ φ 9 Φ X φ»«* Φ* ** Φ** ;id egy fragmensére vonatkoznak, ami egy

terveztünk, és heterológ pre- és propoiípeptíd régiókat tartalmaz, az RG1 fragmens N-termináksához fúzionáltatva, valamint egy egy további régiót, a fragmens C-terminálisához fúzionáltatva.

Ennek következtében a

szerint az RG 1-ből származó fúziós egy részére vagy részeire vonatkozik.

A jelen találmány szerinti polipeptid fragmensek reprezentatív példájaként megemlítjük azokat, amik körülbelül 25-331

Ebben a. szövegösszefüggésben a „körülbelül* kifejezés az yt vagy tartományokat jelenti, amik néhány, az egyik, vagy mindkét végükön. Például ebben a szövege gésben a körülbelül 331 aminosav egy jelent, aminek a mérete 25 plusz-mínusz néhány, 5, 3, 2 vagy 1 aminosavtól 331 plusz-mínusz néhány, 5, 3, 2 vagy 1 aminosavig azaz lehet olyan széles is, hogy a mérete 25 mínusz

5, 3. 2 vagy 1 aminosavval

néhány aminosavtól 331 plusz néhány aminosavig terjed, és lehet olyan keskeny ís, hogy mérete 25 plusz néhány aminosavtól 331 mínusz néhány aminosavig terjed.

Éhből a szempontból erősen előnyben részesítjük az idézett tartományokat, plusz-mínusz 5 aminosav valamelyik, vagy mindkét végen. Különösen előnyben részesítjük az idézett tartományokat, plusz-mínusz 3 aminosav valamelyik, vagy mindkét végen.

«Φ ** *« φ « « « Φ X * * *·ί:

» «-»· 49 * ί, $ φ φ ί * * »* «·# *♦ ***

Rendkívül előnyben, részesítjük az idézett 'tartományokat, pluszmínusz. 1 aminosav valamelyik, vagy mindkét végen, vagy az említett tartományokat addieiók és a iragmensexet ress

SZC2 ben, amiknek a mérete körülbelül 25-331 aminosav.

A jelen találmány szerint különösen előnyben, részesített fragmensek közé az RG1 csonkított mutánsai tartoznak. Az RG! csonkított mutánsai közé tartoznak a 2. ábrán bemutatott szekvencia (2. számú szekvencia} variánsai vagy származékai, kivéve c egvt saz egy egybeí

Cl részt) ami tartalmazza a 2. ábrán bemutatott szekvencia (2. számú szekvencia) N-terminálisát, vagy a csoportok sorozatát, ami tartalmazza a C-terminálist, vagy a csonkított mutánsokban két sor egybefüggő amínosa amik közül az egyik az N-termináUst, a másik a C-termmalist tartalmazza. Az előzőkben meghatározott mérettartományba tartozó fragmensek szintén előnyben részesített megv« módjai a csonkított íragmem előnyben részesítünk a írs_

A. jelen, találmány ezen szempontja, szerint különösen előnyben részesítjük azokat a fragmenseket, amiket az RG1 biológiai és/vagy immunológiai tulajdonságai jellemeznek. Az ilyen fragmensek közé tartoznak azok, amik az KG! kikövetkeztetett strukturális doménjeíí tartalmazzák, ami legalább a 31 -103-as amiuosavakra, 138-221-es és 278-330-as aminosavakra terjed

ΦΦ κ*

Φ *

ΦΦΦ ΦΦΦ * * * φ

Φ«»Φ

ΦΦ * « «Φ φφ »

Φ Φ

ΦΦΦ ki, vagy azok a fragmensek, amiket ellenanyagok generálására használunk, például amiket a 4, példában írtunk lé.

Az ebből a szempontból előnyben részesített régiók közül néhány előnyben részesített régiót a 2. ábrán (2. számú szekvencia) mutatunk be, és ide tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az előzőkben említett típusok, amiket a 2. ábrán (2. számú szekvencia) bemutatott szekvencia elemzésével azonosítunk.

Az ebből a szempontból nagyon előnyben részesített fragmensek közé azok tartoznak, amik tartalmazzák az RG1 olvan régióit, amik különböző szerkezeti tulajdonságokat kombinálnak, azaz például az előzőkben említett tulajdonságokat. Ebből a szempontból a két spondin és egy thrombospondin dómén, amik körülbelül a 31-103-as aminosav csoportokra, a 138-221-ea aminosav csoportokra és a 278-330-as aminosav csoportokra tejednek. ki, és az extracelluláris mátrix fehérjék Mindin/spondin szupercsaládra jellemzőek, különösen előnyben részesített régiók, Ezek a régiók lehetnek egy nagyobb polipeptidben, vagy önmagukban lehetnek a jelen találmány egy előnyben részesített régiói, amint azt az előzőekben tárgyaltuk. Az nyilvánvaló, hogy a „körülbelül” kifejezés ebben a fejezetben ugyanazzal a jelentéssel bír, mint amit az előzőkben, általánosan megadtunk a fragmensekre.

Azokat a régiókat részesítjük még előnyben, amik az RG1 aktivitását befolyásolják. Ebből a szempontból azokat a fragmenseket tartjuk: legelőnyösebbnek, amik az RG.1 kémiai, biológiai

X 0 vagy más £ hasonló vagy jobb aktivitással nem-kívánt aktivitással rei nősen azokat a frag régiókat tartalmaznak pozíciójuk, vagy mind a szekvencíákuk, mind a pos * * * X 0 * * *00 Χ00 « * * * 0 Φ *00 0 »9 ¢, _# : ís, a , illetve csökkent, a szm sn, amik olyan

le a rokon < aktív régióival, azaz család más fehérjéivel, amik közé as RG 1 is tartozik.

A jelen találmány tárgyát is, amik közé tartoznak a i tidok, azok a bíztattunk a. jelen, találmány szerinti vektorokkal, valamint a jelen találmány szerinti poiipeptidek előállítása rekombínáns DNS technikákkal- Ezek a technikák megtalálhatók a szakkönyvekben (Sambrook és mtsai: Molecular Cloning:. A Laboratory Manual: 2. kiadás, Cold Spring: Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Current Protocols in Molecular Biology, szerk.: Ausubel és mtsai, Greene .Publishing és :erscience

A gazdasejteket génsebészeti úton megváltoztathatjuk, hogy okát és a jelen találmány szerinti it expresszálják. Például a polinukleotidokat a fertőzés, transzdukció, transzfekcíó, transzvekciő és transzformáció

jól ismert technikáival lehet bejuttatni, A polinukleotídokat

ΦΧ ♦ ♦ Φ X « * «φφ ·.«.«.

* ♦ φ Ί »«*φ φφ φφ

X *φ φ* φφ láthatjuk önmagukban, vagy más polínukleotidokkal. Ezeket a más polinukleotidokat bejuttathatjuk egymástól függetlenül, bejuttathatjuk egyszerre, vagy hozzákapcsolhatjuk a jelen találmány szerinti polinukleolidokhoz.

Tehát például a jelen találmány szerinti polinukleotidokat a gazdasejtekbe más, külön, szelekciós markert kódoló polinukleotiddal juttathatjuk be, standard technikákat használva a kotranszfekciora és szelekcióra, például emlős sejtekben. Ebben az esetben, a polinukleotidok általában stabilan beépülnek a gazdasejt genomjába.

Egy másik változat szerint a polinukleotidokat egy szelekciós markert tartalmazó vektorba építhetjük be, a a gazdaszervezetben való szaporítás céljából A vektor-konstrukciót a gazdasejtekbe az előzőkben említett technikákkal lehet bejuttatni. Égy plazmid vektor általában csapadékban, azaz például kalciumfoszfát csapadékban, vagy egy töltött lípiddel képezett komplexben juttatható be a sejtbe. Elektroporáciő is használható a palinukleotídnak a gazdaszervezetbe való bejuttatására. Ha a vektor vírus, akkor in vitro pakolható, vagy egy pakoló sejtbe juttatható be, és a pakolt vírust transzdukálhatjuk a sejtekbe. Ismertek nagyon változatos technikák, amik a jelen találmány szerinti alkalmasak a polinukleotidok. előállítására, és a polinukleotidok sejtekbe való bejuttatására, és a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára rutinszerűen alkalmazhatók. Ezeket a technikákat Sambrook és munkatársai szakkönyvében I smegtalálhatjuk (Sambrook és mtsai; Molecular Cloning: A ♦* * Φ *

* ·*«♦·♦ ** ·»·»·

9 χ **· » 4 4

44 » ít *«

Φ ♦ Φ

Laboratory Manual; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spríng Harbor, N.Y. (1989)), ami jellemző számos olya laboratóriumi kézikönyvre, amik részletezik ezeket a technikákat, A jelen találmány ezen szempontja szerint a vektor lehet például egy plazmid vektor, egyszálú vagy kétszálü fágvektor.

kétszálú RNS vagy DNS virális vektor. Az ilyen vektorok leotidok, előnyösen DNS formában juttathatók be a sejtekbe, a DNS és RNS sejtekbe való bejuttatására használt, jól ismert technikákkal. A vektorok, a fág- és virális vektor esetében szintén előnyösen pakolt vagy kapszidba zárt vírusok formájában juttathatók be a sejtekbe, a fertőzés és a transzdukció jól ismert tech-

kaciovagy

maga a bevitt vekt : vektorok lehel replikácio defektívek. Az utóbbi esetben a virális iában csak a komplementálő gazdasejtekben fordul elő,

A vektorok közül csak azokat részesítjük előnyben, bizonyos szempontból, amik a jelen találmány szerinti polinukleotidokat és polipeptideket expresszálják. Az ilyen vektorok általában cisz-ható kontroll régiókat tartalmaznak, amik egy gazdaszervezetben befolyásolják az expressziót, és működés szempontjából az expresszálandó polinukleotidhoz vannak kapcsolva. A megfelelő transz-ható faktorokat vagy a gazdaszervezet szolgáltatja, vagy egy komplementálő vektor szolgáltatja, vagy szolgáltatja, a gaz tatás után.

Az ebből a szempontból különösen előnyben részesített megvalósítási módok szerint a vektorok biztosítják a specifikus »Φ

Φ * ♦ •φφ φ

* φ

Μ φ «

Φ

Φ X ♦ φ

X* ΦΦ φ

Φ Φ Φ »φ ΧΦΦ *·♦· »

X Φ Φ Φ φ

ΦΧ »« Φ^ expresszíőt. Ez a specifikus expresszió lehet indukálható expresszié. vagy csak néhány sejtben meglevő expresszié, vagy lehet indukálható és sejtspecifikus is. Az indukálható vektorok közöl különösen azokat részesítjük előnyben, amikről az expresszió környezeti faktorokkal indukálható, amik könnyen manipulálhatók, mint például a hőmérséklet és tápanyag adalékok. A jelen találmány ezen szempontja szerint megfelelő különböző vektorok, amik lehetnek prokaríóta és eukarióta gazdaszervezetekben használható konstitutív és indukálható expressziős vektorok, jól ismertek, és a szakterületen jártas szakemberek rutinszerűen

A génsebészeti úton megváltoztatott gazdasejtek hagyományos táptalajokban tenyészthetők, antik szükség szerint módosíthatók. többek között promoterek aktiválására, transzformánsok szelektálására, vagy gének amplífikálására. A tenyésztési körülmények, azaz például a hőmérséklet, pH és hasonlók, amiket korábban az expresszióhoz kiválasztott gazdasejthez használtak, általában megfelelnek a jelen találmány szerinti polípeptidek expresszálására, amint az a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló.

Rendkvui különböző expressziós vektorok használhatók a jelen találmány szerinti polipepiíd expresszálására. Az ilyen vektorok közé tartoznak kromoszomális, epíszómáiís és víruseredetű vektorok, azaz például bakteriális plazmidokböl, bakteriofágból, élesztő epíszómákhöl, élesztő kromoSzomália vírusokból, azaz például bakulovlrusokből, papova

Φ« Φφ

X Φ Φ

Φ*Χ Φφφ

X Φ· φφ » φ φ* φ φ * »φ φφ azaz

DV40-ból, vakcínia vírusokból, adenovírusokból, z vírusokból rétrevi.rusokból és alfavírusokból, azaz például Sindbis vírusból és ezek kombinációjából származó vektorokból, például plazmid és bakteriofág ákai elemekből származó vektorokból azaz kozmidokból és >ől származó vektorok, mind használhatók a leien ta-

A megfelelő DNS szekvenciát a számos jól ismert és rutin technika bármelyikével beépíthetjük a. vektorba. Általában, egy DNS szekvenciát az expresszióhoz egy expressziós vektorhoz kap csoljuk, a DNS szekvenciát és az expressziős vektort egy vagy több restrikciós endonukleázzal elba.sit.va, majd a restrikciós fragmenseket T4 DNS ligázzal Összekapcsolva. A restrikciós emésztés és a lígálás erre a célra használható eljárásai jól ismertek és a szakterületen jártas szakemberek rutinszerűen használják. Az ebből a szempontból megfelelő eljárásokat, valamint az expressziós vektorok alternatív technikákkal való előállítását, amik szintén jól ismertek és a szakterületen jártas· szakemberek rutinszerűen. használják, a szakkönyvekben részletesen ismertetik ISambrook és mtsai: Moieeular Cloning: A Laboratory Manual; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)],

X * *♦ ♦♦ * « χ * * φ * φ φ * φφ * ♦♦♦ φφφ φφ φ

Φ » Φ »' φ φ ♦Φ»* ΦΧ Λ 9 XX φφ

Az expressziós vektorban a DNS szekvenciát működés szempontjából a megfelelő expresszi©» kontroll szekvenciáikéhoz kapcsoljuk, beleértve például egy promoterhez, az mRNS transzkripció vezérlése céljából· Ilyen promoter lehet például a lamhda fág .PL promoíere, az Escharicfeh eoá lac, trp, tae és trc promoterei., az SV40 korai és késői promoterei, valamint a retrovirális LTR-ek promoterei, csak hogy néhányat megnevezzünk a jól ismert promoterek közül· Áz nyilvánvaló, hogy számos nem említett promoter, ami megfelel a jelen találmány ezen szempontja szerinti alkalmazásokban, jól ismert, és a szakterületen jártas szakember könnyen használhatja a megbeszélés és az példák figyelembevételéveL

Az expressziós konstrukciók általában tartalmaznak lelő helyeket á ts miciaemjara es átírt régióban, egy riboszömális kötőhelyet a transzlációhoz. A konstrukciók által expresszált átíratok kódoló része tartalmaz egy transzlációt iniciálé AVG kodont az indulásnál, és egy termináciös kodont, a. lefordítandó pozíció végén megfelelő pozícióban elhelyezve.

Emellett a konstrukciók tartalmazhatnak kontroll régiókat, amik szabályozzák, valamint létrehozzák az expressziót. Általában, számos gyakran használt eljárás szerint az ilyen régiók úgy működnek, hogy szabályozzák a transzkripciót, azaz például többek, között represszor kötőhelyek és fokozok.

A szaporodás és expresszió vektorai általában tartalmaznak szelekciós markereket. Az ilyen markerek emellett alkalmasak ** ** XX «X «

Φ * Φ X Φ φ » Φφ * φφφ φφφ Φφ χ * Φφφ * * χ

ΦΦΦΧ ΦΦ «φ ΦΦ Φφ amplifíkálásra, vagy a vektorok tartalmazhatnak további marfcereket erre a célra. Ebből a szempontból az expressziós vektorok előnyösen tartalmaznak egy⁷ vagy több szelekciós marker gént, ami fenotípusos tulajdonságokat biztosít a transzformált gazdasejtek szelekciójához. Az előnyben részesített markerek közé tartozik a díhidrofolát-reduktáz, a neomicin, a puromicin, vagy hígromiéin rezisztencia az eukaríóta sejttenyészetek esetében, és a tetracikiin, theomícin, kanamicin vagy ampieiíiin rezisztencia gének az Escherichia coli és más baktériumok tenyésztéséhez.

A vektort, ami az előzőekben ismertetett módon tartalmazza a megfelelő DNS szekvenciát, valamint egy megfelelő promotert és más megfelelő kontroli szekvenciákat, egy megfelelő gazdaszervezetbe számos különböző jól ismert technikával juttathatjuk be a megfelelő gazdaszervezetbe, amely technikák lehetővé teszik egy kívánt polipeptid expresszióját. A megfelelő gazdaszervezetek reprezentatív példái lehetnek a bakteriális sejtek,, azaz például az Escheriehia cok, a Stroptompces és Scdmoneda iyphimunum sejtek; a gombasejtek, azaz például az élesztősejtek; a rovarsejtek, azaz például a Drosophila 82 és a Spodoptera Si9 sejtek; az állati sejtek, azaz például a CHO, COS és Bowes melanoma sejtek; és a növény sejtek, előnyösen a BTÍ-TN-5B1-4 rovar sejtek. A számos· különböző expressziős konstrukció gazdaszervezetei jól ismertek, és a szakterületen jártas szakember ennek a leírásnak az alapján könnyen ki tud választani egy gazdaszervezetet, hogy a jelen találmány ezen aspektusának megfelelően expresszáljon egy polipeptidet.

ΦΦ

Φ*

9 X » φ* « 9

Különböző emlős sejttenyészet rendszerek is hí az expressziőra. Az emlős expressziős rendszerek közé tartoznak a majomvese íihrobl&szt CÖS-7 sejtvonalai (Gluzman és mtsai: Cell 28, 175 (1991)). Egy kompatibilis vektor expresszálására képes más sejtvonai lehet például a €127, a 3T3, a CHO, a HeLa, a humán vese 293 és a BHK sejtvonai. Az emlős gazdasejtekben számos vírus alapú expressziós rendszer használható. Azokban az e nálunk, az RG.l-et kódoló expressziós v

ami a rus késői promotert és háromrészes vezérszekvenciát tartalmaz. A vitális genom nem-esszenciális El vagy E3 régiójába való kiszerelő életképes vírust eredményez, ami képes az RGl-et exp~ resszálni a megfertőzött gazdasejtekben (bogán és Shenk.: Proceedíngs of the National Academy of Sciences, USA 81, 36553659 (1984)}. Emellett transzkripciós fokozok, azaz például a Rous szarkóma vírus ÍRSV) fokozó használható az expresszié ra emlős gazdasejtekben.

Pontosabban, a. jelen találmány tárgyát rekombináns konstképezik, azaz p<

egy vagy több, az előzőkben ismertetett szekvenciát tartalmaznak. A konstrukció általában egy vektor, azaz például egy plazmid vagy vitális vektor, amibe egy, a jelen találmány szerinti szekvenciát építettünk he. A szekvenciát előrevivő vagy fordított orientációban építhetjük be, .Bizonyos előnyben részesített megvalósítási módok szerint a konstrukció tartalmaz még szabályozó54 szekvenciákat, beleértve például egy promotert, működés szempontjából a szekvenciához kapcsolva. Nagyszámú megfelelő vektor és promoter ismert a szakterületen jártas szakember számára, és számos vektor beszerezhető· kereskedelmi forgalomban, a jelen, találmányban. való felhasználáshoz.

Példaként megadunk néhány vektort, .amik kereskedelmi forgalomban vannak. A baktériumokban előnyösen használható vektorok közé tartozik a pQE70, a pQEőÖ és a pQE9, amik a QlÁGEN USA-től (Valencia, CA) szerezhetők be; a pBS vektorok, a Phagescrípt® vektorok, a Bluescript^ vektorok, a pNHSA, a pNHlőa, a pNH ISA, a pNH46A vektor (Stratagene, LaJolla, CA); és a ptre99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT vektor vektorok, amik a Pharmacia Biotech-től .(Piscataway, NJ) szerezhetők be. Legelőnyösebb a pTrcHisB vektor, amit az Invitrogen-től lehet beszerezni. Az előnyben részesített eukarióta vektorok közé tartozik a pWLNEO, a pSV2CAT, a pOG44, a PXT1 és a FSG vektor, amik a Stratagene-tŐI szerezhetők be; és a PSVK3, pBPV, pMSG és PSVL vektorok, amik a Pharmacia Biotech-től szerezhetők be. A legelőnyösebb a pCineo vektor, ami a Promega-tói szerezhető be, Ezeket, a vektorokat pusztán illusztrálás céljából soroljuk fel a számos kereskedelmi forgalomban levő és jól ismert vektor közül, amik a szakterületen jártas szakember száméira hozzáférhetők, és használhatók a. jelen találmánynak megfelelően. Az nyilvánvaló, hogy bármely más plazmid vagy vektor használható például a. jelen találmánynak megfelelően például egy jelen találmány sze* Φφφφ φ χ φ Φ φφφ φφφ φφ * Φ X Φ X Φ χ

ΦΦΧΦ «.« φφ φχ _φ> inti polinukleotid vagy fenntartására.,

A promoter régiókat bármely kívánt génből szelektálhatjuk, olyan vektorokat használva, amik tartalmaznak olyan riporter transzkripciós egységet, amiből hiányzik a promoter régió, ilyen lehet például a kloramfenikol aeetiltranszferáz (,,cat'^J) transzkripciós egység, restrikciós hasítási hely vagy helyek után, amibe egy kiválasztandó promoter fragmenst lehet bevinni; azaz egy olyan fragmenst, ami tartalmazhat egy promotert. Amint az jól ismert, egy promotert tartalmazó fragmensnek a vektor cat gén előtti restrikciós hasítási helyére való bejuttatása lehetővé teszi a CAT aktivitás megnyilvánulását, amit standard CAT esszékkel lehet kimutatni. Az erre a célra szerinti és könnyén hozzáférhető promoterek használhatók, hanem olyan promoterek is, amiket könnyen előállíthatunk az előzőkben ismertetett technikával, egy riporter gén használatával.

A jelen találmány szerinti polinukleotidok és polipeptidek expresszaiására alkalmas ismert, promoterek közé tartozik az

Tac5 promoter, a lambda PR, PL promoter, a trp promoter és a trc hibrid promoter, ami a trp és lac promoter promoterekből származik. Az ebből a szempontból használható ismert eukartóta promoterek közé tartozik a CMV közvetlen korai promoter, a HSV ** «φ φφ * * Φ * X * « ri φ φφφ φφφ φ ^β < $ Φ Λ Φ φ ·♦»♦ «, ί» », _ββϊ timídin kínáz promoter, a korai és késői SV40 promöterek, a retrovirális LTR-ek promoterei, azaz például Rous szarkóma vírus (_nRS¥”) és a metaHotioaein premoterei, azaz például a metallotioneín-1 promoter,

A megfelelő vektorok és promöterek kiválasztása egy gazdasejtben való expresszióhoz jól Ismert eljárás, és a vektor konstrukció exprcsszálásához, a vektornak a gazdaszervezetbe juttatásához és a gazdaszervezetben való expresszióhoz szükséges technikák a szakterületen rutinszerűen használt eljárások.

/\ rekombináns expressziós vektorok általában tartalmaznak replíkációs origót, egy erősen expresszálódó génből származó promotert, hogy vezéreljük egy utána álló {downstream) struktúrszefcveneia transzkripcióját, valamint egy szelekciós markert, ami lehetővé teszi a vektort tartalmazó sejtek izolálását a vektorral való érintkezés után.

A jelen találmány tárgyát képezik az előzőkben említett konstrukciókat tartalmazó gazdasejtek. A gazdasejt lehet magasabbrendü eukarióta sejt, azaz például emlős sejt, vagy alacsonyabhrendü eukarióta sejt, azaz például élesztősejt, vagy a gazdasejt lehet prokarióta sejt, azaz például baktériumsejt, A gazdasejtekben a konstrukciók hagyományos módon használhatók a rekombináns szekvencia által kódolt géntermék előállítására.

A polipeptid expresszáltatbatók emlős sejtekben» élesztőben, baktériumokban vagy más sejtekben, a megfelelő promöterek vezérietéveh A sejtmentes transzlációs rendszerek is használhatók ilyen fehérjék előállítására, a jelen találmány szerinti φφ *·** φ*φ * * φ *·* φφ φφ * » φ

φ

ΦΦΦΦ φφ φ φ φφ «<«

DNS konstrukciókból származó RNS-ek felhasználásával. A prokariöta és enkarióta gazdaszervezetekben használható megfelelő klónozó és expresszié vektorokat a szakkönyvekben ismertetik [Sambrook és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)].

A jelen találmány szerinti polipeptideket kódoló DNS magasabbrendü eukariőták által való transzkripciója növelhető, ha a, vektorba egy? fokozó szekvenciát juttatunk be. A fokozok a DNS císz-ható elemei, általában körülbelül 10-300 bázispár méretűek, amik úgy hatnak, hogy fokozzák egy promoter transzkripciós aktivitását egy adott gazdasejt·· típus bán. Fokozó például az SV40 fokozó, ami a replíkácíós origó késői oldalán található, 100-270 bázispárnál, a citomegalovírus korai promoter fokozó, a polióma fokozó a replíkácíós origó késői oldalán, és az aúenovirus fokozok.

A jelen találmány szerinti polinukleotidökaf, amik egy jelen találmány szerinti polipeptíd heterológ struktúr-szekvenciáját kódolják, általában standard technikákkal visszük be a vektorba, oly módon, hogy működés szempontjából a promoterhez kapcsolódik. A polinúkleotidot úgy kell elhelyezni, hogy a transzkripciós starthely megfelelő 5' pozícióban legyen a ríboszómális kötőhelyhez viszonyítva. A riboszőmális kötőhely 5 irányban van az AUG-hez viszonyítva, ami az expresszálandő polipeptíd transzlációját inicíálja, Általában nincs másik nyitott leolvasási keret, ami inieiációs kodonnal, általában AUG-vel kezdődik, és a ribo··

X* ** φ « *

ΦΦΧ φ**

végén, és van egy transzkripciós terminációs szignál és egy transzkripciós terminációs szignál, .megfelelően elhelyezve az átírt régió 3' végén.

Az átírt fehériének az ei retikulum lumené-

epitem az e:

szekréciós szi A szignálok a

viszonyítva lehetnek endogén vagy heteroíóg szigni tid expre aszalható módosított formában, azaz- pé

A polipepfúziős fe-

hat, hanem további amínosavak adhatunk a

-terminálisához, hogy f funkcionális régiókat is. _ aminosavakböl álló régiót a

jdhez, hogy ezzel, megkönnyítsük a tisz-

tását és fennmaradását a gazdasejtben, a tisztítás során, vagy a későbbi kezelés és tárolás során. Emellett speciális régiókat is

u.un.k a pof ütést. Ezeket a régiókat a eltávolíthatjuk, A peptid-egysegeK nozzaaoasa a azzal a céllal, hogy lehetővé tegyük a szekréciót vagy exkréciót, hogy javítsuk a stabilitást és megkönnyítsük a tisztítást, többek között, a szakterületen ismert és rutinszerű technikák. Ha például nagymennyiségű RGl-re van szükség ellenanyagok indukálásához, akkor olyan vektorokra van szükség, amik olyan fúziós fehérje magas színtű expressziőjáf vezérlik, ami könnyen fiszφ» ** ._χ**0.

..., :

títhatő. Az ilyen vektorok közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a multifimkciős Bscherichia coli klónozó és- expresszíós vektorok, azaz például a Blue-sori.pt (Stratagene), amiben az rgr I kódoló szekvencia a vektorba az N-terminális· Met csoporttal és a β-galaktozídáz azt követő 7 csoportjával leolvasási keretben van ligáivá, oly módon, hogy hibrid fehérje termelődik; a plN vektorok (Van Heede és Shuster: Journal of Biologica.1 y 264, 5503-5509 {1939}} és hasonlók. A pTrcHis vektorokat (Invitrogen, Carlsbad, CA) használhatjuk idegen polipeptidek políhisztidint (6*-His)^: tartalmazó fúziós fehérje formájában való expresszálására, ami a gyors tisztítást biztosítja. Az ilyen rendszerekben előállított fehérjéket úgy tervezik, meg, hogy hasítási helyeket, azaz például enterokmáz hasítási helyet tartalmazzanak, és ezzel a számunkra érdekes klónozott kiszabadítható a fúziós peptid egységből.

Egy megfelelő gazdatörzs transzformálása és a gs megfelelő sejtsürúségre való tenyésztése után az indukálható promotereket, ha jelen vannak, akkor megfelelő módszerekkel inindukálöszerrel való érintkeztetéssel), és a sejteket még tovább, megfelelő ideig tenyészthetjük.

A sejteket azután tipikus esetben centrifugálással nyerjük ki, fizikai vagy kémiai eszközökkel roncsoljuk, és a kapott nyers kivonatot megtartjuk a további tisztításhoz.

jék expresszálására használt mikrobiális sejtek bármilyen megfelelő módszerrel feltárhatók, beleértve a lefagyasztásolvasztás ciklust, az ultrahangos besugárzást, a

X X ♦ *

Χφφ Φ*Φ *· φ φ Φ 9 « «χ βΚ *♦ • φ φφ ronesolást, vagy a sejteket lizáló ágensek használatát, ezek a módszerek jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára.

Az RG1 polipeptid jól ismert módszerekkel nyerhető ki és tisztítható, beleértve az ammőnium-szulfátos vagy etanolos kiesapást, savas extráimtól, anion- vagy kationcserélő kromatográ alapuló

kromatögráhál és lektin kromafográfiát, Az a legelőnyösebb, ha tisztításra. A fehérje térszerkezetének kialakítására jól ismert technikák használhatók az aktív konformáció regenerálására, ha az izolálás vagy tisztítás során denaturálódik, A számos más módszer ismert a fehérje tisztítására Deutseher, M.: Methods in Enzymology 132, Academic Press, San Diego {1982}; Scopes, R>: Protein Purifíeation:

Practíce Springer-Verlag, New York (1982>k

Egy másik változat szerint a jelen találmány szerinti tideket élt fázis és mtsai:: Solid-Phase Preeman Co., San Francisco (1969);

Merrifield, J.: Journal of the American Chemical Socíety 35, 2149-2154 (1963)]. Az in vítro fehérjeszintézist manuális, technikákkal vagy automatizálással hajtjuk végre. Az automatizált szintézist például végrehajthatjuk az Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer berendezéssel (Perkín Elmer. Foster City,

Ο 0 0 *

φ.«.0'Χ β kémiailag, egy

amiket rekombínáns techCA), a .gyártó utasításai szerint. Az RG1 különböző meg, majd kémiai módc, a teljes tására,

A jelen találmány szerinti természetes, tisztított termékek, termékei, valamint azok a termék nikákkal állítottunk elő prokariőta vagy eukarióta gazdaszervezetekben, beleértve például a. bakteriális, élesztő, magasabbrendü növény, rovar és emlős sejteket. A rekombinációs eljárásban.

a. jelen találmány szerinti povagy nem-gi

Emellett, a jelen találmány szerinti kezdő, módosított metionin csoportokat, néhány esetben a gazdaszervezet által befolyásolt folyamatok eredményeképpen.

Az rg:

dek és az azokat kódoló poíinukleondok használatai

Az rpi polinukleotídokat és t mány szerint számos különböző alkalmazásban használhatjuk, különösen azokban, amikben az RG1 kémiai és biológiai tulajdonságait alkalmazzuk. A további alkalmazások közé tartozik a sejtszaporodás diagnózisa és betegségei, azaz például a prosztatarák, A jelen találmány ezen szempontjait tovább illusztráljuk az alábbi tárgyalási részben, és tovább ismertetjük a specifikációban.

» ν β ♦'·*· * * ** a «-Χ * * »a * * **

A jelen találmány szerinti polinukleotid és polipeptíd szekvenciák használata részben az itt ismertetett RG1 és más extracellulárís mátrix molekulák közötti kémiai és strukturális homolőgián, valamint az RG 1-nek más szövetekkel összehasonlítva a. prosztata szövetekben való preferencíális .expresszióján. alapul Az RG1 használható a prosztata szövet nem megfelelő növekedéséhez kapcsolódó állapotainak, rendellenességeinek vagy betegségeinek diagnosztizálásában és kezelésében. Ezek közé tartozik anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a rák és az áttétes

Az rgl akként, valamint az antíszensz és ribozim ként, vagy terápiáiként az antíszensz

C€ i alatta is használhatók, hogy az RG1 ellen olyan ellenanyagokat állítsunk elő, amik jól használhatók az RG 1 polipeptíd szintjének kimutatására sejtekben és szövetekben, valamint gyógy szereknek a primer és áttétes tumorokba való irányítására.

Az RG1 polipeptidek jól használhatók az RGl-et tartalmazó sejtek elleni immunválasz stimulálásárm

Az RGl-et kódoló polinukleotídok használhatók lehetnek a tídok szintjét mutatják ki sejtekben és szövetekben.

Az RG 1 expressziójával kapcsolatban álló állapotokban, azaz például a prosztatarákban előnyös lehet, ha elnyomjuk az φφ «·φ * « φ φ»

ΦΧ φ χ 9 ♦

ΦΦ ΦΦΦ aRG1 expresszióját vágj' aktivitását. Az RG! expresszióját az antiszensz olígonukleotidok vagy el. Egy másik változat szerint beadhatjuk azokat az e^iíf:i gokat, amik specifikusan felismerik az a területeit, amik az aktivitásért felelősek, sál kapcsolatban álló betegségeket vagy az

Polinukleotíd esszék

A jelen találmány tárgyát képezi továbbá az rpl-gyel rokon polinukleotidok használata a komplementer polinukleotidok kimutatására, azaz például diagnosztikai reagensként. A kóros állapothoz kapcsolódó rpl polinukleotidok kimutatása eszközt biztosít in vitro és in vivő diagnosztikumok kifejlesztésére, amik hozzáadnak, vagy meghatározzák a diagnózist, egy betegségben, vagy egy betegségre való érzékenységben, ami az RG1 szövetspecifikus expressziöjáoéi származik.

Az RGl-et kódoló génben mutációkat hordozó egyebeket DNS szinten lehet kimutatni, számos különböző technika alkalmazásával. A diagnózishoz a polinukleotíd mintákat egy beteg sejtjeiből kaphatjuk meg, azaz például vérből, vizeletből, nyálból, szövet biopsziából és autopszía anyagból. A genomiális DNS~t használhatjuk közvetlenül a kimutatásra, vagy polimeráz láncreakcióval enzim etikusan amplifikálh aljuk az elemzés előtt {Saiki és mtsai; Natúré 324, 163-166 (1986)]. Az RNS vagy cDNS is ugyanígy' használható. Pédaként megemlítjük, hogy az RGl-et kódoló polinukleotíd szekvenciával komplementer polimeráz

** ** φ ♦ * ..

φφφ φφ* φ φ φφ φφ φφ φ* φ

φ φφ láncreakció primerek arra használhatók, hogy azonosítsuk az rgl expresszíőt és mutációkat. Például a deléeíókat és ínszercíókat az ampíifíkáli termék méretváltozása alapján lehet kimutatni, a normál genotípussal összehasonlítva. A pontmutácíókat úgy azonosíthatjuk, hogy az amplíhkált DNS-t radioaktív izotóppal jelzett rp.Z RNS-hez hibrídizáljuk, vagy egy másik változat szerint radioaktív izotóppal jelzett rgl antiszensz DNS szekvenciákhoz, A tökéletesen illeszkedő szekvenciákat a hibásan illeszkedő duplexektől RNáz A emésztéssel, vagy az olvadáspont hőmérsékletének különbsége alapján lehet megkülönböztetni.

Egy referencia gén és egy mutációkat tartalmazó gén közötti szekvencia-különbségek ís kíderithetök közvetlen DNS szekvenálással. Emellett klónozott DNS szegmensek hasznaibatők próbákként, hogy kimutassuk a specifikus DNS szegmenseket. Az ilyen módszerek érzékenységét nagymértékben fokozhatjuk a polimeráz láncreakció vagy más amplilikálási módszer megfelelő használatával. Például egy szekvenáló prímért használunk kétszálú polimeráz láncreakció termékével, vagy módosított polimeráz láncreakcióval generált egyszálú terápiát molekulával. A szekvenciát hagyományos eljárásokkal határozhatjuk meg, hozzáadott radioaktív izotóppal jelzett polínukleotiddal, vagy automatizált szekvenáló eljárásokkal, amikben fluoreszcencia jelölést használunk.

A DNS szekvencia különbségeken alapuló genetikai teszteléseket ügy végezhetjük el, hogy kimutatjuk a DNS fragmensek gélekben való elektroforetíkus mobilitásának különbségeit, denatúráié ágé: inszercíóít

L·

nencia kis deledéit és

A különböző szekvenciák DNS fragmenseit denaturáló formamid gradiens géleken különböztethetjük meg, amikben a különböző DNS frágmensek specifikus olvadáspontjuknak vagy részleges olvadaspont hőmérsékletüknek megíeleloen a gél kulonbozo pozícióiban maradnak le (Myers és mtsai: Science 230, 1242 (1985)1 áz protekció esszékkel deríthetjük ki, azaz például RNáz és S Í protekcióval, vagy a kémiai hasítási módszerekkel (Catton és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 85, 4397-4401 (1985)|.

Tehát egy specifikus DNS szekvencia kimutatását különböző módszerekkel hajthatjuk végre, azaz például hibridizációval, RNáz protekcióval, kémiai hasítással,, közvetlen. DNS szekvenálássa.1, vagy restrikciós enzimek használatával (azaz például a genomiális DNS restrikciós fragmens hossz polimorfizmusaival („RFLP”) és Southern blotjaival).

A hagyományosabb gélelektroforézisek és DNS szekvenálások mellett a mutációk ín situ elemzéssel is kimutathatók.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a diagnosztikai esszék, azaz például a mennyiségi és minőségi esszék, amikkel az RG1 polipeptidet ki lehet mutatni a sejtekben, szövetekben és testfolyadékokban, beleértve a normális és abnormális szinteket.

ifi fe fe

Így például egy jelen találmány szerinti diagnosztikai esszé az RG 1 poüpeptídnek a normális kontroll szövetmintákhoz viszonyított tulexpressziójának kimutatására használható arra, hogy kimutassuk a neoplázia jelenlétét; például a prosztatarákét. Ezek a diagnosztikai tesztek arra is használhatók, hogy kimutassuk az áttétes tumornövekedést. Égy polipeptid, azaz például a jelen találmány szerinti RG1 polipeptid egy gazdaszervezetből származó mintában való szintjének meghatározására használható vizsgáló technikák jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára. Ilyen módszer például a ratiioimmunesszé (RA1) a kompetitív kötési esszék, a Western biot elemzés és az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat (ELISA), valamint a fluoreszcencia aktivált sejtosztályozás (FÁCS). Ezek közül gyakran az ELISAt részesítjük előnyben. Egy ELISA esszéhez kiindulásként egy RG1-specifikus ellenanyagot, előnyösen monoklonális ellenanyagot kell készíteni. Emellett egy általában egy riporter ellenanyagot is kell készíteni, ami fcöztödik a monoklonális ellenanyaghoz. A riporter ellenanyag egy kimutatható ágenshez, azaz például egy radioaktív, fluoreszcens vagy' enzim-reagenshez kötődik., a mi esetünkben tormaperoxidáz enzimhez.

Egy ELISA végrehajtásához mintát veszünk egy gazdaszervezetből, majd szilárd hordozón, azaz például polisztírol lemezen inkubáljuk, ami megköti a mintában levő polipeptideket. Ezután minden, a lemezen szabadon maradt polipeptid-kötő helyet beborítunk, egy aspecifikus fehérjével, azaz például szarvasmarha szérum-albuminnal inkuhálva. Ezután a monoklonális ellena».Φ

Λ#Χ

χ. φ *·> ** Φ * » * *

Χ*Φ ♦* *

Φ » * * Φ * ** «.« «> Φ* nyagot inkubáljuk a lemezen, ekkor a monoklonálís ellenanyagok kötődnek a polísztirol lemezre kötődött RG1 polipeptidekhez, A megkötetlen monoklonálís ellenanyagot pufferrel mossuk le. A tormaperoxidázhoz kapcsolt riporter ellenanyagot felvisszük a lemezre, aminek az az eredménye, hogy a riporter ellenanyag minden, az RG 1-hez kötődött monoklonálís ellenanyaghoz kötődik. Ezután a megkötetlen ellenanyagot lemossuk, A peroxidáz aktivitás reagenseit, beleértve egy kolorimetríás anyagot is, ezután rávisszük a lemezre. Áz ímmobilizált peroxidáz, az RG1hez a primer és szekunder ellenanyagon keresztül kapcsolódva színreakciot ad. Az adott idő alatt kifejlődött szmerösség jelzi a. mintában levő RG1 polipeptid mennyiségét. A mennyiségi eredményeket tipikus esetben egy standard görbe alapján határozzuk meg.

Kompetíciós esszé használható, ha az RGl-re specifikus ellenanyagok szilárd hordozóhoz kötődnek, és jelzett RGl-et, valamint a gazdaszervezetből származó mintát bocsátunk át a szilárd hordozó felett, és a szilárd hordozóhoz kötődött jelzés mennyisége hozható korrelációba a mintában levő RG 1 mennyiségével.

Ezeket, valamint csomó más esszét ismertetnek a szakirodalomban [Hampton és mtsai: Serologícal Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, Mínn. [1990); Maddox és mtsai: J. Exp. Med. 158, 12111 (1983)),

Ellenanyagok φ φ φ φφτ «

♦« **· φ* ** φ * *** 9*·χ φ 9 ♦ X *♦

9*

-ΧΦΦ'

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá azok az ellenanyagok, araik specifikusan az RG 1-hez kötődne, ezeket a továbbiakban RG1 ellenanyagoknak nevezzük. Az RG1 tülexpressdója prosztata szövetekben, valamint sejtfelszíni lokalizációja kiváló marker a szűrővizsgálathoz, diagnosztizáláshoz, prognózishoz, követő esszékhez és leképezési módszerekhez. Emellett, ezek a jellemzők azt mutatják, hogy az RG1 kiváló célpontja a terápiás módszereknek, azaz például a célzott ellenanyag terápiának, az ímmunterápi.ának és a génterápiának. A továbbiakban a „specíh-

san közötti kölcsönhatást i

Iában a fehérjékhez.

Az RG1 antigén determináns vágj” epitop) a ; másszóval, az ellenanyag struktúrához kötődik, mint áltafragmenseí, vagy más szármamunogénként használhatók, hogy az említettek ellen ellenanyagokat állítsunk elő QHarlow és mtsai: „Antibodies: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988)). Ezek az ellenanyag jelen találmány tárgyát képezik továbbá kánéra, egyláncú, humanizált és humán ellenanyagok, valamint Fab fragmensek, és «•X

Φ Φ • Φ χφ*

Φ Λ es íragmens

a.

* φ

φ

χ.Φ X *«

Φ * * X

Φ X X φΑ

X Φ χχ

X* φ

XX* zo eiu isme meg a

A jelen taláhnány szerinti szekvenciának megfelelő polípeptídek ellen generált ellenanyagok megl közvetlenül egy állatba való ínjekeiózásával, vagy a tídeknek egy állatnak, előnyösen nem-humán -állatnak való beadásával. Az így kapott ellenanyag azután kötődik a ?, magukhoz is.

códoló szekvencia is nasznamato olyan etienanyagc előállítására, amik a teljes természetes polipeptidhez kötődnek. Az ilyen ellenanyagokat azután arra használhatjuk, hogy a políÁ monokionális ellenanyagok előállításához bármilyen technika használható, ami az ellenanyagokat folyamatos sejtvonal tenyésztésével biztosítja, A példák közé tartozik a hibridóma technika IKohler és Milstein: Natúré 256, 495-497 (1975)), a humán B-sejt hibridóma technika pCozbor és mtsai: Immunology Today 4, 72 (1983)), valamint az EBV-hibridőma technika., amivel humán monokionális ellenanyagokat lehet előállítani [Colé és mtsai: Monodonal Antibodies and Cancer, 77-96, oldal, Alán R, Líss, Inc, (1985)),

Emellett használhatok azok a technikák is, amiket a „kiméra ellenanyagok’’ előállítására, az egér ellenanyag gének humán ellenanyag génekhez való illesztésére dolgoztak ki, amivel olyan molekulák kaphatók, amiknek megfelelő a speclfitásuk és biológiai aktivitásuk [Morrison és mtsai: Froceedings of the »* Φχ *χ φφφ χ * *** ** XX φ * *

ΦΦ ΦΦ X* φφ φ

φ

Μ*

National Academy of Sciences, USA 81, 6851-6855 (1984); Neuberger és mtsai: Natúré 312, 604-608 (1984); Talceda és mtsai: Natúré 314, 45:2-454 (1985)]. Egy másik változat szerint az egyláncű ellenanyagok előállítására leírt technikák (4,946,778 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás] adaptálhatók RG1-specifikus egyláncű ellenanyagok előállításához.

Emellett „humán” ellenanyagok előállíthatok az 5,877,397 és 5,569,825 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban, ismertetett módszerek használatával, amely publikációkat a továbbiakban teljes egészükben referenciaként kezegox úgy is

S3k?

nnmung;

gy m wö tálunk a limfocíta populációban, vagy Oriandí és mt saí, valamint Winter és Miisteni leírása szerint nagyon specifikusan kötődő reagensekkel átvizsgáljuk a és mtsai:

Proceedings of the National Áeademy of Sciences, USA 86, 38533887 (1989); Winter és Mílstein: Natúré 849, 293-299 (199

Előállíthatok olyan ellenanyag fragmensek,

nek, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a P(abU fragmensek, amiket az ellenanyag molekula pepszines emésztésével állíthatunk elő, és a Pab fragmensek, amiket úgy állíthatunk elő, hogy a F(ab')a fragmensek díszulfid-hídjait redukáljuk. Egy másik változat szerint a Fab expressziős könyvtárak készíthetők, amik «φ

ΦΦ *9 *

♦.«:« >-* *· ,«»» ««* *»«* ♦♦ ♦* lehetővé teszik a kívánt specifitással rendelkező monokionáíis Fab fragmensek gyors és egyszerű azonosítását [Húsé és mtsai: Science 256, 1270-1281 (1989}|.

Az RG1 itt bemutatott aminosav -szekvenciája arra használkus régióit szelektáljuk. Amint az a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, az RG1 polipeptid azon régiói vagy epitopjaí, amik ellen egy ellenanyag irányul, attól függően változhatnak, hogy milyen alkalmazásra szánjuk őket. Például az ímmunesszében való felhasználásra szánt ellenanyagokat, amikkel membránhoz kötött RG 1 -et akarunk kimutatni prosztata sejteken, az RG1 polipeptid hozzáférhető epítopjai ellen kell. irányítani. Az RG1 polipeptidnek azokat a régióit, amik immunogén struktúrával rendelkeznek, valamint más régiókat és doméneket könnyen azonosíthatjuk különböző más, a szakterületen ismert módszerrel, azaz például Cheu-Fashman, GarnierRobson vagy Jameson-Wöíf elemzéssel. Az ezeket a csoportokat tartalmazó fragmensek különösen alkalmasak anti-RGl ellenanyagok előállítására. A különösen jól használható ellenanyagok közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a PLGGES1CSAG.APARYS1T szekvencia (8. számú szekvencia), a HSSDY'SMWRKNQWS szekvencia (10. számú szekvencia), a DAÖTDSGFTFSSPNPATIPQDTV (11. számú szekvencia); és NEIVDSASVPET (12. számú szekvencia). Az ezek a régiók ellen készített poliklonális ellenanyagokat a . példában ismertetjük.

φ φφ· φ * ♦ Φ* ΧΦΦ « φ φφ φφ ,φφ φ *

X* φ φ φ φ« φφ *

φ φφ* *? ο

A jelen találmány szerinti RGI ellenanyagok kút jól használhatók lehetnek a diagnosztikai esszékben, a leképezési eljárásokban, ésa prosztatarák kezelésének terápiás módszereiben, A jelen találmány tárgyát különböző immunológiai esszék képezik,, amiket jól lehet használni az RGI polipeptidek kimutatásában és a prosztatarák diagnosztizálásában. Ezek az esszék általában egy vagy több RGI ellenanyagot tartalmaznak, amik képesek felismerni és megkötniegy RGI polípeptídet. A leginkább előnyben részesített ellenanyagok szelektíve kötik az RGI-et, és nem kötődnek (vagy csak nagyon gyengén kötődnek) a nem-RGl poiipeptidekhez, Az esszék közé tartoznak a szakterületen jól ismert különböző immunesszé formátumok, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a radieimmunesszé különböző típusai, az enzimhez kötött ímmunszorbens vizsgálatok, és hasonlók. Emellett, az immunológiai leképezési módszerek, amik képesek kimutatni a prosztatarákot, szintén a jelen találmány tárgyát képezik, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a jelzett RGI ellenanyagokat használó radioszcintigráhás leképezési módszereket. Ezek az esszék klinikailag jól használhatók lehetnek a. prosztatarák kimutatásában, monitorozásában és prognosztizálásában,

Az előzőkben említett ellenanyagok jól használhatók lehetnek olyan klánok izolálására és azonosítására, amik a polipepticlet expresszálják, vagy a jelen találmány szerinti polípeptid tisztítására, az ellenanyagot egy szilárd hordozóhoz rögzítve, affinitáskromatográfiával végzett izoláláshoz és/vagy tisztításhoz,

Xft

X * φ φ φ φ

X*** φ$* φφ *Χ φ* * * »♦·♦· »*

X * « *φ ** φ Φ ft ft »

Emellett az RG1 ellenanyagok használhatók RG1 pozitív sejtek izolálására, sejtosztályozási és tisztítási technikák alkalmazásával, Pontosabban, az RG1 ellenanyagok használhatók prosztatarák sejtek xenograft tumorszővethöl, tenyészetben levő sejtekből, stb, való izolálására, ellenanyag vagy affinitás-tisztítási technikák használatával. A jelen találpolípeptidet.

Az RG1 polipeptidek használhatók a prosztatarák vagy tumor áttét jelenlétének kimutatására. Az ilyen RG1 tartalmú sejtek jelenléte különböző biológiai mintákban, beleértve a szérumot, prosztatát és más szöveti biopszía mintákat, kimutathatók az RG 1 ellenanyagokkal. Emellett, az RG1 ellenanyagok kü' _a lönhöző leképezési eljárásokban is használhatók, azaz Tc-99m-mel (vágj' más izotóppal) konjugált ellenanyag^ immun szóin tígráfiában, Például az egyik nemrég leképezési protokollhoz hasonló leképezési eljárás, amiben In 111-hez konjugált anti-PSMA ellenanyagot lehet használni, használható az újra felbukkanó, és áttétes prosztata karcinömák ki végzett mutatására {1.997)] , és mtsan

21, 759-766

A jelen találmány szerinti RG! ellenanyagokat egy kimutatható markerrel jelezhetjük, vagy egy második molekulához konjugáltathatjuk, azaz például egy eitotoxikus ágenshez, és arra használhatjuk, hogy a második molekulát egy RG1 pozitív sejthez

Φ» φ* φ * φ«* φφφ·

X « Φ φφ «« φφ· φ ^φ «

φ * φφ irányítsuk. fVitetta, E.S. és mtsai: Immunotoxin Therapy, szerk..; DeVita, Jr., V.T. és munkatársai, Caneer: Principles and Pr&ctlce of Oncolcgy 4th. ed., 2624-2636. oldal, J.B. Líppíneotf Co., Philadelphia (1993)], A citotoxikus ágensek közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a doxorubicin, a daunorübiein, a taxol, az etídiumbromid, a mitomiein, az etoposide, a tenoposide, a vínerístine, a vinhlastine, a colchicine, a dihidroxi-antracin-dion, az aktinomicin D, a diftéría toxin, a Pseudomonas exotoxin (PB) A, PE40, az abrin, és a glükokortikoid valamint más kemoterápiás ágensek, valamint a radioaktív izotópok. A megfelelő kimutatható markerek közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a radioaktív izotópok, a fluoreszcens vegyöletek, a bíolumíneszcens vegyűietek, a kemilummeszcens vegyületek, a fémkeláforok, vagy az enzimek. A megfelelő radioaktív izotópok közé az. alábbiak tartoznak: antímon-124, autim.on-125, arzén-74, bárium-103, bárium-1.40, herillíu.m~7, bizmut-j206, bízmut-207, kadmíum109, kadmium-115m, kalcíum-45. cérium-1.39, cérium~114, cérium-144, cézium-137, krőm~51, kobalt-56, kobalt-57, kobalt58, köbalt-6Ö, kobalt-64, erbium-169, európium-152, gadolínium-153, arany-195, arany-199, hafnium-1.75, hafnium131, índium-11, jód-123, jód-131, irídium-192, vas~55, vas-59, kripton-85, őlom-210, mangán-54, higany-197, higsmy-203, molíbdén-99, neodimíurn-147, neptunium-237, nikkel-63, niobíum-95. ozmíum-185+191, palládium-103, platina- 195m, praesodymium-143, promécium-147, protaktmíum-233, rádiumΦΦ φφ ** * »* ·* φ * « φ *

Φ* ** *

Φ*

X *

222.6, rénium-186, rubídium-86, ruténium-103, ruténium-106, szkandium-44, szkandíum-96, szelén-75, ezüst-1 löm, ezüst-li, nátríum-22, stroncíum-85, stroncium-89, stroncium-90, kén-35, tantál-82, t.echnécium“99m, tedur-125, tellur-132, íhallium-170, thaHium~204, tórium-228, tórium-232, ón-113, titán-44, wólfram-185, vanádiuna-48, vanádium-49, itterbium-169, íttrium-88, íttríum-90, ittrium-91, cink-65 és cirkőnium~95,

A jelen találmány tárgyát különböző, a prosztatarák kezelésére szolgáló immunterápiás módszerek képezik, beleértve az ellenanyag terápiát, az in ribo vakcinákat, és az ex vivő immunterápíás megközelítési módokat. Az egyik megközelitési mód szerint a jelen találmány tárgyát olyan RGI ellenanyagok képezik, amik szisztémásán használhatók a prosztatarák kezelésére. Például nem~konjugált RGI ellenanyag juttathatók be a betegbe, oly módon, hogy az ellenanyag a prosztatarák sejteken, sejtekben vagy azokhoz kapcsolódva található RG I-hez kötődik, és befolyásolja a sejtek és a tumor tönkremenetelét, olyan mechanizmusokkal, amik közé tartozhat a komplement álatl közvetített citolízis, az ellenanyag-függő celluláris eitotoxicítá.s, az RGI fiziológiás· funkciójának megváltoztatása, és/vagy a ligandum-kotodési vagy szignál-transzdukciös bíoszlntézis utak gátlása, A toxikus ágensekhez, azaz például ricinhez vagy' radioaktív izotópokhoz konjugáit RGI ellenanyagok is használhatók terápiásán, hogy a toxiί A ? Ο

0* * * * «0*0

0« 00 0 0

00« «00 0 « «« ** «0 * ’ .0:0 0 <

« ♦ .«' *

Φ

80* kus ágenst közvetlenül bejuttassuk az RGl-et hordozó tumorsejtekbe, ós ezzel tönkretegye a tumorsejteket.

A prosztatarák immunterápia RG 1 ellenanyagok használatával követheti a különböző megközelítési módokból származó ismereteket, amiket sikeresen alkalmaztak a rák más típusai esetében, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a vastagbél rákot (Arién és mtsai: Crítical Revíews ín ímmunology 18, 133-138 (1998)], a többszörös mielőmát (Özaki és mtsai.: Blood 90, 3179-3186 (1997); Tsunenari és mtsai: Blood 90, 2437-2444 (1997)), a gyomorrákot [Kasprzyk és mtsai:

Cancer Research 52, 2771-2776 (1992)1, a B-sejt límfőmát (Funakoshi és mtsai: Imraunther, Emphasis Tumor Immunok 19, 93-101. (1996)], a leukémiát, (Zhong és mtsai: Leuk, Rés. 20, 581-589 (1996)], a vastag- és végbélrák (Moun és mtsai: Cancer Research 54, 6160-6166 (1994): Velders és mtsai: Cancer

Research 55. 4398-4403 (1995)], valamint az; emlőrák (Shepard és mtsai: J. Clinic. Immunoi, 11, 117-127 (1991)],

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá az olyan, vakcinák, amik kiszerelt formában, tartalmaznak egy RG1 polipepíidet vagy annak fragmensét. Egy tumor antigén használata egy vakcinában humoralís és sejtek által közvetített immunitás generálásra, a rákellenes terápiában való felhasználás céljából, jól

Immunok 159, 3113-3117 (1997)1. Ezek a módszerek könnyen ismert a szakterületen, és alkalmazták a mán PSMA és rágcsáló PAP immunogének használatával (H és mtsai; Int. d. Cancer 68, 231-237 (1995); Fong és mtsai: d. oí

ΦΧ φ««Φ ¢4 ΦΦ ΦΦ Φ Φ * ’ φφφ «ΦΦ <·♦ « φ * 9 ¹ »$ «« *«

Φ

ΦΦ «

« «••Φ használhatók egy RG1 polipeptíd, vagy annak íragmense használatával, vagy egy RGl-et kódoló nuklemsav molekula és refcombináns vektorok alkalmazásával, amik képesek expresszální és megfelelő módon prezentálni az RG1 immunogént,

Például a virális bejuttatás! rendszer használható egy RGlet kódoló nuklemsav molekula bejuttatására, A különböző, a jelen találmány ezen aspektusának megfelelően használható virális génbejuttató rendszerek közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a vakcinia, a csírkehimlo, a. kanárihimlő, az adenovírus, az influenza, a poliovírus, az adeno-asszociált vírus, a lentivírus, és sindbus vírus [Restifo: Curr. Opin, Immunoi. 8, 658-663 (1996)). Nem-virális bejuttató rendszerek is használhatók, RGl-et kódoló puszta DNS-t vagy annak fragmensét bejuttatva a betegbe (például intramuszkulárisan), hogy ezzel anti-tumor választ indukáljunk. Az egyik megvalósítási mód szerint a teljes hosszúságú humán rpl cDNS használható. Egy másik megvalósítási mód szerint a humán rgl cDNS fragmensek használhatók. Egy másik megvalósítási mód szerint specifikus Tlimfocita (CTL) epitopokat kódoló rgl nukleínsav molekulákat használhatunk, A CTL epitopokat specifikus algoritmusok hasz(azaz nálatával határozhatjuk me University), amivel az RG! polípeptidben peptideket, amik képesek optimálisan kötődni a specifikált allélekhez, ^fn &

Különböző ex víoo stratégiák is Li te sí mód magában foglalja egyik megálatát az «χ Φ* ** _s « * 9 9 ?δ

ΦΦ «Φ

ΦφΦ ΦΦΦ »· «» «*

RG1 polipeptidnek a beteg immunrendszere számára antigénként veié bemutatására. A dendrites sejtek í~es és Π-es MHC osztályt, 87 kostimuMtort és ínt.erfeukin~12~t expresszálnák, ezért erősen specializált antigén-prezentáló sejtek. A prosztatarákban a prosztata-specifikus membrán antigén (PSMA) peptídjeível pulzáitatott autológ dendrites sejteket használnak Fázis I klinikai vizsgáiban, hogy stimulálják a prosztatarákos beteg immunrendszerét (Tjoa és mtsai: Prostate 28, 65-69 (1996);

Murphy és mtsai: Prostate 29, 371-380 (1996)). Dendrites sejtek * használhatók az RG1 polipeptidek T-sejteknek való bemutatására, 1-es és Π-es MHC osztályú molekulák kontextusában. Az egyik megvalósítási mód szerint autológ dendrites sejteket pulzáltatunk olyan RG1 polípeptidekkel, amik képesek MHC molekulákhoz kötődni. Egy' másik .megvalósítási mód szerint a dendrites sejteket a teljes RG1 polipeptíddel pulzáltatjuk. Egy még további megvalósítási mód magában foglalja az rpl gén tűlexpresszioját dendrites sejtekben, a szakterületen ismert különböző implementáló vektorok, használatával, azaz például adenovirus jArhur és mtsai: Cancer Gene Therapy 4, 17-25 (1997)], retrovírus (henderson és mtsai: Cancer

Research 56, 3763-3770 (1996)), lentivírus, adeno-asszocíált vírus, DNS transzfekció [Ribas és mtsai: Cancer Research 57, 2865-2869 (1997)] és tumor eredetű RNS transzfekció [Ashley és mtsai; J. Exp. Med. 186, 1177-1182 (1997)].

Antí-idiotípusos anti-RGl ellenanyagok is használhatók a rákellenes terápiában vakcinaként, immunválasz indukálására

RG1 polipeptidet expresszáló sejtek ellen. Pontosabban, az antiidiotípusos ellenanyag generálása a szakterületen jól ismert, és könnyen adaptálható arra, hogy olyan antí-idiotipusos anti-RGl ellenanyagokat hozzunk vele létre, amik utánozzak egy RG1 polipeptid egyik epitopját (Wagner és mtsai: Hybridoma 16, 33-40 (1997); Foon és mtsai: J. Clmie. hívest. 96, 334-342 (1995); Herlyn és mtsai: Cancer Immunok Immnnother. 43, 65-76 (1996)]. Egy ilyen antí-idiotípusos ellenanyag használható egy anfí-idiotípusos terápiában, amit jelenleg is végeznek tumor antigének elleni más antí-idiotípusos ellenanyagokkal.

Genetikai immunizációs módszerek használhatók RGl-et expresszáló ráksejtek elleni proülaktíkus vagy terápiás humorális és celluláris immunválasz generálására. Az itt ismertetett, RGlet kódoló DNS molekulákat, amik olyan konstrukciók, amikben egy RG1 polipeptid/immunogént kódoló DNS van, valamint megfelelő szabályozó-szekvenciák, közvetlenül injekciózhatok egy egyed bőrébe, oly módon, hogy az izom vagy a bőr sejtjei vegyék fel a konstrukciót, és expresszáljáfc a kódolt RG1 polipeptídet/immunogént. Az RG1 polipeptid/immunogén vagy sejtfelszíni polipeptídként expresszálható, vagy szekretálhatö. Az RG1 polipeptid/ímmunogén expressziöja prosztatarák elleni profilaklikus vagy terápiás humorális és celluláris immunválasz generálását eredményezi. A szakterületen ismert különböző profilaktikus és terápiás genetikai immunizációs technikák használhatók (erről a www.genweb.com internet címen található összefoglaló).

* ♦-M <0 ···*.♦ ¢4 « 9 4

X XX »-♦' Φ » Φ * »x ♦*· antíszensz vektorok és ribozimek ementer antíszensz

Az rgl

n.ogy a

se_ lidökat

Egy másik változat szerint a retrovírusokból, adenovínisből, herpesz vagy vakcina-vírusból,' vagy különböző bakteriális piazmidokből származó expressziős vektorok is használhatók re kombináris vektorok készítésére és bejuttatására, amik antíszensz rpj-et expresszálnak jSambrook és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring. Harbor, NAL (1989); Current Proíocols ín Möleenlar Biology, szerk,: Ausube.1 és mtsai, Greene Publishing és WileyInterscíence: New York (19872.

A teljes hosszúságú cDNS szekvenciát és/vagy annak szabályozó elemeit tartalmazó polinukleotídok lehetővé teszik a kutatók számára, hogy az rgl polinukleotidot kutatási eszközként használják az- értelmes szálakban [Youssonfian és Lodish; Molecular & Cellular Biology 13, 98-104 (1993)] vagy az antíszensz szálakban jEguohí és mtsai: Annu, Rév. Biochem. 60, 631-652 (1991)] a gén-funkció szabályozására. Ez a technológia jól ismert a szakterületen# és az értelmes vagy antíszensz olígomerek, vagy nagyobb fragmensek a kódoló vagy kontroll régió mentén különböző pontok alapján tervezhetők meg.

ΦΦΧ* ΦΦ φ φ * * *

X Φ Φ Φ φφ φφ *φ

Az Rgl-et kódoló gének kikapcsolhatők, ha a sejtet vagy szövetet olyan expressáós vektorokkal transsfektáljuk, amik magas szinten expresszálják a kívánt poíínukleotid fragmenst. Az ilyen konstrukciók képesek elárasztani a sejteket transzlációban nem működő értelmes vagy antiszensz szekvenciákkal Még akkor is, ha nem integrálódnak a DNS-be, az ilyen vektorokról RNS molekulák íródnak át, egész addig, amíg a kópiákat működésképtelenné teszik az endogén nukleázok. A tranziens expresszié tarthat egy hónapig, vagy tovább is, egy nem-replikálódó vektorral, és tarthat tovább is, ha a megfelelő replikáeiós elemek a vektorrendszer részét képezik.

Amint azt az előzőkben említettük, a génexpresszío módosítását úgy kaphatjuk meg, ha antiszensz molekulákat, DNS-t vagy⁷ RNS-t tervezünk az rgl kontrol régiói, azaz például a promoterek, fokozok és intronok ellen. A transzkripciós iniciácíős helyekről, azaz például a vezérszekvencia ~10-es és a *10~es régióiból származó oligonukleotidokat részesítjük előnyben.. Az antiszensz molekulákat ügy is megtervezetjük, hogy blokkolják az mRNS transzlációját, a riboszómákról való transzkripció megakadályozásával, Hasonlóképpen, a gátlást megkaphatjuk úgy is, ha „tripla hélix* bázispárosodási módszert használunk. A tripla hélix párosodás a dupla hélíxnek azt a képességét használja ki, hogy eléggé kinyílik ahhoz, hogy a polimerázok, transzkripciós faktorok, vagy szabályozó molekulák hozzákötődjenek. A triplex DNS-t használó legfrissebb terápiás előrelépéseket Gee és munkatársai foglalták össze (Gee, J.E. és mtsai: Jn: Hnber and Cár:

sz

X X ΦΦ ΦΦ ·* * « φ Φ β ♦ Φ * **

ΦΧΧ *Φ « # Φ Φ « 9 * « »»φφ φ» ΦΦ ** **

Molecular and Immunoiogíc Approaches, Futura P Kíseo, N.Y, (1994)1.

A ribozimek enzimes .hatású RNS molekulák, amik dizálni az RNS specifikus hasítását (4,987,071 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; WO 93/23057). A ribozim működési mechanizmusa magában foglalja a ribozim molekula szekvencia-specifikus híbridizálódását a megcélzott komplementéi' RNS-hez, ezt követi az hasítás, A jelen találmány tárgyé kalapácsfej motívumű ribozim molekulák képezik, amik specifikusan képesek hatni, és hatékonyan katalizálják az RGl-et kó~

RNS-hen a specifikus ribozim hasítási helyeket kiindulásként úgy azonosítjuk, hogy a eélmolekulát letapogatjuk a ribozim hasítási helyeket keresve, amik közé az alábbi szekvenciák tartoznak: GUA, GUU és GÓC. Ha egyszer már azonosítottuk, a megcélzott génnek a hasítási helyet tartalmazó régiójának megfelelő 15-20

donságait, amik az oligonukleotídot meglelem célpontokat úgy is Kiértékelhetjük, ha vizsgáljuk azt a képességét, hogy a komplementer oligonukleotidokhoz hibridizálódik, ribomukleáz protekciós esszék használatával [írie és mtsai: Advance Pharmaeol. 40, 2007-257 (1997)).

A jelen találmány szerinti antiszensz molekulákat és rihozimeket bármelyik... a szakterületen az RNS szintézisére ismertetett módszerrel előállíthatjuk, Ezek tartoznak az oligonukφ φ φ ♦ * φ φ» ♦ φ φφ φ »« « φ φ φ φ * « φ * φφ φφ *

X Φ V χ» » X « leotídok kémiai szintetizálására szolgáló technikák, azaz például lazisu kémiai szintézis.

másik szerint az RNS molekulákat előállíthatjuk az RGl-et kódoló DNS szekvenciák ín vitro vagy ín vívó transzkripciójával. Az ilyen DNS szekvenciákat számos különböző vektorba építhetjük be, megfelelő RNS polimeráz promoterekkel, azaz például T7 vagy SF6 promoterrel. Egy másik változat szerint az antiszensz RNS-t konstitutive vagy índukálhatóan szintetizáló antiszensz cDNS konstrukciókat juttathatunk he sejtvonalakba, sejtekbe vagy szövetekbe.

Az RNS molekulákat módosíthatjuk, hogy növeljük az intercelluláris stabilitásukat és felezési idejüket, A lehetséges módosítások közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a határoló szekvenciák hozzáadása a molekulák 5' és/vagy 3' végéhez, vagy íoszforotioátot vagy 2'0-metilt használva a foszfodíészteráz kötések helyett a molekula gerincében. A megnőtt stabilitást ügy is elérhetjük, ha nem-hagyományos bázisokat, azaz például inozint és queosint, valamint az adenin, citídin, guaníntimín és uridin acetil-, metil-, tio- és hasonlóképpen módosított formáit építjük be, amiket az endogén endonukleázok nehezen ismernek fel.

Az antiszensz vektoroknak a sejtekbe vag> hejuttatására szolgáló módszerek közé tartoznak az előzőkben ismertetett módszerek, amik egyformán alkalmasak in vivő, in vitro és ex vivő terápiára is. Az- ex vívó terápiához az antiszensz vektorokat a betegből vett sejtekbe juttatjuk be, majd klonálísan

ΦΧ *Φ 88 8* * φ »8 φ φ φ * φ ♦ φ φφφ φ* * * * X 8 φ * X βφφ« 88 «Φ ΦΦ 8φ szaporítjuk, hogy autolög módon visszaültessük ugyanabba a betegbe, amint azt az 5,399,493 és 5,437,994 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetik, amely publikációkat a fövi lekcióval, kezelünk. A transzei £ vagy más vagy nemAz RG 1 -hez kötődő ágensek azonosítására szc azok az esszék és módszerek is, amiket az RG 1-hez kötődő ágensek azonosítására lehet használni. Specifikusan, az RG 1-hez kötődő ágensek az RG 1 ligandum vagy más ágens azon tulajdonsága alapján azonosíthatok, hogy kötődnek az RG 1-hez és/vagy képesek gátolni szerint az egy el esszével azonosíthatjuk. Az élesztő két-hihrid rendszerben egy fúziós fehérjét kódoló expressziős egységet készítünk egy két alegységes transzkripciós faktor egyik alegységéből és az RG 1 polipeptidhöl, majd egy élesztösejtbe juttatjuk be majd expresszáltatjuk, A sejtet tovább módosítjuk, úgy', hogy 1) tartalmazzon egy expressziós egységet, ami egy kimutatható markert kódol, aminek az expressziőjához szükség, van a két alegység transzkripciós faktorra és 2) egy expressziós egység, ami egy olyan fúziós fehérjét kódol, ami a transzkripciós faktor második alegységét és egy klónozott DNS szegmens! tartalmaz. Ha a DNS klónozott ♦♦

ΦΦ »♦· ΦΦ ΦΧ φ φ φ φ * φ φ φ φφ* *»φ φφ φ φ 4» » Φ Φ « X

ΦΦΧΦ ΦΦ W φφ Φφ» szegmense olyan fehérjét ködei, ami kötődik az RG1 tídhez, az expresszié az RG1 és a kódolt fehérje közötti kölcsönhatást eredményezi. Ez a transzkripciós faktor két alegyí kötési közelségbe hozza, ami lehetővé teszi a transz;

tor helyreaiktasat. Ez a ményezL Az élesztő két hibrid rendszer különösen jól használható egy olyan cDNS könyvtár szűrővizsgálatára, ami az RG.1 celluláris kötési partnereinek szegmenseit kódolja,

A fenti esszékben használható RG1 polipeptidek közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, egy izolált :id, az RG1 polipeptid egy fragmense, egy sejt, amit úgy v<

s. meg, hogy egy vágj? egy sejt frakciója, amit ügy változtattunk meg, hogy egy RG1 pölípeptidet expresszáljon. Emellett az RG1 polipeptid lehet a teljes polipeptid, vagy az RG1 polipeptid egy meghatározott fragmense. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy mindaddig, amíg az RG1 polipeptidnek vizsgálható az ágenshez való kötődése, például a molekulasúly vagy az aktivitás eltolódásával, a jelen találmány szerinti esszé használható.

Az a módszer, amivel azt lehet meghatározni ágens/celluláris komponens kötődik-e egy RG1 po ígesen a használt RG1 polipeptid természetén alapul.. Pél egy egy gál-refardáeiős esszét használhatunk annak meghatározására, hogy egy ágens kötődik-e az RG 1-hez vagy annak egy iragmenséhez. Egy másik változat szerint immundetektálási és kúp tecm t az

ΧΦ *«

Φ Φ * Χ· * ΧΦ* φ Φ

ΧΦΦΦ «β használathoz. A jártas szakember könnyen alkalmáz számos, a. szakterületen ismert technikát annak rozására, hogy egy bizonyos ágens kótödik-e egy RGI tidhez.

Az ágensek és celluiáris komponensek tovább vizsgálhatók, hogy képesek-e modulálni egy RG1 polipeptid aktivitását, sejtmentes esszé rendszert vagy cellulárís esszé rendszert használva. Amint az RGI polipeptid aktivitásai egyre meghatározottabbak lesznek, az azonosított aktivitások alapján funkcionális esszék

Amint azt az alábbiakban használjuk, egy ágensről akkor mondjuk, hogy az RGI aktivitását antagonízálja, ha az ágens csökkenti az RGI aktivitását. Az előnyben részesített antagonista szelektíve gátolja az RGl-et, és nem érint semmilyen más fehérjét. Emellett az előnyben, részesített antagonista több mint 50%·· kai csökkenti az RGI aktivitását, előnyösen több mint 9ö%~kal, legelőnyösebben eliminalja az RG 1 teljes aktivitását.

A fenti módszerben vizsgálható ágensek véletlenszerűen választhatók ki, vagy tervezhetők. Amint azt a továbbiakban használjuk, egy ágensről akkor mondjuk, hogy véletlenszerűen van kiválasztva, ha az ágenst véletlenszerűen választjuk ki, anélkül hogy figyelembe vennénk az RGI polipeptid specifikus szekvenciáit. A véletlenszerűen szelektált ágensek egyik példája egy kémiai könyvtár vágy peptid kombin.atoriális könyvtár, vagy egy szervezet táptalaja vagy növényi kivonat használata.

«9 9φ ΦΦ Φ* * * Φ φ Φ Φ Φ 99*

Φ *χφ *99 *Φ Φ

Φ 9 X Φ φ Φ *

ΦΧ9Φ ΦΦ φφ ΦΦ ΦΦΦ akkor

Amint azt a tóvá mondjuk., hogy ésszerűen választottuk ki, vagy az ágenst nem véletlenszerűen választjuk ki, figyelembe veve a. megcélzott hely szekvenciáját és/vagy konformációját az ágens hatásával kapcsolatban. Az ágensek ésszerűen választhatók ki vagy ésszerűen tervezhetők meg, ha olyan pepíid-szekveneíákat használunk, amik az RG1 polipeptíd részét képezik. Egy ésszerűen kiválasztott peptid ágens lehet például egy olyan pepiid, aminek az aminosav szekvenciája azonos egy R<

egy fragmen sével.

szerinti vizsga ellenanyagok, oligonukleotidok, kismolekulák és vitamin-származékok, valamint szénhidrátok. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a jelen találmány szerinti szűrővizsgálati módszerben használt ágensek szerkezetére nézve nincsenek korlátok, A jelen találmány szerinti ágensek egyik osztálya a peptid ágensek, amiknek az aminosav szekvenciáját ügy választjuk meg, hogy figyelembe vesszük az RG 1 polipeptíd aminosav

fázisú (vagy zisü) peptid-szintézis módszerekkel állíthatjuk elő, amint az a szakterületen ismert. Emellett, az ezeket a peptídeket kódoló DNS-t kereskedelmi forgalomban levő oligonukleotid-szmtézis berendezésekkel is megszintefizálhatjuk, és előállíthatjuk rekombináns módszerekkel, standard rekombináns előállítási módszerek alkalmazásával. A szilárd fázisú peptid-szintézissel való elóállí*

Φ* φφ φ*

X Φ φ Φ Φ * φφφ φφφ φ' Φ X «ΦΧΦ ΧΦ ΦΦ

ΦΦ *

Φ· tásra akkor van szükség, ha genetikailag nem. kódolt aminosavakat akarunk bevinni.

A jelen találmány szerinti ágensek egy másik osztálya olyan ellenanyagok, amik ímmunológiailag reagálnak az RG1 polipeptid kritikus pozícióival· Amint azt az előzőkben ismertettük, az ellenanyagokat megfelelő emlős alanyok olyan peptídekkel való immunizálásával kapjuk meg, amik antigén régiókként az RG1 polípeptidnek azokat a részeit tartalmazzák, amiket az ellenanyagokkal meg akarunk célozni. Ezek az ágensek kompetitív kötési vizsgálatokban használhatók, amikkel második generációs gátló ágenseket lehet azonosítani, valamint blokkolni lehet az RG1 aktivitását.

A jelen találmány szerinti módszerekben vizsgált celluláris kivonatok lehetnek például sejtek vagy szövetek vizes kivonatai,, sejtek vagy szövetek szerves kivonatai, vagy részlegesen tisztított celluláris frakciók. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a. jelen találmány szerinti szűrővizsgálati módszerekben használt celluláris kivonatok forrása nincs korlátozva.

Az RG1 polipeptidhez kötődő ágensek, azaz például egy RG1 ellenanyag, arra használhatók, hogy befolyásoljuk az RG1 aktivitását, hogy rákellenes ágenseket a megfelelő emlős sejtekhez irányítsunk, vagy hogy azonosítsunk olyan ágenseket, amik blokkolják az RGl-gyel való kölcsönhatást. Az RGi-et expresszálő sejtek irányíthatók vagy azonosíthatók egy RG 1-hez kötődő ágenssel.

,χ ♦ « *«« φ

Χ»Φ

Ο Ο.

Αχ, hogy az RGl-hez kötődő ágenseket miként használjuk, az függ az RG 1-hez kötődő ágensek természetétől. Példánl az RG 1-hez kötődő ágens az alábbiakra használható; konjugált toxinok, azaz például dlftéria toxinnak, kolera toxinnak, ricínnek vagy Rseudomorcos exotoxinnak egy RGl-et expresszáló sejtben való bejuttatására; az RG1 aktivitásának befolyásolására; egy RGl-et expresszáló sejt közvetlen pusztítására; vagy a kompetitív kötő ágensek azonosítására használt szűrővizsgálatokban. Az RGl-et gátlő ágens például használható arra is, hogy közvetlenül gátoljuk az RGl-et expresszáló sejtek szaporodását, míg egy RG 1-hez kötődő ágens diagnosztikai ágensként használható.

Gyógyászati készítmények és beadás

A. jelen találmány tárgyát képezik továbbá olyan gyógyászati készítmények, amik tartalmazhatnak rgrl polinukleotidokat, RG1 vagy inhibitorokat, önmagukban vagy legalább egy másik ágenssel, azaz· például stabilizáló vegyülettel kombinálva, amit bármilyen steril, biökompatibilis hordozóban, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, sóoldatban, puffereit sőoldatban, glükózban és vízben beadhatunk. Ezek közül a molekulák közül bármelyik, beadható egv betegnek önmagában, vagy más gyógyszerekkel, azaz például gyógyszer hatóanyagokkal vagy hormonokkal kombinálva, gyógyászati készítményekben, amikben töltőanyagokkal vagy gyógyászatilag elfogadható hordozókkal van f φ φ φ

9· ΦΦ*

Φ * ήφ*» ΦΦ

kombinálva.. A jelen találmány egyik megvalósítási módja szerint a gyógyászatilag elfogadható hordozó gyógyászatílag inért.

A jelen találmány tárgyát képezi továbbá a gyógyászati készítmények beadása. Az ilyen beadás lehet orális vagy parenteralis. A parenterálís beadási módszerek közé tartozik az intraarteríális (közvetlenül a tumorba), az intramuszknláris, a szubkután, az íntramedulláris, az intratekálís, íntraventrikulárís, az intravénás, az intraperiíoneális, vagy intranazális beadási mód. Az aktív adalékanyagok mellett ezek a gyógyászati készítmények tartalmazhatnak megfelelő, gyógyászatílag elfogadható hordozókat, amik töltőanyagokat és kiegészítő anyagokat tartalmazhatnak, amik megkönnyítik az aktív adalékanyagok gyógyászatílag használható készítményekké való feldolgozását. A kiszerelés és beadás technikáinak további részletei megtalálhatók az Remíngton’s Pharmaceutlcal Sciences (Mack Publishing Co., Basám, Pa) legújabb kiadásában.

Orális beadáshoz a .gyógyászati készítményeket a szakterületen jól ismert., gyógyászatílag elfogadható hordozókkal szerelhetjük ki, az orális beadáshoz alkalmas dózisokban. Ezek a hordozók lehetővé teszik, hogy a gyógyászati készítmények tabletták, pirulák, drazsék, kapszulák, folyadékok, gélek, szirupok, iszapok, szuszpenziók és hasonlók formájában legyenek kiszerelve, hogy a beteg le tudja nyelni.

as kaphatjuk meg, valamint a keverék őrlésével, a granulátum keaktív adalékanyagok szilárd töltőanyagokkal való kombinálásával

Vi

Φφ ΦΧ φ* « Φ * X Φ ♦ » χ ΦΦΦ ΦΦΧ ♦* φ «ΦΦΧ Φ ««ΦΧ XX XX ΧΦ φφφ verek feldolgozásával, megfelelő segédanyag hozzáadása után, ha szükséges, hogy tablettákat és drazsé-magokat kapjunk. A megfelelő töltőanyagok közé tartoznak a szénhidrát vagy fehérje töltőanyagok, azaz például a cukrok, beleértve a laktózt, a szacharózt, a mannitot vagy szorfoitot; a keményítő kukoricából, búzából, burgonyából vagy más növényekből; a cellulóz,, például a metílcellulöz, a hídrozipropil-metílcellulóz, vagy a karboximetílcellulóz nátriumsö; és a mézgáfc, azaz például az gumíarábikum és a tragacantmézga; és a fehérjék, azaz például a zselatin és a

algínsavat, vagy ezek sóját, azaz nátrium-algirxátot,

A drazsé-magokat megfelelő bevonattal látjuk el, azaz például tömény cukoroldatokkal, amik tartalmazhatnak gumíarábíkumot, talkumot, polivínil-pirrolidont, carbopol gélt, polietilénglikolt és/vagy titándíoxidot, lakkoldatokat és megfelelő szerves oldószereket vagy oldőszer-elegyeket. Festékek vagy pigmentek is adhatók a tablettákhoz vagy a drazsé-bevonatokhoz, amik segítik a termék azonosítását, vagy az aktív adalékanyag mennyiségének jellemzését, azaz a dózist.

Az orálisan használható gyógyászati készítményekközé tartoznak a készített zselatinból bevonattal, azaz például glicerinnel vagy' szorbítfal készített lágy, lezárt kapszulák. A push-fit kapszulák tartalmazhatnak aktív adalékanyagokat, egy töltőanyaggal vagy kötőanyag92

Φ φ X Φ φ X Φ φ φ φ X φ Φ * ΧΦ

X ΦΦ* φφφ ΦΦ X « Φ φ Φ 4 ♦ « »»*:« 44 ΦΦ X* »♦* gal, azaz például laktőzzal vagy keményítővel, kenőanyaggal, azaz például talkummal vagy magnédüm-sztearáttal, és adott tv stábílízálöszerekkel keverve. A lágy az aktív adalékanyagokat megfelelő folyadékokban, azaz

ιvagv a

A parenterális beadáshoz a gyógyászati készítmények az aktív adalékanyagok vizes oldatai. Az injekcíőzáshoz a jelen találmány szerinti gyógyászati készítményeket vizes oldatokban, előnyösen fiziológiásán kompatibilis pufferekben, azaz például

Hank oldatban, Ringer oldatban, vagy elfog

sóoldatban szerelhetjük ki, A vizes injekciós szuszpenziók mazhatnak olyan anyagokat, amik megnövelik a szuszpenzíő viszkozitását, azaz például karboximetileelluióz nátríumsót, szorhitot vagy dextránt. Emellett, az aktív adalékanyagok szuszinjekciós szuszpenzíő

1. A megfelelő Üpofil oldószerek vagy tartoznak a zsírolajok, azaz például a szezámolaj, vagy a szintetikus zsírsavészterek, azaz például az etii-oleát vagy a triglieerídek, vagy liposzómák. Adott esetben, a szuszpenzíő tartalmazhat megfelelő stabilizálószereket vagy ágenseket, amik megnövelik a veε oldhatóságát, ami lehetővé teszí erősen koncentrált oldatok készítését,

A topikális vagy nazális beadáshoz a készítményben penetránsokat használunk, amik megfelelnek annak a korlátnak.

amin át kell hatolni. Az ilyen

ΦΦ »« ΦΦ

ΦΦΦ * Φ Φ «φφ ΦΦΦ ΧΦ φ 9 « φ Φ

ΦΦ Λ*

ΦΦ *

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a gyógyászati csomagok, kittek, amik egy vagy több tartály tartalmaznak, a jelen találmány szerinti, előzőkben említett kés kanyagal közül eggyel vagy többel töltve. tszeknez a csatolva lehet leírás, a .gyógyszer vagy biológiai termék gyártását, vagy eladását szabályozó kormányhivatal által előírt formában, ami tükrözi, hogy a hivatal hozzájárul a termék emberek számára való gyártásához» használatához vagy eladásához.

Gyártás és tárolás

A jelen találmány szerinti gyógyászati készítményeket a szakterületen ismert módon gyárthatjuk, azaz például hagyományos keveréssel, oldással, granulálással, drazsé-készítéssel, porlasztással, emulgeálással, kapszulázással, bezárási vagy lioSjuk, amiket különböző· savakkal készíthetünk el, azaz például sósavval, kénsavval» eeetsawal, tej savval, borkősavval» almasavval. borostyánkősavval, stb. A. sók általában jobban oldódnak vizes vagy más protonos oldószerben, mint a megfelelő szabad bázis formák. Más esetekben az előnyben részesített készítmény lehet líofílezelt por 1 mmol/1 - SÖ mmol/1 hisztidin, ö,l%-2% sza94 ♦ * 00 0» 4 φ φ Φ X 0 » « 00 φ 00 Φ «*0 *0 *

0 Φ Κ Φ 0 *

0« 0« 00 ** *00 eharőz, 2-7% mannit összetételű oldatban {pH^4,5~5,5), amit a felhasználás előtt pufférrel kombinálunk.

Miután a megfelelő hordozóban kiszerelt, jelen h szerinti vegyületet tartalmazó gyógyászati készítménj lítottuk, ezeket egy megfelelő hordozóban helyezhetjük el, majd egy jelzett állapot kezeléséhez megjelölhetjük. Az RG1 beadásához egy ilyen jelölésnek tartalmaznia, kell a. beadás mennyiségét, gyakoriságát és módját.

Terápiásán hatásos dózis

A jelen találmányban, szati készítmények közé tartoznak azok a készítmények, amikben az aktív adalékanyagok ahhoz elegendő mennyiségben találka-

azaz például egy adott kóros állapot kezelését, aro.it az RG1 expresszió jellemez, A. hatékony dózis meghatározása bőven a szakterületen jártas szakember ismereteihez tartozik.

Bármelyik vegyüiet esetében a terápiásán hatásos dózist először sejttenyészetben becsülhetjük meg, azaz például neoplasztikus sejtekben, vagy állatmodellekben, általában egerekben, nyálakban, kutyákban vagy sertésekben. Az állatmoarra is használjuk, hogy megbecsüljük a kívánt koncentráció-tartományt és a beadás módját. Ezt az információt azután arra na?

zist és a beadás módját.

«φ 9* φφ φΧ φ φ Φ Φ * * « £ « ΦΦΧ «X» ΦΦ * φ » Φ β ® « X

ΦΦΦ* ΦΦ Φφ X* Φ*

A terápiásán hatékony dózis kifejezés a fehérje vagy ellenanyagai, antagonistáí vagy inhibitor olyan mennyiségére vonatkozik, ami enyhíti a tüneteket vagy az állapotot. Az ilyen vegyületek terápiás hatékonyságát és toxieítását s meg vagy állatokban, azaz az EDso (az a dózis, ami terápiásán hatékony a populáció 50%-ábanl és az LD50 (a populáció 50%-ában letáiis dózis) meghatározásával. A terápiás és dózisarány a terápiás index, amit az LDso/EDso aránnyal lehet kifejezni.. Azokat a gyógyászati készítményeket részesítjük előnyben, araiknak nagy a terápiás idexük. A sejttenyészet vizsgálatokból és állatkísérletekből kapott adatokat használjuk a humán gyuletek dózisa előnyösen a keringési koncentráció azon tartományában van, amiben benne van az ED50, toxidtás nélkül, vagy minimális toxicítással, A dózis ebben a tartományban változik, a használt dózisformátőb a beteg érzékenységétől és a

A pontos dózist az egyes kezelőorvos választja ki, a kezelendő beteg figyelembe vételével A dózist és a beadást ügy állítjuk be, hogy az aktív adalékanyagból megfelelő szintet biztosítsunk. vagy a kívánt, hatást fenntartsuk, A további amiket figyelembe lehet venni, a következők lehetnek: a. kóros állapot súlyossága, azaz például a tumor mérete és elhelyezkedése; a beteg életkora, testsúlya és nem; a táplálkozás, a beadás időpontja és gyakorisága, győgyszer-kömbínáeió(k}, reakeio-érzé«φ φφ s» η φ * φ φ φ φφφ « φ^φ φφφ φφ

Jt * $ Φ Φ Φ _Λ ΦΦ*Φ φφ *χ ΦΦ Φ ?? V

Φ φφφφ kenységek és a terápiával szemben mutatott tolerancía/reakció. A hosszan ható gyógyászati készítményeket 3-4 naponként, hetente, vagy kéthetente lehet beadni, az adott készítmény felezési idejétől és kiürülésí sel

A normál dózis nagysága 0,1-100,000 mikrogramm v, egészen grammos ossznagyságára es a vo~ natkoző útmutatás megtalálható a szakirodalomban (4,657,760; 5,206,344 vagy 5,225,212 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás). A szakterületen, jártas szakemberek a poli-

A jelen találmányt a továbbiakban az alábbi példákkal is ismertetjük. A példákat csak. azért adjuk meg, hogy a specifikus megvalósítási módokra való hivatkozást illusztráljuk. Ezek a példák, miközben a jelen találmány bizonyos specifikus megvalósítási módjait illusztrálják, nem jelentik a találmány oltalmi

Minden példát standard kísérleti körülmények között hajtunk végre, amik a szakterületen jártas szakember számára jól ismertek, kivéve, ahol az eltérést részletesen ismertetjük. A következő példák rutinszerű molekuláris biológiai technikáit a standard laboratóriuxn kézikönyvekben ismertetett módon, hajtjuk végre [Sambrook és mtsai: Molecular Cloning: A La.bora.tory * *

Φ9 φ* *9 «Φ Φ

9 Φ Φ Φ Φ * *Φ $ ΦΦ® Φβ *

Φ « 9 « 4 « κ »** $* ΦΦ <* *ΦΦ

Manual; 2 Harbor, NA

Cold Spring Harbor Press, Cold

1. Példa

Az rpl -et olyan génként azonosítottuk, ami expresszálódík, az Incyte LifeSeq adatbázis átvizsgálásával. A nukleotid szekvenciát az adatbázis annotációé kutatásával azonosítottuk, a „Protein Functíon” eszköz használatával, amit az Incyte biztosít az adatbázis kutatásához. A nukleotid szekvenciát az annotált adatbázis sejttapadási molekulák kategóriájában találtuk meg, és az f-spondin homológjaként írták le. Az rgl poii·· nukleotid szekvenciáknak az adatbázisban levő könyvtár-készletben való eloszlásának elektronikus Northern biot elemzéséből kiderült, hogy az rgl magas szinten expresszáiodik a prosztata könyvtárakban, és alacsonyabb szinten expresszálódik számos más szövet könyvi.árában, beleértve a normális és tumorszövetekhől származókat ís

Az rgl klánok sorozatának egybefüggő polmukleotid szekvenciává való összeállítása, és az egybefüggő szekvencia editálása után teljes hosszúságú kódoló szekvenciát azonosítottunk a kikövetkeztetett, összeállított polmukleotidban. Ez a szekvencia olyan fehérjét kódol, ami az f-spondínnal és a .MÍndin-2-vel mutat homológíát.

Az Incyte 1640796-os, 1712252-es és 1880265-ös az (ncvte-tól kaptuk a kísérleti, munkához, és a 2360733-

*

Λ «

ΦΦ

Φ

Φ

ΦΦ»

ΦΦ

Φ Φ ΦΦ

Φ Φ «« * Φ

ΦΦ« ΦΦΦ Φ Φ J

ΦΦ ΦΦ

ΦΦ ΦΦ ΦΦ φ Φ Φ «

Φ «$Φ« ügy azonosítottuk, mint ami a legtöbb 5' nukleotid szekvenciát tartalmazza. Ezt a kiónt teljes hosszában szekvenáltuk, és kiderült, hogy a kikövetkeztetett RG1 fehérje teljes kódoló székvencíáját tartalmazza. Ezt a szekvenciát az 1. ábrán mutatjuk be (1, számú szekvencia).

Az rgl mRNS különböző, normál és tumor szövetekből, valamint sejt von alakból származó mintákban. való expressziöja szemi-kvantitatív polímeráz láncreakcióval határoztuk meg, egy Taqman esszé (Perkín Elmer) használatával. A prosztata normális, jóindulatú és tumorszövet mintáit, amiket egy módosított Gleason osztályozási rendszer szerint osztályoztunk, a Stanford

Ezekből az RNS-t standard módszerekkel b

A más 'tumorés normál szövetekből származó RNS-t kereskedelmi forgalomban szereztük be, a Clonetech és Bíochain cégektől. A prosztata tumorsejtvonalakat (PC-3, LNCaP és DE 145) az American Type Culture Collection-től szereztük be, majd standard módszerekkel tenyészetben szaporítottuk, szórumtartábnű táptalajt használva. Az ezekből a sej tvon alakból származó xenograft tumorokat pucér egerekben tenyésztettük, majd a beültetés után 4-6 héttel kinyertük, az egerekből. A tumorokból az RNS-t standard. eljárásokkal izoláljuk.

ít *

S3

A Taqman alapú polimeráz láncreakció elemzést az alábbi prím erekkel hajtjuk végre: CGC GCA TAG GTC CGA CTA C (3. számú szekvencia) és GCC GCG TCC GCA. AAG (4. számú szekvencia) , valamint a Taqman próbával 6-FAM-AGG AAG AAC CAG TAG GTC AGT AAC GGG CTG-Tamra (5. számú szekvencia).

Ezeket a prímeteket és próbákat a Perkin Elmer Primer Expressz szoftverrel terveztük, és a Synthetic Genetics szintetizálta meg. A polimeráz láncreakciókat 30-40 ciklusban hajtottuk végre, majd mennyiségét prosztata RNS használatával határoztuk meg, hogy az összehasonlításhoz standard görbét generáljunk. Ez az elemzés azt demonstrálta, hogy az rgl mENS-t legnagyobb mennyiségben a prosztatában lehet kimutatni, számos más szövetben szintié szignifikánsan alacsonyabb {lásd

5, ábra).

Az RG1 klónozása és expresszálása BHK sejtekben

Az RG1 kódoló régiót az Incyte 3360733 plazmidból nyertük ki. a kódoló szekvenciát polimeráz láncreakcióval ampliíxkáltuk, az SST115 (5'-TCCCTCTAGAGCCACCATGGAAAACCCCAGCCCGGC-3'j (6. számú szekvencia) és az SST113 {S'-AAGGCATCACGTGTTAGACGCA.GTTATCAGGGACG-3') (7. számú szekvencia) primerekkel, standard polimeráz láncreakcióban {.WÖ pl), WPfu Turbo polimeráz puffer (Stratagene, La Jolla, CA)/2C)0 pmol/l dNTP/Ö,2 pmol/l olígonukleoiíd primer/2,5 E Pfu Turbo polimeráz (Stratagene) összetételű oldatban. A polimeráz láncreakció

100 φ φ *

Φ8* *** *

8 Φ * amplifikálásí körülményei a következők voltak: 3 perc 95 ^CC (15 másodpere 95 °C₅ 30 másodperc 60 ^CC, 2 perc 72 ^öC)x35, 72 °C 7 perc, A kapott, polimeráz láncreakcióval ampliSkált terméket egy QIAquíok oszlopon (QLAGEN, Valencia. CA) tisztítottuk, majd Xbal és PnxiI restrikciós enzimekkel emésztettük, így kaptunk egy 1010 bázispár méretű fragmenst, amit 1% agaróz gélből tisztítottunk egy BIO löl GeneClean Kittel (Vísta, CA), A tisztított fragmenst az Epicentre Fást Link Kittel (Epicenter, Madison, WI) ligetijük a nem-citopatikus, Xbal és Pmil restrikciós enzimekkel emésztett pSINrep2I Sindbis expressziós vektorba [Agapov és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, VSA 95, 12989-12994 (1998)], majd DH5 alfa mompetens sejtekbe transzformáljuk (Life Technologies, Gaithersburg, CA), majd LB agariemezeken ampicillinnel. szelektáljuk, és szekvenciaelemzéssel kimutatjuk, hogy tartalmazza a beépített RG1 kódoló szekvenciát. Ennek a plazmídnak a jelölése pPBGö.

Két míkrogramm pPEGS plazmidot használunk 1-3^.10⁵ béhihórcsög vesesejtek (BHK sejtek) transzfektálására, Lipofectamine Plus reagens (Life Technologies, Gaithersburg, MD) használatával, a gyártó utasításai szerint. A transzfekció után a sejteket 24-48 óra hosszat DMEM plusz magzati vérszérum összetételű oldatban inkubáljuk, ekkor a sejteket 1:10 arányban kettéosztjuk, és a plazmidot tartalmazó sejtek szelekcióját 2,5 pg/m.l végkonceulrácíójú puromycin és szérumot tartalmazó DMEM hozzáadásával iniciáljük. Miután a sejtek összenőttek, (4-5 nappal a puromycin hozzáadása után) a «« ♦* «» χ χ Φ * * χ φφΧ ΧΦΦ _χ X X «♦** ΦΦ ** <ΦΦ ΧΦ sejteket foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk, 1:10 arányban megosztjuk, és szérumot valamint 5 pg/nil puromycint tartalmazó DMEM táptalajt adunk hozzá. További 2-3 nap elteltével a táptalajt szérumot nem, de 5 pg/ml puromycint tartalmazó DMEMmel helyette sípúk, 2-3 napig szaporítjuk, majd az RG1 fehérje jelenlétét a táptalaj Western biot elemzéssel mutatjuk ki, RG1 ellenanyagok használatával. Az RGl-et 1 gg/ml szinten mutattuk ki.

4. Példa

Nyúl poüklonális antiszérumot készítettünk öt szintetikus polipeptid szekvenciával szemben, amik az RG1 polipeptid szekvenciából származnak. Ezeket a szekvenciákat, azon az alapon szelektáltuk, hogy milyen kikövetkeztetett pozíciójuk van a fehérje felszínén, azzal a céllal, hogy olyan antiszérumot generáljunk, amik nagyobb valószínűséggé! ismerik fel a sejtfelszíni epitopokat. A císztein csoportokat amin ovaj savval (Abu) helyettesítettük a szintézis elősegítésére. A specifikus aminosav szekvenciákat, pozíciókat az RG1 fehérjén., és az öt peptid jelölését soroljuk fel az alábbiakban.

Jelölés

C

Pozíció Aminosav szekvenciák

28-46 PLGGESÍCSAGAPARYSIT (8, számú szekven2C cia)

48-64 TFTGKWSQTAFFKQYFLFR (9. számú szekven3C

77-91

188*4 ♦♦ *♦ ♦ ♦ * ί

XX XX

5C

263274

HSSDYSMWRKNQWS (10. számú

BAGT.DSGFTFSSPNFAT1PQDTV (11, számú szekvencia)

NEIVDSASVPET (12, számú szekvencia) ddeket kovalens kötéssel a fúrócsiga hemocianínhoz (KLH) kapcsoljuk, egy további C-terminális ciszteinen keresztül, i, egy szarvasimmunogénként

s az anmarhs. szérum-albumin (1 liszérum lásí immunizálásokat Freund féle komplex adjuvánsban hajtottuk végre (0,5 mennyiségű erősítő inj beadott Freund féle í véreztetéseket vége, gátum elleni ellenanyag

háromhetente 0/25 mg/állat adtunk be, intramuszkulárisan adjuvánsban. Periodikus teszta specifikus BSA-peptid konjut ELISA-val mérjük, és az ím, Az IC és 3C elleni antiszérumok bizonyultak aktívnak, A 2C peptid elleni antiszérumok nem ismerték fel az RGI elleni antiszérumokat nem vizsgáltuk,

Az RGI elleni humán monoklonális ellenanyagokat úgy generáltuk, hogy transzgenikus egereket tídek ellen, valamint egy 6 hisztidínnei i<

Á 4C és 5C

RGI fúziós fehérje ♦ Φ **

Φ « ««· ίο:

ellen, amit Eschenckia cofí-ban expresszáltunk. Ezeknek az állatoknak a szplenocitáit mielóma sejtekkel fúzíonáltatfuk, ezzel hibridőma sejteket állítva elő·. A kapott hibridőmákat ELISA-val vizsgáljuk át olyanokat keresve, amik az RG1 peptidek és fehérje elleni, ellenanyagokat termelnek.

5. Példa

Az ellenanyagok Western biot elemzése

Az antiszérumok RG1 specifitásái Western blattal vizsgáltuk. Az RG1-specifikus antíszérumakat (az előzőkben említett IC és 3C szekvenciák ellen készítetteket) vizsgáljuk CO sejtekben tranziensen expresszált RGl-en, LNCaP sejtekből szekretált természetes RG1 fehérjén, és transzfektált bébihorcsőg vesesejtekben (BHK) előállított RGI fehérjén. Az RG1-specifikus antíszérumokat tovább vizsgáltuk az alábbiakból készített lizátumokon; LNCaP tumorok, LNCaP sejtek, PC3 tumorok, FC3 sejtek és számos, humán prosztatarákokból származó klinikai mintákon. A sejteket és a szöveteket, detergens pufferben lizáltatjuk. Ötperces forralás után az egyes iizátumokből 10 μί-t egy 12%-os SDS-poliakrílamíd gélre viszünk, hogy a fehérjéket szétválasszuk. A szétválasztott fehérjéket nitrocellulőz membránokra visszük át. Az RGI ellenanyagok kötési speeifitását úgy ellenőrizzük, hogy homológ és heterológ peptidek jelenlétében végzünk kötési vizsgalatot. Az RGI-specifikus antiszérumokkal a fehérjét az összes mintában kí lehetett mutatni, kivéve a PC-3 sejteket és a PC-3 tumorokat.

♦ * *♦« φφφ

104 >>

6. Példa.

LNCaP sejtekből szekretált természetes RGI fehérje tisztítása.

A tenyészetben szaporított LNCaP sejtekről Western blottal kimutattuk,hogy természetes RGI fehérjét szekretálnak. Ahhoz, hogy a természetes fehérjét megtisztítsuk, a sejteket 48 óra hosszat olyan, táptalajban szaporítottuk, amiben nem volt szérum, Ezt a szérummentes kondicionált táptalajt összegyűjtjük, centrifugáljuk, hogy minden sejtet eltávolítsunk belőle, majd ultraszűréssel körülbelül 5öx~esre koncentráljuk. A koncentrált táptalajt azután ΙΟχ-esre hígítjuk 20 mmol/l nátrium-acetát pufferrel (pH~ó,S), majd egy G-Sepharose anioncserélő oszlopra visszük. Az oszlopot nátrium-klorid gradienssel (0,5% per perc) eluáljuk, miközben 2,0 ml-es frakciókat szedünk. Az RGI fehérje körülbelül 75 mmol/l nátrium-klorídnál eluálődík, Western biot és SDS poliakrilamíd gélelektroforézis alapján. A természetes RGI fehérje valamivel kisebb molekulasúlynál fut mint a baktériumokban expresszált 6 hísztidint tartalmazó RGI-fúziós fehérje, valószínűleg azért, mert hiányzik belőle a fúziós peptid.

Az RGI expresszió immunhisztokémiai festése

Az RGI fehérje expresszíóját a LífeSpan Bioscíences, Inc, határozta meg számos különböző szövetben, beleértve a vesét, a tüdőt, a hasnyálmirigyet, az izmokat, az agyat és a prosztatát.

További prosztata szöveteket a Stanford University School of fc

105 «* «« «« * Φ * X ΦΦΦ * *fcfc Φ«φ φφ

X Φ fc φ X * «φφ φφ ·9 9 ΦΦ Φ « ΦΦ-ΦΦ

Medicine Urology Department-tői kaptunk,, és a Berlex-nél vizsgáltattuk. A szövet-metszeteket standard eljárásokkal paraffinmentesítjük. Az RG1-3C poüklonális ellenanyagot használjuk primer ellenanyagként, és a kimutatási rendszer a Vector ABC-AP kitből (AR5ÖO2) és egy Vector vürüs szubsztrát kiéből (Sk5002) áll. Negatív kontrollként a festést primer ellenanyag távollétében hajtjuk végre.

Minden, a fenti leírásban említett publikációt és szabadalmi bejelentést teljes egészében referenciának tekintünk. Bár a jelen találmányt a specifikus megvalósítási módjaira hivatkozva írtuk le, a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy különböző változások tehetők, és ekvivalensek helyettesíthetők be, anélkül hogy eltérnénk a találmány szellemétől és oltalmi körétől Emellett a j elen találmány céljában, szellemében, és oltalmi körében számos módosítás tehető egy bizonyos helyzethez, anyaghoz, összetételhez, eljáráshoz, eljárási lépéshez vagy lépésekhez való adaptálódás céljából. Az összes ilyen módosítást a mellékelt igénypontok oltalmi körébe tartozónak tekintünk.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a leírásban említett szekvenciákat.

SZEKVENCIA LISTA <110> Harkins, Ricbard Parké s, Deborah .Parry, Gordon Scbneíder, Douglas *· * * * « ** ΧΦ

Steinbrecher,

130> 51791AUSM1 <140>

<141>

<150> 60/172,370 <151> 1999-12-16 <160> 12 <170> Patentín Ver. 2..0 <210> 1 <211> 1785 <212> DNS <222> (296)..(1291) <400> 1 aqaaaqggqf gcggcaqqqc tgccagggga agagqqtgat cqgaaccqgg g>aa qqtcgat 60 gggcagggcg agttgggaa- gcggcagccc cogoegcccc cgcagcccct tctcctcctfc 120 >

ΧΦ ΦΦ ΦΦ Φ'Φ Φ ♦ 9 χ 9 » * Φ ΦΦ *Φ9 Φχ» ** » ·· '>.·> χ 9 Φ φ » Φ *

Λ <? I »*♦* φφ φ« φφ φφ» rctcocacgt eetatctgcc tcrcgctgga: ggccaggccg fcge.a-geateg aagacaggag 184 gaactggagc ctcattggce ggcccggggc gccggcctcg ggcttaaata -ggagctccgg 240 gcfcctggctg ggaccegacc gctgeeggec' gcgctccege tgetcctgcc gggtg atg 2.98

Mer

gaa

a síé

acc

acc

gcc

g ec

gcc

ctg

ggc

aag

gcc

ctc

tgc

get

ctc

34 fe

GI n

Asn

Pro

Ser 5

Pro

Alá

.Alá

Aia

Len 10

Gly

Lys

Alá

Len

Cys 15

.Ara

Len.

ctc

ctg

gcc

act

ctc

gcc

gcc

gcc

ggc

cag

cet

ett

vgg

33*

gag

t c o

334

Len

Le a

Alá 20

Thr

len

Gly

Aia

Aia 25

Gly

Gin

Pro

Len

Gly 30

Gly

Gin

Ser

atc

tgt

tce

gcc

gga

gcc

cég

gcc

aaa

tac

age

a te

acc

ttc

aeg

33C

442

Ite

Cys 35

Ser

Alá

Gly

Alá

Pro 4 0

Lis

Lvs:

Tyr

Ser

He 45

Thr

Pihe

Thr

Gly

aag

tgg

age

cag

aeg

gcc

ttc

ccc

aag

cag

t a c

ccc

ctg

t te

ege

ccc

430

Lys 50

Trp

Ser

Gin

Thr

Alá 55

Phe

Pro

Lys

Gin

Tyr 50

Pro

Len

Phe

Arg

Pro 65

cet

gcg

cag

tgg

tót

t cg

ctg

ctg

333

gcc

gcg

cet

age

tcc

O A C'

tac

538

Pro

Aia

Gin

Trp

Ser 7 0

Ser

Lee

Len

Gly

Ata 75

Alá

His

Ser

Ser

Asp 8 0

Tyr

age

atg

tgg

agg

aag

<á 3:C

cag

tae

gtc

ági.

aac

333

e t g

ege

gae

ttt

58 6

Ser

Met

Trp

Ar g SS

Lys

As.n

Gin

Tyr

Val 9 0

Ser

Asn

Gly

Len

Arg 35

.Asp

Phe

gcg

gag

ege

g gc

gag

gcc

tgg

gcg

ctg

atg

aag

gag

atc

ga g

g cg

gcg

639

Alá

Glu

Arg 100

cl y

Gin

.Ara

T rp

Ara 105

Len

Me 5

Lys

Gin

He 113

Gin.

Aia

Alá

ggg

gag

gcg

ctg

cag

age

gtg

CSC

gcg

gtg

itt

teg

gcg

ccc

gtc

682

G.ly

Gin 115

Alá

Len

Gin

Ser

Var 120

his

Aia

Val

Phe

Ser 125

Alá

Pro

Aia.

Val

ccc

age

gge

acc

333

cag

aeg

teg

gcg

gag

ctg

gag

gtg

cag

ege

*33

7 30

Pro 130

Ser

Gly

Thr

G1 y

Gin 135

Thr

Ser

Aia

Gin

Len 1.40

Gin

Val

Gin

Arg Arg 1.45

C3C

teg

Ctg

gtc

reg

ttt

gtc

gfcg

CíJC

atc

gtg

CCC:

age

ccc

gac

tgg

77 8

His

Per

Len

Val

Ser 150

Phe

Val

Val

Arg

La 155

Val

Pro

Ser

Pro

Asp ISO

Trp

tt e.

3' 3

33 c

ctg

gac

age

ctg

gae

ctg

tgc

gac

333'

gae

cgt

fcgg

egg

826

Phe

Val

Gly

Lal 165

Asp

Ser

tea

Asp

Le a 170

Gye

Asp

Gly

Asp

Arg 17 5

Trp

Arg

g a a

ea g

gcg

geg

ctg

gac

ctg

tac

ccc

tac

gac

vJóTO

ggg

aeg

g 3c

age

87 9

Gin

Gin

Aia ISO

Lis

tea

Asp

Le a

Tyr 155

Pro

Tyr

Asp

Aia

Gl y 105

Thr

Asp

Ser

φφ φφ φ φ φ « φ ».♦* φ φ *«ΦΦ 44

«* * * »*

Φ « Φ* χ-φ *

«ΦΦ

gye

t: t e

acc

tt c

tcc

tcc ccc

íí ciO

fctc

gcc

acc

atc

ccg

cag

gac

a cg

022

ΐ;·:V

Phe

Thr

Tas

Ser

Ser Pro

Asn

The

Aia

Túr

lle

Pro

Gin

Asp

Thr

195

200

?O5

gtg

acc

gvq

ata

acg

tcc tcc

tet

ccc:

agc

cac

ccg

gcc

λελΌ

t cc

ttc

Ρ7Ό

Va 1

Thr

21 u

1 le

Thr

Ser Ser

Ser

Pro

Ser

Pia

Pro

Alá

Asn

Ser

Phe

210

215

220

225

tac

tac

G 3- S

egg

ctg

aag gcc

ctg

cet

ccc

atc

gcc

agg

gtg

&C«3:

ctg

1018

Tyr

Tyr

Tro

Arg

Lee

Ly:s Alá

Leu

Pro

Pro

I ie

Alá

Arg

Vai

Thr

Leu

230

235

240

gtq

vgg

ctg

cga

cag

agc ccc

agg

ttc

atc

cet

CCC

gcc

CCS

ctc

1066

Vai

Arg

Leu

Arg

21 n

Ser Tro

Arg

Al a

Phe

lle

Pro

Pro

Alá

Tro

Vai

245

250

255

•reg

re

agc

agg

gac

aafc gag

Kitt

gta

ga c

agc

gcG

ΐ: c.a.

g t t

CCS

Cselei

1114

Len

Tro

Ser

Arg

Asp

Asn Glu

lle

Va 1

Asp

Ser

Al a

Ser

Vai

Pro

Giu

250

265

270

a cg

ccg

ctg

Cí £vü>

tgc

c? ci o 9 c £

tcc

ctg

tgg

teg

tcc

tgg

ggv

c t g

tgc

1162

Tar

Tro

Leu

Asp

Cys

Glu Vei

Ser

Leu

Trp

Ser

Ser

Trp

Gly

Len

Cys

2 75

230

255

gga

ggc

CüC

tg::

ggg

agg ctc

ggg

a>cc

a a g

agc

agg

dC ’.v

ege

tac

gtc

1210

oly

Giy

Ri s

Cys

Giy

Arg Leu

Giy

Túr

Lys

Ser

Arg

Thr

Arg

Tyr

Vai

'290·

295

300

305

egg

g fc c

cag

CCC

gcc

stSG SttíC

333

agc

ccc

tgc

CCC

gag

ctc

ga.a

gaa

1258

Arg

Vai

Gin

Pro

Alá

&sn Asn

Giy

Ser

Tro

Cys

Pro

Giu

Leu

GTu

Giu

310

315

320

gag

get

gag

tgc

gfcc

cet gat

esc

tgc

gtc

tea

gaceagagec ·

ccgcageeeeI31i

Glu

Als

GIu

Cys

Vai

Pro Asp

Asm

Cys

Vai

32.5

330

tggggccccc cggsgccatg gggtgtcggg ggctcctgtg caggctcatg ct.gcaggcggl.371 c cga g-gg esc tgcactgaag :· <1 ί.t. g C t taaagtcafc tccaggagat gacctggtgc agug<:gt ttc ggccctctgg ettaggggco •cccasggctc tgtccttcat Letaggotgfc:

gcgctcjctcc fcgaccgcggfc gaggccgcgc cgacc.atct.cl931 tggccggcac gggcattggg aaacagectc ctcctttcccl49^:l cccgtgtccc gtctgckctc agectookre fccctgcagga 1551 cagctactct aaattatgtc tcettataag ttattgctgclőll cgtccagggg cetggctece acgtggttgc agatacc.tea 1671 gctgagccca etctcecgsg ggcgcateca agcgggggccI731 act í gagaag tgaataaatg gggcggttt-c ggaagcgfc ea asaaaaaaaa aaaa

1785 <21Q> 2 <211> 331 <212> FEHÉRJE

<213> Homo sapiens <400>2

Met I

e.;.u

Asn Pro Ser 5

Pro Alá Alá

Alá Leu Gly 10

Lys

Alá

Leu

Cys 15

Alá

í.eu

Lee

Leu

Ara

Thr

Leó

Gly

.Al a.

Alá

Gly

O :. n

Pro

Leu

Gly

Gly

Glu

20

25

30

Ser

He

Cys

Ser

Alá

Gly

Ara

Pro

Ara

Lys

Tyr'

Se r

He

Thr

Phe

Thr

35

40

4 5

Gly

Lys

Trp

Ser

Gin

Tfer

Alá

Phe

Pro

Lys

Gin

Tyr

Pro

Leu

Phe

Arg

50

55

SÖ

Pro

Pro

Alá

G lo

Trp

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Alá

Alá

Η1 s

Ser

Ser

Asp

65

70

75

•80

Tyr

Sor

Met

Trp

Ar g

Lys

As-n

Gin

Tyr

Val

Ser

Asn

Gly

.Leu

Arg

Asp

SS

30

35

Phe

A.la

GLu

Arg

G i y

Glu

Alá

Trp

Alá

Lsu

Met

Lys

Glu

de

Glu

Alá

100

105

110

Aló

Gly

G-rU

Alá

Len

Gin

Ser

Val

Pia

A La

Val

Phe

Ser

Alá

Pro

•Ai.S;

115

•20

125

Va 1

Pro

Ser

Gly

Thr

Gly

dn.

Thr

Ser

Alá

GI u

Leó

Glu

Val

Gin

Arg

IL·?

135

14 0

Arg

Hls

Ser

Let

Val

Ser

Phe

Val

Val

Arg

de

Val

Pro

Ser

Pro

Asp

145

150

155

160

Trp

Phe

Val

Gly

Val

Asp

Ser

Leu

Asp

Leu

Cys

Asp

Gly

Asp

Arg

Trp

105

170

175

Arg

G la-

Gin

Alá

Alá

Leu

Asp

Len

Tyr

Pro

Tyr

Asp

Alá

Gly

Thr

Asp

ISO

185

133

Ser

dy

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Pro

Asn

Phe

Ara

Thr

He

Pro

Gin

Asp

195

20ö:

205

Thr

Val

Thr

Gin

de

Thr

Ser'

Ser

Ser'

Pro

Ser'

Pls

Pro

Alá

Asn

Ser

210

215

220

Phe

Tyr

Tyr

Pro

Arg

Leu

Lys

Alá

Leu

Pro

Pro

de

Alá

Arg

Val

Thr

225

230

2 35

24 0

Leó

Vei

Ar -g

Lee

Arg

Gin

Ser

Pro

Arg

Alá

Phe

Ile

Pro

Pro

Alá

Pro

24 5

250

255

Val

Lee

Pro

S e r

Ara

Asp

Aon

Glu

1.1 e

Val

Anp

Ser

Alá

Ser

Val

Pro

2 00

2 05

270

G1 n

Thr

Pro

Leó

Asp

Cys

Glu

Val

Se r

Leu

Trp

Ser

Ser

Trp

Gly

Leó

27S

283

285

Cys

G1 y

G-.Ly

Pia

Cys

Gly

Arg

Len

Gly

Thr

Lys

Ser

Arg

Thr

Arg

Tyr

Φ ♦:

» S * ΦΦΧΦ Φ 9 X

230 235 300

Oá.;. Arc; Oiíl G1íí 2í:g á.Ls Asrs. Asn G;.y yer Pro Cys Pío Glu Lso Glu

30S 310 315 320

Giu Glo Aj í: Gj.il Cys i 2ro A.sp Asn Gys 3:1.1

325 330 φ»

ΦΦ

9«φ <210>3 <211> 19 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <223> A mesterséges szekvencia leírása: primer <400> 3 cgcgcatagc tccgaetac 19 < 210 > 4 <211> 15 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <223> A mesterséges szekvencia leírása: primer <4OÖ> 4 gccgegtecg caaag 15 >

φφ φφ φφ φ* » * Φ Φ χ φ Φ χ φφ* *».φ ΦΦ

Φ * Φ * Φ Φ «Φ»Φ ΦΦ φφ ^* »ÍJf <210> 5 <21 1> 30 <21Ζ> DNS <2Ϊ3> Mesterséges Szekvencia <220>

<223^> A mesterséges szekvencia leírása: próba <40Ö>5 aggaagaacc agtacgteag taaegggetg

-5Λ <210>6 <211> 36 <212> DNS <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása; primer <4öO>6 tccctetaga gccaccatgg aaaaccccag cccggc 36 c210>7 χχ χχ χχ χχ * χ χ χ ·Χ· * χ 9 ** « XX* XXX χχ ·*

-f _Λ ,-x * X X » * χ * j £ XX X * XX XX XX XX* <211> 35 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <22Ö>

<223> A mesterséges szekvencia leírása; primer <400>7 aaggcatcac gtgttagacg cagttatcag ggacg 35 <210>8 <211> 19 <212> FEHÉRJE <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400>8

Pro Len. Gly Gly Glu Ser Ke Cys Ser Alá Glv Alá Pro Alá Lys Tyr 1 5 10 15

Ser lle Thr <210> 9 <211> 19 <212> FEHÉRJE

X» ψφ φφ ** « φφφχ φ * ** χ ΦΦβ *ΦΦ ΦΦ * φ φ φ χ Φ Φ X «««rx ΦΦ ΦΦ X* *** <213> Mesterséges Szekvencia <223> A mesterséges szekvencia leírása:

<400> 9

Thr Phe Thr :i ,ys Trp Ser Gin Thr Alá Phe Pro Lys Gin Tyr Pro 5 10 15 <211> 15 <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400> 10

His Ser Ser Asp Tyr Ser Met Trp Árg Lys Asn Gin. Tyr Val Ser 1 5 10 15 <210> 11 <211> 23 <212> FEHÉRJE <213> Mesterséges Szekvencia

11,4

*.* X»

JÍ Φ φ Φ φ Φ * φφ φ ΦΦ* ♦ X Φ Φ* φ

Φ * φ * Φ * 4.

ν««« φφ Φ* *·*· ** <220>

<223> A mesterséges szekvencia. leírása:

<400> 11

Asp Alá Gly Thr Ásp Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Pro Asn Phe Alá. 1 5 10 15

Thr He Pro Gly Asp Thr Val >12 <211> 12 <212> FEHÉRJE <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223>,A mesterséges szekvencia leírása: peptid <400> 12

Asn Glu He Val Asp Ser Alá Ser Val Pro Glu Thr

Claims (35)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Izolált ellenanyag vagy ellenanyag. íragmens, ami specifikusan kötődik egy polipeptídhez, melynek aminosav szekvenciája ugyanaz, mint a 2. ábra szerinti RGI polipeptídek (2. számú szekvencia) aminosav szekvenciájának része de nem egésze, vagy variánsai vagy származékai, ahol az izolált ellenanyag vagy ellenanyag íragmens specifikusan kötődik valamely alábbiak közöl kiválasztott csoport tagjaihoz;

   a) polipeptid, ami a 2, számú aminosav szekvencia. 28-46-os aminosavait tartalmazza; és

   b) polipeptid, ami a 2. számú aminosav szekvencia 188-210-es aminosavait tartalmazza.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti ellenanyag, amiben az ellenanyag specifikusan kötődik a PLGGESÍCSAGAFÁKY’SIT szekvenciához (8. számú szekvencia),
3. 3. Az 'L igénypont szerinti ellenanyag, amiben az ellenanyag specifikusan kötődik a DAGTDSGFTFSSPNPATIPQDTV szekvenciához (II, számú szekvencia).
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag, amiben az ellenanyag poliklonálís ellenanyag.
5. 5. Az 1-3, igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag, amiben az ellenanyag monoklonálís ellenanyag,
6. 6. Immunkonjugátum., ami tartalmaz egy 1. igénypont szerinti izolált, ellenanyagot, vagy ellenanyag fragmenst, egy terápiás ágenshez konjugálva,
7. 7. A 6. igénypont szerinti immunkonjugátum, amiben a terápiás ágens egy citotoxíkus ágens,
8. 8. A 7. igénypont szerinti immunkonjugátum, amiben a citotoxíkus ágenst az alábbi csoportból választjuk ki: ricin, doxoruί bicín, daunorubicín, taxol, etidíumbromid, mítomicin, eíoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicine, di'hídroxi-antracindion, aktinomicin D, diftéria toxín, Pseudöznonas exotoxín (PE) A, PE40, aferín, glükokortikoid, valamint radioaktív izotópok.
9. 9. A 6. igénypont szerinti ímmunkonjugátum, amiben az. ellenanyag fragmenst az alábbi csoportból választjuk ki: Fv, F(ab*) és F(ab'b
10. 10. Egy terápiás szert és egy izolált ellenanyagot vagy ellenanyag, fragmenst, ami specifikusan kötődik egy pnlipeptidbez, melynek aminosav szekvenciája ugyanaz, mint a 2. ábra szerinti RGI polípeptidek (2. számú szekvencia) aminosav szekvenciájának része de nem egésze, vagy variánsait vagy származékait, tartalmazó konjugá tűm, ahol az b kötői

    4V ak-.

    vagy ellenanyag fragmens közül kiválasztott csoport tagjaihoz:

    a) a 2. számú aminosav szekvencia 28-46-os aminosavai;

    b) a 2. számú aminosav szekvencia 77-91-es aminosavai;

    c) a 2, számú aminosav szekvencia 188-2 l ö-es aminosavai;

    d) a 2. számú aminosav szekvencia 263-274-es aminosavai;

    alkalmazása az RGI polipeptidet (2. számú szekvencia) expresszáló sejt szelektív roncsolására alkalmas készítmény előállítására, az immunkonjugátumnak a sejtfel a sejttel történő reagáltatásávai, oly módon, hogy az ímmunkonjugátum terápiás ágense el tudja pusztítani a sejtet.
11. 11. Egy terápiás szert és egy izolált ellenanyagot vagy ellenanyag fragmenst. ami specifikusan kötődik egy polípeptidbez, melynek aminosav szekvenciája ugyanaz, mint a 2. ábra szerinti RGI polípeptidek (2. számú szekvencia)· aminosav szekvenciájának része de nem egésze, vagy variánsait vagy származékait tartalmazó konjugátum, ahol az izolált ellenanyag vagy ellenanyag fragmens * tf

    117 specifikusán kötődik valamely alábbiak közül kiválasztott csoport φ ΧΦΦ «ΦΦΦ φφφ * » » ΦΦ Φ χ X ♦ φ ♦ φ * χ «Α Α«« φφ ΦΦΦ

    a)

    b)

    c) a 2, számú aminosav szekvencia 28-46-os aminosavai; a 2, számú aminosav szekvencia 77-91-es aminosavai; a 2. -számú aminosav szekvencia 188-210-es aminosavai; a 2. számú aminosav szekvencia 263-274-es aminosavai;

    alkalmazása humán betegben az RG1 expressziójával összefüggő betegségi állapot kezelésére alkalmas készítmény előállítására,
12. 12. Áz 1. igénypont szerinti ellenanyag, amiben az ellenanyag specifikusan kötődik a PLGGESICSAGAPAKYSIT szekvenciái számú szekvencia.).
13. 13. Az 1. igénypont szerinti ellenanyag. amiben az ellenanyag specifikusan kötődik a H8SDYSMWRKNQYVS szekvenciához (10. számú szekvencia).
14. 14. Az 1. igénypont szerinti ellenanyag, amiben az ellenanyag specifikusan kötődik a DÁGTDSGFTFSSPNFATIFQDTV szekvenciához (11. számú szekvencia).
15. 15. Az 1. igénypont szerinti ellenanyag, amiben az ellenanyag specifikusan kötődik a NEIYDSASVPET szekvenciához (12. számú.

    szekvencia),
16. 16. Diagnosztikai eljárás, melynek során egy gazdaszervezetből származó mintát elemzőnk, hogy tartalmaz-e egy polipeptidet, ami az alábbi csoportba tartozik;

    a) polipeptíd, ami a 2. számú szekvencia 28-46-os aminosavait

    b) polipeptíd, ami a 2. számú szekvencia 188-210-es aminosavait tartalmazza;

    ahol az elemzés azt jelenti, hogy a mintát az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyaggal vagy ellenanyag-fragmenssel hozzuk ί

    * * * 9 9 9*4 944 4 Φ» * Κ 9 9 ♦ ♦ 9 Α <

    > 9 9 9 y 9

    4 4 4 9« 44 «44 érintkezésbe, ami specifikusan kötődik a. polípeptidhez, és kimutatj az ellenanyagnak a mintában levő polípeptidhez való kötődését.
17. 17, Egy ellenanyag vagy ellenanyag fragmens, ami specifikusan kötődik egy polípeptidhez, melynek aminosav szekvenciája ugyanaz, mint a 2, számú szekvencia szerinti RGI pokpeptidek aminosav szekvenciájának része de nem egésze, vagy variánsai vagy származékai, ahol az izolált ellenanyag vagy ellenanyag fragmens specifikusan kötődik valamely alábbiak közül kiválasztott csoport tagjaihoz:

    a) a 2, számú aminosav szekvencia 28-46-os aminosavai;

    b) a 2, számú aminosav szekvencia 77-9 í-es aminosavai;

    c) a 2, számú aminosav szekvencia 188-210-es aminosavai;

    d) a 2, számú aminosav szekvencia 263-274-es aminosavai;

    alkalmazása a 2, számú szekvencia szerinti polipeptiddel Összefüggő áttételnek betegen történő diagnosztizálására, alkalmas készítmény előállítására.
18. 18. Egy ellenanyag vagy ellenanyag fragmens, ami specifikusan kötődik egy polipeptídhez, melynek, aminosav szekvenciája ugyanaz, mint a 2. számú, szekvencia szerinti RGI poiípeptídek aminosav venciájának része de nem egésze, vagy variánsai vagy az íz rag vagy et ifag '-eaí at

    a) a b) a c) a d) a kaimé .zása

    specifikusan kötődik valamely alábbiak közül kiválasztott csoport oz.

    a 2, számú aminosav szekvencia 28-46-os aminosavai; a 2, számú aminosav szekvencia 77-91-es aminosavai; a 2. számú aminosav szekvencia 188-2úö-es aminosavai; a 2. számú aminosav szekvencia 263-274-es aminosavai.;

    betegen történő ssztatarák diagnosztizálására alkalmas készítmény előállítására.

    119 * »*♦ Φ * φ φ X * Φ ** ««« φφ ΦΦΦ
19. 19. Α 17. vagy 18. igénypont szerinti, alkalmazás, amiben az ellenanyag specifikusan kötődik a PLGGESICSAGAPAKY8IT szekvenciához (8. számú szekvencia).
20. 20. A 17. vagy 18. igénypont szerinti alkalmazás, amiben az ellenanyag specifikusan kötődik a HS8DYSMWRKRQYVS szekvenciához (10. számú szekvencia).
21. 21. A 17. vagy 18. igénypont szerinti alkalmazás, amiben az ellenanyag specifikusan kötődik a DAGTDSGFTFSSPNFATIPQ.DTV szekvenciához (11, számú szekvencia).
22. 22. A 17, vagy 18. igénypont szerinti alkalmazás, amiben az ellenanyag specifikusan kötődik a NEIVDSASV.PET szekvenciához (12, számú szekvencia).
23. 23. A 17-22. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény leképezési eljárásra szolgál,
24. 24. A 17-22, igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény Te-99m~mel konjugált anti-RGl ellenanyaggal vagy ln-1 Irigyel konjugált anti-RGl ellenanyaggal végzett immunoszeintigráfiás
25. 25. A 17-24, igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az ellenanyag jelezve van, oly módon, hogy közvetlenül vagy közvetve égy kimutatható jelet generál egy vegyülettel, amit az alábbi csoportból választhatunk ki: radioaktív izotóp, enzim, kromoför vagy fluoreszkáló anyag.
26. 26. A 17-25, igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az ellenanyag egy kimutatható jellel van jelezve, vagy egy második molekulához konjugált, a második molekulának egy RG1 pozitív sejthez történő irányítására.
27. 27. A 26, igénypont szerinti alkalmazás, ahol a cítotoxikus szer riem, doxoruhicin, daunorubícin, Taxol™ (paclitaxel), etídinm-bromid, mitomicín. etoposíd, tenoposid, vinkrisztín, vinblasztin, colchieín, «

    «X $

    -f ’Ο Λ ri·. >»*♦ φφφ φ **«♦ φ* * Φ φ Φ Λ

    X ΦΦΦ φ Φ * Φ Φ Φ > Λ

    ΦΦ φφφ φφ φφφ díhídroxi-antracín-díon, aktinomícin D, diftéria toxín, Pseudomonas exotoxin :(PE) A, FE4G., rícin, abrin és glükokcrtikoid közül választott.
28. 28. A 26. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a kimutatható jel antimon-124, antimon-125, arzén.-74, bárium--103, bárium-140, berillíum-7, bizmut-j206, feizmut-207, kadmium-109, kadmium-115m, kaIcíum-45, cérium-139, céríum-114, eérium-144, cézium-137, krómSÍ, kobalt-56, kobalt-57, kobalt-58, kobalt-öö, kohalt-64, erhÍurn-169, európium-152, gadolinium-153, arany-195, arany-199, hafnium -175, hafnium-181, indium-11, jód-123, jód-131, írídium-192, vas-55, vas59, kripton-85, ólom-210, mangán-54, higany-197, higany-203, molibdén-99, neoáimium-147, neptunium-237, nikkel-63, niohium-95, ozmium-185+191, palládium-103, platina-195m, praesodymium-1.43, promécíum-147, protaktininm-233, rádium-2226, réníum-186, rubidium-86, ruténium-103, ruténium-106, szkandíum-44. szkandium-46, szelén-75, ezüst-1 löm, ezüst-11, nátrium-22, stro.ncium-85, strondum-89, stroncium-90, kén-35, tantál-82, tec.hnécíum-99m_J tellur-125, tellur-132, thallium-170, thalUum-204, törium-223, törium-232, ón-113, titán-44, wolfram-185. vanádium-48, vanádium-49, itterhium-169, ittrium-88, íttrium-9Ö, íttrium-91, cink65 és cirkónium-95.
29. 29. Izolált ellenanyag vagy ellenanyag fragmens, ami specifikusan kötődik egy RG1 polipeptídhez, melynek aminosav szekvenciája 2. számú szekvencia, ahol az ellenanyag vagy ellenanyag specifikusan kötődik valamely alábbiak közül kiválasztott a 2, számú ammosav szekvencia 23-46~os ammosavar a 2, számú ammosav szekvencia 77-91-es amixiosavaí;

    a 2, számú aminosav szekvencia 188-210~es aminosavaí;

    a 2:< számú aminosav szekvencia 263-274~es aminosavaí;

    gyógyszerként történő alkalmazásra * * •k **Φ ΧΦΦΦ ΦΦ*Χ * φ φ

    ΧΦΦ φφ
30. 30. Izolált ellenanyag vagy ellenanyag fragmens, ami specifikusan ik. a 2. ábra szerinti 2. számú aminosav szekvencia 28-46-os aminosavaihoz, gyógyszerként történő alkalmazásra.
31. 31. Ellenanyag a 29. vagy 30. igénypont szerinti alkalmazásra, ahol az ellenanyag poüklonális vagy monoklonálís ellenanyag.
32. 32. Immunkonjugátum, ami egy izolált ellenanyagot vagy ellenanyag fragmenst, ami specifikusan kötődik egy RGI polipeptídhez, melynek aminosav szekvenciája 2. számú szekvencia, ahol az ellenanyag vagy ellenanyag fragmens specifikusan kötődik valamely alábbiak közül kiválasztott csoport tagjaihoz:

    a)

    b)

    c) a 2. számú aminosav szekvencia 28-4ó-os aminosavaí; a 2. számú aminosav szekvencia. 77-91-es aminosavaí.; a 2. számú aminosav szekvencia 138-210-es aminosavaí; a 2. számú aminosav szekvencia 263-274-es aminosavaí; egy terápiás szerhez konjugálva, gyógyszerként történő ira.
33. 33. Ellenanyag a 32. igénypont szerinti alkalmazáshoz, ahol a terápiás szer egy citotoxikus szer,
34. 34. Ellenanyag a 33. igénypont szerinti alkalmazáshoz, ahol a citotoxikus szer ricin, doxorubicin, daunorubiein, faxol, etidiumhromid, mítomicín, etoposíd, tenoposid, vinkrisztin, vinblasztin, cölchicin, dihidroxí-antracin-dion, aktinomicin D, díftéria toxín, Pseudomonas exotoxin (PE) A, ΡΕ40, ricin, abrin, glükokortikoid és radioizotópok közül választott,
35. 35. Ellenanyag a 29-34, igénypontok bármelyike szerinti alkalmazáshoz, ahol az ellenanyag. fragmens Fv, P(aö j és P(ab'}2 fragmensek közül választott.