PT92146B

PT92146B - Processo para a preparacao do inibidor de glicosidade salbostatina e de composicoes farmaceuticas que a contem

Info

Publication number: PT92146B
Application number: PT92146A
Authority: PT
Inventors: Laszlo Vertesy; Hans-Wolfram Fehlhaber; Arno Schulz
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1988-10-28
Filing date: 1989-10-27
Publication date: 1995-06-30
Also published as: DK171329B1; JPH02196780A; CA1338185C; JP2942574B2; EP0366060B1; IE63272B1; EP0366060A1; DE58907085D1; DK537389D0; PT92146A; ATE102196T1; ES2063097T3; DK537389A; DE3836675A1; US5091524A; IE893482L

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 92 146

REQUERENTE: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, indus trial e comercial, com sede em D-6230 Frank furt am Main 80, República Federal Alemã.

EPÍGRAFE: ·· PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DO INIBIDOR

DE GLICOSIDASE SALBOSTATINA E DE COMPO SIÇQES FARMACÊUTICAS QUE A CONTÉM

INVENTORES: Dr.László Vértesy, Dr.Hans-Wolfram Fehlhaber e Dr.Arno Schulz.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

República Federal Alemã, em 28 de Outu bro de 1988, sob ο η®. P 38 36 675.4.

INPI. MOD. 113 R F 10732

Descrição referente à patente de invenção de HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-6230 Frankfurt am Main 80, República Federal Alemã, (inventores: Dr. László Vertesy, Dr. Hans-Wolfram Fehlhaber e Dr. Arno Schulz, residentes na Alemanha Ocidental), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE INIBIDOR DE GLIÇOSIDADE .SALBOSTATINA E DE CQMP2ãI£®ES_FARMACÊUTICAS_2UE_A_CONTÊM .

Descrição

A presente invenção refere-se ao pseudo-disacarídeo salbostatina, biologicamente activo, aos seus sais fisiologicamente aceitáveis, ao processo para a sua preparação, bem como à sua utilização em farmácia e na protecção fitossanitária.

A salbostatina é um pseudo-disacarídeo básico não redutível, o qual é caracterisado pela fórmula I e pelas propriedades físicas ou químicas.

Z_.C._

Ja foram descritos diversos pseudo-disacarídeos básicos com acção inibidora de enzimas, na literatura (ver Patentes americanas 4 062 950, 4 065 557, 4 254 256, e além disso E.

jTruscheit et al, Angew. Chem. 93, 738-755, (1981)). Estes têm propriedades de inibição de sacarose e maltose ou propriedades ianti-microbianas e podem ser utilisados por exemplo no tratamento de Diabetes mellitus ou como antibióticos.

A substância salbostatina de acordo com a invenção possui uma eficácia como inibidor de glicosidase e presta-se por conseguinte para utilização na farmácia e na protecção fitos sanitária.

j A salbostatina possui a seguinte configuração:

Não foi descrito ainda até ao presente um éter básico, cíclico, não redutor desta natureza.

Pertencem também aos objectivos da presente invenção os equivalentes químicos evidentes, bem como sais fisiologicamente aceitáveis da salbostatina, especiaimente sais de adição de ácido, como por exemplo o cloridrato, que se podem preparar de forma genericamente conhecida por si.

t.C. 1

A invenção refere-se ainda a um processo para a preparação da salbostatina, o qual se caracteriza pelo facto de

a) se cultivar num meio nutriente o microorganismo obtido comerciaimente Streptomyces albus (ATCC 21 838) bem como as suas variantes e mutantes, até o composto de fórmula I se acumular suficientemente na cultura, e

b) eventualmente se isolar, purificar e obter os derivados do composto acima.

i _x

Numa solução nutriente que contem uma fonte de carbono e uma fonte de azoto,bem como os sais inorgânicos habitualmente utilizados com esta finalidade, o Streptomyces albus ATCC 21 838, produz entre outras substâncias a salbostatina.

ξ Em vez da estirpe ATCC 21 838 podem naturalmente ser

I também utilizados os seus mutantes e/ou variantes, desde que sintetizem o composto de acordo com a invenção. Estes mutantes podem ser produzidos de forma conhecida por si por radiação ultravioleta ou raios X, ou com mutagéneos químicos, como por exemplo etanossulfonato de metilo (sulfonato de etilmetilo, EMS) ou 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona (MOB).

Como fontes de carbono preferidas para a fermentação aeróbica prestam-se por exemplo hidratos de carbono assimiláveis e açúcar-álcoois, tais como glucose, lactose ou D-manite, bem como produtos naturais contendo hidratos de carbono, tais como extracto de malte e óleos e gorduras. Como nutrientes contendo azoto interessam entre outros: aminoácidos, peptídeos e proteínas, assim como os seus produtos de degradação como peptonas ou triptonas, e ainda extractos de carne, gérmens moídos, por exemplo de milho, trigo, feijão, soja ou de algodoeiro, resíduos de destilação da preparação de bebidas alcoólicas, farinha de carne ou extractos de leveduras, mas também sais de amónio e nitratos . Como outros sais inorgânicos a solução nutriente pode conter por exemplo cloretos, carbonatos, sulfatos ou fosfatos, tanto de metais alcalinos como de metais alcalinoterrosos, ou de oligoelementos como por exemplo ferro, zinco, cobalto e manganês.

A formação da salbostatina decorre particularmente bem numa solução nutriente que contém 0,1 a 15% de componentes nutrientes, tais como farinha de soja, óleo de soja e manite, especialmente 0,1 a 3% de cada um referido ao peso global da solução nutriente. A fermentação é realizada de preferência por via aeróbica, por exemplo submersa com agitação interna ou externa em balões de agitação, ou fermentadores, eventualmente com introdução de ar ou de oxigénio. A fermentação pode ser realizada numa gama de temperaturas de cerca de 18 a 35°C, preferivelmente a cerca de 25 a 30°C, especialmente a 28 até 30°C. 0 intervalo de pH deve situar-se entre 6 e 8, preferivelmente entre 6,5 e 7,5. Nestas condições a calda de cultura, após 6 a 15 dias, apresenta geralmente um valor nominal da concentração da salbostatina.

É vantajoso promover-se a cultura em vários passos, isto é, prepara-se primeiro uma ou mais pré-culturas num meio nutriente líquido com que se inocula depois o meio de produção propriamente dito, a cultura principal, por exemplo numa proporção volumétrica de 1:10. A pré-cultura é obtida por exemplo inoculando-se um micélio com esporos numa solução nutriente e deixando crescer durante cerca de 80 a 400 horas. O micélio com esporos pode ser obtido deixando crescer a estirpe cerca de 12 dias sobre uma base nutriente sólida ou líquida, por exemplo levedura-malte-agar.

A evolução da fermentação pode ser acompanhada com base no valor do pH da cultura ou no volume de micélio, ou por ensaio da actividade biológica. A salbostatina está contida tanto no micélio como também no filtrado da cultura. A quantidade principal da salbostatina é no entanto encontrada em geral no filtrado da cultura.

isolamento do composto mencionado do meio de cultura é realizado de acordo com métodos conhecidos, tendo em conta as propriedades químicas, físicas e biológicas do produto, como por exemplo cromatografia em permutadores de iões, crivo molecular, resinas de adsorção e suportes de fase reversa, por precipitação com dissolventes , osmose reversa e outras .

É ainda vantajoso separar a fase aquosa do micélio, por exemplo por filtração ou centrifugação, e isolar e purificar a salbostatina em cada uma das fases .

Um processo preferido consiste em se extrair com butanol o filtrado da cultura para remoção de gorduras e concentrar a fase aquosa em vácuo. 0 concentrado aquoso, depois de

diluído com uma quantidade de dupla até quíntupla de metanol, é submetida a centrifugação para eliminação das substâncias de peso molecular elevado precipitadas . A partir do sobrenadante aquoso-metanólico isolam-se primeiro com permutadores de iões fortemente ácidos, como por exemplo Dowex 50 WX 2, os constituintes básicos. Em seguida, com um permutador de aniões como !por exemplo Amberlite IRA-68, eliminam-se destes as substâncias anfóteras. A fracção básica remanescente contém a salbosjtatina. Depois da eliminação de sais com auxílio de um crivo ( R) molecular, como por exemplo Sephadex LH-2, por separação por meio de cromatografia em permutadores de iões e novamente eliminação dos sais, obtém-se a salbostatina pura. Os espectros !^H-RMN da salbostatina pura estão representados na fig. 1. O espectro a) foi tomado em d -DMSO a 400 MHz e 300 K; o desvio quíI v mico está referido ao TMS. O espectro b) foi tomado em d.-DMSO b

com adição de 1% de água a 300 K.

A salbostatina de acordo com a invenção presta-se como inibidor de glicosidase para aterapia de doenças do metabolismo do homem e dos animais de sangue quente.

Como inibidor da trehalase a salbostatina presta-se também como meio de protecção fitossanitária. A trehalase é uma importante substância de reserva energética para insectos, fungos e também no mundo vegetal, por exemplo em alguns grãos de polen. No processo do metabolismo da trehalase, que não tem qualquer importância para os animais de sangue quente, intervém sempre o enzima hidrolítico trehalase. Se se inibir este enzima pode-se então descobrir selectivamente os organismos que são dependentes da trehalase.

A inibição do enzima trehalase por meio de saibostatina é muito eficaz. Mesmo em soluções 10 a 10 molares de salbostatina o enzima é inibido de 50%. Ensaios enzimocinéticos mais profundos mostraram que a salbostatina inibe a trehalase competitivamente em relação à trehalose. A constante de inibi„ -7 dor Ki e de 1,8 x 10 M.

A presente invenção refere-se ainda a composições farmacêuticas, bem como a meios de protecção fitossanitária , que contem o composto de acordo com a invenção e que podem ser preparadas de acordo com métodos gerais conhecidos (ver por

L.C

exemplo EP 0 240 853 e EP 0 224 0 24 ) .

Ensai o_de_trehala se

O ensaio da trehalase baseia-se na determinação colorimétrica de D-glucose que é libertada pela trehalase da trehalose.

A trehalase (Sigma ns τ 8778) foi diluída antes do começo do ensaio a 1:1000 em tampão de fosfato 20 mM pH 6,5. A trehalose foi dissolvida na concentração 0,1 M em ácido 2-(N-morfolino)-etanossulfónico 0,1 M.

Para o começo do ensaio misturaram-se 100 >ul de cada água, trehalose e trehalase e incubou-se 30 minutos a 37°C. A reacção foi parada por aquecimento do preparado reactivo a 100°C. A toma de controle foi parada imediatamente (minuto 0) por fervura. A salbostatina foi adicionada igualmente em diversas concentrações em vez da água, aos preparados reactivos.

A glucose libertada da trehalose foi determinada colorimetricamente. Para isso a glucose foi submetida a reacção por meio de glucose-oxidase e o peróxido de hidrogénio formado foi utilizado para oxidação de o-dianisidina . A o-dianisidina oxidada foi determinada num fotómetro. Todos os reagentes mencionados acima para a determinação da glucose foram retirados do glucose-kit da firma Sigma (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, Alemanha) (ns 510-DA) e o ensaio foi realizado em estrita observância com o protocolo que o acompanha.

Exemplo 1

Obtenção da salbostatina por fermentação (2000 litros)

Para a obtenção por fermentação do inibidor de glicosidase de acordo com a invenção realiza-se a cultura do microorganismo produtor Streptomyces albus ATCC 21 838 - como é corrente em microbiologia - a partir de uma forma permanente liofilizada desta estirpe. A cultura realiza-se primeiro sobre um meio nutriente sólido em placas de Petri esterilizadas. As colónias individuais são em seguida cultivadas em tubos inclinados e com estas culturas realiza-se a produção em massa de esporos, necessários para a fermentação, em frascos Roux .

Meio de agar para passagens sobre o meio nutriente sólido: Dextrina 15,0 g/1

Açúcar de cana 2,0 g/1

Extracto de carne	1,0	g/i
Extracto de levedura	2 , 0	g/i
sal	0,5	g/i
^k2^HPO4	0,5	g/i
FeSO. 7HO 4 2	0,01	g/i
Agar-Agar	2 ,0	g/i
pH	7,3
Esterilização a	120°	c,
Incubação a	30°	c,

min.

dias material obtido por arrastamento dos esporos com água de um balão Roux foi tomado em 100 ml de água esterilizada e serviu como inoculo para a preparação do ls precursor de fermentação vegetativa submersa (volume de trabalho 1,2 1).

Meio precursor:

Amido solúvel	4	,0	g/i
glucose	1	,0	g/i
caseina-peptona	1	,0	g/i
cornsteep líquido	0	,4	g/i
farinha de soja	0	,4	g/i
sulfato de amónio	0	,8	g/i

8,3

120°C,

18°C ,

0 min.

dias numa máquina de agitação a 150 rpm e 5 cm de amplitude. Passadas 48 horas o conteúdo de um balão de Fernbach com a ls pré-cultura assim obtida (ver acima) foi utilisado como inoculo para o 22 precursor de 200 1, utilisando-se também aqui o meio de precursor (ver acima). 0 tempo de esteri1isação foi de 30 min. A incubação foi realizada durante 48 h a 28°C sob agitação, com uma velocidade periférica de 5 m/seg e uma taxa de arejamento de 0,1 vvm.

O conteúdo da 2s pré-cultura serviu como inoculo para a fermentação principal.

Meio da fermentação principal:

farinha de	amendoim	30 ,0	g/i
cornsteep	sólido	10 , 0	g/i
fécula de	milho	20 ,0	g/i

40,0 g/1 5,0 g/1 5,0 g/1 8,0 g/1

6,8

120°C, dextrina sulfato de amónio sulfato de magnésio, 71^0 carbonato de cálcio PH esterilisação a

0 min.

A fermentação principal foi realisada a 28 C sob agitação com uma velocidade periférica de 4 m/seg. e uma taxa de arejamento de 0,6 vvm. A formação do inibidor de acordo com a invenção começou ao fim de 4 dias e alcançou o seu máximo depois de 10 a 12 dias. Depois de se alcançar o máximo de fermentação recolheu-se o conteúdo do fermentador. 0 rendimento em salbostatina de fórmula I estava compreendido entre 0,5 e 5 mg/1 da solução de cultura.

t.C.

Exemplo 2

I^ol amen t o_âa_salbo s^t a t i na_a_pa r ti r_da_s ol H2ão_de_cult ur a

2000 1 da solução de fermentação de acordo com o exemplo 1 foram separadas da massa celular por meio de filtro de prensa e o líquido límpido foi extraído 2 vezes, utilisando de cada vez 600 1 de n-butanol. Em seguida concentrou-se a fase aquosa desengordurada em vácuo, num evaporador de fluxo descendente, até 150 1 e diluiu-se este concentrado com 600 1 de metanol. Neste caso formou-se um sedimento claro floculento, que foi separado por centrifugação e descartado. O sebrenadante i aquoso-metanólico foi novamente concentrado em vácuo e seco, obtendo-se 18 kg de uma massa viscosa castanha. Em seguida promoveu-se a adsorção em meio aquoso em 70 1 de um permutador de catiões Dowex 50 WX 2 (forma ácida) , lavou-se o permutador carregado com água pura e promoveu-se a desoreção do inibidor com solução 0,5 M de hidróxido de amónio. Os eluidos que inibam a trehalase foram recolhidos e liofilisados (3,5 kg). A partir destes, por uma via de trabalho análoga em 70 1 do permutador de Íaniões Amberlita IRA-68, separam-se os compostos amorfos. A salbostatina estava contida no eluido da coluna. A liofilisação do eluido activo inibitoriamente produzio 850 g do produto seco. A cromatografia por gel usando Sephadex LH-20, bem como a liofilisação do produto activo, produziram 62 g de salbostatina bru. ta .

g deste material foram em seguida- carregados numa coluna Fast Flow de S-Sepharose de 2,4 1 de capacidade. O permutador de catiões tinha sido previamente equilibrado com tampão de acetato de amónio, pH 3,1.

A eluição da salbostatina foi realisada com um gradiente de acetato de amónio de 0 a 0,6 molar. As fracçoes que inibam a trehalase foram liofilisadas, em seguida foram submetidas à eliminação do sal por meio de Sephadex LH-20 e novamente sobre Fractogel TSK HW-40 e 1iofi1isadas . Resultaram daqui 520 mg de salbostatina pura branca amorfa. 0 poder rotatório específico é de [ 0< ] θθ= +115° (c=l em água).

R_E_I_V_I_N_D_I_C_A_2_Õ_E_S

Claims

R_E_I_V_I_N_D_I_C_A_2_Õ_E_S

- lâ Processo para a preparação de um composto de fórmula caracterizado pelo facto de se cultivar o microorganismo Streptomyces albus ATCC 21 838, ou um seu mutante ou variante, e se isolar o composto de fórmula I do filtrado da cultura e/ou do micélio e se purificar.
- 2
3 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterí zado pelo facto de a cultura ter lugar em condições aeróbicas submersas .

_ ₃§ _

Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado pelo facto de se incorporar como ingrediente activo o composto salbostatina, quando preparado pelo processo da reivindicação 1, e eventualmente em combinação com subs tências auxiliares e/ou substâncias veiculares correntes, e de se dar à composição uma forma apropriada para administração.
- 4 fl Processo para a preparação de um meio de protecção fitossanitária caracterizado pelo facto de se incorporar como ingrediente activo um composto preparado de acordo com a reivindicação 1, em combinação com substâncias auxiliares e aditivos correntes, e de se dar à composição uma forma de agente de protecção fitossanitária.
- 5§ Processo para a protecção de plantas de insectos e/ ou de fungos nocivos, caracterizado pelo facto de se tratarem a= plantas com um composto de acordo com a reivindicação 1.

A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 28 de Outubro de 1988, sob o número P 38 36 675.4.

Lisboa 27 de Outubro de 1989 o AGENTE OFICIAL DA PEOPRIEDADE INDCSTKIAL

RESUMO

A invenção refere-se a um processo para a preparação | de um composto de formula I que compreende cultivar-se o microorganismo Streptomyces albus ATCC 21 838, ou um seu mutante ou variante, e se isolar o composto de fórmula I do filtrado da cultura e/ou do micélio, e se purif icar.