JPH0733799A - 高比活性トロンビンおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 比活性が１０００単位／Ａ₂₈₀ 以上であるト
ロンビン。プロトロンビン複合体の状態にて、プロトロ
ンビンをトロンビンへの変換処理に付すことによるトロ
ンビンの製造方法、特に前記処理後、陽イオン交換体で
処理することによるトロンビンの製造方法。 【効果】 当該方法によって製造されたトロンビンは、
１０００単位／Ａ₂₈₀ もの高い比活性を有し、トロンビ
ン製剤として極めて有用である。また、当該トロンビン
は、溶液状態においても冷所で長期間安定である。従っ
て本発明の方法はトロンビンの製造方法として極めて実
用的なものであり、しかも得られる精製トロンビンは有
用な医薬品として臨床に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、高比活性を有するトロ
ンビンおよびその製造方法に関する。詳細には、高い比
活性を有しかつ安定なトロンビンであり、およびその製
造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】トロンビンは分子量約３４０００、等電
点約７．１のセリンプロテアーゼであり、血液凝固過程
の最終段階に働く蛋白分解酵素である。すなわち、フィ
ブリノゲンに作用してフィブリンを生成することにより
血液凝固作用を生じる。このため、トロンビンは臨床的
には外科領域における局所止血剤として、また内科領域
における上部消化管出血などの止血剤として用いられて
いる。

【０００３】トロンビンは、生体内においては前駆物質
であるプロトロンビンの形で存在しており、活性化Ｘ因
子などによって限定分解を受けて生成される。従来、ト
ロンビンの製造は、ヒトなどの血漿を原料として、まず
プロトロンビンを抽出、精製し、得られた精製プロトロ
ンビンにトロンボプラスチンなどを作用させて行われて
いる。すなわち、トロンビンへの変換は精製されたプロ
トロンビンを対象にして行われているのである。このよ
うに、トロンビンの製造は、まず上記の如く(1) プロト
ロンビンの精製からはじまり、(2) プロトロンビンから
トロンビンへの変換、(3) トロンビンの精製などの各種
の数工程を経て製造されているのが現状である。

【０００４】また、この方法を基本として各種の改良方
法が報告されている。例えば、クエン酸処理した血漿を
陰イオン交換体に接触させ、吸着したプロトロンビンを
当該交換体上でトロンビンに変換した後に溶出・回収す
る方法（米国特許第５１４３８３８９号）、血漿を低温
エタノール処理後、陰イオン交換体処理することにより
精製したプロトロンビンをトロンビンに変換し、更に陽
イオン交換体処理により精製する方法（特開平３−１２
８３９８号）などが知られている。

【０００５】しかし、これらの方法で取得されたトロン
ビンは、比活性が低くかつ極めて不安定であるという問
題があった。特に安定性に関しては、製剤化のためには
欠かせない条件であるため、従来よりトロンビンの安定
性を確保するための方法が様々講じられている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、比活
性の高いトロンビンを提供することである。また、本発
明のもう一つの目的は、比活性が高くかつ安定性の高い
トロンビンの製造方法を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、トロンビンに変換
する出発原料としてプロトロンビン複合体を用いること
により、比活性の高いトロンビンが簡便に製造できるこ
とを見出した。さらに本発明者らは、かかる方法で得ら
れたトロンビンが溶液状態においても冷所で長時間安定
であることを見出した。本発明者らは、本発明方法で得
られたトロンビンが、従来のトロンビンに比し極めて比
活性の高いものであることを確認して本発明を完成し
た。

【０００８】すなわち、本発明は１０００単位／Ａ₂₈₀
以上もの高い比活性を有するトロンビンである。さら
に、本発明はプロトロンビン複合体の状態にて、プロト
ロンビンをトロンビンに変換する処理に付することを特
徴とするトロンビンの製造方法である。

【０００９】本発明の方法において、プロトロンビンを
トロンビンに変換する処理に付す対象物は、プロトロン
ビン複合体である。ここで用いられるプロトロンビン複
合体は、血液凝固因子の１つであるプロトロンビン（血
液凝固第II因子）と共にその他の血液凝固に関係する因
子を含んだものである。プロトロンビンと共に含まれる
成分としては、例えば血液凝固第VII因子、第IX因子、
第Ｘ因子などが挙げられる。またこれは、高純度精製品
である必要はなく粗製品であってもよい。

【００１０】また、プロトロンビン複合体の由来および
その取得方法は特に制限されない。本発明方法は、プロ
トロンビン複合体自体またはプロトロンビン複合体を含
有するもの全てを変換処理の出発原料とすることができ
る。プロトロンビン複合体を含有するものとして、好ま
しくは血漿蛋白含有物が例示される。この場合、例えば
血漿そのもの、好ましくは血漿を当該複合体が含まれる
程度に適当な精製処理を施したものを、変換処理の原料
として使用することができる。血漿の由来も特に問わ
ず、例えばウシ由来のもの，ヒト由来のもの等が挙げら
れるが、好ましくはヒト由来のものである。

【００１１】血漿を精製処理して変換処理の原料である
プロトロンビン複合体とする場合において、血漿の精製
処理方法としては、公知の手段が用いられる。例えば、
特開昭６２−１００１９号公報および特開平３−１２８
３９８号公報に記載の方法が使用できる。具体的には、
血漿を陰イオン交換体で処理してプロトロンビン複合体
を調製する方法，血漿からクリオプレシピテートを除い
た脱クリオ血漿を用いてプロトロンビン複合体を調製す
る方法等が挙げられる。陰イオン交換体としては、ＤＥ
ＡＥ系（例えばＤＥＡＥ−アガロース，ＤＥＡＥ−デキ
ストラン，ＤＥＡＥ−セルロースなど）、ＱＡＥ系（例
えば、ＱＡＥ−アガロース，ＱＡＥ−デキストランな
ど）等が挙げられる。

【００１２】上記の手段で得られたプロトロンビン複合
体は、その複合体の状態でトロンビンへの変換処理に付
すことができる。変換処理として、プロトロンビンをト
ロンビンに変換する公知の方法を用いることができる。
例えば、プロトロンビンにＣａ⁺²の存在下にトロンボプ
ラスチン，ヘビ毒などを作用させる方法、高濃度クエン
酸塩による自然転化法等を用いることができる。

【００１３】本発明においては、特に当該変換処理の際
にベンズアミジン類（ベンズアミジン，ｐ−アミノベン
ズアミジンなど）を共存させておくことが好ましい。ベ
ンズアミジン類を共存させておくことにより、プロトロ
ンビンからトロンビンへの変換を安定な状態で実施で
き、収率よくトロンビンが取得できる。ベンズアミジン
類の添加量としては０．０００１〜０．１Ｍ程度、好ま
しくは０．０００１〜０．０１Ｍ程度が例示される。

【００１４】上記変換処理により得られた処理物は、次
にトロンビンの精製工程に付される。かかる精製方法と
しては、複合体の状態で変換したトロンビンを当該複合
体から単離しうる方法であるならいかなる方法をも使用
することができ、例えば陽イオン交換体による処理、硫
安分画処理、アフィニティクロマトグラフィー処理（リ
ガンドとして、例えばアルギニルメチルエステルあるい
はヘパリンナトリウムなどを用いることが好ましい。）
方法などが使用できる。好ましくは、陽イオン交換体処
理（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０（１３），ｐ２５
０１，１９７１年に記載の方法など）である。使用され
る陽イオン交換体としては、例えば、スルホエチル型
（スルホエチル−デキストラン，スルホエチル−アガロ
ース等），スルホプロピル型（スルホプロピル−デキス
トラン，スルホプロピル−アガロース等），カルボキシ
メチル型（カルボキシメチル−デキストラン，カルボキ
シメチル−アガロース等），アンバーライトＩＲＣ５０
等が挙げられる。

【００１５】陽イオン交換体処理は、トロンビンが他の
夾雑物から精製物として単離される条件のもとで行われ
る。具体的には、陽イオン交換体への吸着および洗浄
は、好ましくは０．０１〜０．１Ｍの塩化ナトリウムを
含有する０．０１〜０．０５Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ
６〜８程度）、あるいは０．０１〜０．１Ｍの塩化ナト
リウムを含有する０．０１〜０．２Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ６〜８程度）を用いることによって行われる。ま
た、溶出には０．０５〜０．３Ｍ、ｐＨ６〜８程度のク
エン酸緩衝液を用いることが好ましい。

【００１６】なお、透析、限外濾過、ゲル濾過などの公
知の手段により、さらに精製を行うこともできる。

【００１７】本発明においては、上記陽イオン交換体処
理の前に予め、プロトロンビン複合体変換処理物を炭素
原子数１〜１０個、特に２〜１０個のアルキル基を有す
るジアルキルホスフェートまたはトリアルキルホスフェ
ートと、特に好ましくは更に界面活性剤との共存下に接
触してウイルスを不活化（以下、ＳＤ処理という。）し
ておくほうがより好ましい。ＳＤ処理は公知の方法（特
開昭６０−５１１１６号公報、特開平３−２１８３２２
号公報）に準じて行うことができる。また、特に好まし
くはＳＤ処理時に安定化剤として、ベンズアミジン類
（ベンズアミジン、ｐ−アミノベンズアミジン等）、塩
基性アミノ酸（アルギニン、リジン等）あるいはε−ア
ミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）を添加し、共存状態で行う
方法である。添加量としては、ベンズアミジン類で０．
０００１〜０．１Ｍ程度、塩基性アミノ酸で０．１〜１
Ｍ程度、ＥＡＣＡで１〜１０％（ｗ／ｖ）程度（いずれ
も最終濃度）が例示される。

【００１８】上記ＳＤ処理時に用いられる界面活性剤と
して、好ましくは非イオン性界面活性剤であり、ポリオ
ール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル（Ｓｐ
ａｎ系）、ポリオキシエチレン・ソルビタン脂肪酸エス
テル（Ｔｗｅｅｎ系）、ポリオキシエチレン・アルキル
フェノールエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系）、ポリオキシエ
チレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン高級アルキ
ルエーテル等が挙げられる。具体的にはＴｗｅｅｎ８０
（別名ポリソルベート８０）、トリトンＸ１００、スル
ホベタイン等が例示される。

【００１９】上記の処理により、夾雑する各種蛋白（例
えば、フィブリノゲン、フィブリン、α₁ グロブリン、
α₂ グロブリン、βグロブリン、γグロブリン、プロテ
アーゼなど）から単離された精製トロンビンを得ること
ができる。かかるトロンビンの比活性は、少なくとも１
０００単位／Ａ₂₈₀ 程度であることが好ましい。ここで
１単位／Ａ₂₈₀ は１単位／ｍｇ蛋白に相当する。なお、
トロンビンの比活性は通常の測定方法により求めること
ができる。好ましくはヒト血漿をフィブリノーゲン源と
して、ＢＢＬフィブロメーターなどにより凝固時間を測
定することにより求める方法である。具体的には、生理
食塩液にて様々な割合で希釈された検体０．１ｍｌを３
７℃に２分間保ち、次いで３７℃に保たれていた血漿
０．２ｍｌを加え、凝固時間を測定することによって求
めることができる。

【００２０】当該トロンビンは自体公知の手法により製
剤化することにより高比活性を有するトロンビン製剤と
することができる。この際、必要に応じて、医薬上許容
される担体，添加剤などの添加および加熱，滅菌，除菌
濾過処理，分注小分け，凍結乾燥処理などが通常の方法
に準じて行われる。

【００２１】

【発明の効果】本発明により調製されたトロンビンは、
少なくとも１０００単位／Ａ₂₈₀ もの高い比活性を有す
る。従来品および市販品のトロンビン製剤の比活性が５
００〜６００単位／Ａ₂₈₀ 程度であることから、本発明
のトロンビンはトロンビン製剤として極めて有用であ
る。加えて、本発明により調製されたトロンビンは、溶
液状態においても冷所で長時間安定である。従って、本
発明の方法は、トロンビンの製造方法として極めて実用
的なものであり、しかも、調製された精製トロンビンは
有用な医薬品として臨床に提供することができる。

【００２２】

【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例を
挙げるが、本発明はこれらに何ら限定されるものではな
い。

【００２３】実施例１ プロトロンビン、トロンビンの
調製 ヒト血漿を凍結融解して得た脱クリオ血漿２リットル
を、０．０７５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１Ｍクエ
ン酸ナトリウムからなる緩衝液（ｐＨ７）で平衡化した
ＤＥＡＥ−デキストラン（商品名ＤＥＡＥ−セファデッ
クス、Ａ−５０、ファルマシア社製）に接触させて、プ
ロトロンビン複合体を吸着させた後に、１Ｍ塩化ナトリ
ウムおよび０．０１Ｍクエン酸ナトリウムからなる緩衝
液（ｐＨ７）で溶出した。溶出液を透析後にトロンボプ
ラスチン、２．５％塩化カルシウムおよび０．０８２Ｍ
ベンズアミジンを各々１／１０量ずつ添加して２５℃で
３時間加温した。ｐＨを７に調整し、トリ−Ｎ−ブチル
ホスフェート（ＴＮＢＰ）、Ｔｗｅｅｎ８０およびＥＡ
ＣＡを各々、最終濃度で０．３％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ
／ｖ）および４％（ｗ／ｖ）となるように添加し、３０
℃で６時間加温した。次に、上記反応液をｐＨを６．７
に調整し、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．
７）で平衡化したスルホプロピル−デキストラン（商品
名ＳＰ−セファデックス Ｃ−５０、ファルマシア社
製）に接触させて、トロンビンのみを吸着させた。かか
るカラムを０．０２Ｍクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ
６．７）、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）、次
いで０．０４５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）溶液で
洗浄後、吸着させたトロンビンを０．１Ｍクエン酸ナト
リウム溶液（ｐＨ７）で溶出・単離した。溶出液をペリ
コン（分画分子量１万：ミリポア社製）にて濃縮し、除
菌濾過して精製トロンビンを調製した。各精製工程にお
いて、得られるプロトロンビン、トロンビンの精製度
（比活性、回収率）を表１に示す。

【００２４】

【表１】

【００２５】実施例２ プロトロンビン、トロンビン
の調製 ヒト血漿を凍結融解して得た脱クリオ血漿を、０．０７
５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１Ｍクエン酸ナトリウ
ムからなる緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＤＥＡＥ−セ
ファデックス Ａ−５０に接触させ、０．１５Ｍ塩化ナ
トリウムおよび０．０１Ｍクエン酸ナトリウムからなる
緩衝液（ｐＨ７）で洗浄後、１Ｍ塩化ナトリウムおよび
０．０１Ｍクエン酸ナトリウムからなる緩衝液（ｐＨ
７）で溶出した。溶出液に２．５％塩化カルシウムおよ
びトロンボプラスチンを各々１／１０量ずつ添加して１
５℃で３時間加温した。ｐＨを７に調整し、トリ−Ｎ−
ブチルホスフェート（ＴＮＢＰ）、Ｔｗｅｅｎ８０およ
びＥＡＣＡを各々、最終濃度で０．３％（ｗ／ｖ）、１
％（ｗ／ｖ）および４％（ｗ／ｖ）となるように添加
し、３０℃で６時間加温した。次に、上記反応液をｐＨ
を６．７に調整し、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ６．７）で平衡化したスルホプロピル−デキストラン
（商品名ＳＰ−セファデックス Ｃ−５０、ファルマシ
ア社製）に接触させて、トロンビンのみを吸着させた。
かかるカラムを０．０２Ｍクエン酸ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ６．７）、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）、
次いで０．０４５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）溶液
で洗浄後、吸着させたトロンビンを０．１Ｍクエン酸ナ
トリウム溶液（ｐＨ７）で溶出・単離した。溶出液をペ
リコン（分画分子量１万：ミリポア社製）にて濃縮し、
除菌濾過して精製トロンビンを調製した。

【００２６】比較例１ プトロンビン単体からのトロ
ンビンの調製 コーンの第II＋III 抽出画分から０．１Ｍ塩化ナトリウ
ム溶液でプロトロンビンを単体の形で抽出した。得られ
た抽出液をｐＨ６．７に調整した後、１％塩化カルシウ
ム（１／１０量）、トロンボプラスチン（１／１０量）
および血漿（１／４０量）を添加して２０℃で３時間加
温した。この反応液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．
５）で平衡化させておいた陰イオン交換体（ＳＰ−セフ
ァデックスＣ−５０，ファルマシア製）に接触させ、
０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）にて吸着させた
トロンビンを溶出させた。溶出液に、０．３％（ｗ／
ｖ）ＴＮＢＰ、１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および４
％（ｗ／ｖ）ＥＡＣＡを添加し、３０℃で６時間加温し
た（ＳＤ処理）。得られた反応液を０．０２Ｍクエン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させておいたアフィニテ
ィカラム（カラム：ヘパリントーヨーパール，トーソー
社製）に付し、０．３Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
でトロンビンを溶出した。この溶出液を限外濾過膜（分
画分子量１万）にて濃縮し、除菌濾過して精製トロンビ
ンを調製した。

【００２７】実験例１ 実施例１で取得された本発明のトロンビンの各性状を、
比較例１で得られたコーンの第II＋III 抽出画分から調
製したトロンビン精製品および市販のトロンビン製剤
（化血研製）と比較した。 (1)比活性 トロンビン力価および２８０ｎｍでの吸光度を測定し、
その比活性を比較した。その結果、本発明のトロンビン
は１０００単位／Ａ₂₈₀ であるのに対して、第II＋III
抽出画分由来のものは５５５単位／Ａ₂₈₀ 、市販品は５
８２単位／Ａ_{28 0} であった。 (2)分布 セルロースアセテート電気泳動の結果、本発明のトロン
ビンはβ画分が１００％であるのに対して、第II＋III
抽出画分由来のものは５５％、市販品は９２％であっ
た。 (3)分子量測定 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（ファストシステム、ファ
ルマシア社製）の結果、本発明のトロンビンは非還元下
で、分子量３万４千の単一バンドとして確認されたが、
第II＋III 抽出画分由来のものおよび市販品では分子量
３万４千のバンド以外に高分子側、低分子側にバンドが
認められた。 高速液体クロマトグラフィーによるゲル濾過分析（カ
ラム：ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ（トーソー
製），移動相：０．２Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸
緩衝液 (pH 6.8), 流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ，検出波
長：２８０ｎｍ）を行った結果、本発明のトロンビンは
保持時間１３．２分付近に単一のピークとして得られた
のに対して、第II＋III 抽出画分由来および市販品では
保持時間１３．２分付近のピークの他に夾雑ピークが出
現した。 (4)安定性 実施例１のトロンビンを５００単位／ｍｌおよび１７０
０単位／ｍｌの溶液状態で２５℃で７日間保存した場
合、トロンビン力価の低下は見られず安定であった。一
方、市販品を１０００単位／ｍｌの溶液状態で同様に保
存したところ、２０％程度力価が低下した。

【００２８】

【表２】

【００２９】実験例２ 実施例２のトロンビンの安定性 実施例２で得られたトロンビンを用いて、６０００単位
／ｍｌ，ｐＨ６、１０００単位／ｍｌ，ｐＨ５．５およ
びｐＨ６の検体溶液を調製し、１０℃および２５℃で８
週間保存した後のトロンビン力価の残存率を調べた。そ
の結果、本発明方法で調製されたトロンビンは、溶液状
態、通常の冷蔵保存（１０℃）において、少なくとも８
週間は安定であることがわかった。

【００３０】

【表３】

【００３１】参考例１ トロンビンへの変換反応の条
件の検討 トロンビンへの変換反応開始１時間後に各種安定化剤
を添加し、添加後４時間経過後のトロンビン活性の残存
率から、安定化剤のトロンビンに対する安定化効果を調
べた

【００３２】

【表４】

【００３３】安定化剤を最初から添加した状態でトロ
ンビンへの変換反応（２５℃，３時間）を行った。表４
に各種安定化剤のトロンビンに対する安定化効果を示
す。

【００３４】

【表５】

【００３５】上記およびの結果、一番効果のあっ
たベンズアミジンの濃度をかえた場合の安定化効果につ
いて検討した。

【００３６】

【表６】

【００３７】参考例２ 各種添加剤を共存させてＳＤ処理時の安定化条件を検討
した。使用した添加剤およびその濃度を表７に記載す
る。これらの添加剤の共存下に３０℃で６時間処理し
た。結果を表７に示す。

【００３８】

【表７】

【００３９】安定化剤であるアルギニン（表８）およ
びＥＡＣＡ（表９）の添加濃度と安定化効果の関係を確
認した。

【００４０】

【表８】

【００４１】

【表９】

【００４２】アルギニンを添加する場合は最終濃度０．
４Ｍ以上で安定化効果が認められた。また、ＥＡＣＡの
場合は１％ｗ／ｖ以上の添加であれば安定化効果がある
ことが判明した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 森定 康明 大阪市都島区都島中通３−５−44 株式会 社ミドリ十字都島工場内 (72)発明者 松本 勇彦 大阪市都島区都島中通３−５−44 株式会 社ミドリ十字都島工場内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 比活性が１０００単位／Ａ₂₈₀ 以上であ
   るトロンビン。
2. 【請求項２】 プロトロンビン複合体をトロンビンへの
   変換処理に付することを特徴とするトロンビンの製造方
   法。
3. 【請求項３】 プロトロンビン複合体をトロンビンへの
   変換処理に付し、得られた処理物を陽イオン交換体で処
   理することによりトロンビンを回収することを特徴とす
   るトロンビンの製造方法。