PT988307E - Isolamento de acidos nucleicos em fase solida - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "ISOLAMENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS EM FASE SÓLIDA" A presente invenção refere-se ao isolamento de ácidos nucleicos e, especialmente, a um método para isolar ADN de células, que combina um passo de isolamento de células, em fase sólida e um passo de isolamento de ADN, em fase sólida. 0 isolamento de ácidos nucleicos é um passo importante em muitos processos bioquímicos e de diagnóstico. Por exemplo, a separação de ácidos nucleicos de misturas complexas, em que estes muitas vezes se encontram, é frequentemente necessária, antes que se possam realizar outros estudos e processos, e.g. detecção, clonagem, sequenciação, amplificação, hibrídação, síntese de ADN, etc; a presença de grandes quantidades de material contaminante, celular ou outro, e.g. proteínas ou hídratos de carbono, nestas misturas complexas, impede muitas vezes muitas das reacções e técnicas utilizadas em biologia molecular. Além disso, o ADN pode contaminar preparações de ARN e vice-versa. Assim, são necessários métodos para o isolamento de ácidos nucleicos de misturas complexas, tais como células, tecidos, etc, não só do ponto de vista preparativo, mas também nos muitos métodos em uso hoje em dia, que se baseiam na identificação de ADN ou ARN, e.g. diagnóstico de infecções microbianas, ciência forense, tipagem de sangue e tecidos, detecção de variações genéticas, etc. A utilização de identificação de ADN ou ARN é agora amplamente aceite como um meio para distinguir entre diferentes células, ou tipos de células, ou entre variantes do mesmo tipo de célula, contendo mutações de ADN. Assim, a tipagem IILA, que é maio usualmentc realizada por identificação 1

de antigénios de superfície característicos, utilizando anticorpos, pode alternativamente ser realizada por identificação do ADN que codifica para estes antigénios. Pode-se identificar uma infecção ou contaminação microbiana por análise de ácidos nucleicos para identificar o organismo alvo, em vez de se fazer a detecção baseada em particularidades que cdidcteiizeiu as células dos microorganlsmos, e.g. morfologia e bioquímica. Podem-se identificar variações genéticas por meios semelhantes.

Em geral, o ADN ou ARN é identificado por hibridação com um, ou mais oligonucleótidos, sob condições suficientemente rígidas para assegurar um nível baixo de ligação não específica. Vulgarmente, os nucleótidos hibridantes são utilizados em pares como iniciadores de síntese nas várias formas de amplificação in vitro agora disponíveis, essencialmente por reacção em cadeia com polimerase (PCR), mas também por reacção de amplificação com ligase (LAR), por replicação de sequência auto-sustentada (3SR) e pelo sistema de amplificação por replicase Q-beta. Após a amplificação, o ADN pode ainda ser caracterizado por sequenciação, e.g. pelo método de Sanger. A amplificação e sequenciação podem ser combinadas.

Como referido acima, todos os métodos requerem geralmente um passo inicial de isolamento de ADN, para separar o ácido nucleico de materiais, e.g. proteínas que podem interferir nas técnicas de hibridação e amplificação que estão a ser utilizadas. São conhecidos vários métodos para o isolamento de ácidos nucleicos mas, de um modo geral, estes baseiam-se numa série complexa de passos de extracção e lavagem e são demorados e trabalhosos.

Os métodos clássicos para o isolamento de ácidos nucleicos a partir de materiais de partida complexos, tais 2

como o sangue ou produtos sanguíneos, ou tecidos, envolve a lise do material biolóqico por um detergente ou agente caotrópico, possivelmente na presença de enzimas que degradam proteínas, seguido de várias extracções com solventes orgânicos, e.g. fenol e/ou clorofórmio, precipitação com etanol, centrifugação e diálise dos ácidos nucleicos. Não só e3tes métodos são trabalhosos e demorados, como também o número relativamente elevado de passos necessários, aumenta o risco de degradação, perda de amostra, ou contaminação cruzada de amostras, quando se processam em simultâneo várias amostras.

Melhorias nos métodos de isolamento de ácidos nucleicos estão portanto a ser continuamente procuradas, e mais recentemente, foram propostos outros métodos que se baseiam na utilização de uma fase sólida. Na US-A-5.234.809, por exemplo, descreve-se um método em que os ácidos nucleicos estão ligados a uma fase sólida na forma de partículas de sílica, na presença de um agente caotrópico, tal como um sal de guanidinio, e são assim separados do restante da amostra. A WO 91/12079 descreve um método em que o ácido nucleico é "agarrado" pela superfície de uma fase sólida, por precipitação. De um modo geral, utilizam-se os álcoois e sais como precipitantes. A WO-A-9207863 descreve métodos para o isolamento de ácidos nucleicos, que envolvem a) imobilizar as células numa matriz b) lisar as células c) fixar o ácido nucleico na superfície da matriz e d) eluir os ácidos nucleicos A "matriz" da WO-A-9207863 pode ser composta por um leito de partículas, grosseiramente agregadas, de modo a que os espaços entre elas tenham o tamanho adequado para "agarrar" as células. A superfície da matriz poderá possuir propriedades de troca iónica, o que permite uma ligação reversível dos ácidos 3

* (V U-

t nucleicos à superfície. Não é descrita nenhuma ligação das células à matriz.

Embora estes métodos acelerem o processo de separação de ácidos nucleicos, persiste uma necessidade de métodos que sejam rápidos e simples de realizar, que permitam bons rendimentos sem perdas e, em particular, que permitam facilmente isolar ácidos nucleicos de células, em misturas ou ambientes em que possam estar presentes em concentrações baixas, como um passo preparativo inicial, no isolamento de ácidos nucleicos a partir de células alvo, em processos de detecção de células baseados em ácidos nucleicos. A presente invenção responde a esta necessidade. Em particular, enquanto que as técnicas baseadas na hibridação, tal como a PCR e outros métodos baseados em ácidos nucleicos, para a detecção de microorganismos, permitem uma detecção de células em amostras com uma sensibilidade elevada, a preparação de células, i.e. a concentração de células alvo e purificação de ácidos nucleicos, são factores cruciais para se obter uma sensibilidade e reprodutibilidade elevadas no método. Actualmente, as células são usualmente, primeiro isoladas da amostra, por filtração, centrifugação, ou ligação por afinidade a anticorpos ligados a uma fase sólida. Após concentração das células deste modo, o ADN é então purificado a partir das células concentradas, muitas vezes por métodos de extracção com fenol/clorofórmio, convencionais, como discutido acima, com as sua desvantagens inerentes.

Os requerentes propõem uma nova aproximação a este problema, que integra o isolamento das células e a purificação de ácidos nucleicos num "passo" único, utilizando a mesma fase sólida para ambas, a absorção de células e purificação de ácidos nucleicos. isto é conseguido, ligando as células a um suporte sólido como primeiro passo. 0 mesmo suporte sólido é então utilizado sob condições que lisam as células ligadas e que permitem então que o ácido nucleico se ligue ao suporte. 4

Deste modo, o ácido nucleico pode ser isolado a partir de uma amostra, de um modo adequado para a amplificação, ου onf.ro processo a jusante, por um processo de execução simples e rápida, que pode demorar menos de 45 minutos.

Num aspecto, a presente invenção proporciona um método para o isolamento de ácidos nucleicos, a partir de uma amostra de células, que compreende: a) ligar as células na referida amostra a um suporte sólido, para isolar as células da amostra; b) lisar as células isoladas e c) ligar o ácido nucleico libertado das referidas células Usadas, ao mesmo suporte, referido. O ácido nucleico pode ser ADN, ARN ou qualquer modificação sua, natural ou sintética, e suas combinações. De preferência, contudo, o ácido nucleico será ADN, que pode ser de cadeia simples ou dupla, ou ter qualquer outra forma, e.g. linear ou circular. 0 termo "célula" é utilizado aqui incluindo células procarióticas (incluindo arqueobactérias) e eucarióticas e outras entidades viáveis, tais como vírus e micoplasmas e componentes sub-celulares, como organelos. As "células" representativas incluem assim, todos os tipos de células animais, de mamíferos e não mamíferos, células vegetais, protoplastos, bactérias, protozoários e virus. A amostra pode assim ser qualquer material que contém ácidos nucleicos nestas células, incluindo, por exemplo, alimentos e produtos semelhantes, amostras clínicas e ambientais. Assim, a amostra pode ser uma amostra biológica, que pode conter qualquer material virai ou celular, incluindo todas as células procarióticas ou eucarióticas, vírus, bacteriófagos, micoplasmas, protoplastos e organelos. Este material biológico pode assim compreender todos os tipos de células animais de mamífero e não mamífero, células vegetais. 5

algas, incluindo algas azuis-verdes, fungos, bactérias, protozoários, etc. Exemplos de amostras incluem assim, sangue total, e produtos derivados de sangue, tais como plasma ou "buffy coat", urina, fezes, fluido cerebroespinal ou qualquer outro fluido corporal, tecidos, culturas de células, suspensões de células, etc. e também amostras ambientais, tais como solo, água ou amostras alimentares. A amostra pode também incluir materiais de partida relativamente puros ou parcialmente purificados, tais como preparações semi-puras, obtidas por outros processos de separação de células. A ligação das células ao suporte sólido pode ser realizada de qualquer modo conhecido, ou conveniente. Por exemplo, a ligação não específica de células ao suporte, pode ser conseguida pela escolha adequada do suporte sólido e condições, e.g. A natureza química ou física da superfície do suporte sólido, (e.g. hidrofobicidade ou carga), o pH ou composição do meio de isolamento, etc. a natureza das células alvo pode também desempenhar um papel e verificou-se, por exemplo, que certas células hidrofóbicas se podem ligar facilmente, de forma não especifica, a superfícies hidrofóbicas, enquanto que células hidrofílicas se podem ligar a superfícies mais hidrofílicas. Também se tem verificado que as células carregadas negativamente, como os linfócitos-B, têm um grau elevado de ligação não específica, a superfícies fracamente carregadas positivamente. Assim, podem-se utilizar suportes sólidos com superfícies de carga adequada para a ligação de um tipo de célula desejado. Podem-se utilizar tampões adequados, etc. como meio, no passo de isolamento de células, para se obterem condições adequadas para a ligação de células, levando simplesmente ao contacto, o suporte sólido e a amostra num meio adequado. De forma conveniente, pode-se adicionar um tampão de carga, osmolaridade, etc., adequados, à amostra, antes, em simultâneo, ou depois do contacto com o suporte sólido. 6 κ

Com vantagem, pode-se conseguir uma ligação não |específica de células de acordo com a invenção, por precipitação das células no suporte, utilizando um precipitante, por exemplo, contactando as células com o suporte, na presença de álcool e sal, e.g., adicionando à amostra um tampão que contém álcool e sal. A utilização de plcool e sal nos processos de separação e purificaçSu é comum, qualquer álcool ou sal adequado, utilizado nestes processos, [pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. Assim, ie forma conveniente, o álcool pode ser qualquer alcanol e verificou-se que os alcanóis inferiores, tais como o .sopropanol e etanol são adequados. Outros álcoois adequados .ncluem metanol e n-butanol, 0 sal pode ser fornecido por qualquer fonte adequada, E.g. cloreto, ou acetato de sódio ou potássio, ou acetato de Imónio. As concentrações adequadas de álcool e sai podem ser seterminadas de acordo com o sistema e reagentes precisos, jtilizados. De um modo geral, verifica-se que é adequada a jdição de 0,5 a 3 volumes de álcool, e.g. 1 volume, à amostra. ||e forma conveniente, o álcool pode ser utilizado a Joncentrações de 50-100% (p/v). Verificou-se que a utilização

Eje concentrações de sal de e.g. 0,1 a 10,0 M, mais Sarticularmente de 0,1 a 7,0 M, e.g. 0,1 a 3,0 M é adequada, e Sonvenientemente, o sal pode ser incluído nas concentrações Hcima na solução de álcool. Assim, pode-se utilizar um Elesignado "tampão de ligação à célula", que contém o álcool e Q sal nas concentrações desejadas. Alternativamente, o sal e o Lcool podem ser adicionados separadamente. A utilização de álcool como precipitante para as células R& acordo com a invenção é vantajosa para utilização do método |i processos de diagnóstico clinico, uma vez que a utilização gÊ álcool para preservar amostras clínicas é comum. Assim, as Jiostras do paciente podem simplesmente ser adicionadas a um ãmpão de ligação de células contendo álcool, sendo as 7 ( L-c, ^ amostras conservadas e prontas para a purificação dos ácidos nucleicos.

Como alternativa à precipitação com sal/álcool, podem-se utilizar outros precipitantes, por exemplo polietilenoglicóis (PEGs), ou outros polímeros de peso molecular elevado com propriedades semelhantes, quer 3ozinhos, que: em combinação com sal e/ou álcool. A concentração destes polímeros pode variar, dependendo do sistema preciso, e.g. polímero e tipo de célula, mas podem-se utilizar geralmente concentrações de 1 a 50% (p/v), e.g. 2-30%.

As células com actividade fagocítica podem ser capturadas pela sua capacidade de se "ligar" ou "engolir" uma fase sólida de partículas, e.g. contas, podendo assim ser facilmente recolhidas. Neste caso, a amostra que contém as células apenas necessita de ser posta em contacto, ou ser incubada, com a fase sólida, sob condições adequadas. Este tipo de captura de células não depende de ligação específica. O suporte sólido pode também ser fornecido com porções que auxiliam à ligação não especifica de células, por exemplo proteínas ou fragmentos de proteína, ou polipéptidos que são ligados não especificamente pelas células. Assim, por exemplo, um suporte sólido revestido com, ou que transporta anticorpos, irá ligar-se a células de uma forma não específica, através de receptores Fc na superfície da célula. As técnicas para a imobilização de anticorpos e outras proteínas, ou polipéptidos, em superfícies sólidas, são bem conhecidas na arte.

Por fim, como referido acima, a ligação não específica de células a suportes sólidos com superfícies carregadas, hidrofóbicas, ou hidrofílicas, pode ser conseguida utilizando tampões, muitas vezes em combinação com sal, para se obterem condições de pH adequadas para a ligação. Os tampões e

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condições precisos irão variar, dependendo do tipo de célula, suporte sólido, etc.

Misturam-se os vários componentes e deixa-se simplesmente em repouso durante um intervalo de tempo adequado, para permitir que as célula se liguem ao suporte. O suporte pode então ser removido da solução por qualquer meio conveniente, que dependerá, obviamente, da natureza do suporte e inclui todas as formas de remoção do suporte para longe do sobrenadante da amostra, ou vice-versa, por exemplo centrifugação, decantação, pipetagem, etc.

As condições durante o processo não são criticas e verificou-se ser conveniente, por exemplo, misturar simplesmente a amostra com o "tampão de ligação a células", na presença de uma fase sólida e deixar em repouso à temperatura ambiente, e.g. de 5 a 30 minutos, e.g. 20 minutos antes da separação. Como referido acima, o tempo de reacção não é crítico e tão pouco como 5 minutos são suficientes. No entanto, se conveniente, podem-se utilizar períodos maiores, e.g. 20 minutos a 3 horas, ou mesmo durante a noite. A mistura pode ser realizada por qualquer meio conveniente, incluindo, por exemplo, agitação simples por mistura ou mistura no vortex. Também, se desejado, podem-se utilizar temperaturas mais elevadas, ou mais baixas, mas não é necessário.

Outros componentes opcionais na composição de "ligação à célula" incluem polímeros de peso molecular elevado, e.g. PEGs, etc., detergentes não carregados, fracos, e.g. Triton X-100, NP-40 etc, ADNases e outras enzimas, desde que estas deixem as células intactas.

As composições de "ligação a células" preferidas compreendem, por exemplo:

isopropanol, acetato de amónio 0,75 M etanol a 75%, acetato de amónio 0,75 M. 9

Embora seja preferida a ligação não específica de células, de acordo com a invenção, também é possível utilizar suportes sólidos que foram modificados, para permitir a captura selectiva das células desejadas contendo os ácidos nucleicos. Assim, por exemplo, podem-se utilizar suportes contendo anticorpos ou outras proteínas de ligação, e.g. lectinas, específicos para um tipo dc célula desejado. Isto poderá introduzir um grau de selectividade ao isolamento do ácido nucleico, uma vez que apenas o ácido nucleico de uma fonte alvo desejada, dentro da mistura complexa, pode ser separado. Assim, por exemplo, este suporte pode ser utilizado para separar e remover o tipo de células alvo desejadas, etc, da amostra. A preparação destas matrizes de captura de células, selectivas, é bem conhecida na arte e está descrita na literatura. 0 suporte sólido pode ser qualquer um dos suportes ou matrizes bem conhecidos, que são actualmente amplamente utilizados, ou propostos para a imobilização, separação etc. Estes podem tomar a forma de partículas, folhas, geles, filtros, membranas, fibras, capilares ou tiras de microtítulo, tubos, placas ou poços, etc.

De forma conveniente, o suporte pode ser feito de vidro, sílica, latex ou um material polimérico. Preferem-se materiais que apresentem uma área de superfície elevada para ligação a células e subsequentemente ao ácido nucleico. Estes suportes terão geralmente uma superfície irregular e podem ser, por exemplo, porosos ou na forma de partículas, e.g. partículas, fibras, poços, malhas, materiais sinterizados e crivos. 0 material na forma de partículas, e.g. contas, é geralmente preferido devido à sua maior capacidade de ligação, particularmente as contas poliméricas. 10 ('

De forma conveniente, urn suporte sólido na forma de partículas utilizado de acordo com a invenção, compreenderá contas esféricas. O tamanho das contas não é critico, mas poderão, por exemplo, ter um diâmetro na ordem de pelo menos 1 e de preferência na ordem de pelo menos 2 μπι e ter um diâmetro máximo preferencialmente não superior a 10 e mais preferencialmente não superior a 6 μπι. Por exemplo, verificou-se que contas com um diâmetro de 2,8 μπι e 4,5 μιη, funcionam bem.

As partículas monodispersas, isto é as que são substancialmente uniformes em tamanho (e.g. tamanho com um desvio padrão de diâmetro inferior a 5%) têm a vantagem de proporcionar uma reprodutibilidade da reacção muito uniforme. As partículas de polímero monodispersas, produzidas pela técnica descrita em US-A-4336173, são especialmente adequadas.

As contas poliméricas não magnéticas, adequadas para utilização no método da invenção, estão disponíveis da Dyno Particles AS (Lillestrom, Noruega), bem como da Qiagen, Pharmacia e Serotec.

No entanto, para auxiliar na manipulação e separação, preferem-se contas magnéticas. 0 termo "magnético", tal como aqui utilizado, significa que o suporte é capaz de ter um momento magnético induzido neste, quando colocado num campo magnético e é portanto deslocável sob a acção desse campo. Por outras palavras, um suporte que compreende partículas magnéticas pode ser facilmente removido por agregação magnética, o que proporciona um modo de separar as partículas rápido, simples e eficaz, após os passos de ligação das células e ácido nucleico e é um método muito menos exigente do que as Lécnicas tradicionais, como a centrifugação, que originam forças de traeção, que poderão romper as células ou degradar o ácido nucleico. 11 ίί

•t

Assim, utilizando o método da invenção, as partículas magnéticas com células ligadas podem ser removidas para uma superfície adequada, por aplicação de um campo magnético, e.g. utilizando um magnete permanente. É normalmente suficiente aplicar um magnete do lado do vaso que contém a mistura de amostra, para agregar as partículas à parede do vaso e remover, vazando, o restante da amostra, São especialmente preferidas, partículas supermagnéticas, por exemplo, as descritas por Sintef na EP-A-106873, como agregação magnética e o agrupamento das partículas durante a reacção pode ser evitado, assegurando assim uma uniformidade e a extracção de ácidos nucleicos. As partículas magnéticas bem conhecidas comercializadas pela Dynal As (Oslo, Noruega) como DYNABEADS, são particularmente adequadas para utilização na presente invenção.

As partículas revestidas funcionalizadas, para utilização na presente invenção, podem ser preparadas por modificação das contas, de acordo com as patentes US 4.336.173, 4.459.378 e 4.654.267. Assim, as contas ou outros suportes, podem ser preparados com diferentes tipos de superfícies funcionalizadas, por exemplo carregadas positiva ou negativamente, hidrofílicas ou hidrofóbicas.

Diferentes células exibem diferentes graus de ligação não específica a diferentes superfícies e suportes e poderá ser vantajoso "titular" a quantidade de suporte sólido (e.g. o número de partículas), por unidade de volume, de modo a optimizar as condições de ligação a células e determinar a área de suporte óptima, e.g. concentração de partículas para um dado sistema.

Após a ligação de células, as células isoladas ou ligadas ao suporte são lisadas para libertar o seu ácido nucleico. Os métodos de lise celular são bem conhecidos na arte e estão amplamente descritos na literatura, podendo-se utilizar 12

qualquer método conhecido. Outros métodos poderão ser adequados para diferentes células, mas qualquer dos métodos seguintes pode, por exemplo, ser utilizado: lise por detergente, utilizando, e.g. SDS, LiDS ou sarcosil, em tampões adequados; utilização de agentes caotrópicos, como o cloridrato de guanidínio (GHC1), tiocianato de guanidínio (GTC), iodeto de sódio (Nal), pcrclorato, etc; disrupçâo mecânica, tal como por uma prensa francesa, sonicação, moagem com contas de vidro, alumina ou em azoto líquido; lise enzimática, por exemplo utilizando lisozimas, proteinases, pronases ou celulases ou qualquer das outras enzimas de lise existentes no mercado; a lise de células por infecção por bacteriófagos ou vírus; secagem por congelação; choque osmótico; tratamento por micro-ondas; tratamento por temperatura, e.g. aquecendo ou fervendo, ou congelando, e.g. em gelo seco ou azoto líquido; e descongelamento, lise alcalina. Como mencionado acima, todos estes métodos são técnicas de lise convencionais e são bem conhecidos na arte e quaisquer destes métodos, ou combinação de métodos, pode ser utilizada.

De forma conveniente, a lise pode ser realizada de acordo com a presente invenção, utilizando agentes caotrópicos e/ou detergentes. Por exemplo, no caso de células bacterianas, verificou-se que a combinação de um agente caotrópico com um detergente é particularmente eficaz. Um exemplo de um agente de lise adequado inclui, assim, um agente caotrópico como o GTC ou GHC1 e um detergente como o SDS ou Sarcosil. Os agentes líticos podem ser fornecidos numa solução aquosa simples, ou podem ser incluídos numa solução tampão, para formar um designado "tampão de lise". Pode-se utilizar qualquer tampão adequado, incluindo por exemplo, Tris, Bicina, Tricina e fosfato. Alternativamente, os agentes líticos podem ser adicionados separadamente. As concentrações e quantidades adequadas de agentes líticos irão variar de acordo com o sistema preciso, natureza dos pedidos, etc., e podem ser adequadamente determinados, mas podem-se utilizar, por 13

exemplo, concentrações de 2M a 7 M de agente caotrópico, tal como GTC GHC1, Nal ou perclorato, agentes alcalinos 0,1 M a 1M, tais como NaOH e 0,1 a 50% (p/v) , e.g. 0,5 a 15% de detergente. Assim, um exemplo representativo de um tampão de lise adequado, inclui uma solução aquosa de GTC 4M, sarcosil a 1% (p/v).

Para realizar o método da invenção, as células isoladas, ligadas ao suporte, podem ser, de forma conveniente, removidas ou separadas do restante da amostra, concentrando e enriquecendo desse modo as células. Assim, o passo de ligação das células serve para enriquecer as células, ou para as concentrar num volume menor do que a amostra inicial. A lise pode então ser realizada, de forma conveniente, adicionando um tampão de lise adequado, contendo os agentes liticos desejados ou submetendo as células isoladas às condições de lise desejadas. Por exemplo, no caso da adição simples de tampão de lise contendo os agentes de lise adequados, pode-se simplesmente incubar as células isoladas na presença do tampão de lise, durante um intervalo de tempo adequado, para permitir que a lise ocorra. Diferentes condições de incubação poderão ser adequadas para diferentes sistemas de lise e estes são conhecidos na arte. Por exemplo, para um detergente e/ou agente caotrópico contendo tampão de lise, a incubação pode ser realizada à temperatura ambiente, ou a temperaturas superiores, e.g. 37°C ou 65°C. De igual modo, o tempo de incubação pode variar de uns poucos minutos, e.g. 5 ou 10 minutos, a horas, e.g. 1 a 2 horas. No caso dos tampões de lise GTC/sarcosil e células bacterianas, verificou-se ser adequada uma incubação a e.g. 65°C, durante 10-20 minutos, mas isto poderá, obviamente, variar de acordo com a necessidade. Para uma lise enzimática, e.g. utilizando proteinase K, etc, poderão ser necessários tempos de tratamento mais longos, e.g. durante a noite.

Após a lise, o ácido nucleico libertado é ligado pelo mesmo suporte a que as células lisadas estão ligadas. Esta 14

ligação do ácido nucleico pode ser realizada de qualquer forma conhecida na arte para ligar ácidos nucleicos a um suporte sólido. De forma conveniente, o ácido nucleico é ligado de forma não especifica ao suporte, i.e. independentemente da sequência. Assim, por exemplo, o ácido nucleico libertado pode ser precipitado no suporte utilizando qualquer dos precipitantes conhecidos para ácidoo nucleicos, e.g. álcoois, combinações álcool/sal, polietilenoglicóis (PEGs), etc. A precipitação de ácidos nucleicos em contas, deste modo, está descrita por exemplo em WO 91/12079. Assim, pode-se adicionar sal ao suporte e libertar o ácido nucleico para a solução, seguido de adição de álcool, o que irá fazer com que o ácido nucleico precipite. Alternativamente, o sal e o álcool podem ser adicionados em conjunto, ou o sal pode ser omitido. Como descrito acima em relação ao passo de ligação das células, pode-se utilizar qualquer álcool ou sal adequado e as quantidades ou concentrações adequadas podem ser determinadas facilmente. Técnicas de ligação de ácidos nucleicos, não especificas, alternativas, podem incluir a utilização de detergentes como descrito na WO 96/18731 da Dynal AS (o designado processo "DNA directo") e a utilização de agentes caotrópicos e uma fase sólida de ligação a ácidos nucleicos, tais como partículas de sílica, como descrito por Asko N.V. na EP-A-0389063. A ligação iónica do ácido nucleico ao suporte pode ser conseguida utilizando um suporte sólido com uma superfície carregada, por exemplo um suporte revestido com poliaminas. 0 suporte utilizado neste método da invenção pode também transportar grupos funcionais, que auxiliam na ligação específica, ou náo específica, dos ácidos nucleicos, por exemplo proteínas de ligação ao ADN, e.g. fechos de leucina ou histonas, ou corantes intercalares (e.g. brometo de etídio ou Hoechst 42945) que podem revestir o suporte. 15

Igualmente, o suporte pode ser provido de parceiros de ligação, para efectuar a captura selectiva de ácidos nucleicos. Por exemplo, podem-se utilizar sequências complementares de ADN ou ARN, ou proteínas de ligação ao ADN, ou proteínas virais que se ligam a ácido nucleico virai. A ligação destas proteínas ao suporte sólido pode ser conseguida Utilizando técnicas bem conhecidas na arte.

Um método conveniente para precipitar o ácido nucleico de acordo com a invenção é adicionar um precipitante, e.g. um álcool, à mistura que contém o suporte e as células lisadas. Assim, pode-se adicionar simplesmente um volume adequado de álcool, e.g. etanol a 100% ou 96% à mistura e incubar durante um período de tempo suficiente, para permitir que o ácido nucleico libertado se ligue ao suporte. As condições de incubação para este passo não são críticas e podem simplesmente compreender a incubação durante 5-10 minutos, à temperatura ambiente. No entanto, o período de tempo pode variar, e a temperatura pode ser aumentada, de acordo com o desejado.

Embora não seja necessário, pode ser conveniente introduzir um ou mais passos de lavagem no método de isolamento da invenção, por exemplo a seguir ao passo de ligação do ácido nucleico. Podem-se utilizar quaisquer tampões de lavagem ou outros meios, convencionais. De um modo geral, preferem-se tampões de força iónica baixa a moderada, e.g. Tris-HCl 10 mM a pH 8,0/NaCl 10 mM. Podem-se utilizar, se desejado, outros meios de lavagem convencionais, e.g. contendo álcoois, por exemplo lavagem com etanol a 70%. A utilização de partículas magnéticas permite passos de lavagem fáceis, simplesmente agregando as partículas, removendo o meio de ligação do ácido nucleico, adicionando o meio de lavagem e reagregando as partículas, tantas vezes quanto o necessário. 16

Após o processo de isolamento do ácido nucleico e quaisquer passos de lavagem opcionais desejados, o suporte que transporta o ácido nucleico ligado pode ser transferido, e.g. ressuspendido ou imerso em qualquer meio adequado, e.g. água ou tampão de baixa força iónica. Dependendo do suporte e da natureza de qualquer processamento subsequente desejado, pode ou não ser desejável libertar o ácido nucleico do suporte.

No caso de um suporte sólido na forma de partículas, tal como contas magnéticas ou não magnéticas, isto pode em muitos casos, ser utilizado directamente, por exemplo em PCR ou outras amplificações, sem eluir o ácido nucleico do suporte. Além disso, para muitos métodos de detecção ou identificação de ADN, a eluição não é necessária, pois embora o ADN possa estar em contacto ao acaso com a superfície da conta e ligado em vários pontos, por pontes de hidrogénio, ou forças iónicas, ou outras, haverá geralmente, comprimentos de ADN disponíveis, suficientes para hibridar com oligonucleótidos, ou para amplificação,

No entanto, se desejado, a eluição do ácido nucleico pode ser facilmente conseguida utilizando meios conhecidos, por exemplo, aquecendo, e.g. a 65°C durante 5 a 10 minutos, após o que o suporte pode ser removido do meio, deixando o ácido nucleico em solução. Este aquecimento é automaticamente obtido em PCR, pelo passo de desnaturação do ADN, que antecede o programa de ciclização.

Se desejado, para remover o ARN do ADN, isto pode ser conseguido destruindo o ARN antes do passo de separação do ADN, por exemplo por adição de uma ARNase ou de uma base como o NaOH.

Uma vantagem da presente invenção é a de ser de execução rápida e simples e com uma combinação adequada de ligação celular, passos de lise e ligação de ácidos nucleicos, proporciona um método que origina, de forma fiável e simples. í H—1 ; I J U ácidos nucleicos isolados, num curto espaço de tempo, em muitos casos em menos de uma hora, ou mesmo menos de 45 minutos . A simplicidade do método permite a análise de um grande número de amostras Concomitantemente , o passo de ligação de células resulta num enriquecimento, ou concentração de células, melhorando desse modo o processo de isolamento de ácidos nucleicos. A invenção é vantajosamente passível de automatização, particularmente quando se utilizam como suporte partículas e, especialmente, partículas magnéticas.

Como referido acima, o método da invenção tem utilidade particular como primeiro passo preliminar para preparar ácidos nucleicos, para utilização em processos de detecção baseados em ácidos nucleicos.

Assim, um outro aspecto da presente invenção é a utilização do método de isolamento do ácido nucleico como anteriormente definido, na preparação de ácidos nucleicos para utilização num método de detecção de células alvo, baseado em ácidos nucleicos.

De forma alternativa, este aspecto da invenção proporciona um método para detectar a presença ou ausência de uma célula alvo numa amostra, em que o referido método compreende: (a) ligar as células na referida amostra a um suporte sólido, para isolar células da amostra; (b) lisar as células isoladas; (c) ligar o ácido nucleico libertado das referidas células lisadas, ao mesmo suporte, referido; e (d) detectar a presença ou ausência de ácidos nucleicos característicos das referidas células alvo, de entre o referido ácido nucleico ligado. 18

Como referido acima, vantajosamente, o ácido nucleico ligado não precisa ser eluído ou removido do suporte antes rip se realizar o passo de detecção, embora isso possa ser efectuado, se desejado. 0 facto de o ácido nucleico ser ou não eluído, poderá também depender do método particular utilizado no passo de ligação do ácido nucleico. Assim, alguns processos de ligação de ácidos nucleicos irão ligar o ácido nucleico de um modo mais forte do que outros. No caso da ligação do ADN utilizando detergentes (e.g. por ADN directo), por exemplo, o ácido nucleico irá eluir do suporte sólido quando um tampão de eluição, ou outro meio adequado for introduzido. 0 ácido nucleico ligado por meio de um precipitante, como o álcool, ou um agente caotrópico, irá permanecer ligado de um modo mais forte e poderá não eluir quando colocado num meio tampão e pode ser necessário aquecer, para ser eluído.

Assim, o ácido nucleico ligado ao suporte pode ser utilizado directamente num processo de detecção baseado em ácidos nucleicos, especialmente se o suporte é na forma de partículas, simplesmente ressuspendendo o suporte em, ou adicionando ao suporte, um meio adequado para o passo de detecção. 0 ácido nucleico pode ser eluído para o meio ou, como mencionado acima, não é necessário que este seja eluído. São conhecidas várias técnicas para a detecção de ácidos nucleicos e estas estão descritas na literatura e qualquer destas pode ser utilizada de acordo com a presente invenção. Na sua forma mais simples, o ácido nucleico pode ser detectado por hibridação com uma sonda, estando descritos muitos destes protocolos de hibridação (veja-se, e.g. Sambrook et ai., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spríng Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY) . Mais vulgarmente, a detecção envolverá um passo de hibridação in situ e/ou um passo de amplificação in vitro, utilizando qualquer dos métodos descritos na literatura. Assim, como referido, podem-se utilizar técnicas como a LAR, 3SR e o sistema de Q-beta replicase. No entanto, a PCR e as suas várias modificações, 19

e.g. a utilização de iniciadores de síntese inseridos, será geralmente o método de escolha (veja-se e.g. Abramson e Meyers, 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4: 41-47 para uma revisão de tecnologias de amplificação de ácidos nucleicos).

Outros métodos de detecção podem basear-se numa aproximação de sequenciação, por exemplo, a aproximação de minisequenciação como descrito por Syvanen e Sõderlund, 1990, Genomics, 8: 684-692.

Em técnicas de amplificação como a PCR, o aquecimento necessário no primeiro passo para fundir o duplex de ADN pode libertar o ADN ligado ao suporte. Assim, no caso de um passo de detecção subsequente, como a PCR, o ácido nucleico ligado ao suporte pode ser adicionado directamente à mistura reaccional e o ácido nucleico irá eluir no primeiro passo do processo de detecção. A amostra de ácido nucleico ligada ao suporte, isolada, inteira, obtida de acordo com a invenção, pode ser utilizada no passo de detecção, ou uma alíquota.

Os resultados da PCR, ou outro passo de detecção, podem ser detectados ou visualizados por qualquer meio, descrito na arte. Por exemplo, os produtos da PCR ou outra amplificação, podem ser corridos num gel de electroforese, e.g. um gel de agarose corado com brometo de etídio, utilizando técnicas conhecidas. Alternativamente, o sistema DIANA pode ser utilizado, o qual é uma modificação da técnica de iniciador de síntese inserido. No sistema DIANA (detecção de ácidos nucleicos amplificados imobilizados) (veja-se Wahlberg et al., Mol. Cell Probes, 285 (1990)), o segundo par de iniciadores de síntese, interno, transporta, respectivamente, meios de Imobilização, para permitir a captura de ADN amplificado e um marcador ou meio de ligação de um marcador para permitir o reconhecimento. Isto proporciona as vantagens duplas de um sinal de ruído de fundo reduzido e meios rápidos e fáceis para a detecção do ADN amplificado. 20

\] Ο ácido nucleico amplificado pode também ser detectado, ou o resultado confirmado, por sequenciação, utilizando qualquer das muitas diferentes tecnologias de sequenciação, que estão agora disponíveis, e.g. sequenciação convencional, sequenciação de fase sólida, sequenciação cíclica, sequenciação automática e minisequenciação.

Com vantagem, verificou-se que as células isoladas podem ser mantidas num tampão de "ligação a células" de acordo com a invenção e.g. um tampão sal/álcool, durante pelo menos uma semana, à temperatura ambiente, sem perda detectável de sensibilidade, num passo de detecção de ácidos nucleicos subsequente. Esta estabilidade é uma vantagem em situações de campo.

Os vários reagentes e componentes necessários para realizar os métodos da invenção, podem ser convenientemente fornecidos na forma de kit. Estes kits representam um outro aspecto da invenção.

Na sua forma mais simples, a invenção proporciona um kit para isolar o ácido nucleico de uma amostra, que compreende: (a) um suporte sólido; (b) opcionalmente, meios para ligar as células ao referido suporte sólido; (c) meios para lisar as referidas células; e (d) meios para ligar o ácido nucleico libertado das referidas células lisadas, ao mesmo suporte sólido, referido.

Os vários meios (b) , (c) e (d) podem ser como descrito e discutido acima, em relação ao método da invenção.

Um outro componente opcional é (e) um meio para detectar a presença ou ausência de ácidos nucleicos característicos de uma célula alvo dentro da referida banda de ácido nucleico. Como discutido acima, estes meios podem incluir uma sonda ou sequências de oligonucleótidos iniciadores de síntese 21 υ adequados, para utilização em técnicas de detecção baseadas em hibridação e/ou amplificação.

Opcionalmente, também se pode incluir neste kit tampões, sais, polímeros, enzimas, etc. A i nvenção será agora descrita em maior pormenor nos exemplos seguintes, não limitantes, com referência à figura, em que:

Figura 1: mostra os resultados da electroforese em gel de agarose corado com EtBr, da separação dos produtos de amplificação por PCR, do ADN obtido de acordo com a invenção, a partir de células de 5 espécies de cianobactérias. As linhas 1 a 7 correspondem a amostras 1 a 7, como descrito no exemplo 1.

Exemplo 1

Materiais

Amostra 1; Planktothrix rubescens NIVA-CYA 1, amostra 2; Planktothrix agardhii NIVa-CYA 29, amostra 3;

Planktothrix rubescens NIVa-CYA 55, amostra 4;

Planktothrix mougeotii NIVa-CYA 56/1, amostra 5;

Planktothrix agardhii NIVA-CYA 116, amostra 6, controlo negativo nos reagentes de purificação de células e ADN e amostra 7; controlo negativo em reagentes de PCR.

Protocolo de isolamento de células e ADN: 0,5 ml de água contendo aproximadamente 105 células misturadas com 20 μΐ de contas (1 pg/ml) e 0,5 ml de tampão de ligação de células (isopropanol, 0,75 M NH4Ac) num tubo de microcentrifuga. A mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 20 minutos e em seguida o tubo foi colocado num magnete MPC-E (Dynal A.S.) durante 2 minutos. O sobrenadante 22

f \i foi removido cuidadosamente. Adicionaram-se 50 μΐ de GTC 4 M, sarcosil a 1% e incubou-se a 65°C durante 10 minutos. Eir seguida, adicionaram-se 200 μΐ de EtOH a 96% e a incubação foi continuada durante 5 minutos à temperatura ambiente. As contas foram atraídas para a parede do tubo com o magnete e o sobrenadante foi removido. 0 complexo foi lavado duas vezes com 500 μΐ de EtOH a 7 0%. Todo o ctanol foi removido e adicionaram-se 50 μΐ de água. Para remover o etanol residual os tubos foram incubados a 65°C durante 10 minutos, com a tampa aberta.

Amplificação por PCR: A região entre os genes que codificam para RuBisco grande (Rbcl) e subunidade pequena (Rbcs) foi amplificada.

As amplificações foram feitas utilizando o sistema

GeneAmp 2400 PCR, em volumes de 50 μΐ contendo 10 pmol de iniciadores de síntese (CW) 5' CGTAGCTTCCGGTGGTATCCACGT3' e (DF) 5' GGGCARYTTCCACAKNGTCCA3', 200 μΜ de dNTP, Tris-HCl 10 mM (pH 8,8) MgCl2 1,5 mM, KC1 50 mM, Triton X-100 a 0,1%, polimerase de ADN termoestável DynaZyme 1U (Finnzymes OY) e 5 μΐ da solução contas/ADN. O programa de PCR utilizado tem um passo de desnaturação inicial a 94°C durante 4 minutos, e em seguida a ciclização com os parâmetros; 94°C durante 30 segundos, 40°C durante 30 segundos e 72°C durante 2 minutos durante 2 ciclos, em seguida 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos e 72°C durante 2 minutos, durante 40 ciclos. Por fim, incluiu-se um passo de extensão durante 7 minutos. Por sequenciação de ADN, verificou-se que os fragmentos amplificados estavam na região entre RuBisCo grande (Rbcl) e a subunidade pequena (Rbcs).

Gel 10 μΐ dos produtos amplificados de cada uma das amostras 1 a 7, foram corridos num gel de agarose corado com EtBr a 1,5%, durante 30 minutos, a 100 volts. O padrão de peso 23 molecular era ADN digerido com <j)X 114 HaelII. Os resultados são apresentados na figura 1.

Resultados Δ figura 1 mostra claramente que foi possível detectar as células de todas as amostras 1 a 5. Com base nos resultados de PCR obtidos, tal como visualizado no gel de agarose corado com EtBr, o limite de detecção foi estimado como sendo de 10-100 células/ml.

Lisboa, 8 de Novembro de 2001 O AGENTB OFICIAL !>A PROPRIEiMÍJK ΓΜΗΚΤΡΙΑΙ

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Claims (20)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para isolar ácido nucleico de uma amostra de células, que compreende a) ligar as células na referida amostra a um suporte sólido, para isolar as células da amostra; b) lisar as células isoladas; e c) ligar o ácido nucleico libertado das referidas células lisadas ao mesmo suporte, referido.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido ácido nucleico é ADN.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que no passo (a) as células são precipitadas no suporte, utilizando um precipitante.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o precipitante compreende álcool e sal.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que no passo (a) as células se ligam ao suporte por meio de porções de ligação a células, proporcionadas no, ou dentro do suporte.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que as referidas porções de ligação a células permitem a ligação selectiva de células alvo.
7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o suporte sólido está na forma de partículas.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o suporte compreende contas magnéticas. 1
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que no passo (b), as células são lisadas utilizando um detergente e/ou um agente caotrópico.
10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que no passo (c) o ácido nucleico é ligado de forma não específica ao suporte.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o ácido nucleico é precipitado no suporte, utilizando um precipitante.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que o precipitante compreende álcool e opcionalmente sal e/ou um detergente.
13. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que no passo (c) o ácido nucleico se liga ao suporte por meio de parceiros de ligação, proporcionados pelo suporte, para auxiliar a captura selectiva de ácidos nucleicos.
14. 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que o ácido nucleico ligado é eluído do suporte.
15. 15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que as células ligadas ao suporte são separadas do restante da amostra, concentrando desse modo as células.
16. 16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que o suporte sólido está na forma de partículas e em que no passo (a) a referida amostra é misturada com o referido suporte na forma de partículas e deixado em repouso durante um período de tempo adequado, para permitir que as células se liguem ao suporte, após o que o suporte é removido do restante da amostra. 2
17. 17. Utilização do método de isolamento de ácidos nucleicos como definido em qualquer das reivindicações 1 a 16, na preparação de ácidos nucleicos para utilização num método de detecção de células alvo, baseado em ácidos nucleicos.
18. 18. Método para detectar a presença ou ausência de uma célula alvo numa amostra, que compreende a) ligar as células na referida amostra a um suporte sólido, para isolar células da amostra; b) lisar as células isoladas; c) ligar o ácido nucleico libertado das referidas células lisadas ao mesmo suporte, referido; e d) detectar a presença ou ausência de ácidos nucleicos caracteristicos das referidas células alvo, de entre o referido ácido nucleico ligado.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o referido passo de detecção (d) compreende hibridação in situ e/ou amplificação in vitro, e/ou sequenciação de ácidos nucleicos.
20. 20. Kit para isolar ácido nucleico de uma amostra, que compreende: a) um suporte sólido; b) opcionalmente, meios para ligar células ao referido suporte sólido; c) meios para lisar as referidas células; e meios para ligar o ácido nucleico libertado das referidas d) células lisadas, ao mesmo suporte sólido, referido; em que o referido suporte sólido (a) e meios (b) a (d) são como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13. Lisboa, 8 de Novembro de 2001 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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