JP2594256B2 - ウロキナーゼの殺菌方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ウロキナーゼのパスツール殺菌方法に関す
る。この方法により得られるウロキナーゼは血栓溶解剤
として用いることができる。

プラスミノーゲンは触媒の作用の下にプラスミンに転
化される。ウロキナーゼはこの反応の触媒の１つであ
る。ウロキナーゼは例えば人尿中に微量存在する。ウロ
キナーゼを血栓溶解に用いることは知られている。商業
的に入手しうるウロキナーゼ製品がしばしば高分子量
（分子量54,000）および低分子量（分子量33,000）型の
ウロキナーゼから成ることも既に知られている。高分子
量ウロキナーゼ（HMW−UK）は天然型の分子に相当する
のに対し、低分子量型（LMW−UK）はHMW−UKのタンパク
分解生成物である。

天然型に対応しているのでHMW−UKの方が治療目的で
投与するのに好ましい。低分子量型への転化が自触媒作
用により、あるいは汚染プロテアーゼにより引き起こさ
れるかどうかは明らかでない（J.Biochem.90（225−23
2）1981;Thromb.Res.23（541−547）1981参照）。

ウロキナーゼの単離および精製には各種の方法が既に
報告されている。これらの方法は主として、好ましくな
いHMW−UK:LMW−UK比を有するウロキナーゼ生成物を製
造することになる。

HMW−ウロキナーゼの取得方法が西独特許出願公開第
2,815,853号明細書に記載されている。この方法を用い
た場合の収量は、LMW画分が除去されるために、そして
またHMW−ウロキナーゼの分解が止められないために極
めて低い。

本発明の目的は、高割合の尿中にみられるようなHMW
−ウロキナーゼおよび高い安定性を有するウロキナーゼ
調整物を製造することにある。

驚くべきことに、ウロキナーゼを溶液から陽イオン交
換体上に結合させそして段階的濃度勾配溶出を行うこと
によりウロキナーゼを随伴タンパクから好収率で分離で
き、そしてこの精製方法によりHMW−ウロキナーゼの安
定性が相当に高められることを見出した。更にまた、驚
くべきことに、ウイルスを不活性化させるために熱処理
する際のHMW−ウロキナーゼの分解を、ウロキナーゼ溶
液を10,000〜100,000IU/mlの濃度に希釈するか、または
６以下、好ましくは４〜5.95のpHに調節することにより
防止できることを見出した。

これら３つの手順を組合せることができる。

すなわち、本発明は、タンパク分解活性を有する異物
質が除去され、そして高い安定性を有する生成物を好収
率で製造できるウロキナーゼの精製方法に関する。

本発明はまた、HMW−UKの割合およびウロキナーゼ活
性を大して低下させることのないウロキナーゼの溶液の
パスツール殺菌方法にも関する。

本発明は特に、ウロキナーゼの溶液を陽イオン交換体
と接触させ、タンパク分解活性を有する不純物を段階的
溶出によりそれを担持した交換体から除去しそしてウロ
キナーゼを溶出することよりなるウロキナーゼの精製方
法に関する。

例えば尿を出発溶液として用いることができる。

本発明はまた、ウロキナーゼの溶液を６以下のpH、好
ましくは４〜5.95、そして、10,000〜100,000IU/mlのウ
ロキナーゼ濃度に調節し、次いで単糖類または二糖類ま
たは糖アルコール、および場合によりアミノ酸の存在下
に40〜90℃、好ましくは55〜65℃の温度で、少くとも１
時間、好ましくは８〜20時間加熱することによりなる、
熱処理によるウロキナーゼの溶液中の病原性ウイルスの
失活化方法にも関する。次にそのウロキナーゼの溶液は
濃縮しそして過により減菌することができる。糖類の
濃度は好ましくは400〜600g/であり、またアミノ酸の
それは好ましくは１〜３モル／である。

本発明はまた、特に注射、潅流または類似の方法によ
り投与されうる、この方法により製造された生成物を治
療目的に使用することに関する。

ウロキナーゼ含有水性溶液が干渉量の塩類を含有する
場合には、これらをそれから実質的な程度除去するのが
有利である。

他の望ましくない随伴タンパクは、場合により、例え
ば陰イオン交換体を用いて除くことができる。

好ましい方法は、場合によりウロキナーゼ含有溶液か
ら塩類を除去し、場合によりその低塩類濃度の溶液を陰
イオン交換体と接触させ、そしてその交換体を除去し、
場合により上清あるいはまた脱塩された溶液をpH5〜
６、好ましくは5.4〜5.6に調節しそしてそれを陽イオン
交換体、好ましくはCM−セルロースと接触させることよ
りなる。その陽イオン交換体を好ましくはpH5.5で、そ
して好ましくは５〜10mSi（20℃）の伝導度を有する緩
衝液で洗浄し、そしてそのウロキナーゼをpH5.5〜9.5、
好ましくは6.5〜９で、そして好ましくは20〜30mSi（20
℃）の伝導度を有する緩衝液で溶出する。

特に好ましい態様においては、ウロキナーゼ含有溶液
例えば尿を場合により脱塩し、不純物を場合により陰イ
オン交換体で処理することにより除去し、その溶液をpH
5.5に調節し、そしてCM−セルロースを添加しそして次
に除去しそして、0.07モル／の酢酸ナトリウムと0.5
モル／のグリシンを含有するpH5.5の緩衝液（伝導度:
0〜5mSi;20℃）で洗浄し次いで0.15モル／の酢酸ナト
リウムと0.5モル／のグリシンを含有するpH5.5の緩衝
液（伝導度:5〜10mSi;20℃）で洗浄し、そして次にその
ウロキナーゼをpH9の緩衝液（伝導度:20〜30mSi:20℃）
で溶出するというような方法とすることができる。

更にまた、溶出液を5.5のpHに調節し、そして単糖類
またはオリゴ糖類または糖アルコール、好ましくは1kg/
のシユークロースおよび場合によつては水溶性アミノ
酸、好ましくは112g/のグリシンの添加後、10,000〜1
00,000IU/ml、好ましくは50,000IU/mlのウロキナーゼ最
終濃度で60℃で10時間加熱しそして濃縮しそして過に
より滅菌するようにして本発明方法を行うこともでき
る。

前述の方法により製造された生成物は当初の溶液に相
当するHMW/LMW−ウロキナーゼ比および高純度を有する
と同時に良安定性を有している点で区別される。

例えば、高分子量ウロキナーゼ／低分子量ウロキナー
ゼ比が70/30の出発材料を用いた場合には、85％の収率
および90％を超える純度で得られた生成物は同じHMW−U
K/LMW−UK比を有した。陽イオン交換体の洗浄を省略す
ると、生成物中のHMW/LMW比は55/45であり、収率は90％
であり、そして純度は60％を下回つた。この場合には、
最終生成物の安定性もより低かつた。溶液を室温で放置
すると、そのポリマー比は低分子量画分優勢にシフトし
た。HMW−UK/LMW−UK比はモノ−Ｓ−カラム（FPLC−Pha
rmacia）で２つの型を分離後、アミド分解活性の測定に
よつて測定した。

最終生成物の収率およびポリマー比はまた加熱段階で
のpHにも依存する。そのpHは、約5.5とするのが有利で
あり、そのpHでは、好ましい高分子量ウロキナーゼ／低
分子量ウロキナーゼ比が得られしかも収率は極めて良好
である。

本発明を次の実施例により詳細に説明する。

実施例 1. 精製 ウロキナーゼ含有出発溶液から４℃でのゲル過によ
り塩を除去し、そしてその溶出液を集め、そしてpH8でD
EAE−セルロースを用いそれから不純物を除去した。300
g/のシユークロースおよび37.5g/のグリシンをその
溶出液に添加し、そのpHを塩酸で5.5に調節し、そして
４℃で、0.07モル／の酢酸ナトリウムと0.5モル／
のグリシンを含有しそして5.5のpHを有する溶液で平衡
させたCM−セルロースを添加し、そしてその混合物を１
時間撹拌した。そのゲルを吸引乾燥し、平衡緩衝液で洗
い、カラムに充填しそして0.15モル／の酢酸ナトリウ
ムと0.5モル／のグリシンを含有するpH5.5の緩衝液
（伝導度:7.8〜8.1mSi、20℃）で洗浄し次いでウロキナ
ーゼを0.2モル／の酢酸ナトリウムと0.5モル／のグ
リシンを含有するpH9.0の溶液（伝導度:26〜30mSi、20
℃）を用いて溶出した。

2. ウイルス不活性化 前記溶出液１あたりに1kgのシユークロースおよび1
12gのグリシンを添加し、そのpHを塩酸で5.5に調節し、
ウロキナーゼ濃度を50,000IU/mlに希釈し、次いでその
溶液を60℃で10時間加熱した。ウロキナーゼの加熱した
溶液を濃縮し、次いで過により滅菌した。

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ウロキナーゼ含有溶液を６より低いpH値お
   よびウロキナーゼ濃度10,000〜100,000IU/mlに調整し、
   該溶液を400〜1,000g/のシュークロースおよび１〜３
   モル／のグリシンの存在下、40〜90℃で少なくとも１
   時間加熱することを特徴とするウロキナーゼ含有溶液の
   殺菌方法。
2. 【請求項２】ウロキナーゼ含有溶液のウロキナーゼ濃度
   を50,000IU/mlに調整する特許請求の範囲第１項記載の
   方法。
3. 【請求項３】ウロキナーゼ含有溶液のpHを5.5に調整す
   る特許請求の範囲第１項または第２項記載の方法。