CN1187362C - 核酸的固相分离法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种分离细胞样品中核酸的方法，所述的方法包括：(a)使样品中的细胞与固体支持物相结合以分离出细胞；(b)裂解分离出的细胞；(c)使裂解细胞释放出的核酸与上述同一固体支持物结合。本发明还提供了实施以上方法的试剂盒。该方法可用于制备核酸以供基于核酸的靶细胞检测法所用。
Description
本发明涉及核酸的分离，具体地说是一种将固相细胞分离步骤与固相DNA分离步骤相结合从细胞中分离DNA的方法。
在许多生物化学和诊断方法中，核酸的分离是重要的一步。例如，只有将核酸从它们通常所处的复杂混合物中分离出来后才能进行例如检测、克隆、测序、扩增、杂交、cDNA合成等其他研究和过程；混合物中含大量诸如细胞、蛋白质或碳水化合物之类杂质，常会妨碍分子生物学中的许多反应和技术。此外，DNA会污染RNA制剂，反之亦然。所以，从诸如细胞和组织等复杂混合物中分离核酸的方法不仅为制备所需要，而且为目前使用的许多基于DNA或RNA鉴定的方法所需要，例如微生物感染的诊断、法医学、组织和血液分型、遗传变异的检测等。
目前，DNA或RNA鉴定已被广泛用于区分不同细胞或细胞类型或相同细胞含DNA突变的变体。所以，通常用抗体鉴定特征性表面抗原来进行的HLA分型可以换成鉴定编码所述抗原的DNA。微生物感染或污染可以通过检测靶生物的核酸分析来鉴定，而不是依赖于用形态学或生物化学方法检测微生物细胞的特征。遗传变异也可以用类似的方法来鉴定。
一般的说，DNA或RNA是通过在足以确保低水平非特异性杂交的严谨条件下与一种或多种寡核苷酸的杂交来检测的。通常，发生杂交的核苷酸成对地作为引物用于目前各种形式的体外扩增，主要是聚合酶链反应(PCR)，但也包括连接酶扩增反应(LAR)、自身维持序列复制(3SR)和Q-β复制酶扩增系统。扩增后，可以通过Sanger法等进一步测序鉴定DNA的特征。扩增和测序可以组合在一起。
如前所述，各种方法都需要最初的核酸分离步骤，将核酸与蛋白质等会干扰杂交和扩增技术的物质相分离。
已知有许多分离核酸的方法，但总的说来，它们都依赖于一系列复杂的抽提和洗涤步骤，既费时又费事。
从诸如血液或血制品或组织等复杂的起始物质中分离核酸的经典方法包括用除垢剂或离液剂，可能在蛋白质降解酶存在下，裂解生物材料，然后用有机溶剂(例如苯酚和/或氯仿)抽提数次，乙醇沉淀，离心和核酸透析。这些方法不仅费事费时，而且较多的步骤增加了降解、样品损失或在同时处理多份样品时样品交叉污染的可能性，
所以一直以来都在试图改进分离核酸的方法，最近提出了依赖于使用固相的其他方法。例如，在美国专利5,234,809说明的方法中，核酸在例如胍盐等离液剂存在下与二氧化硅颗粒形式的固相结合，由此与样品中的其余物质相分离。WO91/12079说明的方法中，核酸通过沉淀被固相的表面所捕获。通常，使用醇类和盐类作为沉淀剂。
虽然这些方法加快了核酸分离过程，但是仍然需要更快和更简单的方法以便获得无损耗的良好得率，尤其是便于修改以适用于在核酸浓度可能很低的混合物或环境中从细胞中分离核酸，作为在以核酸为基础的细胞检测过程中从靶细胞中分离核酸的第一制备步骤。本发明满足了这一需要。具体地说，虽然例如PCR等基于杂交的技术和其他基于核酸的技术能够高灵敏度地检测出样品或样品制剂等中的细胞，但是靶细胞浓度和核酸纯度是此类方法达到高灵敏度和高再现性的关键因素。目前，通常先通过过滤、离心或亲和性结合固定于固相的抗体来从样品中分离细胞。如此将细胞浓缩之后，再从浓缩细胞中纯化DNA，一般是通过前述经典的苯酚/氯仿抽提法，但伴有他们附带的缺点。
现在，我们提出一种解决这一问题的新方法，该方法通过将同一固相即用于细胞吸附又用于核酸纯化，将细胞分离与核酸纯化结合成“一步”。该方法是如下实现的，首先使细胞与固相支持物结合，然后在可使细胞裂解和结合的条件下使用同一固相支持物，使核酸与支持物结合。
如此，可以在45分钟之内简单而迅速地从样品中分离出核酸，成为适合扩增或其他下游过程的形式。
所以，本发明内容之一提供了一种从细胞样品中分离核酸的方法，它包括：
(a)使所述样品中的细胞与固相支持物结合以从样品中分离出细胞；
(b)裂解分离细胞；
(c)使经所述裂解的细胞释放出的核酸与前述同一固相支持物结合。
核酸可以是DNA、RNA或他们的天然或人工修饰形式，以及它们的混合物。但是，核酸以DNA为佳，可以是单链、双链或任何其他形式，例如线形或环状。
“细胞”一词在此包括所有原核细胞(包括古细菌)和真核细胞，以及诸如病毒和支原体等其他活性生物体，还包括诸如细胞器等亚细胞组分。所以，代表性“细胞”包括各类哺乳动物和非哺乳动物细胞，植物细胞，原生质体，细菌，原生动物和病毒。
所以，样品可以是包含上述细胞内核酸的各种材料，包括例如食物和及相关产品，临床和环境样品。所以，样品可能是生物样品，其中含各种病毒或细胞物质，包括各种原核和真核细胞、病毒、噬菌体、支原体、原生质体和细胞器。所以，这些生物材料可包含各类哺乳动物和非哺乳动物细胞、植物细胞、包括蓝绿藻在内的藻类、真菌、细菌、原生动物等。所以，代表性样品包括全血或血制品(诸如血浆或黄色白细胞层)、尿液、粪便、脑脊髓液或其他各种体液、组织、细胞培养物、细胞悬浮液等，还包括诸如土壤、水等环境样品，或食物样品。
样品还包括较纯或部分纯化的起始材料，例如用其他细胞分类方法获得的半纯制剂。
可用各种已知或常规方法使细胞与固相支持物结合。例如，选择合适的固相支持物和条件来实现细胞与支持物的非特异性结合。所述条件例如固相支持物表面的化学和物理特征等，(如疏水性或电荷)，分离介质的pH或组成等。靶细胞的特征也起着一定的作用，例如，已经证明：某些疏水性细胞易于非特异性地结合疏水性表面，而亲水性细胞则结合亲水性更高的表面。已经发现，带负电的细胞例如B淋巴细胞与带弱正电的表面有高程度的非特异性结合。所以可以使用表面带有合适电荷的固相支持物来结合所需的细胞类型。合适的缓冲液等可用作细胞分离步骤的介质来获取适宜细胞结合的条件，即在合适的介质中简单地令固相支持物与样品接触。较好的是，可以在接触固相支持物之前、同时或之后在样品中添加具有适宜电荷和渗透压等的缓冲液。
较好的是，根据本发明，可以用沉淀剂将细胞沉淀在支持物上实现细胞的非特异性结合，例如，通过在样品中添加含有醇和盐的缓冲液，使得细胞与支持物在醇和盐的存在下相互接触。在分离和纯化步骤(例如沉淀)中使用醇或盐是本领域的公知常识，适用于此类过程的各种醇或盐都适用于本发明。所以，较好的是，醇可以是已知适用的各种烷基醇和低级烷基醇，例如异丙醇和乙醇。其他合适的醇包括甲醇和正丁醇。
盐可以是各种常用来源的，例如钠或钾的氯化物或乙酸盐，或是乙酸铵。醇和盐的合适浓度可根据所用的具体系统和反应试剂来确定。一般说来，在样品中添加0.5至3体积，例如1体积的醇比较合适。较好的是，可以使用50％-100％(w/v)的醇。已经发现，使用0.1至10.0M的盐浓度比较合适，0.1至7.0M更好，例如0.1至3.0M，而且，以上浓度的盐宜含于醇溶液中。所以，可使用含有所需浓度醇和盐的缓冲液作为所谓的“细胞结合缓冲液”。或者，可以分别添加盐和醇。根据本发明，用醇作为细胞的沉淀剂，在将本发明方法用于临床诊断时具有优越性，因为通常用醇来保存临床样品。所以，可以方便地将患者样品加入含醇的细胞结合缓冲液中，由此保存样品并便于纯化核酸。
不用盐/醇沉淀，也可使用其它沉淀剂，例如聚乙二醇(PEGs)或性能类似的其它高分子聚合物，它们可以单独使用或与盐和/或醇结合使用。这些聚合物的浓度取决于具体的系统，例如聚合物和细胞的类型，但是一般为约1至50％(w/v)，例如2-30％。
可以利用其“结合”或“吞噬”颗粒固相(例如微珠)的能力来捕捉具有吞噬活性的细胞，并方便地加以收集。此时，只需将含细胞样品在合适的条件下与固相接触或一起培养。这种细胞捕捉法与特异性结合无关。
可以使固相支持物具有有助于细胞非特异性结合的部分，例如细胞非特异性结合的蛋白质或蛋白质片段或多肽。所以，例如，包被或携带了抗体的固相支持物可以通过细胞表面的Fc受体非特异性地结合细胞。将抗体或其它蛋白质或多肽固定在固相表面上的技术是本领域众所周知的。
最后，如前所述，可以用缓冲液，通常和盐一起，形成适宜结合的pH条件，以实现细胞与具有带电、疏水性或亲水性表面的固相支持物非特异性结合。具体的缓冲液和条件取决于细胞和固相支持物等的类型。
混合各种组分，静置一段合适的时间，让细胞与支持物结合。然后，可用各种方法从溶液中分离出支持物，所用方法取决于支持物的特性，并包括各种形式将支持物与细胞清液相分离的方法，例如，离心、倾淅、移液等。
以上过程的条件无关紧要，但是已经发现，较好的是，只需在固相存在下将样品与“细胞结合缓冲液”混合，室温静置例如5至30分钟，例如20分钟，然后分离。如前所述，反应时间并不重要，通常，短至5分钟可能已足够。但是，如果方便的话，可以使用较长的时间，例如20分钟至3小时，或甚至通宵。可用各种合适的方法进行混合，例如仅通过搅和或涡流加以搅拌。此外，必要时可以使用较高或较低的温度，但这并非必需。
“细胞结合”组合物中的其它可选组分包括PEG等高分子聚合物，诸如TritonX-100、NP-40等无电荷温和除垢剂，DNA酶和其它酶，只要它们不破坏细胞的完好性。
例如，较好的“细胞结合”组合物可以包含：
异丙醇，0.75M乙酸铵，
75％乙醇，0.75M乙酸铵。
虽然本发明优选细胞的非特异性结合，但是也可以使用经修饰的固相支持物允许选择性地捕捉所需含核酸细胞。所以，可使用带有例如专一于所需细胞类型的抗体、或凝集素等其它结合蛋白的支持物。这可以使得核酸的分离具有一定程度的选择性，因为可以只分离复杂混合物中来自所需靶源的核酸。所以，可以使用此类支持物从样品中分离或得到所需类型的靶细胞等。
此类选择性细胞捕捉基质的制备是本领域众所周知的，在文献中已有所记载。
固相支持物可以是目前广泛用于固定化和分离等目的各种常用支持物或基质。其形式可以是颗粒、薄片、凝胶、过滤介质、薄膜、纤维、毛细管、微滴条/管/板/格等。
较好的是，支持物用玻璃、二氧化硅、乳胶或聚合材料制成。较好的是具有高表面积以用于结合细胞继而结合核酸的材料。这类支持物一般具有不规则的表面，可以是例如多孔或颗粒状的，例如颗粒、纤维、织物片、烧结物或筛网。一般优选颗粒材料，例如微珠，尤其是聚合物微珠，因为它们具有更大的结合容量。
较好的是，本发明所用颗粒状固体支持物包括球形微珠。微珠的大小并不重要，但它们的(例如)直径约至少1微米，至少2微米更好，直径不宜超过10微米，不超过6微米更好。例如，直径2.8微米和4.5微米的微珠被证明性能良好。
单分散颗粒即大小基本一致的颗粒具有反应再现一致性高的优点。尤其适用的是用US-A-4336173所述技术生产的单分散聚合物颗粒。
适用于本发明方法的非磁性聚合物微珠可向Dyno Particles AS(Lillestrom，Norway)、Qiagen、Pharmacia、和Serotec购买。
但是，为了帮助操作和分离，以使用磁性微珠为宜。“磁性”在此表示：支持物能够在处于磁场中时带上磁性，使得它能够在磁场作用下被移动。换言之，包含磁性颗粒的支持物能够方便地用磁性聚集(aggregation)来移动，这就提供了一种在细胞和核酸结合步骤之后迅速、简便而有效地分离颗粒，而且比常规技术温和得多的方法，常规技术中例如离心会产生破坏细胞和降解核酸的剪切力。
所以，采用本发明方法，可以(例如)用永磁体产生磁场将结合有细胞的磁性颗粒移动到合适的表面上。通常，用磁体作用于含有样品的容器壁就足以使得颗粒聚集于器壁，然后倒去样品的其余部分。
尤其好的是超顺磁性颗粒，例如Sintef在EP-A-106873中说明的那些，因为它们可以避免颗粒在反应过程中发生磁性聚集和结块，由此确保均匀性和核酸抽提操作。公知的Dynal AS(Oslo，Norway)出售的磁性颗粒DYNABEADS尤其适用于本发明。
用于本发明的功能化包被颗粒可以通过修饰美国专利4,336,173、4,459,378和4,654,267所述的微珠来制备。这样，可以制备出具有不同类型功能化表面，例如带正电或负电，亲水性或疏水性表面的微珠或其它支持物。
不同细胞表现出与不同表面和支持物不同程度的非特异性结合，为了优化细胞结合条件和确定最佳支持物面积，例如给定系统中颗粒的浓度，宜“滴定”每体积单位中固相支持物的量(例如颗粒数)。
细胞结合之后，分离或与支持物结合的细胞被裂解以释放出它们的核酸。细胞裂解的方法是本领域众所周知的，在许多文献中有所记载，任何一种已知技术都可使用。对不同细胞用不同的方法可能更合适，但是以下方法都可以使用，例如：在合适的缓冲液中用SDS、LiDS或十二烷基肌氨酸钠等的除垢剂裂解法；用盐酸胍(GHCl)、异氢酸胍(GTC)、碘化钠(NaI)、高氯酸盐等离液剂；用French压力，超声波处理，用玻璃微珠、氧化铝或液氮研磨等的机械破坏；例如用溶菌酶、蛋白酶、链霉蛋白酶或纤维素酶或其它市售裂解酶的酶裂解法；噬菌体或病毒感染裂解细胞；冷冻干燥；渗透压休克；微波处理；温度处理；例如加热或沸煮，或在干冰或液氮中冷冻后再融化；碱裂解。如前所述，这些方法都是标准裂解法，都是本领域众所周知的，以上方法中任一种或以上方法的组合都可以使用。
较好的是，可根据本发明用离液剂和/或除垢剂来裂解。例如，就细菌细胞而言，将离液剂与除垢剂结合被发现特别有效。因此，一例合适的裂解剂包含诸如GTC和GHCl的离液剂和诸如SDS或十二烷基肌氨酸钠的除垢剂。裂解剂可以简单水溶液的形式使用，也可以包含在缓冲液中形成所谓的“裂解缓冲液”。各种合适的缓冲液都可以使用，其中包括例如Tris Bicine、Tricine和磷酸盐缓冲液。或者，多种裂解剂可分别加入。合适的裂解剂浓度和量取决于具体的系统、细胞特性等，这是可以正确确定的，但是可以使用例如2M至7M诸如GTC、GHCl、碘化钠和高氯酸盐的离液剂，0.1M至1M诸如NaOH的碱，和0.1至50％(w/v)例如0.5至15％除垢剂。这样，一例代表性的合适的裂解剂缓冲液包含4M GTC水溶液，1％(w/v)十二烷基肌氨酸钠。
要实施本发明，可方便地将分离的、与支持物结合的细胞与样品其余部分相分离，由此浓缩或富集细胞。这样，细胞结合步骤起到了富集或浓缩细胞使其体积小于最初样品的作用。然后，加入合适的含所需裂解剂的裂解缓冲液或让分离细胞处于所需的裂解条件下，如此就可以裂解细胞。例如，如果是简单地加入含合适裂解剂的裂解缓冲液，只需将分离细胞在裂解缓冲液存在下培养合适的时间使裂解得以发生。对于不同的裂解系统宜使用不同的培养条件，这些是本领域众所周知的。例如，对于含除垢剂和/或离液剂的裂解缓冲液来说，培养可在室温或例如37℃或65℃等较高温度下进行。同样，培养时间可从几分钟(例如5分钟或10分钟)至数小时(例如1至2小时)不等。如果是GTC/十二肌氨酸钠裂解缓冲液和细菌细胞，已证明，65℃培养10-20分钟比较适宜，当然，这可以根据需要加以改变。对于酶(例如K蛋白酶)裂解来说，可能需要较长的处理时间，例如通宵。
裂解之后，释放出的核酸与被裂解细胞所结合的同一支持物结合。这一步核酸结合可用本领域已知的各种核酸结合固相支持物的方法来进行。较简便的是核酸与支持物非特异性(即与序列无关)结合。这样，例如，可用各种已知核酸沉淀剂，例如醇类、醇/盐混合物、聚乙二醇(PEG)等，将释放出的核酸沉淀在支持物上。例如WO91/12079说明了用这种方式将核酸沉淀在微珠上。所以，可向含支持物和释放的核酸的溶液添加盐，然后添加醇，引起核酸沉淀。或者，盐和醇可以同时加入，或者也可以不加盐。如前文就细胞结合步骤所述，任何合适的醇和盐都可以使用，确定适宜的量和浓度是很容易的。
其他非特异性核酸结合技术包括如Dynal A.S.的WO96/18731所述使用除垢剂(所谓的“DNA直接”法(DNA direct))，如Akzo N.V在EP-A-0389063中所述使用离液剂和二氧化硅颗粒之类核酸结合固相。
可用表面带电的固相支持物，例如聚胺包被的支持物，实现核酸与支持物的离子性结合。
本发明所用支持物可带有协助特异性或非特异性核酸结合的官能团，例如可在支持物上涂以亮氨酸拉链或组蛋白DNA结合蛋白或嵌入染料(例如溴乙锭或Hoechst42945)。
可使支持物带上协助选择性捕捉核酸的结合部分。例如，可使用互补DNA或RNA序列，或DNA结合蛋白，或结合病毒核酸的病毒蛋白。可用本领域的公知技术将所述蛋白与固相支持物结合。
本发明简便的沉淀核酸法是在含支持物和被裂解细胞的混合物中添加醇之类沉淀剂。可简单地在混合物中添加适量的醇，例如100％或96％的乙醇，培养足够长的时间使释放的核酸与支持物结合。这一步的培养条件并不重要，可能仅是室温培养5-10分钟。但是，根据选择，可以改变培养时间和提高培养温度。
虽非必要，但较好的是在本发明分离方法中引入一步或多步洗涤步骤，例如在核酸结合步骤之后进行。各种常规洗涤缓冲液或其它介质均可使用。一般说来，优选低或中等离子强度的缓冲液，例如10mM Tris-HCl，pH8.0/10mM NaCl。根据需要，也可使用其它标准洗涤介质，例如含醇的介质，例如用70％乙醇洗涤。
使用磁性颗粒便于洗涤，只需聚集颗粒，去除核酸结合介质，添加洗涤介质，再次聚集颗粒，根据需要重复多次。
在核酸分离和视要求选用的洗涤步骤之后，可将结合有核酸的支持物转移(重悬或浸没)入各种合适的介质(例如水或低离子强度缓冲液)中。根据支持物和后续加工的特性，可将核酸从支持物上释放也可以不释放。
如果是诸如磁性或非磁性微珠之类颗粒固相支持物，许多时候，核酸无需从支持物上洗脱就可直接用于例如PCR或其它扩增反应。而且，对许多DNA检测或鉴定方法来说不必进行洗脱，因为虽然DNA与微珠表面的接触是随机的，并且在许多位点是靠氢键或离子键或其它力结合的，但是DNA的长度一般已足以与寡核苷酸杂交，也足以发生扩增反应。
但是，如果需要，用已知技术例如通过加热(例如65℃加热5-10分钟)可方便地洗脱核酸，此后可从介质中去除支持物而只在溶液中留下核酸。所述的加热在PCR中是通过循环程序前的DNA变性步骤自动实现的。
如果要去除DNA中的RNA，可通过在DNA分离步骤之前破坏RNA，例如添加RNA酶或NaOH之类的碱来实现。
本发明优点之一是迅速而简便，而且，通过细胞结合、裂解和核酸结合步骤的适当组合，提供了一种在短时间内(许多情况下少于1小时，甚至少于45分钟)获得分离的核酸的可靠而简便的方法。方法的简单性提高了样品处理能力。同时，细胞结合步骤富集或浓缩了细胞，由此优化了核酸分离过程。
本发明便于自动化，尤其是在用颗粒特别是磁性颗粒作为支持物时。
如前所述，本发明方法具有特殊的用途，即在制备核酸用于基于核酸的检测过程时作为预备性的第一步。
这样，本发明的另一方面内容是应用该核酸分离方法如前文所述制备用于基于核酸的靶细胞检测法的核酸。
换言之，本发明的这方面内容提供了一种检测样品中有无靶细胞的方法，该方法包括：
(a)样品中的细胞与固相支持物结合以从样品中分离出细胞；
(b)裂解分离出的细胞；
(c)从所述裂解细胞中释放出的核酸与同一固相支持物结合；
(d)检测素数结合的核酸中有无所述靶细胞的特征性核酸。
如前所述，本发明的优点在于不必在检测步骤之前将结合核的酸从支持物上洗脱或分离，虽然也可以根据需要进行上述操作。是否洗脱核酸还取决于核酸结合步骤中使用的具体方法。所以，这种可靠的核酸结合过程会使核酸的结合比其它方法更紧密。如果是用除垢剂进行DNA结合(例如DNA直接法)，在引入洗脱缓冲液或其它合适的介质时，核酸将从固相支持物上洗脱。处于缓冲介质中时，通过例如醇或离液剂沉淀结合的核酸将仍与支持物紧密结合，此时可能需要加热洗脱。
这样，支持物-结合核酸可直接用于基于核酸的检测，特别是当支持物是颗粒时，只需将支持物重悬在检测步骤的合适介质中，或将所述介质加入支持物。将核酸洗脱到介质中，或如前所述，洗脱不是必需的。
许多检测核酸的技术是已知的，并在文献中有所记载，其中任何一种都可用于本发明。最简单的是通过与探针的杂交来检测核酸，许多文献记述了此类杂交方案(参见Sambrook等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbour Press，Cold Spring Harbor，NY)。最常见的是，检测包括原位杂交，和/或用文献中所述方法进行的体外扩增。这样，如前所述，可使用例如LAR、3SR和Q-β复制酶系统等技术。但是，通常选用PCR及其修改形式(例如使用嵌套引物)(有关核酸扩增技术的综述，参见：Abramson & Myers，1993，CurrentOpinion in Biotechnology，4：41-47)。
其它检测可能以测序为基础，例如Syvanen & Soderlund在1990，Genomics中所述的微测序法，8：684-692。
在例如PCR的扩增技术中，第一步熔解DNA双螺旋所需的加热会使结合的DNA从支持物上释放。这样，在其后的检测步骤例如PCR中，可将与支持物结合的核酸直接加到反应混合物中，核酸将在检测过程的第一步被洗脱。可将本发明获得的全部分离出的与支持物结合的核酸样品用于检测步骤，或使用其中一份。
可用多种方法检测或显示PCR或其它检测步骤的结果，这些是本领域的已知技术。例如，可对PCR或其它扩增产物进行凝胶电泳，例如用已知技术溴乙锭染色琼脂糖凝结。或者，可用DIANA系统，该系统是嵌套引物技术的一种修改形式。DIANA(固定化扩增核酸的检测)系统中(参见Wahlberg等，Mol.Cell.Probes4：285(1990))，内部第二引物对分别带有捕捉扩增DNA的固定化工具和一种标记或用于结合标记以便识别的工具。其双重优点在于既降低了背景信号，又可迅速而简便地检测出扩增DNA。
还可以通过测序来检测扩增的核酸或最后确认产物，可用许多不同的已知测序技术进行测序，例如标准测序法，固相测序法，循环测序法，自动测序和微测序。
本发明的优点在于，已发现，室温下，分离细胞可在“细胞结合”缓冲液(例如盐/醇缓冲液)中维持至少1周，在其后的检测步骤中没有测得灵敏度降低。这种稳定性在实际情况中是非常有利的。
较方便的是，可以试剂盒的形式提供用于实施本发明方法所需的各种反应试剂和组分。所述试剂盒即本发明的另一方面内容。
简而言之，本发明的这方面内容提供了用于从样品中分离核酸的试剂盒，它包括：
(a)固相支持物；
(b)可选的，使所述细胞与固相支持物结合的工具；
(c)裂解所述细胞的工具；
(d)使所述裂解细胞所释放的核酸与前述同一固相支持物结合的工具。
在本发明方法中，各种工具(b)、(c)和(d)如前文所述。
另一可选组成是(e)，即检测所述结合的核酸中有无靶细胞的特征性核酸的方法。如前所述，这类方法包括用于杂交和/或基于扩增的检测的合适的探针或引物寡核苷酸序列。
试剂盒中还可以包括缓冲液、盐、聚合物、酶等。
在以下实施例中，参照以下附图，将对本发明进行更详细的说明。附图中：
图1显示用本发明方法从5种蓝细菌中获得的DNA经PCR扩增后的EtBr染色琼脂糖凝胶电泳结果。泳道1-7对应于实施例1中的样品1-7。
实施例1
材料：
样品1：Planktothrix rubescens NIVA-CYA 1；
样品2：Planktothrix agardhii NIVA-CYA 29；
样品3：Planktothrix rubescens NIVA-CYA 55；
样品4：Planktothrix mougeotii NIVA-CYA 56/1；
样品5：Planktothrix agardhii NIVA-CYA 116；
样品6：细胞和DNA纯化试剂的阴性对照；
样品7：PCR试剂阴性对照。
细胞和DNA分离方案；
含约105个细胞的0.5ml水与20μl微珠(1μg/ml)和0.5ml细胞结合缓冲液(异丙醇，0.75M NH4Ac)在微离心管中混合。混合物室温孵育20分钟，然后试管在MPC-E磁体(Dynal A.S.)上放置2分钟。小心地去除清液。加入50μl 4M GTC、1％十二烷基肌氨酸钠，65℃孵育10分钟。然后加入200μl 96％EtOH，室温下继续孵育5分钟。用磁体使得微珠附着于试管壁，去除清液。复合物用500μl 70％乙醇洗涤2次。完全清除乙醇，加入50μl水。为了去除残余乙醇，试管在65℃开盖孵育10分钟。
PCR扩增
扩增的是RuBisCo大亚基(Rbcl)和小亚基(Rbcs)编码基因之间的区域。扩增是在含10pmol引物(CW)5’CGTAGCTTCCGGTGGTATCCACGT3’和(DF)5’GGGCARYTTCCACAKNGTCCA3’，200μM dNTP，10mM Tris-HCl(pH8.8)，1.5mM MgCl2，50mM KCl，0.1％Triton X-100，1单位DynaZyme热稳定性DNA聚合酶(Finnzymes Oy)和5μl微珠/DNA溶液的50μl体积中，用GeneAmp 2400 PCR系统(Perkin Elmer)进行的。所用的PCR程序包括，先在94℃变性4分钟，然后94℃30秒，40℃30秒和72℃2分钟循环2轮，再94℃30秒，60℃30秒，72℃2分钟循环40轮。最后，延伸7分钟。通过DNA测序证实扩增片段就是RuBisCo大亚基(Rbel)和小亚基(Rbcs)编码基因之间的区域。
凝胶：
样品1-7的扩增产物各10μl在EtB染色的琼脂糖凝胶上100伏电泳30分钟。分子量标准物是φX174 HaeIII消化的DNA。结果如图1所示。
结果：
图1清楚地显示：来自样品1至5的细胞都可以检测。根据所得的PCR结果，如EtB染色的琼脂糖凝胶所示，检测的极限可能是10-100细胞/ml。
Claims (19)
1.一种从真核细胞或原核细胞细胞样品中分离核酸的方法，所述方法包括：
(a)将固相支持物与细胞样品混合，从而让样品中的细胞与固相支持物结合，由此从样品中分离出细胞；
(b)裂解分离出的细胞；
(c)所述裂解细胞释放出的核酸与同一固相支持物结合；并进行以下步骤之一：
(d)将核酸从固相支持物上洗脱；或者
(e)将结合于固相支持物上的核酸直接用于基于核酸的检测过程。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的核酸是DNA。
3.根据权利要求1或2所述的方法，在步骤(a)中，用沉淀剂将细胞沉淀在支持物上。
4.根据权利要求3所述的方法，所述的沉淀剂含醇和盐。
5.根据权利要求1或2所述的方法，在步骤(a)中，细胞通过支持物上或支持物内的细胞结合部分与支持物结合。
6.根据权利要求5所述的方法，所述的细胞结合部分可选择性结合靶细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其中的固相支持物是颗粒状的。
8.根据权利要求7所述的方法，其中的支持物包含磁性微珠。
9.根据权利要求1所述的方法，在步骤(b)中，用除垢剂和/或离液剂裂解细胞。
10.根据权利要求1所述的方法，在步骤(c)中，核酸与支持物非特异性结合。
11.根据权利要求10所述的方法，用沉淀剂将核酸沉淀在支持物上。
12.根据权利要求11所述的方法，其中的沉淀剂含醇，可有可无盐，和/或除垢剂。
13.根据权利要求1所述的方法，在步骤(c)中，核酸通过支持物上协助选择性捕捉核酸的结合部分与支持物结合。
14.根据权利要求1所述的方法，将结合在固相支持物上的细胞与样品其余部分相分离，从而浓缩细胞。
15.根据权利要求1所述的方法，其中固相支持物的形式是颗粒，在步骤(a)中，所述样品与所述颗粒状支持物混合，静置合适的时间使细胞与支持物结合，然后将支持物与样品其余部分相分离。
16.权利要求1所述的核酸分离方法的用途，它被用于制备基于核酸的靶细胞检测方法中所用的核酸。
17.一种检测样品中有无真核或原核靶细胞的方法，所述方法包括：
(a)将固相支持物与细胞样品混合，从而让样品中的细胞与固相支持物结合，由此从样品中分离出细胞；
(b)裂解分离出的细胞；
(c)所述裂解细胞释放出的核酸与同一固相支持物结合；
(d)检测所述结合的核酸中有无靶细胞的特征性核酸。
18.根据权利要求17所述的方法，所述的检测步骤(d)包括原位杂交和/或体外扩增和/或核酸测序。
19.一种用于用于权利要求1所属方法的试剂盒，它包括：
(a)固相支持物；
(b)任选的、使细胞与所述固相支持物结合的工具；
(c)裂解所述细胞的工具；
(d)使所述裂解细胞释放出的核酸与固相支持物结合的工具；
(e)将核酸从固相支持物上洗脱的工具；或者
(f)用结合于固相支持物上的核酸检测靶细胞特征性核酸的工具。
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