PT94917B

PT94917B - Processo para a preparacao de factor viii estavel

Info

Publication number: PT94917B
Application number: PT94917A
Authority: PT
Inventors: Norbert Heimburger; Klaus Wellner; Karl-Heinz Wenz; Gerhardt Kumpe
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1989-08-07
Filing date: 1990-08-06
Publication date: 1997-05-28
Also published as: AU6015090A; AU635298B2; IE902817A1; US5424401A; EP0412466A3; DE3926034C2; JPH03148294A; DE59004488D1; CA2022650C; PT94917A; EP0412466A2; IE63919B1; KR0174262B1; ATE101041T1; ES2062222T3; CA2022650A1; JP3180957B2; DK0412466T3; DE3926034A1; KR910004208A

Description

A presente invenção refere-se a um processo para prei paração de um concentrado de factor VIII pasteurizado, com eleί vada actividade específica e estabilidade, sendo as impurezas contidas na solução de factor VIII adsorvidas através de pelo menos dupla adsorção com Al(OH)^, uma resina de permuta aniónij ca ou Cag(P0₄)_2> de preferência com dois adsorventes diferentes de entre estes grupos.

A coagulação plasmãtica é um processo enzimático; os i factores nela envolvidos são proteinas, sobretudo com as pro! priedades de proteases, que circulam na corrente sanguínea sob i;

i a forma dos seus percursores inactivos, e que só são activadas : em contacto com superfícies humectáveis ou em caso de lesão.

^: Para além da trombina também outras proteases de coagulação, ! por exemplo os factores Xa e IXa, atacam o factor VIII e podem j inactivá-lo. Tem também especial importância a proteina C, que j pode também inactivar o factor Va. Os factores V e VIII são os j factores de coagulação mais instáveis. Começam a degradar-se a i partir do momento da colheita de sangue, para o que contribui ’ ! z 2+ • j também o factor de serem estabilizados por Ca , sendo a coI ι

ií lheita de sangue feita com agentes eomplexantes tais como citratos e EDTA. Tais factos estão de acordo com as observações de que no crioprecipitado de plasma humano, que é utilizado em todo o mundo como material de partida para a obtenção de factor VIII, apenas se encontram 40-60% da actividade de factor VIII do plasma humano, dos quais apenas restam 10 a 20% após a purificação do factor VIII. Tal facto constitui um grande handicap para o abastecimento dos hemofílicos, pois por um lado não só a matéria prima sangue é um bem precioso e apenas disponível com limitações, e por outro estes baixos rendimentos influenciam o preço do produto. Isto aplica-se muito especialmente desde a introdução da fases de tratamento adicionais que garantem uma inactivação de virus durante a preparação de factor VIII.

' Fay et al. (proc. Natl. Acad. Sei., USA, 79, 7200, | 1982) indicam para um factor VIII obtido pelos métodos convencionais um rendimento de 12,7%. Um valor praticamente idêntico é obtido por Zimmermann e Fulcher com os modernos métodos da í cromatografia de afinidade imunológica (EP-A-0 083 483).

Muitos autores referiram que o factor VIII se liga bem a resina de permuta iónica DEAE e ECTEOLA, podendo ser rei movido novamente com halogenetos, mas que perde a sua actividade dentro de 24 horas (S. van Creveld et al., Thromb.Diathes.

ί VI (2/3), 282, 1961; R. Baugh et al., Blochim. Biophys. Acta ί 371, 360, 1974), sem que fosse fornecida uma solução para o ί problema, pois a adição de inibidores das proteases tais como

PMSF (fluoreto de fenil-metano-sulfonilo) e benzamidina não é adequada para a produção de uma preparação humana.

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Devido a situação descrita, verificava-se uma necessidade urgente de medidas tendentes a impedir uma decomposição do factor VIII durante o isolamento e purificação, que pudessem ί ser aplicadas tão rapidamente quanto possível, i.e. logo no ! início do isolamento ou da purificação. Como momento precoce foi seleccionado o tratamento do crioprecipitado que é obtido a partir do plasma através da chamada crioprecipitação, e que é í tratado como uma matéria prima.

' Em geral, e de acordo com os actuais conhecimentos

-i técnicos, os crioprecipitados dissolvidos são tratados com Al(OH)g, a fim de eliminar vestígios de impurezas com factores da protrombina (factor II, VII, IX e X). Desta forma pretende-se evitar uma activação destes factores, que poderia catabolizar o factor VIII durante a purificação. Surpreendentemente, desoobriu-se que uma única adsorção de uma solução fresca do í crioprecipitado a A1(OH)„ não é suficiente para eliminar os ll , i; factores da protrombina e outras proteases, pois mesmo apos a '! adsorção foi possível detectar no sobrenadante da solução adli sorvida uma nítida actividade amidolítica, de forma mais sensíj vel por meio do teste F Xa, apesar de essa actividade não pare! cer ser idêntica à do F Xa.

i i; Surpreendentemente, descobriu-se que através do traL tamento prévio do crioprecipitado, por exemplo através de ad: sorções múltiplas a Al(OH)g, Ca^PO^^ ou a uma resina de per_h muta aniónica, ou também através de adsorções mistas, se pode ί obter um factor VIII estável, que pode ser facilmente manuseado ι e sem grandes pereas.

Assim, são objecto da presente invenção as medidas l· í que, quando aplicadas a um crioprecipitado dissolvido de fresI co, impeçam a perca de uma grande parte da actividade do factor VIII durante a purificação e pasteurização, e que conduzem a um produto final caracterizado por um bom rendimento e uma elevada ; actividade específica, natividade e especificidade.

ii Constitui em especial objecto da presente invenção um

I!

H processo para a preparação de factor VIII estável por tratamento de fracções de plasma que contêm factor VIII, como se utili:i ί zam correntemente para a preparação de factor VIII, de prefe! rêneia de crioprecipitado dissolvido ou de uma fracção de Cohn | I, caracterizado por se tratarem as referidas fracções eom ad! sorventes que ligam as enzimas e pro-enzimas amidoliticamente/ proteoliticamente activas que degradam o factor VIII, depois do que se pode obter um faetor VIII estável eventualmente pasteurjí zado, com um bom rendimento.

Constitui especial objecto da presente invenção um ., processo para a preparação de factor VIII com elevada actividaI

- 3 de específica e estabilidade, caracterizado por se submeter uma solução que contém factor VIII tal como a de crioprecipitado, a pelo menos duas adsorções com AKOH)^, uma resina de permuta aniónica ou Cag(P0^)₂, antes de se recuperar o factor VIII da solução assim tratada através dos métodos já conhecidos.

Tais métodos conhecidos são descritos por exemplo na EP-A-0 018 561 ou EP-A-0 173 242.

De preferência o material de partida contendo o factor VIII é adsorvido com uma mistura de pelo menos dois adsorventes diferentes. É favorável um tratamento com Ca^PO^),, ou também com uma resina alcalina de permuta aniónica com matrix hidófila, por exemplo à base de polissacáridos, tais como celulose ou polissacáridos interligados e grupos funcionais, tais

R como são característicos por exemplo para DEAE- Sephadex, •p

ECTEOLA ou QAE- Sephadex (QAE).

A selecção do tipo e quantidade do adsorvente (em geral 1-3% p/v) faz-se sob o ponto de vista de que sejam adsorvidos e removidos enzimas e zimógenos, sobretudo proteinases que podem encontrar-se em conjunto com o factor VIII, mas não o factor VIII. Como indicador para tal determina-se a actividade amidolítica do produto final, de preferência utilizando peptídeos cromogénicos, tais como são utilizadas na determinação do factor Xa e que são correntes no mercado. 0 composto final de factor VIII deve ser praticamente isento de tais matérias.

Quando são utilizados vários adsorventes, estes podem ser adicionados individualmente ou também em separado, mas de preferência são adicionados sucessivamente com intervalos de 1 minuto a 30 minutos, e separados em conjunto. Uma forma de preparação preferida prevê a centrifugação de todos os adsorventes adicionados após períodos de adsorção de 1-30 minutos.

tratamento de uma solução de crioprecipitado (crio-solução) pode ser feito de preferência a um pH de 6,5 - 7,5 e com uma potência iónica fisiológica (10-15 mS) , de preferência num meio que não contenha quaisquer iões citrato ou outros captadores de iões metálicos bivalentes, de preferência primeiro com Al(OH) , mas também em conjunto com Ca (PO. ) e/ou resina □ 3 4 2

DEAE e/ou ECTEOLA e/ou QAE. Condição indispensável para a eficácia do tratamento é a adição sucessiva dos adsorventes. A separação por meio de centrifugação pode ser feita de uma só vez.

Os resultados de tais adsorções sobretudo com misturas de adsorventes são apresentados na Tabela 1. Podem ser resumidos da seguinte forma:

A actividade amidolítica, que se mantém na crio-solução ainda após a segunda adsorção a Α1(0Η)_ο θ que pode ser deo tectada na preparação final, só pode ser drasticamente reduzida através de uma outra adsorção subsequente com Ca^CPO^)^ e/ou ECTEOLA e/ou QAE ou com um outro permutador iónico alcalino; é também eficaz uma mistura de várias resinas de permuta iónica.

Surpreendentemente não se observa qualquer perca de actividade do factor VIII através do tratamento, se não se exceder uma determinada quantidade de adsorvente. Esta situa-se em 10 g para Ca^PO^^ e para QAE e ECTEOLA em aprox. 20 a 30 g de resina humedecida por litro de crio-solução. Uma tal solução é obtida normalmente dissolvendo 1 Kg de crioprecipitado em 3 1 de solução tampão.

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Através do tratamento prévio da crio-soluçâo com adsorventes e resina de permuta aniónica removem-se, para além da actividade amidolítica, também proteínas não específicas. Desta forma é aumentado não só o rendimento do factor VIII, como tam bém a actividade específica. 0 tratamento prévio da crio-solução fresca com adsorventes e resinas de permuta iónica tem ainI da a vantagem de conduzir a uma preparação intermédia estável, ii que pode ser pasteurizada a 60°C em solução aquosa praticamente ii sem percas e que pode ser melhor manuseada. Esta conduz a uma r preparação final estável que pode ser dializada, filtrada e ari;

[; mazenada sem grandes percas da sua actividade.

I

Revelou-se mais eficaz o tratamento prévio da crioR R

J -solução com ECTEOLA, QAE- Sephadex, DEAE- Sephadex e uma misI I : tura destas resinas de permuta aniónica, associado a uma adsorção prévia com A1(OH)₂. É notável o resultado de adsorção mista R 5 com QAE- Sephadex, Ca^íPO^^, pois conduz a uma preparação com uma boa actividade específica e suficiente estabilidade, com [ um elevado rendimento. Uma diálise durante 20 horas a 20°C e um ' armazenamento durante 24 horas a 20°C constituem grandes sobrecargas, e a perca de actividade foi de apenas 11% no total. Há que salientar ainda que soluções de factor VIII tão estáveis e i simultaneamente tão isentas de proteínas, conforme são caracteI rizadas por actividades específicas de aprox. 100 E/mg, não : haviam ainda sido descritas. A-sobrecarga durante 4 dias à tem! peratura ambiente deve ser considerado como um teste provocató| rio, a fim de reconhecer ainda últimos vestígios de impurezas ! enzimáticas que possam destruir o factor VIII.

: É possível verificar que a perca de actividade do factor VIII durante o armazenamento pode ser atribuída a impu• rezas dos concentrados de factor VIII com proteases, estando ij correlacionado com a actividade amidolítica residual na preparação final (ver Tabela 1).

Uma amostra adsorvida uma vez com A1(OH)₃ contém logo após a diálise compostos de cisão, correspondentes a uma massa í

; molecular de 50 a 40 kDa, e durante o armazenamento decompõe-se ’ i praticamente na totalidade em subunidades ainda mais pequenas • l

(inferiores a 40 kDa). Pelo contrário, as amostras tratadas duas vezes com Al(OH)^ mais QAE e ECTEOLA mantêm-se estáveis durante 48 horas. Isso está bem de acordo com as actividades de

I j factor VIII medidas durante o armazenamento e deve-se certameni te à reduzida actividade amidolítica dessas amostras.

Constitui objecto da presente invenção um concentrado i

de factor VIII altamente purificado, com uma boa recuperação | clínica e tempo de semi-vida, bem como um processo para a sua ξ preparação e pasteurização com um bom rendimento e elevada es; tabilidade, caracterizado por a matéria prima, em especial o h crioprecipitado, ser tratado após dissolução, durante tanto Ij tempo com adsorventes, tais como Al(OH)g, Ca^íPO^)^ e resinas '! de permuta iónica alcalinas (DEAE, QAE, ECTEOLA), até a solução se apresentar livre de actividade amidolítica, determinada na d preparação final.

J Esta determinação é possível com o substrato S-2222 ' da firma KABI (Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA), tal como é utilizado para a determinação do factor X; igualmente indicado é o BCP 200, Z-D-Leu-Gly-Arg-MNA, da Behringwerke AG, ou o ^RChromozym TH da firma Boehringer Mannheim GmbH.

j

Determinação do Factor VIII

A determinação do factor VIII faz-se por exemplo de

Η acordo com o seguinte processo:

Misturar 1 parte, por exemplo 0,1 ml de tromboplastina parcial, por exemplo preparada de acordo com a patente P i 23 16 430.9-52 (Ma 160) com uma parte de plasma deficiente em ί factor VIII e uma parte de plasma normal diluído. Manter esta mistura durante 6 minutos a 37°C. Após adição de uma parte de solução de cloreto de cálcio 0,025 molar aquecida a 37°C, determina-se o tempo que decorre desde a adição da solução de cloreto de cálcio até ao aparecimento de um coágulo. Para a determinação quantitativa lê-se o tempo de coagulação resultante da solução contendo factor VIII, a partir de uma curva de caliJ bração preparada com uma série de diluições de plasma normal.

• 1 unidade internacional (= 1 UI) de factor VIII corresponde à

actividade de factor VIII de 1 ml de plasma normal.

Determinação da actividade amidolítica

Esta determinação pode ser efectuada por exemplo seí gundo o princípio de uma determinação do factor X .

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Toma:

100 μΐ de amostra + 500 μΐ de solução tampão, 50 ! mmol/1 Tris/150 mmol/1 NaCl, pH 8.2 + 100 μΐ de substrato, BCP j! 200, 3 mmol/1 ou S-2222, 3 mmol/1.

ji Pré-incubar durante 5 minutos a 37°C e em seguida deh terminar a transformação do substrato durante 20 minutos a 37°C j: e 405 nm. Avaliação da actividade amidolítica segundo Delta !; OD/min.

H π As medidas para estabilização do factor VIII podem ji ser aplicadas, quase independentemente do material de partida, í a todos os processos de preparação até agora descritos, p.e. de acordo com a DE 34 32 083 ou EP 0 018 561 ou DE 34 32 083 ou EP 0 173 242, conforme se indica em seguida nos exemplos. Os tampões seguidamente utilizados são descritos após os exemplos.

! EXEMPLO 1 ! - Material de partida: 1 kg de crioprecipitado dissolvido em 3 1 de tampão de dissolução a + 37°C e em seguida tratado com:

i;

- 1 x 8% (v/v) de Al(OH)^: adsorver 4 1 de solução com 320 ml de Al(OH)g a 1% durante 15 minutos a + 25°C. Centrifugar o agente de adsorção durante 15 min a 3000 rpm, e adicionar ao ί sobrenadante da crio-solução adsorvida os agentes estabilizaj dores.

! - Estabilização e aquecimento:

Para tal, levar 4040 ml do sobrenadante do AKOH)^ a uma concentração final correspondente a 100%, através da adição de 4040 g de sacarose; em seguida adicionar 545,4 g de glicina correspondentes a 1,8 mol/1, e acertar a concentração de

J CaC^ _a 5 mmol/1. Acertar o pH da solução estabilizada a pH 'í 7,3 com NaOH 2,5N, e depois aquecer durante 10 horas a + 60 C.

Antes e depois do aquecimento determinou-se a aetividade do factor VIII:C, com 2,0 E/ml e 1,6 E/ml.

- Preparação da adsorção com DEAE de acordo com a DE 34 32 083: Diluir a crio-solução aquecida (6868 ml) com 6868 ml de tampão de diluição, e acertar a pH 5,5 com ácido acético 2N.

R

- Adsorção com DEAE- Sepharose C1-6B em processamento de lote:

Adsorver 13736 ml de crio-solução diluida, pasteurizada, com R

300 ml de DEAE- Sepharose CL-6B equilibrada, durante 4 horas ' à temperatura ambiente, e em seguida separar a Sepharose.

I p | - Lavagem da Sepharose e transferência para uma coluna:

! Lavar previamente a Sepharose carregada com factor VIII sobre i um filtro de porcelana, em seguida transferir para uma coluna i (0 7,2 cm) e tratar com 3 litros de tampão de lavagem.

! p i - Eluição da DEAE- Sepharose na coluna:

i p

Remover o factor VIII:C da DEAE- Sepharose lavada por meio de i uma solução de CaCl₂ contendo lisina e tamponada com acetato (0,3 mol/1), e levar o eluado, 195 ml, a uma concentração final de 0,75% através da adição de 1,46 g de sacarose.

- Diálise:

i Dialisar 195 ml de eluado contra 20 litros de tampão de diálise, durante 16 horas a + 4°C. Determinar o teor de proteii nas neste material (0D₂g_{0 nm} 1% = 10 mg/ml), determinar a aci tividade de factor VIII e calcular a aetividade específica;

o

Armazenar partes aliquotas num teste de provocação a 20 C, e determinar a aetividade de factor VIII após 24, 48 e 96 horas (ver tabela, ensaio 1).

j - Acerto da concentração e filtração para esterilizar:

Filtrar para esterilizar 218 ml de factor VIII:C dializado : através de filtros Sartorius; acertar a aetividade para 28

U/ml de factor VIII:C, vazar em recipientes e liofilizar.

EXEMPLO 2

- Material de partida: crioprecipitado, dissolver 1 kg com 3 ! litros de tampão de dissolução a + 37°C e depois tratar com:

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- 2 x 5% (v/v) de Al(OH)g; adsorver 4 litros de solução com respectivamente 2 x 200 ml de Al(0H)~ a 1% durante 15 minutos O a 25 C, em seguida centrifugar a 3000 rpm e juntar ao sobrenadante agentes estabilizadores para a pasteurização.

Estabilização e aquecimento: Para tal, levar os 4040 ml do sobrenadante do Al(OH)g a uma concentração final correspondente a 100% (p/v) através da adição de 4040 g de sacarose; em seguida juntar 545,4 g de glicina correspondentes a 1,8 mol/1 e acertar a concentração de CaC^ a 5 mmol/1. Acertar o pH da solução estabilizada a 7,3 com NaOH 2,5N, e depois aquecer durante 10 horas a + 60°C. Antes e depois do aquecimento determinar a actividade do factor VIII:C, com 2,0 U/ml e 1,9 U/ml.

Preparação para a adsorção com DEAE de acordo com a DE 34 32 083:

Diluir a crio-solução aquecida (6868 ml) com 6868 ml de tampão de diluição 1:2, e acertar a pH 5,5 com ácido acético 2N.

R

Adsorção com DEAE- Sepharose CL-6B em processamento de lote:

Adsorver 13736 ml de crio-solução diluída com 300 ml de R

DEAE- Sepharose CL-6B equilibrada, durante 4 horas à temperatura ambiente, e em seguida separar a Sepharose.

p

Lavagem da Sepharose e transferência para uma coluna;

Lavar previamente a Sepharose carregada com factor VIII sobre um filtro de porcelana, em seguida transferir para uma coluna (0 7,2 cm) e tratar com 3 litros de tampão de lavagem.

R

Eluição da DEAE- Sepharose na coluna:

R

Remover o factor VIII:C da DEAE- Sepharose lavada por meio de uma solução de CaCl^ (0,3 mol/1) contendo lisina e tamponada com acetato, e levar o eluado, 195 ml, a uma concentração final de 0,75% através da adição de 1,46 g de sacarose.

Diálise: dializar 195 ml de eluado contra 20 litros de tampão de diálise, durante 16 horas a + 4°C. Determinar o teor de proteinas neste material através da OD a 280 nm, determinar a actividade de faetor VIII e calcular a partir dos dois valores a actividade específica e o rendimento. Armazenar partes aliquotas num teste de provocação a 20°C, e determinar a

actividade de factor VIII após 24, 48 e 96 horas (ver tabela 1, ensaio 2),

- Acerto da concentração e filtração para esterilizar:

j Filtrar para esterilizar 218 ml de factor VIII:C dializado ί , \ através de filtros Sartorius; acertar a actividade para 28 U/ml de factor VIII:C, vazar em recipientes e liofilizar.

¹ EXEMPLO 3 d

Em analogia com o exemplo 1 adsorveu-se uma solução I de crioprecipitado fresco, primeiro com 1 x 5% (v/v) de A1(OH)~ d x ί e depois adsorveu-se o sobrenadante apos centrifugação com uma !' segunda quantidade de 58 (v/v) de A1(OH)₀ passados 5 minutos a lí n 3 _h 25°C juntou-se 3% (p/v) de ECTEOLA (120 g/2 1) e incubou-se du! rante 15 minutos. Após separação do agente de adsorção, obteve-se no sobrenadante, e conforme já descrito, o factor VIII altamente purificado, pasteurizado. Tal como se demonstra no ensaio 3 da Tabela, também assim se obtém um composto estável com bom rendimento e elevada actividade específica.

EXEMPLO 4

De acordo com o exemplo 1, dissolveu-se de novo 1 kg de crioprecipitado de fresco a 37°C, mas em seguida adsorveu-se apenas uma vez com

- 5% (v/v) de Al(0H)_o adsorver 4 1 de crioprecipitado dissolvil □

H do com 200 ml de Al(OH)g a 1%, a + 25°C durante 15 minutos, e em seguida centrifugar o agente de adsorção a 3000 rpm. Em seguida procedeu-se a uma chamada adsorção mista, com

- 1 x 5% (v/v) de A1(OH)₃ e 3% de QAE-^RSephadex-A50: Em primeiro lugar trataram-se os 4 litros do primeiro sobrenadante de A1(OH)₃ com 200 ml de AKOH)^ a 1%, e agitaram-se durante 5 minutos, antes de se adicionar 120 g de QAE-Sephadex-A50 huj medecido, adsorvendo-se com este composto durante 15 minutos a + 25 C. 0 sobrenadante obtido após centrifugação foi estaI bilizado de acordo com o exemplo 1, pasteurizado e purificado ' » R ; através de adsorção com DEAE- Sepharose. 0 rendimento, acti’ I vidade específica e estabilidade são indicados na Tabela (ver ensaio 4).

EXEMPLO 5

Tal como no exemplo 1, dissolveu-se 1 kg de criopreji cipitado com 3,0 1 de tampão e adsorveu-se com 200 ml de solujj ção de Al(0H)o a 1% durante 15 minutos a 25°C e separar o soI: 3 i brenadante por meio de centrifugação. Em seguida, tratá-lo da f seguinte forma:

^,! - respectivamente 1 x com 5% (v/v) de Al(0H)_o, 3% (p/v) de ,! r 3

QAE- Sephadex-A50 humedecido e 3% (p/v) de ECTEOLA humedecido; adicionar os agentes de adsorção com intervalos de 5 minutos, incubar durante 15 minutos a 25°C e centrifugar 15 mili jj nutos apos a adição de ECTEOLA (3000 rpm). Também a pasteuriI; zação e ultrapurificação foram efectuadas de acordo com o exemplo 1. 0 rendimento e propriedades do produto final enji contram-se indicados na Tabela, no ensaio 5.

jí ;i

EXEMPLO 6

De acordo com o exemplo 2 utilizou-se 1 kg de crioprecipitado dissolvido de fresco e adsorveu-se uma vez com 5% i (v/v) de AHOH)^ e em seguida adsorveu-se o sobrenadante da seguinte forma:

í : - 1 x com 5% (v/v) de Al(OH)g, depois oom 3% de QAE, e por fim com 1% de Ca^JPO^L·: em primeiro lugar foram tratados 4 litros jj □ τ· 2 j! do primeiro sobrenadante do A1(OH)~ com mais 200 ml de Al(OH)

I O a 1%, (5 minutos, 25 C), depois nas mesmas condições com 120

I R ! g de QAE- Sephadex A50 e por fim com 40 g de Ca_o(P0,. )_o durani o j 4 2 ι te 15 minutos a + 25 C. Todos os agentes de adsorção forma centrifugados em conjunto e após centrifugação adicionaram os agentes estabilizadores ao sobrenadanre, pasteurizou-se diluiu-se e purificou-se o factor VIII sobre DEAE-Sepharose de acordo com o exemplo 1. 0 eluado surpreende pela sua elevada actividade específica (ver ensaio 6 na Tabela).

Também os crioprecipitados tal como são tratados de . acordo com as EP 0 018 561 B1 ou EP 0 032 655 para obter con‘i centrados de factor VIII, conduzem com um bom rendimento a pro13 dutos estáveis e altamente eficazes, se os materiais de partida foram tratados por adsorção de acordo com a presente invenção. Tal é demonstrado no exemplo que se segue.

EXEMPLO 7

Dissolver 6 kg de erioprecipitado bruto com 18 litros de um tampão com a seguinte composição, a uma temperatura de 37°C: 0,08 mol/1 de NaCl, 0,27 mol/1 de glicina, 0,5 U/ml de heparina, 0,1 U/ml de AT III, pH 6,0. Obtêm-se 24 1 de crio-solução, que São adsorvidos primeiro com;

-1x5% (v/v) de al(0H)g:

Para tal, juntar a 25°C, aos 24 de da crio-solução bruta, 1,2 litros de Α1(ΟΗ)^ a 1%, agitar durante 15 minutos e centrifugar o agente de adsorção a 3000 rpm. Em seguida proceder a uma adsorção mista oom:

- 5% (v/v) de AKOH)^ ^e 3% de QAE-^Sephadex A50: a 24 litros do primeiro sobrenadante de Ai(OH)^ juntar uma vez mais 1,2 litros de Al(OH), a 1%, e agitar durante 5 minutos; em seguida

J p adsorver a solução com 720 g de QAE- Sephadex A50 durante mais 15 minutos a 25°C. 0 sobrenadante obtido após centrifugação é tratado de acordo com a Ma 339 (EP 0 018 561; USP 4 297 344) de modo a obter o concentrado de faetor VIII e liofilizado.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- 1a „ ΐ

; Processo para a preparação de Factor VIII es^! tável por tratamento de fracções de plasma que contêm Factor : VIII, como se utilizam correntemente para a preparação de FacI ί tor VIII, de preferência, de crioprecipitado dissolvido ou de í uma fracção de Cohn I, caracterizado por se tratar as referidas j fracções com adsorventes que ligam as enzimas e pro-enzimas !i |; amidoliticamente/proteoliticamente activas que degradam o Fac„ tor VIII, depois do que se pode obter um Factor VIII estável

Í!

j[ eventualmente pasteurizado com bom rendimento.

π r - 2ã Π

Processo para a preparação de Factcr VIII com elevada actividade específica e estabilidade, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se submeter uma solução que |í contém Factor VIII pelo menos a duas adsorções oom Al(0H)_o, um i d permutador de aniões ou Ca^PO^)^, antes de se recuperar o Factor VIII.

Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por se realizar a adsorção em diferentes adsorventes .

_ ip _

Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se tratar com um permutador básico com uma matriz hidrófila e agrupamentos aniónicos.

- 5² Processo de acordo com a reivindicação 2, ca16 f· ί

racterizado por se tratar com um permutador de aniões básicos com uma matriz à base de polissacáridos e agrupamentos aniónicos .

Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se realizar o tratamento a um valor de pH de li 6,5 - 7,5 e uma condutibilidade de 10 - 15 mS.

i!

,i Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se efectuar o tratamento com um meio que não j contém iões citrato nem outros captadores de iões metálicos bii valentes.

Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se adicionar dois adsorventes diferentes um de! pois do outro e, em seguida, se separar o sobrenadante.

I - 9ã j Processo de acordo com a reivindicação 2, ca! racterizado por se pasteurizar adicionalmente.

ii

- 10§ Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se utilizarem os adsorventes numa quantidade compreendida entre cerca de 20 - 30 gramas/litro.

i A requerente reivindica a prioridade do pedi-