KR100366482B1 - 백신으로서 정제된 분류가능하지 않은 헤모필루스 인프루엔자 p5단백질, 및 그의 정제방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 헤모필루스 인플루엔자 세균의 P5 외막 단백질 또는 P5 단백질에 대한 항체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 P5 단백질 단리 방법 및 헤모필루스 인플루엔자 감염치료에 사용하기 위한 백신 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) 세균 균주의 P5외막 단백질 및 P5 단백질에 대한 항체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 P5 단백질의 단리 방법 및 헤모필루스 인플루엔자 감염의 치료에 사용하기 위한 백신 조성물에 관한 것이다.
헤모필루스 인플루엔자 균주는 두 개의 군, 분류가능한 군 및 분류가능하지 않은 군으로 나누어진다. 공지된 캡슐을 갖는 균주는 기준 항혈청과 캡슐의 혈청학적 반응에 의해 분류된다. 일반적으로, 유형 a-f는 분류가능한 것으로 동정되었다. 캡슐을 갖지 않고 임의의 기준 항혈청과 반응하지 않는 균주는 분류가능하지 않다.
분류가능하지 않은 헤모필루스 인플루엔자 (NTHi) 감염은 중이염, 부비강염, 및 만성 폐 차단 질병을 포함하는 몇가지 질병 상태에 관련되어 있다. 헤모필루스 인플루엔자 유형 b (Hib)는 네 살이하의 아동에 있어 수막염 및 기타 침습성 감염의 주원인이다. 이 유기체의 캡슐 다당체에 대한 항체는 살균성이고, 생체외에서 옵소닌성이고 실험 동물 및 사람에 있어 보호성이다. 본원에서 사용된 바의 옵소닌성은 미생물이 식세포에 의해 보다 쉽게 취해질 수 있도록 하기 위한 미생물의 표면의 제제로서 정의된다. 헤모필루스 인플루엔자 유형은 B 질병의 예방을 위한 안전하고 효과적인 백신이 생산되어오는 동안, 백신은 모두 세균내 세포 벽에 대해 외부인 다당체 캡슐에 대해 항체를 생성하는 것에 기초한다. 헤모필루스 인플루엔자 균주의 NTHi 균주는 정의에 따라 캡슐이 결여되어 있다. 따라서, 캡슐에 대한 항체는 NTHi 감염 예방에 효과적이지 않을 것이다.
헤모필루스 인플루엔자 세균의 외막 단백질을 특성화하고 그의 백신 효능을 평가하는 것은 흥미롭다. Munson 일동 (J. Clin, Invest, 72 : 677 - 684 (1983))은 헤모필루스 인플루엔자 균주의 주요 외막 단백질중 하나인 P2 의 정제 및 특성화를 보고했다. 연구자들은 P2 단백질이 고농도로 존재하고, 용이하게 정제되고, 토끼에게서 보호 항체를 유발함을 밝혔다. P5 단백질은 외막 단백질 층과 연관있다고 생각되며 앞서 나트륨 도데실 설페이트(SDS)를 사용한 용해 및 유기 용매 분획 분별에 의해 추출되었다. (Coulton 일동. Can. J. Microbiology. 20 : 280 - 287 (1983)). 그러나, SDS의 사용이 특정 환경에서 단백질을 변성시킬 수 있다고 시사되었다.
Munson 및 Granoff(미국 미생물 학회 (p. 544, (1985))은 P5 및 P6 단백질의 부분적 특성화를 보고했다. 결과로서, P6 세포 벽 복합체는 어린 쥐 모델에서 보호활성을 갖는 토끼 내에서의 항체를 유도하지만, P5 는 어린 쥐에게 보호성인 항혈청을 산출하지도 않거니와 생체외에서 면역형광활성을 갖는 면역형광성에 의해 세균 표면으로써 항혈청이 복귀되지도 않음을 나타냈다. 이런 발견에 근거하여 당업자들은 P5 가 헤모필루스 인플루엔자 유형 b 에 의해 야기된 질병의 예방을 위한 백신 후보가 아니었다고 결론지었다.
따라서, 본 발명의 목적은 헤모필루스 인플루엔자 세균의 본질적으로 순수한 P5 외막 단백질, P5 단백질에 대한 항체 및 헤모필루스 인플루엔자 감염 균주의 치료에 사용하기 위한 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 부가적인 목적은 헤모필루스 인플루엔자 세균의 외막으로부터 P5 단백질을 정제하는 방법 및 활성 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있는 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 따라서, P5 는 헤모필루스 인플루엔자의 NTHi및 유형 b 균주에 대한 백신을 생산하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 다음의 도면 및 상세한 설명을 참고로 하여 보다 완전히 이해될 것이다.
본 발명은 분류가능하지 않은 헤모필루스 인플루엔자 세균의 정제된 P5 외막 단백질에 관한 것이다. P5 단백질은 보존 영역 및 가변 영역 모두를 갖는 28 - 35 KDa 열 변형 가능한 외막 단백질이다.
P5 단백질은 분류가능하지 않는 헤모필루스 인플루엔자에 대한 백신에 P5 단백질 (및 P5 단백질의 에피토프를 갖는 펩티드 및 단백질)을 특히 가치있게 하는 몇가지 특성을 가지고 있다. 본원에서 사용된 바의 에피토프는 항체의 가변 영역이 결합한 항원의 영역으로서 정의된다. 대부분의 항원은 다수의 에피토프를 가지므로 항원에 대한 다가 항혈청은 다수의 상이한 항체들을 함유할 것이고, 각각의 항체는 항원 상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 선행기술로 공개된 보고서와는 달리, P5 단백질은 세균의 표면에 반응하고 살균성인 항체를 유도할 수 있다. 이 단백질은 정제되었고 분류가능하지 않은 헤모필루스 인플루엔자의 상이한 균주들에 대해 면역 반응을 유도한다고 밝혀졌다.
본 발명의 펩티드 또는 단백질은 P5 단백질과 공통의 에피토프를 갖고 따라서 그와 면역학적으로 상호반응한다. 이것들은 P5 단백질의 에피토프를 함유하는 단편들 또는 올리고펩티드들을 포함할 수 있다. 본원에 정의된 바의, 올리고펩티드는 몇몇 단량체 반복 단위의 중합체 사슬로시 정의된다. P5 단백질의 N-말단 아미노산 서열은 측정되었고 제 5 도에 도시되어 있다. 본 발명의 펩티드 및 단백질을 제 2 도에 묘사된 아미노산 서열의 적어도 일부 또는 임의 생물학적으로 동등한 서열을 갖는 임의 펩티드 또는 단백질로 이루어진다. 변형된 서열은 기능적으로 동등한 아미노산 잔기가 무변화를 초래하는 서열내 잔기로 치환된 서열을 포함한다. 예컨대, 서열내 하나 이상의 아미노산 잔기는 기능적 등가물로서 작용하여 무변형을 초래하는 유사한 극성의 또다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 서열내 아미노산에 대한 치환체는 아미노 산이 속한 부류의 다른 구성원으로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 비극성 (소수성) 아미노산은 글리신, 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 하전된 (염기성)아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스팔트산 및 글루탐산을 포함한다.
또한 본 발명의 펩티드 및 단백질은 서열내에 표현된 P5 단백질의 에피토프를 갖는 단편 또는 올리고펩티드 또는 상기 단편 또는 에피토프의 임의 동족체를 포함한다. 게다가, 임의로 펩티드 및 단백질은 예컨대, 아미노산 시스테인 및 리신과 같은 커플링기 또는 기타 연결 기의 부착에 의해 다른 분자로 형상이 변형될 수 있다.
아래에 상세히 서술된 바와 같이, P5 단백질 및 본 발명의 펩티드 및 단백질은 백신에서 매우 상이한 형태들로 사용된다 (예컨대, 단독으로 또는 혼합물로). 이들 목적을 위하여, 펩티드 및 단백질은 헤모필루스 인플루엔자로부터 단리에 의하거나 화학적 합성에 의해, 또는 잠재적으로 다양한 숙주 세포내에서 재조합 발현과 같은 생물학적 방법에 의해 생산할 수 있다.
천연 P5 단백질은 상이한 세정제 추출 절차에 의해 헤모필루스 인플루엔자로부터 정제시킨다. 이 절차는 단백질의 중요한 항원 에피토프를 파괴할 수 있고 사람에 대한 투여용으로 안전하다고 널리 인정받지 못한, 각각의 나트륨 도데실설페이트 및 2-메르캅토에탄올과 같은 변성제 및 환원제의 사용을 수반하지 않는다.
이 철자는 먼저 헤모필루스 인플루엔자 세포의 외막 성분을 얻는 것을 수반한다. 외막성분은 전체 세포막 분획물로 부터 제조할 수 있다. 전체막 분획물은 전형적으로 프렌치 압착기 또는 기타 균질화 장치로부터 배제, 연마 또는 음파처리와 같은 방법에 의해 헤모필루스 인플루엔자 세포의 파괴 후에 차등 침강에 의해 제조된다. 그 다음 전체 막 분획물을 밀도 구배 침강에 의하거나 폴리옥시에틸렌 옥틸페놀 (트리톤 X-100™) 또는 N-라우로일 사르코신, 나트륨염 (사르코실) 과 같은 특정 세정제로써 내막 구성물의 차등 용해에 의해 내막 및 외막으로 분획 분별시킨다. 바람직한 실시양태로, 세포 외막 성분은 pH 7.4 의 100 mM HEPES-NaOH 1mM MgCl2내 0.1-2% (w/v) 트리톤 X-100 에서 내막의 차등 용해에 의해 제조한다. 이러한 추출은 전형적으로 두 번 실시한다.
외막 성분의 대안적인 원천으로서, 헤모필루스 인플루엔자 세포의 배양 배지가 유용하다. 이 배지는 이 세균의 외막의 뿌려진 성분들(소위 "기포")을 함유한다. 참조 Loeb, M.R. (1987) Infection and Immunity 55 (11) : 2612-2618.
그다음 외막-세포벽 복합체로 부터 P5 단백질의 용해를 3단계 차등 용해에 의해 성취한다. 1단계로 0.1-10%, 전형적으로 0.1-2% (w.v) 도데실설포베타인 (쯔비터겐트TM3-14)의 수용액을 사용하여 외막 단백질을 제거시킨다. 바람직하게, 1% 용액을 사용하고 추출은 보통 2-3회 수행한다. 쯔비터겐트TM 3-14 및 0.5M NaCl 추출 후에, P5 단백질을 50mM 트리스-Hcl, pH 8, 5mM Na2EDTA 내 1% 사르코실로써 용해시킨다. 추출물을 동일 완충액내 1% 쯔비터겐트™ 3-14로 조정하고 50mM 트리스-HCl, pH8, 5mM Na2EDTA (3x)내 1% 쯔비터겐트™ 3-14 로 조정하고 50mM 트리스-Hcl, pH8, 5mM Na2EDTA (3x)내 1% 쯔비터겐트™ 3 - 14의 10배 과량에 대해 24시간에 걸쳐 투석시킨다. 그다음 투석된 추출물을 직렬로 연결된 음이온 교환 (DEAE)컬럼 및 양이온 교환 (S) 컬럼을 통과시킨다. 컬럼을 분리시키고 S 칼럼을 동일한 쯔비터겐트 함유 완충액내에서 중분의 염 구배로써 용출시킨다. 정제된 P5 단백질은 SDS-PAGE 에 의해 분석된 바 단일 피이크로서 용출된다 (제 1 도).
이 방법에 의해 정제된 P5 단백질은 실질적으로 세균 내독소가 없고 사람에게 투여하기 적당하다. P5 단백질의 정제 제제를 예컨대 헤모필루스 인플루엔자에 대한 백신으로서 제약학적 조성물로서 단독으로, 또는 중이염 또는 기타 질병에 관련된 기타 유기체의 항원 및/또는 보조약과의 혼합물로서 배합된다. 원한다면, 단백질을 표준 화학 기술 또는 효소 기술에 의해 단편화시켜 항원 단편을 생산한다.
본 발명의 펩티드 및 단백질은 제 2 도에 도시된 아미노산 서열 또는 상기 서술된 바의 이 서열의 변이물에 따라 화학적으로 합성될 수 있다. 펩티드 및 단백질의 고체 또는 액체상 합성을 위한 임의 표준 화학이 유용하다. 화학 합성은 P5 단백질의 에피토프를 함유하는 올리고펩티드의 생산에 특히 적합할 것이다.
헤모필루스 인플루엔자의 캡슐 다당체에 대한 항체에 의한 경험은 생체의 검정에서 세균을 죽이는 항체의 능력이 사람 유아에게서 보호면역 반응을 유도하는 능력과 밀접하게 상호관련되어 있음을 보여준다 (Fedea 일동, J. Infect. Dis., 160, 999-1004 (1989)).
본 발명의 펩티드 및 단백질에 대한 반응으로 유도된 항-P5 단백질 항체를 유사한 생체외 검정 시스템을 사용하여 시험하여 헤모필루스 인플루엔자 세포를 죽이는 능력을 입증한다. 이 결과는 보호 면역 반응을 유도하고 사람 유아, 아동 및 성인을 위한 백신으로서 작용하는 P5 단백질의 효능과 유사한 상호연관을 83, Infect. Immun. 39 : 297 - 304; Anderson 일동, 1972, J. Clin, Invest. 51 : 31 - 38)이 특정 펩티드 단백질 또는 그의 단편에 대한 항체가 분류가능하지 않은 헤모필루스 인플루엔자에 대해 살균 활성을 갖는지 여부를 측정하는데 유용하다.
본 발명의 펩티드 및 단백질은 분류가능하지 않은 헤모필루스 인플루엔자에 대한 백신 처리를 위한 부단위 백신내 면역원으로서 유용하다. 이 백신은, 이 유기체의 분류가능하지 않은 균주에 의해 야기된 급성 중이염 및 기타 질병에 걸릴 가능성을 감소시키거나 예방하는데, 일반적으로 중이염에 대항해 아동 또는 성인을 백신처리하거나, 또는 중이염 또는 기타 질병에 걸릴 위험에 처한 아동(예컨대, 귀감염 병력이 있는 아동)을 백신처리하는데 유용하다.
본 발명의 펩티드 및 단백질은 일가 및 다가 백신으로서 배합된다. 본원에서 사용된 바의 일가 백신은 단일 성분으로서 정의되고 다가 백신은 다-성분으로서 정의된다.
P5 단백질 자체는 상기 서술된 방법에 의해 생산되거나 단리된 바대로 또는 다른 항원과 혼합되어 사용된다.
본 발명의 펩티드 또는 단백질 헤모필루스 인플루엔자의 다른 항원과 함께 다강 부단위 백신으로서 투여된다.
언급된 바대로, P5 단백질의 에피토프를 갖는 펩티드 및 단백질은 헤모필루스 인플루엔자의 기타 외막 단백질에 대한 항체로써 헤모필루스 인플루엔자를 죽이는데 상승 작용을 하는 살균 항체를 야기한다. 따라서, 본 발명의 실시양태로, P5 단백질(또는 공통 에피토프를 갖는 펩티드 또는 단백질)을 헤모필루스 인플루엔자의 기타 외막 단백질(또는 그의 에피토프를 갖는 펩티드 또는 단백질)과 함께 투여시켜 상승 살균 활성을 얻는다. 헤모필루스 인플루엔자의 특히 바람직한 외막 단백질은 펩티도글리칸-관련 외막 리포단백질(PAL) 및 Deich, P.A. 일동(1988) J. Bacteriol. 170 (2) :489 - 498에 의해 서술된 헤모필루스 리포단백질 PCP 이며, 이의 지도는 본원에 참고로 병합된다. 기타 외막 단백질의 에피토프와의 혼합 투여의 경우에, P5 단백질 펩티드는 혼합물로서 또는 접합체 또는 유전자 융합 펩티드 또는 단백질로서 따로따로 투여된다. 예컨대 PAL 및 PCP 또는 그로부터 유래된 임의 단백질, 펩티드 또는 에피토프를 P5 단백질 또는 P5 단백질 유래 펩티드 또는 단백질과의 혼합물로서 또는 접합물 또는 융합물로서 투여된다. 접합물은 단백질성 물질을 결합시키기 위한 표준 기술에 의해 형성된다. P5 단백질 또는 임의로 유래된 펩티드 또는 펩티드 및 단백질은 기타 유기체(예컨대, 캡슐이 있는 캡슐이 없는, 세균, 비루스, 곰팡이 및 기생충)의 항원과 함께 사용될 수 있다. 예컨대, P5단백질은 중이염 또는 기타 질병과 관련된 기타 미생물의 항원과 함께 유용하다. 이는 스트렙토 코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) A군, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococus aureus), 호흡 합포 비루스, 및 브랜에멜라 카타르아리스(Branhemella catarrhalis)를 포함한다.
백신 조성물을 펩티드 또는 단백질로써, 단독으로 또는 서술된 다양한 조합물로 배합할 시에, 면역원을 적당한 농도로 조정하고 임의 적당한 백신 보조약과 배합시킨다. 또한 면역원을 리포좀에 혼입시키거나 백신 배합물에 사용하기 위한 다당체 및/또는 기타 중합체에 접합시킬 수 있다.
본 발명의 백신은 다양한 방식으로 사람 또는 동물에게 투여된다. 이들은 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하내, 구강 및 비후 경로의 투여를 포함한다.
본 발명의 펩티드 및 단백질은 또한 생 백신으로서 투여된다. 이 목적을 위해, 이 펩티드 또는 단백질을 발현하는 재조합 미생물을 제조한다. 백신 수용체는 수용체내에서 증폭하고, P5 단백질 펩티드 또는 단백질을 발현하고 헤모필루스 인플루엔자의 면역 반응을 야기하는 재조합 미생물로써 접종시킨다. 바람직한 생 백신 벡터는 종두(Paoletti 및 Panicali, 미국 특허 제 4,603,112 호) 및 감쇠 살모넬라 균주(Stocker, 미국 특허 제 4,550,081 호)와 같은 발진 비루스이다.
생 백신은 실질적으로 장기 지속 면역을 제공할 수 있는 장기간 자극을 유도하므로 특히 유리하다. 면역 반응이 차후의 헤모필루스 인플루엔자 감염에 대해 보호성이라면, 생 백신은 그 자체로서 헤모필루스 인플루엔자에 대한 예방 백신으로사용될 수 있다.
다가 생 백신은 헤모필루스 인플루엔자의 상이한 에피토프(예컨대 PAL 및 PCP 또는 그의 에피토프와 같은 기타 외막 단백질)을 발현하는 하나 또는 몇몇 재조합 미생물로부터 제조된다. 게다가, 다른 병원성 미생물의 에피토프를 백신내로 병합시킬 수 있다. 예컨대 종두 비루스를 헤모필루스 인플루엔자의 것에 더하여 기타 에피토프에 대한 코딩 서열을 함유하도록 조작 할 수 있다. 상기 재조합 비루스는 자체로서 다가 백신내 면역원으로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 각각 헤모필루스 인플루엔자의 외막 단백질의 상이한 에피토프 및/또는 기타 질병 유발 유기체의 에피토프를 코딩하는 상이한 유전자를 발현시키는 종두 또는 기타 비루스의 혼합물을 다가 백신으로서 배합시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 백신은 불활화 비루스 백신이다. 불활화 백신은 그들의 감염성이 보통 화학 처리(예컨대, 포름알데히드 처리)에 의해 파괴되어 있다는 의미에서 "죽어" 있다. 이상적으로, 이 비루스의 감염능력은 비루스의 면역원성을 갖는 단백질에 영향을 미치지 않으면서 파괴된다. 불활화 백신을 제조하기 위하여, 원하는 에피토프를 발현하는 다량의 재조합 비루스를 배양물에서 증식시켜 필요량의 관련 항원을 얻는다. 상이한 에피토프를 발현하는 불활화 비루스의 혼합물이 "다가" 백신의 배합에 유용하다. 특정 경우에, "다가" 불활화 백신은 함께 투여된 생 비루스의 상호 간섭으로 야기되는 잠재적 어려움 때문에 생 백신 배합물이 바람직하다. 어느 한 경우든, 불활화 비루스 또는 비루스들의 혼합물은, 항원의 면역학적 반응을 증진시키기 위해 적당한 보조약내에 배합된다. 적당한 배합제로 다음의것들이 포함된다 : 표면 활성 물질, 예컨대 헥사데실아민, 옥타데실아미노산 에스테르, 옥타데실아미노, 리소레시틴, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, N,N-디코타데실-N'-N' 비스(2-히드록시에틸-프로판디아민), 메톡시헥사데실글리세룰 및 플루로닉 폴리올; 폴리아민, 예컨대 피란, 덱스트랄설페이트, 폴리 IC, 카르보폴; 펩티드, 예컨대 뮤라밀 디펩티드, 디메틸글리신, 투프트신; 오일 유탁액; 및 미네랄 겔, 예컨대 수산화암모늄, 인산암모늄등.
본 발명의 펩티드 및 단백질은 또한 헤모필루스 인플루엔자에 대한 수동 면역요법에서 사용하기 위해 폴리클로날 항체를 생산하는데 유용하다. 사람 면역글로블린은 이종 면역글로블린이 그의 외래 면역원 성분에 해로운 면역반응을 일으킬 수 있으므로 바람직하다. 폴리클로람 항혈청은 서술된 임의 형태의 펩티드 또는 단백질로서 면역화된 개체로부터 얻는다. 그 다음 면역글로블린 분획물을 풍부하게 한다. 예컨대, P5 단백질의 에피토프에 대해 특이적인 면역글로블린을 본 발명의 펩티드 또는 단백질을 사용하는 면역친화 기술에 의해 풍부화시킨다. 이 항체를 P5 단백질의 에피토프를 함유하는 면역흡수체 상에 항혈청으로부터 특이적으로 흡수시키고나서 면역글로블린의 풍부화된 분획물로서 면역흡수체로부터 용출시킨다.
게다가 P5 단백질을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 그와 혼성체화하는 임의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 환자의 다양한 조직 또는 체액내 헤모필루스 인플루엔자의 검출을 위한 핵산 혼성체화 검정에서 프로브로서 사용될 수 있다. 이 프로브는 다음을 포함하는 임의 핵산 임의 유형의 혼성체화 검정에서 사용된다 : 서어던 블롯9Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98 : 508); 노어던블롯(Thomas 일동, 1989 Proc. Nat'l Acad., Sci, USA 77 : 5201-05); 콜로니 블롯(Grunstein 일동, 1975, Proc. Nat'l Acas. Sci. USA 72 : 3961-65), 등. 혼성체화 방법은 검정의 요구사항에 따라 달라질 수 있다.
본 발명은 부가로 하기 실시예로 설명한다.
실시예 1
P5의 정제
외막의 각기 다른 세정제 추출로 P5 단백질 추출물을 NTHi 및 Hib 균주 모두로부터 얻는다. 쯔비터겐트 옥틸글루코사이드 3-14 및 쯔비터겐트 3-14 및 0.5M NaCl 추출 후에, P5 단백질을 50mM 트리스-Hcl, pH8, 5mM Na2EDTA 내 1% 사르코실로 용해시킨다. 추출물을 동일 완충제 내에서 1% 쯔비터겐트™ 3-14로 조정하고, 24시간에 걸쳐 50mM 트리스-HCl, pH8, 5mM Na2EDTA (3x )내 1% 쯔비터겐트™ 3-14의 10배과량에 대해 투석시킨다. 그리고나서, 투석된 추출물을 직렬로 연결된 음이온 교환(DEAE) 컬럼 및 양이온 교환 (S) 컬럼을 통해 통과시킨다. 컬럼을 분리시키고 S컬럼을 완충제를 함유한 동일 쯔비터겐트내 중분의 염 구배로 용리시킨다. SDS-PAGE로 분석될 때 정제된 P5 단백질은 단일 피크로 용리된다(제 1 도).
실시예 2
단백 효소 소화, 펩티드 단리, 및 단백질 서열화
정제된 NTHi P5 및 Hib P5를 직접 사용하여 N-말단 아미노산 서열을 결정한다(제 5 도). 엔도-펩티다제, Lys-C, Arg-C, Glu-C, 파파인, 트립신, 및 키모트립신을 포함하는 몇몇 단백 효소로 단백 효소 소화시켜 중첩 펩티드를 얻음으로써, NTHi 단백질의 총 서열을 결정한다. 또한, 브롬화 시아노겐을 사용하여 메티오닌잔기에서 단백질을 절단시켜 큰 단편을 생성한다. 미세구멍(microbore) 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 펩티드를 단리시키고 서열을 단백질 서열기로 결정한다. 펩티드 배열은 이. 콜리 OmpA 단백질에 대한 중첩 펩티드 및 동족체를 사용한다(제 2 도).
실시예 3
전 세포 엘리사 검정
몇몇 각기 다른 균주로부터 전체 포르말린 고정된 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus Influenzae) 세포를 BHI-XV 배지내 OD490=1.0으로 성장시켜 중간-로그상 세포로부터 제조한다. 세포를 인산염 완충 식염(PBS)(7mM NaHPO4-7H2O, 2mM KH2PO4, 2mM CK1, 137mM NaCl pH 7.4)로 2회 세척하고 나서, 0.3% 포르말린으로 PBS내 재분산시키고, 1-2시간동안 실온에서 항온처리한다. PBS내 세포를 세척하여 포르말린을 제거하고, 최종 농도 OD620=0.2으로 PBS내 세포를 재분산시킨다. 그리고나서, 세포 75 마이크로리터를 마이크로리터 평판의 웰에 첨가하고 37℃에서 밤새 건조시킨다. 평판을 1시간동안 PBS-0.1% Tween-20으로 블로킹시키고, 마이크로평판 세척기로 세척시킨다. 0.15mM CaCl2, 0.5mM MgCl2, 1% 젤라틴 및 0.3% Tween-20(PCM-GT)를 함유한 인산염 완충 살린내 희석된 항혈청 100 마이크로리터를 웰에 첨가하고, 평판을 2시간동안 37℃에서 항온처리시킨다. 세척 후, 결합 항원을37℃에서 한시간동안 PBS 0.05% Tween-20, 0.1% 젤라틴내 희석된 알칼리성 인산효소(TAGO)에 결합된 염소 항-쥐(IgG+IgM)으로 감지했다. 다시 세포를 세척하고, 평판을 30분 동안 디에탄올아민내 인산 p-니트로페닐(SIGMA)의 1mg/ml 용액으로 전개시켰다. 3N NaOH 첨가 후 반응을 켄칭시킨다. 평판을 OD450, 참고 OD620에서 판독기로 읽는다. 토끼 및 쥐 항-P5 혈청에 대한 전 세포 엘리사(ELISA) 자료가 개별적으로 제 3 및 4도에 제시된다.
실시예 4
살균 검정
몇몇 각기 다른 헤모필루스 인플루엔자 균주로부터의 세포를 BHI-XV 배지 내에서 밤새 성장시킨다. 다음날, 밤새 저장물의 1 : 10 희석물로부터 신선한 배양물을 제조하고 OD490=1.0으로 성장시킨다. 세포 성장하는 동안, 보충 원료, 전-초유 송아지 혈청을 1시간동안 P860295 세포로 미리 흡수시킨다. 그리고나서, 세포를 보충물로부터 펠릿화시키고, 미리 흡수된 보충물을 0.2um 단위 여과지를 통해 여과시키고 사용하기 전에 얼음상에 저장한다. 상기 검정에서 스크리닝된 항혈청 전부를 15분 동안 56℃ 에서 열 항온처리시켜 보충 활성을 제거하고, PCM 내 1 : 5로 희석시키고나서 후속으로 2배 희석시켜 살균 96 웰 미세적하 평판 내에 제조한다. 0D410=1.0 으로 성장된 세균 세포를 1 : 5 희석으로 보충 원료를 함유한 PCM 내 1 : 100,000으로 희석시킨다. 상기 혼합물의 15 마이크로리터를 항 혈청을 일련 희석시킨 항 혈청에 첨가시키고, 평판을 37℃에서 45분동안 항온처리시켰다. 그리고나서,각각의 반응물 10 마이크로리터를 BHI-XV 상에 놓는다. 37℃에서 밤새 항온처리 후, 콜로니를 계수하여 살균 역가(면역전 혈청 대조군과 비교하여 세균50% 이상을 사멸시킬 수 있는 높은 희석의 항 혈청의 상당물)를 결정한다. P5에 대한 살균자료가 제 6 도에 제시되어 있다.
서열 목록
(1) 일반정보 :
(i) 출원인 : 게리 더블류 즐롯니크 Dr.
(ii) 발명의 명칭 : 분류가능하지 않은 헤모필루스 인플루엔자 균주에 대한 백신으로서 정제된 분류가능하지 않은 헤모필루스 인플루엔자 P5 단백질
(iii) 서열 수 :
(iv) 연락 주소
(A) 수신인 : 아메리칸 사이아나미드 컴파니
(B) 가 : 원 사이아나미드 플라자
(C) 도시 : 웨인
(D) 주 : 뉴 저어지
(E) 국가 : 미합중국
(F) 우편번호 : 07470-8426
(v) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 유형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : 호환성 IBM PC
(C) 작동 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : 페이턴트 인 릴리이즈 ＃1.0, 버전 ＃1.25
(vi) 현 출원 자료 :
(A) 출원번호 : US
(B) 출원일 : 1994년 3월 7일
(C) 분류 :
(viii) 변리사/대리인 정보 :
(A) 성명 : 제임스 제이. 해링톤
(b) 참고/서류 번호 : 32,144
(ix) 통신 정보 :
(A) 전화 : 201/831-3246
(B) 텔레팩스 : 201/831-3305
(2) SEQ ID 번호 : 1에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 338 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 꼬임 : 공지되지 않음
(D) 위상 : 공지되지 않음
(iii) 분자 유형 : 단백질
(Xi) 서열 설명 : SEQ ID 번호 : 1 :
제 1도는 정제된 분류가능하지 않은 (non-typable) P5 단백질 및 유형 B P5 단백질의 나트륨 도데실 설페이트 (SDS)겔을 제공한다. 레인 1의 이중선은 P5 단백질의 열변형 및 비-열변형 형태를 나타낸다.
제 2 도는 항균 항체를 유도할 수 있는 정제된 P5 단백질의 아미노산 서열을 제공한다.
제 3 도는 NTHi P5 에 대한 토끼 항혈청으로부터 발생된 전세포 엘리사(Elisa) 종말점 역가를 제공한다.
제 4 도는 NTHI P5에 대한 생쥐 항혈청으로부터 발생된 전세포 엘리사 종말점 역가를 제공한다.
제 5 도는 몇개의 상이한 분류가능하지 않은 헤모필루스 균주에 대한 P860295 로부터의 P5 항혈청의 항균 활성을 제공한다.
Claims (10)
- 살균 항체를 유도하는, 헤모필루스 인플루인자 균주의 실질적으로 순수한 P5 외막 단백질 또는 그의 에피토프 또는 에피토프들을 갖는 그의 펩티드.
- 제1항에 있어서, 에피토프가 분류가능하지 않은 헤모필루스 인플루엔자의 본질적으로 모든 균주의 외막 상에 존재하는 P5 외막 단백질 또는 그의 에피토프 또는 에피토프들을 갖는 그의 펩티드.
- 제1항에 있어서, 아미노산 서열이, 제2도에 제공된 P5 단백질이거나, 또는 숙주내 헤로필루스 인플루엔자에 대한 살균 항체를 유도하는 단백질의 살균성질 또는 옵소닌 성질 또는 둘다를 손상시키지 않으면서 아미노산 잔기가 추가, 삽입, 치환 또는 결실된 변형 서열인, P5 외막 단백질 또는 그의 에피토프 또는 에피토프들을 갖는 그의 펩티드.
- 제3항의 단백질의 에피토프 또는 에피토프들 또는 에피토프들의 조합물에 대한 아미노산 서열에서 상응하고, 분류가능하지 않은 헤모필루스 인플루엔자에 대항해 항체 또는 항체들을 유도할 수 있는 유리 또는 접합 형태의 올리고 뉴클레오티드.
- N-라우로일 사르코신, 나트륨 염 수용액으로써, 외막 단백질의 화합물제제를 추출한 후에 헤모필루스 인플루엔자의 외막으로부터 P5단백질을 단리 및 정제하는 방법으로서, 하기(a)-(e)로 구성됨을 특징으로 하는 방법:(a) 설포베타인 수용액으로써 P5단백질을 함유하는 불융성 잔기를 추출하는 단계;(b) N-라우로일-사르코시네이트로써 단계 (a)의 불용성 잔기를 용해시키는 단계;(c) 설포베타인으로써 단계 (b)의 잔기를 투석시키는 단계;(d) 적당한 양이온 교환 칼럼으로부터 P5 단백질을 용출시키는 단계; 및(e) 용출후에 양이온 교환 칼럼으로부터 본질적으로 순수한 P5 단백질을 회수하는 단계.
- 제약학적으로 허용가능한 부형제내 면역원 양의 헤모필루스 인플루엔자 P5단백질 또는 그의 에피토프 또는 에피토프들을 갖는 펩티드, 및 임의의 보조약으로 구성되는 백신 조성물.
- 제6항에 있어서, 최소한 1개의 부가적 항원 또는 하나 이상의 유기체를 더 포함하는 백신 조성물.
- 제7항에 있어서, 유기체가 세균, 비루스, 기생충 또는 곰팡이인 백신 조성물.
- 제약학적으로 허용가능한 부형제내 유기체의 항원 또는 그의 에피토프 또는 에피토프들의 항원에 접합된 P5 단백질 또는 그의 에피토프 또는 에피토프들을 갖는 펩티드, 및 임의의 보조약으로 구성되는 항원 접합물로 이루어진 백신 조성물.
- 제9항에 있어서, 유기체는 헤모필루스 인플루엔자인 백신 조성물.
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