JP4236215B2 - 非型性のヘモフイルス インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）株用のワクチンとしての精製非型性ヘモフイルス インフルエンザＰ５蛋白質 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヘモフィルス インフルエンザ細菌株のＰ５外膜蛋白質およびＰ５蛋白質に対する抗体に関する。本発明はまた、Ｐ５蛋白質を単離する方法およびヘモフィルス インフルエンザ感染の治療に用いるためのワクチン組成物にも関する。
【０００２】
【発明の背景】
ヘモフィルス インフルエンザ株は一定の型に属するものと非型性のものとの２つの群に分類される。既知の莢膜を保持する株は莢膜と対照抗血清との血清学的反応によりその型が決定される。現在ではａ−ｆ型が一定の型に属するものとして同定されている。莢膜を保持しておらず、そして対照抗血清のいずれのものとも反応しない株が非型性のものである。
【０００３】
非型性のヘモフィルス インフルエンザ（ＮＴＨｉ）感染は、中耳炎、副鼻腔炎、および慢性の肺閉塞性疾患を初めとする数々の疾患状態に関連している。ヘモフィルス インフルエンザｂ型（Ｈｉｂ）は、髄膜炎および４歳の年齢以下の小児の侵襲性感染の主原因である。生物体の莢膜多糖に対する抗体は、殺菌性、インビトロにおけるオプソニン作用、ならびに実験動物およびヒトにおける防御作用を示す。本明細書において用いる際には、オプソニンは、食作用による微生物の取り込みをより簡便に行うことを可能にする微生物表面の構成物であるとして特定される。ヘモフィルス インフルエンザＢ型の疾患の予防のための安全かつ有効なワクチンが作製されている一方で、これらのワクチンは全て細菌の細胞壁外部に存在する多糖莢膜に対する抗体産生に基づいている。定義によれば、ヘモフィルス インフルエンザ株の内のＮＴＨｉ株は莢膜を有さない。従って、莢膜に対する抗体はＮＴＨｉ感染の予防には有効ではないであろう。
【０００４】
ヘモフィルス インフルエンザ細菌の外膜蛋白質の特性決定を行い、そしてそれらのワクチンとしての可能性を評価することが本発明の目的である。Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７２：６７７−６８４（１９８３））は、ヘモフィルス インフルエンザ株の主要外膜蛋白質の内の一つであるＰ２の精製および特性決定を報告した。この研究者達は、Ｐ２蛋白質が高濃度で存在し、精製が容易であり、そしてウサギにおいて防御抗体を誘導することを見いだした。Ｐ５蛋白質は外膜蛋白質層に結合していると考えられ、そして既にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）での可溶化および有機溶媒分留により抽出されている。（Ｃｏｕｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２０：２８０−２８７（１９８３））。しかしながら、ＳＤＳの利用により特定の環境下では蛋白質が変性する可能性があることが示唆されている。
【０００５】
ＭｕｎｓｏｎおよびＧｒａｎｏｆｆ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（ｐ．５４４、（１９８５））は、Ｐ５およびＰ６蛋白質の部分的な特性決定を報告している。これらの結果により、Ｐ６細胞壁複合体はラット幼児モデルで防御活性を示す抗体をウサギで誘導する一方で、Ｐ５はラット幼児において防御作用を示す抗血清を産生させる訳でもなく、またＰ５はインビトロでの免疫蛍光活性を示す蛍光抗体法によると細菌表面と一緒に用いても抗血清復帰を誘導する訳でもないことが示された。これらの所見に基づき、当業者は、Ｐ５はヘモフィルス インフルエンザｂ型により引き起こされる疾患の防御のためのワクチン候補物ではないと結論付けた。
【０００６】
【発明の構成】
発明の要約
従って、ヘモフィルス インフルエンザ細菌の本質的に純粋なＰ５外膜蛋白質、Ｐ５蛋白質に対する抗体、およびヘモフィルス インフルエンザの感染株の治療における利用のためのワクチン組成物を提供することが本発明の目的である。
【０００７】
さらに、ヘモフィルス インフルエンザ細菌の外膜からＰ５蛋白質を精製し、そして活性抗体を産生するのに用いることが可能な蛋白質を産生する方法を提供することが、本発明の目的である。従って、Ｐ５を用いてＮＴＨｉおよびヘモフィルス インフルエンザのｂ型株のためのワクチンを産生することが可能である。本発明は以下に示す図面および詳細な既述を参照することにより一層完全に理解されるであろう。
【０００８】
好ましい態様の詳細な記述
本発明は、非型性のヘモフィルス インフルエンザ細菌の精製済みＰ５外膜蛋白質に関する。このＰ５蛋白質は、不変および可変領域の両方を有する２８−３５ｋＤａの熱変性性外膜蛋白質である。
【０００９】
Ｐ５蛋白質は数々の特性を有しており、これらの特性をもつためにＰ５（ならびにＰ５蛋白質のエピトープを有するペプチドおよび蛋白質）は非型性のヘモフィルス インフルエンザに対するワクチン接種にとって特に価値あるものとなっている。本明細書において用いる際には、エピトープは、抗体の可変領域が結合する抗原の領域として特定される。大半の抗原は多数のエピトープを有しており、そしてそのためにその抗原に対する多価抗血清は大多数の異なる抗体を含むと思われ、そしてその各々の抗体は抗原上の異なるエピトープに結合することが可能である。従来の技術で発表されている報告とは異なり、Ｐ５蛋白質は細菌表面と反応し、かつ殺菌性を示す抗体を誘導することが可能である。この蛋白質は既に精製されており、そして非型性のヘモフィルス インフルエンザの様々な株に対する免疫反応を誘導することが示されている。
【００１０】
本発明のペプチドもしくは蛋白質はＰ５蛋白質と共通なエピトープを保持しており、そしてそのためＰ５との免疫学的交差反応性を示す。これらはＰ５蛋白質のエピトープを含む断片もしくはオリゴペプチドを含むことができる。本明細書において用いる際には、オリゴペプチドは幾つかの単量体反復単位のポリマー鎖として特定される。Ｐ５蛋白質のＮ−末端アミノ酸配列が決定されており、これを図５に示す。本発明のペプチドおよび蛋白質は図２において示されるアミノ酸配列の少なくとも一部分を有するいずれかのペプチドもしくは蛋白質、あるいはいずれかの生物学的等価配列を含む。変化させた配列には、機能的に等価なアミノ酸残基でこの配列内の残基を置換してサイレント変化を生じている配列がある。例えば、この配列内の一つもしくは複数のアミノ酸残基を、機能的等価物として作用してサイレント変化をもたらす類似極性の他のアミノ酸と置換することができる。この配列内のアミノ酸についての置換物は、そのアミノ酸が属する種類の複数の他の一員から選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンがある。極性の中性アミノ酸には、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンがある。荷電している（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシン、およびヒスチジンがある。負に荷電している（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸がある。
【００１１】
本発明のペプチドおよび蛋白質は、Ｐ５蛋白質のエピトープがその配列内に存在している断片もしくはオリゴヌクレオチド、あるいはそのような断片もしくはエピトープのいずれのアナログをも含む。その上、いずれのペプチドおよび蛋白質も、例えばアミノ酸のシステインおよびリシンのような結合性の基もしくは他の連結基を結合させることにより、他の分子へ複合体形成させるための改変を加えることが可能である。
【００１２】
以下に詳細を示すように、Ｐ５蛋白質ならびに本発明のペプチドおよび蛋白質は多くの異なる形態（例えば、単一物もしくは混合物）でワクチンに有用である。これらの目的のためには、これらのペプチドおよび蛋白質をヘモフィルス インフルエンザからの単離により、もしくは化学合成により、もしくは恐らく種々の宿主細胞内での組換え発現のような生物工学的方法により産生する。
【００１３】
天然のＰ５蛋白質は分画的界面活性抽出の方法によりヘモフィルス インフルエンザから精製する。この方法は、各々、この蛋白質の重要な抗原性エピトープを破壊する可能性がある、そしてヒトへの投与について安全であるとして広く許可されている訳ではない、ドデシル硫酸ナトリウムおよび２−メルカプトエタノールのような変性剤および還元剤の使用を必要としない。
【００１４】
この方法はまず第一にヘモフィルス インフルエンザ細胞の外膜構成成分を取得することを必要とする。外膜構成成分は全細胞膜分画から調製することができる。全膜分画は、典型的には超音波破砕、粉砕、もしくはフレンチプレスでの圧壊、あるいは他の均質化装置のような方法によるヘモフィルス インフルエンザ細胞の破砕後の分画的沈降法により調製する。その後、全膜分画を密度勾配沈降法により、あるいはポリオキシエチレンオクチルフェノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商標））もしくはＮ−ラウロイルサルコシンのナトリウム塩（サルコシル）のような特定の界面活性剤での内膜構成成分の分画的可溶化により内膜と外膜とへ分画化する。好ましい態様においては、細胞の外膜構成成分を、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、ｐＨ７．４中の０．１−２％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中での内膜の分画的可溶化により調製する。
【００１５】
ヘモフィルス インフルエンザ細胞の培養培地は外膜構成成分の別の源として有用である。この培地は細菌の外膜の脱落してきた構成成分（「ブレッブ（小さな粒の意味）」と称する）を含む。Ｌｏｅｂ、Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５５（１１）：２６１２−２６１８、を参照せよ。
【００１６】
その後、外膜−細胞壁複合体からのＰ５蛋白質の可溶化を３段階の分画的可溶化により達成する。第一段階においては、０．１−１０％、典型的には０．１−２％（ｗ／ｖ）のドデシルスルホベタイン（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商標）３−１４）の水溶液を用いて外膜蛋白質を除去する。１％溶液を用いることが好ましく、そして通常はこの抽出を２−３回実施する。Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商標）３−１４および０．５ＭのＮａＣｌでの抽出後、Ｐ５蛋白質を５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、５ｍＭのＮａ₂ＥＤＴＡ中の１％のサルコシルで可溶化する。この抽出物を同一緩衝液中で１％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商標）３−１４に調整し、そして５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、５ｍＭのＮａ₂ＥＤＴＡ（３×）中の１０倍過剰の１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商標）３−１４に対して２４時間以上透析する。その後透析済み抽出物を直列に接続してある陰イオン交換（ＤＥＡＥ）カラムと陽イオン交換（Ｓ）カラムに通す。これらのカラムを切り離し、そしてＳカラムについて同一のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ含有性緩衝液中の増加塩濃度勾配液での溶出を行う。精製Ｐ５蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したところ一本のシングルピークとして溶出される（図１）。
【００１７】
この方法により精製したＰ５蛋白質は細菌性内毒素を実質的に含まず、そしてヒトへの投与に適する。その後Ｐ５蛋白質の精製調製物を、ヘモフィルス インフルエンザ用のワクチンを例とする薬剤学的組成物として単独で、あるいはアジュバンドおよび／または中耳炎もしくは他の疾患に関連する他の生物体の抗原との混合物の状態で調剤する。所望であらばこの蛋白質を、標準的な化学的もしくは酵素的技術により断片化させて抗原性セグメントを作製する。
【００１８】
本発明のペプチドおよび蛋白質を、既述されるように、図２に示されるアミノ酸配列もしくはその配列の変異物に従って化学的に合成することができる。ペプチドおよび蛋白質の固相もしくは液相合成のための標準的な化学的手法が有用である。化学合成は、Ｐ５蛋白質のエピトープを含むオリゴヌクレオチドの産生に特に適するであろう。
【００１９】
ヘモフィルス インフルエンザの莢膜多糖に対する抗体を用いた実験により、インビトロアッセイにおいて細菌を殺す抗体の能力がヒトの乳児における防御的免疫反応を誘導する能力と密接に関連していることが示されている（Ｆｅｄｅａｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１６０、９９９−１００４（１９８９））。
【００２０】
本発明のペプチドおよび蛋白質に反応して誘導される抗−Ｐ５蛋白質抗体を類似のインビトロアッセイ系において検査してヘモフィルス インフルエンザ細胞を殺す能力を証明する。これらの結果により、Ｐ５蛋白質の、防御的免疫反応を誘導する可能性と、ヒトの乳児、小児、および成人のためのワクチンに役立つ可能性とに類似の関連性が示される。
【００２１】
インビトロでの補体介在性殺菌性アッセイ系（Ｍｕｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８３、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． ３９：２９７−３０４；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９７２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ５１：３１−３８）は、ＰＲＰおよびリポ多糖（ＬＰＳ）に対する抗体のヘモフィルス インフルエンザに対する殺菌活性を測定するのに従来用いられており、この系は特定のペプチド蛋白質もしくはその断片に対する抗体が非型性のヘモフィルス インフルエンザに対する殺菌活性を有するか否かを決定するのに役立つ。
【００２２】
本発明のペプチドおよび蛋白質は、非型性のヘモフィルス インフルエンザに対するワクチン接種用のサブユニットワクチン中の免疫原として有用である。これらのワクチンは、その生物体の非型性株により引き起こされる急性中耳炎および他の疾患を予防するもしくはそれらの疾患への感受性を低下させるのに有用であり、一般的には小児および成人に中耳炎に対するワクチン接種を施す、あるいは中耳炎もしくは他の疾患に罹患する危険のある小児（例えば、耳の感染歴のある小児）にワクチン接種を施すのに役立つ。
【００２３】
本発明のペプチドおよび蛋白質は、一価および多価ワクチンとして製剤する。本明細書において用いる際には、一価ワクチンは単一構成成分として特定され、そして多価ワクチンは複数の構成成分として特定される。
【００２４】
Ｐ５蛋白質自体を、既述の方法により作製されるもしくは単離される、あるいは他の抗原との混合物として使用する。
【００２５】
本発明のペプチドもしくは蛋白質を、ヘモフィルス インフルエンザの他の抗原と組み合わせてある多価サブユニットワクチンとして投与する。
【００２６】
既述されるように、Ｐ５蛋白質のエピトープを有するペプチドおよび蛋白質は、ヘモフィルス インフルエンザを殺すのにヘモフィルス インフルエンザの他の外膜蛋白質に対する抗体と相乗的に作用する殺菌性抗体を誘導する。従って本発明のある態様においては、Ｐ５蛋白質（あるいは共通エピトープを有するペプチドもしくは蛋白質）を、相乗的殺菌活性を達成するためにヘモフィルス インフルエンザの他の外膜蛋白質（あるいはそのエピトープを有するペプチドもしくは蛋白質）と組み合わせて投与する。ヘモフィルス インフルエンザの特に好ましい外膜蛋白質は、ペプチドグリカンに結合している外膜リポ蛋白質（ＰＡＬ）、およびＤｅｉｃｈ、Ｐ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７０（２）：４８９−４９８、（この教示は引用することにより本明細書に取り込まれる）により記載されるヘモフィルスのリポ蛋白質ＰＣＰである。他の外膜蛋白質のエピトープとの組み合わせ投与のためには、Ｐ５蛋白質ペプチドを、別々に、混合物として、あるいは複合体もしくは遺伝子融合ペプチドまたは蛋白質として、のいずれかで投与する。例えば、ＰＡＬおよびＰＣＰ、あるいはそれらから得られるいずれかの蛋白質、ペプチド、もしくはエピトープを、Ｐ５蛋白質、あるいはＰ５蛋白質から得られるペプチドもしくは蛋白質との混合物として、あるいは複合体もしくは融合体として投与する。複合体は蛋白質性物質を結合させるための標準的な技術により形成する。Ｐ５蛋白質、あるいはそれから得られるいずれかのペプチドもしくは蛋白質を、他の生物体（例えば、莢膜を保持するもしくは莢膜を保持しない細菌、ウイルス、真菌類、および寄生虫）の抗原と組み合わせて使用することができる。例えば、Ｐ５蛋白質は、中耳炎もしくは他の疾患に関連する他の微生物の抗原と組み合わせるのに役立つ。これらの微生物には、ストレプトコックス ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ストレプトコックス ピヨゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のグループＡ、スタフィロコックス アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、呼吸器のシンシチウムウイルス、およびブランヘメラ カタルハリス（Ｂｒａｎｈｅｍｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）がある。
【００２７】
ペプチドもしくは蛋白質を単独で、もしくは既述される様々な組み合わせ物中に含むワクチン組成物の製剤にあたっては、免疫原を適切な濃度に調節し、そしていずれかの適切なワクチン用アジュバンドと共に製剤する。免疫原をリポソーム内に取り込ませるか、あるいは多糖類および／またはワクチン製剤の利用のための他のポリマーに対して複合体形成させることもできる。
【００２８】
本発明のワクチンは様々な方法でヒトもしくは動物に投与する。これらの方法には、皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、経口、および経鼻経路の投与がある。
【００２９】
本発明のペプチドおよび蛋白質は、生ワクチンとしても投与する。この目的のためには、そのペプチドもしくは蛋白質を発現する組換え微生物を調製する。ワクチン被接種者に、その被接種者内で増殖し、Ｐ５蛋白質のペプチドもしくは蛋白質を発現し、そしてヘモフィルス インフルエンザの免疫反応を誘導する組換え微生物を接種する。好ましい生ワクチンベクターは、ワクシニアのようなポックスウイルス（ＰａｏｌｅｔｔｅｉおよびＰａｎｉｃａｌｉ、米国特許第４，６０３，１１２号）および弱毒化したサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株（Ｓｔｏｃｋｅｒ、米国特許第４，５５０，０８１号）である。
【００３０】
生ワクチンは特に有利であり、それはそれらが実質的に長期継続的な免疫を付与することが可能である持続性刺激を誘導するためである。免疫反応が後に生じるヘモフィルス インフルエンザ感染に対して防御作用を示す場合には、生ワクチン自体をヘモフィルス インフルエンザに対する予防的ワクチンに用いることができる。
【００３１】
多価生ワクチンは、ヘモフィルス インフルエンザの異なるエピトープ（例えば、ＰＡＬおよびＰＣＰのような他の外膜蛋白質、もしくはそれらのエピトープ）を発現する単一もしくは幾つかの組換え微生物から調製する。その上、他の病原性微生物のエピトープをワクチン内に取り込ませることができる。例えば、ワクシニアウイルスをヘモフィルス インフルエンザのもの以外にも他のエピトープのコーディング配列を含むように作製することができる。このような組換えウイルス自体を多価ワクチンの免疫原として用いることができる。別法として、ヘモフィルス インフルエンザの外膜蛋白質の様々なエピトープおよび／または他の疾患の原因となる生物体のエピトープをコード化する異なる遺伝子を各々のウイルスが発現するワクシニアウイルスもしくは他のウイルスの混合物を多価ワクチンとして製剤することができる。
【００３２】
本発明の他のワクチンは、不活化ウイルスワクチンである。不活化ワクチンは、それらの感染性が通常は化学的処理（例えば、ホルムアルデヒド処理）により破壊されているという意味において「死んだ」ものである。ウイルスの感染性が、そのウイルスの免疫原性を保持する蛋白質に影響を及ぼすことなく破壊されるのが理想である。不活化ワクチンを調製する目的では、所望のエピトープを発現する大量の組換えウイルスを培養物中で増殖させて必要量の適切な抗原を提供する。異なるエピトープを発現する不活化ウイルスの混合物は「多価」ワクチンの製剤に有用である。特定の事例においてはこれらの不活化「多価」ワクチンは生ワクチンの製剤より好ましく、それは複数の生ワクチンを一緒に投与すると互いに妨害しあうことにより生じる障害が存在する可能性があるためである。いずれの場合においても不活化ウイルスもしくはウイルスの混合物を、抗原に対する免疫学的反応を亢進させる目的で適切なアジュバンド中で製剤する。適切なアジュバンドには、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、オクタデシルアミン、リゾレシチン、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチルプロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニックポリオール類を例とする界面活性物質類、ピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、カルボポールを例とするポリアミン類、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、ツフトシンを例とするペプチド類、油性乳化物類、ならびに水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムなどを例とする鉱物ゲルがある。
【００３３】
本発明のペプチドおよび蛋白質は、ヘモフィルス インフルエンザに対する受動性免疫療法での利用のためのポリクローナル抗体を産生するのに有用である。ヒトの免疫グロブリンが好ましく、それは異種の免疫グロブリンは外来性免疫原構成成分に対する有害な免疫反応を引き起こす可能性があるためである。ポリクローナル抗血清は既述のいずれかの形態のペプチドもしくは蛋白質で免疫化した個体から取得する。その後に免疫グロブリン分画を濃縮する。例えば、Ｐ５蛋白質のエピトープに特異的な免疫グロブリンを、本発明のペプチドもしくは蛋白質を利用する免疫親和性技術により濃縮する。抗体を、抗血清からＰ５蛋白質のエピトープを含む免疫吸着体上に特異的に吸着させ、そしてその後に免疫グロブリンの濃縮分画としてその免疫吸着体から溶出する。
【００３４】
その上、それらの抗体とハイブリダイズするＰ５蛋白質もしくはいずれかのヌクレオチド配列をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列を有する核酸を、患者の様々な組織もしくは体液でのヘモフィルス インフルエンザの検出のための核酸ハイブリッド形成アッセイでのプローブとして使用することができる。これらのプローブを、サザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ ｉｏｌ． ９８：５０８）、ノザンブロット（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．、１９８９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：５２０１−０５）、コロニーブロット（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９７５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２：３９６１−６５）などを初めとする、いかなる種類の核酸のハイブリッド形成アッセイにも使用することができる。ハイブリッド形成の緊縮度はアッセイの必要事項によって変化させることができる。
【００３５】
本発明は以下に示す実施例により更に詳しく説明される。
【００３６】
【実施例】
実施例１
Ｐ５の精製
Ｐ５の蛋白質抽出物は、外膜の分画的界面活性剤抽出によりＮＴＨｉおよびＨｉｂ体の両方から取得する。Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商標）オクチルグルコシド３−１４およびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商標）３−１４および０．５ＭのＮａＣｌ抽出の後に、Ｐ５蛋白質を５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、５ｍＭのＮａ₂ＥＤＴＡ中の１％サルコシルで可溶化する。この抽出物を同じ緩衝液中で１％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商標）３−１４に調節し、そして５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、５ｍＭのＮａ₂ＥＤＴＡ中の１０倍過剰の１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商標）３−１４に対して２４時間以上透析する。その後、透析済み抽出物を直列に接続してある陰イオン交換（ＤＥＡＥ）カラムと陽イオン交換（Ｓ）カラムに通す。これらのカラムを切り離し、そしてＳカラムについて同一のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商標）含有性緩衝液中の増加塩濃度勾配液での溶出を行う。精製済みＰ５蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したところ一本のシングルピークとして溶出される（図１）。
【００３７】
実施例２
プロテアーゼ消化、ペプチド単離、および蛋白質の配列決定
精製したＮＴＨｉ Ｐ５とＨｉｂ Ｐ５とを直接使用してＮ−末端アミノ酸配列を決定する（図５）。ＮＴＨｉ蛋白質の全配列を、エンドペプチダーゼ類、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｒｇ−Ｃ、Ｇｌｕ−Ｃ、パパイン、トリプシン、およびキモトリプシンを初めとする数々のプロテアーゼでのプロテアーゼ消化により重複ペプチドを取得することにより決定する。また臭化シアノゲンを使用してメチオニン残基で蛋白質を開裂させて大きな断片を作成する。これらのペプチドを微小孔付き（ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて単離し、そして配列を蛋白質配列決定機で決定する。ペプチドのアラインメント決定には、重複ペプチドおよび大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のＯｍｐＡ蛋白質に対する相同性を利用する。
【００３８】
実施例３
全細胞のＥＬＩＳＡアッセイ
数々の異なる株から取得したホルマリン固定化済み全ヘモフィルス インフルエンザ細胞は、ＢＨＩ−ＸＶ培地中でＯＤ₄₉₀＝１．０になるまで増殖させた中間対数期の細胞から調製する。細胞をリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）（７ｍＭのＮａＨＰＯ₄−７Ｈ₂Ｏ、２ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄、２ｍＭのＫＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で２度洗浄し、そしてその後０．３％のホルマリンを含むＰＢＳ中に再懸濁させ、そして室温において１−２時間インキュベートする。ホルマリンは、ＰＢＳ中で細胞を洗浄することにより除去し、そして最終濃度ＯＤ₆₂₀＝０．２になるようにＰＢＳ中に細胞を再懸濁する。その後７５マイクロリットルの細胞をマイクロタイタープレートの各ウエルに添加し、そして３７℃において一晩乾燥させる。プレートをＰＢＳ−０．１％のＴｗｅｅｎ−２０で１時間遮断し、そしてマイクトプレート洗浄機中で洗浄する。０．１５ｍＭのＣａＣｌ₂、０．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、１％のゼラチン、および０．３％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＣＭ−ＧＴ）を含むリン酸緩衝化食塩水で希釈してある抗血清１００マイクロリットルを各ウエルに添加し、そしてプレートを３７℃で２時間インキュベートする。洗浄後に結合抗体を、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、０．１％のゼラチンで希釈したアルカリ性ホスファターゼ（ＴＡＧＯ）に複合体形成させてあるヤギの抗マウス（ＩｇＧ＋ＩｇＭ）で検出した。細胞を再度洗浄し、そしてプレートをジエタノールアミン中のｐ−ニトロフェニルリン酸（ＳＩＧＭＡ社）の１ｍｇ／ｍｌ溶液で発色させた。この反応を３ＮのＮａＯＨの添加後に中断させる。ＯＤ₆₂₀を対照にとった上で、プレートの計測をＯＤ₄₅₀において行う。ウサギおよびマウスの抗−Ｐ５血清についての全細胞のＥＬＩＳＡデータを図３および４にそれぞれ示す。
【００３９】
実施例４
殺菌性のアッセイ
数々の異なるヘモフィルス インフルエンザ株からの細胞を一晩ＢＨＩ−ＸＶ培地中で増殖させる。その次の日に新鮮な培養物を一晩保存した培養物の１：１０希釈物から調製し、そしてＯＤ₄₉₀＝１．０になるまで増殖させる。細胞増殖中に補体源である初乳を出す以前のウシの血清をＰ８６０２９５細胞に一時間予備吸着させる。その後細胞をペレット形成させて補体から除去し、そして予備吸着させた補体を０．２μｍのフェルター装置を通してフルター滅菌し、そして使用するまで氷上で保存する。このアッセイでスクリーニングしたすべての抗血清は、５６℃の熱による不活化を１５分間施して補体活性を除去し、そしてＰＣＭで１：５に希釈し、その後に２倍希釈を行うが、この２倍希釈液は滅菌済みの９６ウエルマイクロタイタープレート中で調製する。ＯＤ₄₁₀＝１．０になるまで増殖させた細菌細胞を、１：５の希釈率で補体源を含むＰＣＭで１：１００，０００に希釈する。この混合物１５マイクロリットルを抗血清の各連続希釈物に添加し、そしてプレートを３７℃で４５分間インキュベートさせた。その後、各反応物１０マイクロリットルをＢＨＩ−ＸＶでプレート培養する。３７℃で一晩インキュベートした後にコロニーを計測して殺菌性力価を決定する（予備免疫血清対照と比較して５０％を上回る細菌を殺すことが可能な抗血清の最高希釈率の逆数）。Ｐ５に関する殺菌性のデータを図６に示す。
【００４０】
本発明の主な特徴または態様は以下のとうりである。
【００４１】
１．殺菌性抗体を誘導する、ヘモフィルス インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）細菌株の実質的に純粋なＰ５外膜蛋白質、あるいはその一つのエピトープもしくは複数のエピトープを有するそのペプチド。
【００４２】
２．エピトープが非型性のヘモフィルス インフルエンザの本質的に全ての株の外膜に存在する、前記１のペプチドもしくは蛋白質。
【００４３】
３．アミノ酸配列が図２に示されているものであるか、あるいはその蛋白質の殺菌性もしくはオプソニン作用特性あるいはその両方を弱めることなくアミノ酸残基が付加、挿入、置換、もしくは欠損しており、その蛋白質が宿主内でヘモフィルス インフルエンザに対する殺菌性抗体を誘導するいずれかのその改変配列である、前記１のＰ５蛋白質。
【００４４】
４．アミノ酸配列が前記３の蛋白質の一つのエピトープもしくは複数のエピトープ、あるいは複数のエピトープの組み合わせ物に相当するオリゴヌクレオチドであって、遊離もしくは複合体のいずれかの形態のオリゴヌクレオチドが非型性のヘモフィルス インフルエンザに対する一つ抗体もしくは複数の抗体を誘導することが可能であるオリゴヌクレオチド。
【００４５】
５．Ｎ−ラウロイルサルコシンのナトリウム塩の水溶液で外膜構成化合物を抽出した後にヘモフィルス インフルエンザの外膜からＰ５蛋白質を単離および精製する方法であって、
（ａ）スルホベタインの水溶液でＰ５蛋白質を含む不溶性残渣を抽出する段階、
（ｂ）Ｎ−ラウロイルサルコシネートで段階（ａ）の不溶性残渣を可溶化する段階、
（ｃ）スルホベタインで段階（ｂ）の残渣を透析する段階、
（ｄ）適切な陽イオン交換カラムからＰ５蛋白質を溶出する段階、ならびに（ｅ）溶出後に陽イオン交換カラムから本質的に純粋なＰ５蛋白質を回収する段階を含む方法。
【００４６】
６．薬剤学的に許容される賦形剤および場合によって存在するアジュバンド中に、ヘモフィルス インフルエンザのＰ５蛋白質あるいはその一つのエピトープもしくは複数のエピトープを有するペプチドの免疫原的な量を含んでなるワクチン組成物。
【００４７】
７．少なくとも一つの追加抗原、あるいは一つもしくは複数の生物体を更に含む、前記６のワクチン組成物。
【００４８】
８．生物体が、細菌、ウイルス、寄生虫、もしくは真菌類である、前記７のワクチン組成物。
【００４９】
９．薬剤学的に許容される賦形剤および場合によって存在するアジュバンド中に、ある生物体の抗原あるいはその一つのエピトープもしくは複数のエピトープと複合体を形成しているＰ５蛋白質あるいはその一つのエピトープもしくは複数のエピトープを有するペプチドからなる抗原複合体を含んでなるワクチン組成物。
【００５０】
１０．生物体がヘモフィルス インフルエンザである、前記９のワクチン組成物。
【００５１】
１１．ヘモフィルス インフルエンザのＰ５蛋白質、あるいはその一つのエピトープもしくは複数のエピトープを有するペプチドの免疫原的な量をある個体に投与することを含む、ヘモフィルス インフルエンザに対する免疫化の方法。
【００５２】
１２．Ｐ５蛋白質が図２に示されるアミノ酸配列、もしくはそのいずれかの改変配列を有し、その蛋白質の殺菌性もしくはオプソニン作用特性を本質的に弱めることなくアミノ酸残基に添加、挿入、置換、もしくは欠損が生じている、前記１１の方法。
【００５３】
１３．Ｐ５蛋白質、あるいはその一つのエピトープもしくは複数のエピトープを有するペプチドを、ヘモフィルス インフルエンザの少なくとも一つの他の抗原と共に投与する、前記１２の方法。
【００５４】
１４．ヘモフィルス インフルエンザのＰ５蛋白質、あるいはその一つのエピトープもしくは複数のエピトープを有するペプチドの免疫原的な量をある個体に投与することを含む、中耳炎、副鼻腔炎、もしくは慢性的肺閉塞性疾患の原因因子により生じる急性中耳炎、副鼻腔炎、もしくは慢性の肺閉塞性疾患を予防するもしくはそれらの疾患に対する感受性を減少させる方法。
【００５５】
【表１】

【００５６】
【表２】

【図面の簡単な説明】
【図１】精製した非型性およびＢ型のＰ５蛋白質のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲルを示す図である。レーン１の二本線は、Ｐ５蛋白質の熱変性形態および熱変成していない形態を表す。
【図２】殺菌性抗体を誘導することが可能な精製済みＰ５蛋白質のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】ＮＴＨｉ Ｐ５に対するウサギ抗血清から得られた全細胞のＥＬＩＳＡ終点力価を示す図である。
【図４】ＮＴＨｉ Ｐ５に対するマウス抗血清から得られた全細胞のＥＬＩＳＡ終点力価を示す図である。
【図５】Ｐ８６０２９５からのＰ５抗血清の、数々の異なる非型性なヘモフィルス インフルエンザに対する殺菌性活性を示す図である。

Claims (1)

1. Ｎ−ラウロイルサルコシンのナトリウム塩の水溶液でヘモフィルス インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚｅ）の外膜構成化合物を抽出した後に該外膜からＰ５蛋白質を単離し精製する方法であって、
   （ａ）スルホベタインの水溶液でＰ５蛋白質を含む不溶性残渣を抽出する段階、
   （ｂ）Ｎ−ラウロイルサルコシネートで段階（ａ）の不溶性残渣を可溶化する段階、
   （ｃ）スルホベタインで段階（ｂ）の残渣を透析する段階、
   （ｄ）適切な陽イオン交換カラムからＰ５蛋白質を溶出する段階、ならびに
   （ｅ）溶出後に陽イオン交換カラムから本質的に純粋なＰ５蛋白質を回収する段階、
   を含む上記の方法。

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