PT680765E - Vacina para estirpe não tipável de haemophilus influenzae. - Google Patents

Description

ΡΕ0680765 ι

DESCRIÇÃO "VACINA PARA ESTIRPE NÃO TIPÁVEL DE HAEMOPHILUS INFLUENZAE"

CAMPO DO INVENTO 0 presente invento está relacionado com a proteína P5 da membrana externa da estirpe bacteriana Haemophilus influenzae e com anticorpos dirigidos contra a proteína P5. 0 invento também está relacionado com um método de isolamento da proteína P5 e com uma composição de vacina para usar no tratamento da infecção por Haemophilus influenzae.

FUNDAMENTO DO INVENTO

As estirpes de Haemophilus influenzae estão divididas em dois grupos, tipáveis e não tipáveis. As estirpes que possuem uma cápsula conhecida são tipadas através de uma reacção serológica da cápsula com anti-soros de referência. Normalmente, os tipos a-f têm sido identificados como tipáveis. As estirpes que não possuem uma cápsula e não reagem com qualquer um dos anti-soros de referência são não tipáveis.

As infecções por Haemophilus influenzae não tipáveis (NTHi) estão implicadas em vários estados de 2 ΡΕ0680765 doença, incluindo otite média, sinusite e doença obstrutiva pulmonar crónica. 0 Haemophilus influenzae tipo b (Hib) é uma das principais causas de meningite e outras doenças invasivas em crianças com idade inferior a quatro anos. Os anticorpos dirigidos contra o polissacárido capsular do organismo são bactericidas, opsónicos in vitro e protectores em animais experimentais e seres humanos. Tal como aqui é usado, opsónico é definido como preparação da superfície de microrganismos de forma a poderem ser mais facilmente ingeridos por fagócitos. Se bem que tenham sido produzidas vacinas seguras e eficazes para a prevenção de doença por Haemophilus influenzae tipo B, as vacinas são todas baseadas na produção de anticorpos contra a cápsula de polissacárido, a qual é exterior relativamente à parede celular da bactéria. As estirpes de NTHi das estirpes de Haemophilus influenzae por definição não possuem uma cápsula. Assim, os anticorpos contra a cápsula não serão eficazes na prevenção de infecções por NTHi.

Tem interesse caracterizar as proteínas da membrana externa de bactérias Haemophilus influenzae e avaliar o seu potencial como vacina. Munson et al., (J. Clin. Invest, 72:677-684 (1983)) descreveram a purificação e caracterização de P2, uma das principais proteínas da membrana externa de estirpes de Haemophilus influenzae. Os investigadores encontraram que a proteína P2 está presente em concentrações elevadas, é facilmente purificada e induz anticorpos protectores em coelhos. Pensa-se que a proteína P5 esteja associada à camada proteica da membrana externa e 3 ΡΕ0680765 foi previamente extraída através de solubilização com dodecilsulfato de sódio (SDS) e fraccionamento com solventes orgânicos. (Coulton et al., Can. J. Microbiology. 20:280-287 (1983)). Foi, no entanto, sugerido que a utilização de SDS possa desnaturar as proteínas em determinadas circunstâncias.

Munson e Granoff (American Society of Microbiology, Infection and Immunity Vol. 49, N°3 (p.544, (1985)), descreveram a caracterização parcial das proteínas P5 e P6. Os resultados indicaram que, apesar do complexo P6 da parede celular induzir anticorpos em coelhos que tinham actividade protectora no modelo de rato jovem, P5 não induziu a produção de anti-soro que fosse protector em ratos jovens nem o anti-soro reagiu com a superfície de bactérias por imunofluorescência in vitro. Baseado nestes resultados os especialistas concluíram que P5 não era um candidato a vacina para a prevenção de doença causada por Haemophilus influenzae tipo b.

Munson et al. (Infection and Immunity, 61:4-017-4020 (1993)), descreveram a clonagem e expressão em E. coli da proteína P5. No entanto, a proteína assim produzida estava largamente na forma desnaturada e pensava-se não estar na conformação correcta.

Assim, constitui um objectivo do presente invento proporcionar proteína da membrana externa P5 nativa, essencialmente pura, de bactérias Haemophilus influenzae, 4 ΡΕ0680765 anticorpos dirigidos contra a proteína P5 e uma composição de vacina para usar no tratamento de estirpes infecciosas de Haemophilus influenzae.

Constitui ainda objectivo do presente invento proporcionar um método de purificação da proteína P5 a partir da membrana externa de bactérias Haemophilus influenzae e que dá origem a proteína que pode ser usada para produzir anticorpos activos. Assim, P5 pode ser usada para produzir uma vacina para NTHi e estirpes tipo b de Haemophilus influenzae. 0 invento pode ser melhor compreendido através de referência aos desenhos e descrição detalhada que se seguem.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Proporciona um gel de dodecilsulfato de sódio (SDS) de proteínas P5 purificadas não tipáveis e do tipo B. A dupla banda na pista 1 representa as formas modificadas pelo calor e não modificadas pelo calor da proteína P5.

Figura 2: Proporciona a sequência de aminoácidos da proteína P5 purificada, que é capaz de induzir um anticorpo bactericida.

Figura 3: Proporciona títulos de células totais por diluição limite em ELISA gerados a partir de anti-soros de coelho dirigidos contra P5 NTHi. 5 ΡΕ0680765

Figura 4: Proporciona títulos de células totais por diluição limite em ELISA gerados a partir de anti-soros de ratinho dirigidos contra P5 NTHi.

Figura 5: Proporciona actividade bactericida de anti-soro P5 de P860295 contra várias estirpes diferentes não tipáveis de Haemophilus.

Descrição da Forma de Realização Preferida 0 presente invento está relacionado com uma proteína P5 de membrana externa nativa, purificada, de bactérias não tipáveis de Haemophilus influenzae. A proteína P5 é uma proteína da membrana externa de 28-35 KDa, modificável pelo calor, com regiões conservadas e variáveis. A proteína P5 (e peptídeos e proteínas tendo epitopos da proteína P5) tem várias propriedades que a tornam especialmente importante para vacinação contra Haemophilus influenzae não tipáveis. Tal como aqui é usado, epitopo é definido como uma região de um antigénio à qual se liga a região variável de um anticorpo. A maior parte dos antigénios possui um grande número de epitopos, e portanto um anti-soro polivalente contra o antigénio conterá um grande número de anticorpos diferentes, cada anticorpo sendo capaz de se ligar a um epitopo diferente no antigénio. Ao contrário das descrições publicadas em 6 ΡΕ0680765 trabalhos anteriores, a proteína P5 é capaz de induzir anticorpos que reagem com a superfície da bactéria e são bactericidas. A proteína foi purificada e demonstrou-se induzir uma resposta imune contra diferentes estirpes de Haemophilus influenzae não tipáveis.

Os peptídeos ou proteínas do presente invento possuem um epitopo comum com a proteína P5 e assim originam reacções imunes cruzadas. Eles podem incluir fragmentos ou oligopeptídeos contendo epitopos da proteína P5. Tal como aqui é usado, os oligopeptídeos são definidos como cadeias poliméricas de algumas unidades monoméricas repetidas. A sequência de aminoácidos N-terminal da proteína P5 foi determinada e está apresentada em SEQ ID N0:1. Os peptídeos e proteínas do presente invento compreendem qualquer peptídeo ou proteína tendo pelo menos uma porção da sequência de aminoácidos descrita na Figura 2 ou quaisquer sequências biologicamente equivalentes. Sequências alteradas incluem sequências em que resíduos de aminoácidos funcionalmente equivalentes substituem resíduos dentro da sequência resultando numa alteração silenciosa. Por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro da sequência podem ser substituídos por um outro aminoácido de polaridade semelhante que actua com um equivalente funcional, resultando numa alteração silenciosa. Os substitutos de um aminoácido dentro da sequência podem ser seleccionados entre outros membros da classe a que o aminoácido pertence. Por exemplo, os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem glicina, alanina, leucina, 7 ΡΕ0680765 isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os aminoácidos neutros polares incluem serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina. Ao aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido aspártico e glutâmico.

Os peptideos e proteínas do presente invento também incluem fragmentos ou oligopeptídeos tendo epitopos da proteína P5 representados dentro da sequência ou quaisquer análogos de tais fragmentos ou epitopos. Ainda, qualquer um dos peptideos e proteínas pode ser modificado por conjugação com outras moléculas, e.g., através da ligação de grupos de acoplagem tais como os aminoácidos cisteína e lisina ou outros grupos de ligação.

Conforme descrito detalhadamente abaixo, a proteína P5 e os peptideos e proteínas deste invento são úteis de muitas formas diferentes, (e.g. sozinhos ou em misturas) em vacinas. Para estes fins, os peptideos e proteínas são produzidos através do isolamento a partir de Haemophilus ínfluenzae ou por síntese química, ou potencialmente por métodos de biotecnologia tais como expressão recombinante em várias células hospedeiras. A proteína P5 nativa é purificada a partir de Haemophilus ínfluenzae através de um processo de extracção diferencial com detergente. 0 processo não envolve a utilização de desnaturantes e agentes redutores tais como ΡΕ0680765 dodecilsulfato de sódio e 2-mercaptoetanol, respectiva-mente, os quais podem destruir epitopos antigénicos importantes da proteína e que não são consensualmente aceites como seguros para administração ao ser humano. 0 processo inclui primeiro a obtenção de componentes da membrana externa de células de Haemophilus influenzae. Os componentes da membrana externa podem ser preparados a partir de uma fracção de membranas totais celulares. As fracções de membranas totais são tipicamente preparadas através de sedimentação diferencial após disrupção de células de Haemophilus influenzae por métodos tais como sonicação, trituração ou extrusão a partir de uma prensa francesa ou outro sistema de homogeneização. A fracção de membranas totais é então fraccionada em membranas internas e externas por sedimentação em gradiente de densidade ou por solubilização diferencial dos constituintes de membranas internas com determinados detergentes, tais como polioxietilenoctilfenol (Triton X-100™) ou N-lauroil sarcosina, sal sódico (sarcosil) . Na forma de realização preferida, os componentes da membrana externa celular são preparados por solubilização diferencial de membranas internas em 0,1-2% (p/v) de Triton X-100 em HEPES-NaOH 100 mM, MgCl2 1 mM, pH 7,4. Esta extracção é tipicamente efectuada duas vezes.

Como fonte alternativa de componentes da membrana externa, é útil um meio de cultura de células de Haemophilus influenzae. O meio contém componentes lançados 9 ΡΕ0680765 a partir da membrana externa da bactéria (designados "bolhas"). Ver Loeb, M.R. (1987) Infection and Immunity 55(11):2612-2618. A solubilização da proteína P5 a partir do complexo membrana externa-parede celular foi então conseguida através de uma solubilização diferencial em três passos sucessivos. No primeiro passo, uma solução aquosa de 0,1-10%, tipicamente 0,1-2% (p/v) de dodecilsulfobetaina (Zwittergent™ 3-14) foi usada para remover proteínas da membrana externa. De preferência, é usada uma solução a 1% e a extracção é geralmente realizada 2-3 vezes. Após extracções com Zwittergent™3-14 e NaCl 0,5 M, a proteína P5 é solubilizada com 1% sarcosil em tris-HCl 50 mM, Na2EDTA 5 mM. Os extractos foram ajustados a 1% de Zuittergent™3-14 no mesmo tampão e dialisados contra um excesso de 10 vezes de 1% Zwittergent™3-14 em Tris-HCl 50 mM, pH 8, Na2EDTA 5 mM (3X) durante 24 horas. O extracto dialisado foi então passado através de uma coluna de permuta aniónica (DEAE) e de uma coluna de permuta catiónica (S) ligadas em tandem. As colunas foram separadas e a coluna S foi eluida com um gradiente crescente de sal no mesmo tampão contendo Zwittergent, a proteína P5 purificada foi eluida como um único pico conforme analisado por SDS-PAGE (Figura 1). A proteína P5 purificada por este método está substancialmente livre de endotoxinas bacterianas e é adequada para administração a seres humanos. A preparação 10 ΡΕ0680765 purificada da proteína P5 foi então formulada sozinha como composição farmacêutica, como por exemplo numa vacina para Haemophilus influenzae, ou numa mistura com adjuvantes e/ou com antigénios de outros organismos implicados na otite média ou noutras doenças. Caso se pretenda, a proteína é fragmentada por técnicas químicas ou enzimáticas convencionais para produzir segmentos antigénicos.

Os peptídeos e proteínas deste invento podem ser sintetizados quimicamente de acordo com a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:l ou variações desta sequência como descrito atrás. É útil qualquer uma das químicas convencionais para a síntese em fase sólida ou líquida de peptídeos e proteínas. A síntese química pode ser particularmente adequada para a produção de oligo-peptídeos contendo epitopos da proteína P5. A experiência com anticorpos contra o polissa-cárido capsular de Haemophilus influenzae mostra que a capacidade dos anticorpos para matarem as bactérias em ensaios in vitro está estreitamente relacionada com a capacidade para induzir uma resposta imune protectora em bébés (Fedea et ai., J. Infect. Dis., 160, 999-1004 (1989) ) .

Os anticorpos contra a proteína P5, induzidos na resposta aos peptídeos e proteínas deste invento, foram testados usando sistemas de ensaio ín vitro semelhantes para demonstrar a capacidade de matar células de Haemo- 11 ΡΕ0680765 philus influenzae. Estes resultados mostram uma correlação semelhante com o potencial da proteína P5 para induzir uma resposta imune protectora e para servir numa vacina para bebés, crianças e adultos.

Um sistema de ensaio bactericida in vitro mediada pelo complemento (Musher et ai., 1983, Infect. Immun. 39:297-304; Anderson et ai., 1972, J. Clin. Invest. 51:31-38), que foi anteriormente usado para medir a actividade bactericida de anticorpos contra PRP e lipopolissacárido (LPS) de Haemophilus influenzae, é útil para determinar se o anticorpo dirigido contra uma proteína ou peptídeo particular ou seu fragmento tem actividade bactericida contra Haemophilus influenzae não tipável.

Os peptídeos e proteínas do presente invento são úteis como imunogénios em vacinas de subunidades para vacinação contra Haemophilus influenzae não tipável. As vacinas são úteis para prevenir ou reduzir a suscepti-bilidade a otite média aguda e outras doenças causadas por estirpes mão tipáveis do organismo, geralmente para vacinar crianças ou adultos contra otite média ou contra crianças em risco de contraírem otite média (por exemplo, crianças com uma história de infecção dos ouvidos).

Os peptídeos e proteínas deste invento são formulados como vacinas univalentes e multivalentes. Conforme aqui usado as vacinas univalentes são definidas como componente simples e as vacinas multivalentes são definidas como de múltiplos componentes. 12 ΡΕ0680765 A própria proteína P5 é usada como produzida ou isolada por métodos descritos atrás ou misturada com outros antigénios.

Os peptídeos ou proteínas deste invento são administrados como vacinas de subunidades multivalentes em combinação com outros antigénios de Haemophilus influenzae.

Conforme referido, peptídeos e proteínas tendo epitopos da proteína P5 induzem anticorpos bactericidas que actuam sinergisticamente na morte de Haemophilus influenzae com anticorpos contra outras proteínas da membrana externa de Haemophilus influenzae. Assim, numa forma de realização do invento, a proteína P5 é administrada conjuntamente com outras proteínas da membrana externa de Haemophilus influenzae (ou peptídeos ou proteínas tendo epitopos dela) para conseguir uma actividade bactericida sinergística. Proteínas de membrana externa particularmente preferidas de Haemophilus influenzae são a lipoproteína de membrana externa associada a peptidoglicano (PAL) e a lipoproteína de Haemophilus PCP descrita por Deich, P.A. et al. (1988) J. Bacteriol. 170(2):489-498.

Para a administração combinada com epitopos de outras proteínas da membrana externa, peptídeos da proteína P5 são administrados separadamente, como uma mistura ou como um conjugado ou peptídeo ou proteína de fusão génica. Por exemplo, as proteínas PAL e PCP ou quaisquer proteínas, 13 ΡΕ0680765 peptídeos ou epitopos derivados das mesmas, são administrados como uma mistura ou como um conjugado ou fusão com uma proteína P5 ou um peptídeo ou proteína derivado da proteína P5. 0 conjugado é formado por técnicas convencionais de acoplagem de materiais proteicos. A proteína P5 ou quaisquer peptídeos ou proteínas derivados podem ser usados conjuntamente com antigénios de outros organismos (e.g. bactérias encapsuladas ou não encapsuladas, bactérias, vírus, fungos e parasitas). Por exemplo, a proteína P5 é útil em conjunção com antigénios de outros microrganismos implicados em otite média ou outras doenças. Estes incluem Streptococcus pneumonia, Streptococcus pyogene, Staphylococus aureus do grupo A, vírus sincial respiratório e Branhemella catarrhalis.

Na formulação de composições de vacina com o peptídeo ou proteína, sozinho ou em várias combinações descritas, o imunogénio é ajustado a uma concentração adequada e formulado com qualquer adjuvante de vacina adequado. 0 imunogénio pode ser igualmente incorporado em lipossomas, ou conjugado com polissacáridos e/ou outros polímeros para usar numa formulação de vacina.

As vacinas do presente invento são administradas a seres humanos ou animais numa variedade de formas. Estas incluem as vias de administração intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, oral e intranasal. 14 ΡΕ0680765

Os peptídeos e proteínas deste invento são igualmente administradas como uma vacina viva. Com esta finalidade, são preparados microrganismos recombinantes que se multiplicam no recipiente, expressam o peptídeo ou proteína da proteína P5 e induzem uma resposta imune contra Haemophilus influenzae. Os vectores de vacina vivos são poxvírus, tais como vírus da vacina (Paoletti e Panicali, Patente U.S. N° 4,603,112), e estirpes atenuadas de Salmonella (Stocker, Patente U.S. N° 4,550,081).

As vacinas vivas são particularmente vantajosas devido a conduzirem a um estímulo prolongado que pode conferir imunidade substancialmente duradoura. Quando a resposta imune é protectora contra subsequente infecção por Haemophilus influenzae, a própria vacina viva pode ser usada numa vacina preventiva contra Haemophilus influenzae.

As vacinas vivas multivalentes são preparadas a partir de um único ou de vários microrganismos recombinantes que expressam diferentes epitopos de Haemophilus influenzae (e.g., outras proteínas da membrana externa tais como PAL e PCP ou seus epitopos). Ainda, epitopos de outros microrganismos patogénicos podem ser incorporados na vacina. Por exemplo, um vírus da vacina pode ser manipulado de forma a conter sequências codificadoras de outros epitopos para além dos de Haemophilus influenzae. Tal vírus recombinante, pode ser ele próprio usado como imunogénio numa vacina multivalente. Como alternativa, uma mistura de vírus da vacina ou de outros vírus, cada um deles expressando um gene diferente codificador de diferentes 15 ΡΕ0680765 epitopos das proteína da membrana externa de Haemophilus influenzae e/ou epitopos de outros organismos causadores de doença, pode ser formulada como uma vacina multivalente.

Uma outra vacina do presente invento é uma vacina de vírus inactivado. Tais vacinas inactivadas são "mortas" no sentido de a sua infecciosidade ter sido destruída, geralmente através de tratamento químico (e.g., tratamento com formaldeído) . Idealmente, a infecciosidade do vírus é destruída sem afectar as proteínas que conferem imunoge-nicidade ao vírus. Para preparar as vacinas inactivadas, grandes quantidades de vírus recombinante expressando os epitopos pretendidos são crescidas em cultura para proporcionar a quantidade necessária dos antigénios importantes. Uma mistura de vírus inactivados expressando diferentes epitopos é útil para a formulação de vacinas "multivalentes". Em determinadas circunstâncias, estas vacinas inactivadas multivalente são preferíveis à formulação de vacina viva devido a potenciais dificuldades que surgem da interferência mútua dos vírus vivos administrados em conjunto. Em qualquer dos casos, o vírus ou mistura de vírus inactivados é formulado num adjuvante adequado de forma a aumentar a resposta imunológica aos antigénios. Adjuvantes adequados incluem: substâncias tensioactivas, e.g., hexadecilamina, ésteres de octadecil-aminoácidos, octadecilamina, lisolecitina, brometo de dimetildioctadecilamónio, N,N-dicoctadecil-N'-N'-bis(2-hidroetil-propanodiamina), metoxi-hexadecilglicerol e polióis plurónicos; poliaminas, e.g., pirano, dextranos-sulfato, poli IC, carbopol; peptídeos, e.g., muramildi- 16 ΡΕ0680765 peptídeo, dimetilglicina, tuftsina; emulsões oleosas; e géis minerais, e.g., hidróxido de alumínio, fosfato de aluminio, etc.

Os peptídeos e proteínas do presente invento são igualmente úteis para produzir anticorpos policlonais para usar em imunoterapia passiva contra Haemophilus influenzae. A imunoglobulina humana é preferida porque a imunoglobulina heteróloga pode provocar uma resposta imune prejudicial contra os seus componentes imunogénicos estranhos. Os anti-soros policlonais são obtidos a partir de indivíduos imunizados com os peptídeos ou proteínas em qualquer uma das formas descritas. A fracção de imunoglobulinas é então enriquecida. Por exemplo, as imunoglobulinas específicas de epitopos da proteína P5 são enriquecidas por técnicas de imunoafinidade empregando os peptídeos ou proteínas deste invento. 0 anticorpo é especificamente absorvido dos anti-soros por um imunoadsorvente contendo epitopos da proteína P5 e depois eluido do imunoadsorvente como uma fracção enriquecida em imunoglobulinas.

Para além disso, os ácidos nucleicos tendo a sequência nucleotídica do gene codificador da proteína P5, ou quaisquer sequências nucleotídicas que hibridem com ele, podem ser usadas como sondas nos ensaios de hibridação de ácidos nucleicos para a detecção de Haemophilus influenzae em vários tecidos ou fluidos corporais de doentes. As sondas podem ser usadas em ensaios de hibridação de qualquer tipo de ácido nucleico incluindo: transferências Southern (Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98:508); transfe- 17 ΡΕ0680765 rências Northern (Thomas et al., 1989 Proc. Natl Acad. Sei. USA 77:5201-05); transferências de colónias (Grunstein et ai., 1975, Proc. Natl Acad Sei USA 72:3961-65), etc. A restringência da hibridação pode variar dependendo das necessidades do ensaio. O invento é ainda ilustrado pelos exemplos que se seguem.

Exemplo 1

Purificação de P5

Extractos proteicos de P5 são obtidos a partir de estirpes NTHi e Hib através da extraeção diferencial da membrana externa com detergentes. Após extraeções com Zwittergent octilglucósido 3-14 e Zwittergent 3-14 e NaCl 0,5M, a proteína P5 é solubilizada com 1% de Sarcosil em Tris-KCl 50 mM, pH 8, Na2EDTA 5 mM. Os extractos foram ajustados a 1% de Zwittergent™3-14 no mesmo tampão e dia-lisados contra um excesso de 10 vezes de 1% Zwittergent™3-14 em Tris-HCl 50 mM, pH 8, Na2EDTA 5 mM (3X) durante 24 horas. O extracto dialisado foi então passado através de uma coluna de permuta aniónica (DEAE) e de uma coluna de permuta catiónica (S) ligadas em tandem. As colunas foram separadas e a coluna S foi eluida com um gradiente salino crescente no mesmo tampão contendo Zwittergent. A proteína P5 purificada foi eluida como um único pico conforme analisado por SDS-PAGE (Figura 1). ΡΕ0680765 18

Exemplo 2

Digestão com protease, isolamento do peptídeo e sequenciação proteica. P5 NTHi e P5 Hib purificadas foram usadas direc-tamente para determinar a sequência de aminoácidos N-terminal (Figura 2). A sequência total da proteína NTHi foi determinada obtendo-se peptídeos sobreponíveis por digestão com proteases, usando várias proteases incluindo endopepti-dases Lys-C, Arg-C, Glu-C, papaína, tripsina e quimotri-psina. 0 brometo de cianogénio também é usado para clivar a proteína em resíduos de metionina para criar fragmentos maiores. Os peptídeos são isolados usando cromatografia Líquida de Alta resolução (HPLC) Microbore e as sequências determinadas com um sequenciador de proteínas. 0 alinhamento dos peptídeos utiliza peptídeos sobreponíveis e homologia com a proteína OmpA de E. coli (FIGURA 2).

Exemplo 3

Ensaio ELISA para células totais

As células de Haemophilus influenzae fixadas com formalina derivadas de várias estirpes diferentes foram preparadas a partir de células a meio da fase logarítmica crescidas até OD490 =1,0 em meio BHI-XV. As células foram lavadas duas vezes em soro fisiológico tamponado com fosfatos (PBS) (NaHP04-7H20, KH2P04 2 mM, CKl 2 mM, NaCl 137 19 ΡΕ0680765 mM pH 7,4) depois ressuspensas em PBS com formalina a 0,3% e incubadas à temperatura ambiente durante 1-2 horas. A formalina foi removida através da lavagem das células em PBS e as células ressuspensas em PBS para uma concentração final OD62o = 0,2. Setenta e cinco microlitros de células foram então adicionados aos alvéolos de placas de microtitulação e secos durante a noite a 37°C. As placas foram bloqueadas com PBS-0,1% Tween-20 durante uma hora e lavadas num lavador de microplacas. Cem microlitros de anti-soro diluído em soro fisiológico tamponado com fos-fatos contendo CaCl3 0,15 mM, MgCl2 0,5 mM, 1% de gelatina e 0,3% Tween-20 (PCM-GT) foram adicionados aos alvéolos e as placas foram incubadas a 37°C durante duas horas. Após lavagem, os anticorpos ligados foram detectados com anticorpos de cabra anti-imunoglobulinas de ratinho (igG+lgM) conjugados com fosfatase alcalina (TAGO) diluídos em PBS 0,05% Tween-20, 0,1% de gelatina durante uma hora a 37°C. As células foram novamente lavadas e as placas foram reveladas com uma solução a 1 mg/ml de p-nitrofenilfosfato (SIGMA) em dietanolamina durante trinta minutos. A reacção foi parada após a adição de NaOH 3N. As placas foram lidas num leitor a OD450 , referência OD62o· Os dados de ELISA com células totais para soro de coelho e de ratinho anti-P5 estão apresentados nas Figuras 3 e 4 respectivamente.

Exemplo 4

Ensaio bactericida Células de várias estirpes diferentes de Haemo 20 ΡΕ0680765 phílus influenzae foram crescidas durante a noite em meio BHi-xv. No dia seguinte preparam-se culturas frescas a partir de uma diluição a 1:10 de uma cultura crescida durante a noite e crescidas até D049o=l,0. Durante o crescimento celular, soro de vitela pré-colostro, uma fonte de complemento, foi pré-adsorvido a células P860295 durante uma hora. As células foram então sedimentadas para separação do complemento e o complemento pré-adsorvido foi esterilizado por filtração através de uma unidade de filtração de 0,2 μιη e guardado em gelo antes de ser usado. Todos os anti-soros testados neste ensaio foram inactivados pelo calor a 56 °C durante quinze minutos para remover actividade de complemento e diluído a 1:5 em PCM seguido de sucessivas diluições de duas vezes que foram preparadas em placas de microtitulação de 96 alvéolos estéreis. As células bacterianas crescidas até uma DO410 = 1,0 foram diluídas em PCM contendo a fonte de complemento numa diluição de 1:5. Quinze microlitros desta mistura foram adicionados às diluições seriadas de anti-soro e as placas foram deixadas a incubar durante quarenta e cinco minutos a 37°C. Após isto, dez microlitros de cada uma das reacções foram semeados em BHI-XV. Após incubação durante a noite a 37°C, as colónias foram contadas para determinar os títulos bacterianos (o inverso da diluição mais alta de anti-soro capaz de matar mais de 50% das bactérias comparativamente com os controlos de soros pré-imunes). Os dados bacte-ricidas relativamente a P5 estão representados na Figura 5. 21 ΡΕ0680765 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS 1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Zotnick Dr., Gary W. (ii) TÍTULO DO INVENTO: Proteína P5 purificada de Haemophilus influenzae não tipável como uma vacina para estirpes não tipáveis de Haemophilus influenzae (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 1

(iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA (A) DESTINATÁRIO: American Cyanamid Company (B) RUA: One Cyanamid Plaza (C) CIDADE: Wayne (D) ESTADO: New Jersey

(E) PAÍS: US (F) CÓDIGO POSTAL: 07470-8426 (iv) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO:

(A) NÚMERO DO PEDIDO: US (B) DATA DE ENTREGA: 07-MAR-1994 (C) CLASSIFICAÇÃO:

(viii) INFORMAÇÃO SOBRE PROCURADOR/AGENTE

(A) NOME: Arrington, James J (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/RESUMO: 32 144 (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: 201/831-3246 (B) TELEFAX: 201/831-3305 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 338 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecida (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l:

Ala Pro Gin Glu A«n Xhjr Fhe Tyr Ala Gly Vai Lye Ala Gly Gin Gly 1 S 10 15

Ser Phe Hie Asp Gly 11« Aon Âen Asn Gly Ala Ile Lya Glu Adp Ser 20 25 30 ΡΕ0680765 - 22 -

Ile hep Leu Thr Leu Gly Tyr Gly Tyr Arg Arg 35 40 Gly Vai Phe Gly Gly Tyr Gin Ile Leu Asn Gin 50 ss Ala Ala Glu Leu Gly Tyr Aep Âen Phe Gly Arg 65 70 75 Gltt Gly Lys Thr Lys Ala Lys Hle Thr Actn His 85 50 Leu Lys Gly Ser Tyr Glu Val Leu Asp Gly Leu 100 105 Alá Gly vai Ala Leu Vai Arg Ser Asp Tyr Lye 115. 120 Asn Ser Thr Arg Aap Xáá Lye Lye Gly Thr Kis Í3Õ 13 S Gly Leu Phe Ala Vai Gly Ala Glu Tyr Ala Val 145 150 1Í5 Vai Arg Leu Glu Tyr Gla Gla Leu Thr Arg Val 165 170 Gin Aep Lys Asn Ala Fro Ser Ile Aea Pro Asn 180 165 Asn Pro Xaa ile Gly Sèr Ile Asa Ala Gly Ile 155 200 Gin Gly Ala Ala fro Vai Lys Thr Phe Ser Leu 210 215 Phe Ala Phe Gly Lye Ala Asa Leu Lye Pro Gin 225 230 235 Asp Ser 11e Tyr Gly Glu Ket Ser Gin Val Lys 245 250 Vai Ale Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Aap 260 2S5 Leu Ser Gin Glu Arg Ala Aep Ser Val Ala Asn 275 280 Gly Vai Ala Ala Asp Ala lie Ser Ala Thr Gly 230 25S Pro Vai Thr Gly Ala Thr Xaã Asp Gin Val Trp 10:5 310 315 11® Ala Thr Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu 325 330 Thr Lys Lisboa, 22 de Maio de 2007

Aen Thr Phe Thr Tyr 45

Aop Asa fhe Gly Leu 60

Vai Lys Phe Arg Ala 80

Gly Ais Uie tea Ser 95

Aep Vai Tyr Gly Lys 110

Ffae Tyr Glu Ala Pro 125

Thr AÍa Arg Ala Ser 140

Leu Pro Glu Leu Ale 160

Gly Lys Tyr Arg Pro 175

Thr Ala Xle Kis Tyr

ISO

Ser Tyr Arg Phe Gly 205

Asa Leu Aap Vai Thr 220

Ala Gin Ala Thr Leu 240

Ser Ala Lys Vai Ala

SS5S

Ala Phe h&ti Val Lye 270

Tyr Phe Vai Ala Lys 28S

Tyr Gly Lys Ala Aen 300

Gly Arg Trp Ala Leti 320 lie Ala val Asa Gly 335 ΡΕ0680765 23

Claims (16)

1. ΡΕ0680765 ι REIVINDICAÇÕES 1. Proteína da membrana externa P5 nativa, substancialmente pura, de uma estirpe bacteriana de Haemo-philus influenzae.
2. 2. A proteína da membrana externa P5 nativa, substancialmente pura da estirpe bacteriana de Haemophilus influenzae de acordo com a reivindicação 1, obtida através de um processo de purificação compreendendo a extracção diferencial de células de Haemophilus influenzae com um detergente não desnaturante.
3. 3. A proteína da reivindicação 2, em que o referido processo de purificação compreende a extracção de uma preparação de compostos da membrana externa das referidas células com uma solução aquosa de N-lauroil sarcosina, sal sódico, compreendendo: (a) extracção de um resíduo insolúvel compreendendo a proteína P5 com uma solução aquosa de sulfobetaína; (b) solubilização do resíduo insolúvel do passo (a) com N-lauroil-sarcosinato; (c) diálise do resíduo do passo (b) com sulfobetaína; (d) passagem do extracto dialisado através de uma coluna de permuta aniónica e de uma coluna de permuta catiónica; 2 ΡΕ0680765 (e) eluição da proteína P5 de coluna de permuta catiónica adequada e (f) recuperação da proteína P5 essencialmente pura a partir de uma coluna de permuta catiónica após eluição.
4. 4. A proteína P5 da Reivindicação 1 em que a sequência de aminoácidos é proporcionada em SEQ ID N0:1, ou qualquer sua sequência modificada em que os resíduos de aminoácidos foram adicionados, inseridos, substituídos ou eliminados sem alteração das propriedades bactericidas ou opsónicas, ou ambas, da proteína, em que a proteína induz anticorpos bactericidas contra Haemophilus influenzae num hospedeiro.
5. 5. Um método de isolamento e purificação da proteína P5 a partir de uma membrana externa de Haemophilus influenzae após extracção de uma preparação de compostos da membrana externa com uma solução aquosa de N-lauroil sarcosina, sal sódico, o método melhorado compreendendo: (a) extracção de um resíduo insolúvel compreendendo a proteína P5 com uma solução aquosa de sulfobetaína; (b) solubilização do resíduo insolúvel do passo (a) com N-lauroil-sarcosinato; (c) diálise do resíduo do passo (b) com sulfobetaína; (d) passagem do extracto dialisado através de uma 3 ΡΕ0680765 coluna de permuta aniónica e de uma coluna de permuta catiónica; (e) eluição da proteína P5 de coluna de permuta catiónica adequada e (f) recuperação da proteína P5 essencialmente pura a partir de uma coluna de permuta catiónica após eluição.
6. 6. Uma composição de vacina compreendendo uma quantidade imunogénica da proteína P5, nativa, substancialmente pura, de Haemophilus influenzae de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, num veículo farmaceuti-camente aceitável e um adjuvante facultativo.
7. 7. A composição de vacina da Reivindicação 6, ainda compreendendo pelo menos um antigénio adicional ou um ou mais organismos.
8. 8. A composição de vacina da Reivindicação 7, em que o organismo é uma bactéria, vírus, parasita ou fungo.
9. 9. Uma composição de vacina compreendendo um conjugado de antigénio composto por proteína P5 nativa, substancialmente pura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, conjugada com um antigénio de um organismo, ou um epitopo ou epitopos seus, num veículo farmaceuticamente aceitável e um adjuvante facultativo. 4 ΡΕ0680765
10. 10. A composição de vacina da Reivindicação 9, em que o organismo é Haemophilus influenzae.
11. 11. Uma quantidade imunogénica de proteína P5 nativa, substancialmente pura, de Haemophilus influenzae de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, para usar na imunização contra Haemophilus influenzae.
12. 12. A utilização de uma quantidade imunogénica de proteína P5 nativa, substancialmente pura, de Haemophilus influenzae de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, na produção de um medicamento para imunização contra Haemophilus influenzae.
13. 13. Uma utilização como reivindicada na Reivindicação 12, em que a proteína tem substancialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:l, ou qualquer sua sequência modificada, em que resíduos de aminoácidos foram adicionados, inseridos, substituídos ou eliminados sem alteração substancial das propriedades bactericidas ou opsónicas, ou ambas, da proteína.
14. 14. Uma utilização como reivindicado na Reivindicação 12 ou Reivindicação 13, em que a proteína é administrada conjuntamente com pelo menos um outro antigénio de Haemophilus influenzae. 5 ΡΕ0680765
15. 15. Uma quantidade imunogénica de proteína P5 nativa, substancialmente pura, de Haemophilus ínfluenzae derivada de um agente etiológico de otite média, sinusite ou doença obstrutiva pulmonar crónica, para usar na prevenção, redução da susceptibilidade ou tratamento de otite média aguda, sinusite ou doença obstrutiva pulmonar crónica.
16. 16. A utilização de uma quantidade imunogénica de proteína P5 nativa, substancialmente pura, de Haemophilus ínfluenzae derivada de um agente etiológico de otite média, sinusite ou doença obstrutiva pulmonar crónica na produção de um medicamento para prevenir, reduzir a susceptibilidade ou tratar otite média aguda, sinusite ou doença obstrutiva pulmonar crónica. Lisboa, 22 de Maio de 2007