PT614984E - Anticorpos humanos anti-tnf - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "ANTICORPOS HUMANOS ANTI-TNF"

FUNDAMENTO DO INVENTO

Campo: Esta descrição está relacionada, de um modo geral, com anticorpos monoclonais e, especifícamente, com anticorpos monoclonais humanos que se ligam ao factor de necrose tumoral humano (TNFa). Técnica Anterior: TNFa é uma citoquina pluripotente e pleiotrópica. É produzida principalmente por macrófagos activados, no entanto, as suas síntese e secreção também foram observadas usando granulócitos, células B das amígdalas, linhas de células B, células assassinas naturais, linhas de células T, isolados primários crónicos de células B malignas e células T do sangue periférico. TNFa também pode ser expresso nas superfícies celulares, aparentemente em duas formas. Uma é uma proteína transmembranar integral do tipo 2, com um peso molecular de 26 Kd, em monócitos, células T e noutras células. A outra forma é um produto de 17 Kd, secretado, que está ligado ao seu receptor.

Entre as muitas actividades do TNFa secretado estão o factor de crescimento de timócitos, o factor de crescimento e maturação de células B, a produção in vivo de necrose hemorrágica, perda de peso, colapso cardiovascular e falha de múltiplos orgãos. Naturalmente, estas últimas actividades são a fonte do interesse clínico em TNFa.

Durante o choque séptico, assim como em doenças inflamatórias, têm sido documentadas as síntese e secreção de TNFa, IL-1, IL-6 e IL-8. Assim, os sistemas imunitários de alguns indivíduos são expostos cronicamente a estas citoquinas. De facto, foram descritos anticorpos de baixa afinidade contra TNFa (A. Fomsgaard et al “Auto-antibodies to Tumor Necrosis Factor α in Healthy Humans and Patients with Inflammatory Diseases and Gram-Negative Bacterial Infections.” Scand. J. Immunol. 30:219-23, 1989; e K. Bendtzen et al “Auto-antibodies to IL-Ια and TNFa in Normal Individuais and Infectious and Immunoinflammatory Disorders.” Prog. Leukocyte. Biol. 10B:447-52, 1990). No entanto, estes auto-anticorpos podem não ser específicos (H. -G. Leusch et al “Failure to Demonstrate TNFa Specific Autoantibodies in Human Sera by ELISA and Western Blot.” J. Immunol. Meth. 139:145-147,1991).

Uma característica peculiar do soro humano, assim como de outros animais, é o seu teor em anticorpos naturais e polirreactivos. Estes são geralmente anticorpos IgM que se ligam a vários auto-antigénios com baixa afinidade (A.. B. Hartman et al “Organ Reactive Autoantibodies from Non-Immunized Adult Balb/c Mice are Polyreactive and express Non-Biased Vh Gene Usage. “Molec. Immunol. 26:359-70, 1989; e, P. Casali et al “CD5+ B Lymphocytes, Polyreactive Antibodies and the Human B cell Repertoire.” Immunol. Today. 10:364-8, 1989). Assim, espera-se que a reactividade do tipo auto-anticorpo contra TNFa humano seja de baixa afinidade e, provavelmente, com reactividade cruzada com vários outros antigénios.

Alguns anticorpos neutralizantes de elevada afinidade contra IL-la foram descritos em soros normais (N. Mae et al “Identification of High-Affmity Anti-IL-Ια Autoantibodies in Normal Human Serum as na Interfering Substance in a Sensitive-Linked Immunosorbent Assay for IL-Ια.” Lymphokine Cytokine and Research 10: (1) 61-68, 1991) ou de doentes (H. Suzuki ei al “Demonstratiou of Neutralizing Autoantibodies Against IL-Ια in Sera from Patientes with Rheumatoid Arthritis.” J. Ixnmunol. 145:2140-6,1990).

Apesar destas considerações, desconhecemos a descrição de quaisquer anticorpos monoclonais humanos que se liguem especificamente a TNFa, mesmo pensando que tais anticorpos possam ter valor clínico significativo. Assim, verifica-se a necessidade de anticorpos monoclonais monospecíficos contra TNFa. SUMÁRIO DO INVENTO:

Produzimos anticorpos monoclonais humanos que se ligam a TNFa humano e de ratinho. Os anticorpos ligam-se a um TNFa humano recombinante (rhTNFa) com um título comparável a três mAbs de ratinho neutralizantes, de afinidade elevada, quando testados por ELISA. Os anticorpos melhor caracterizados são do isotipo IgM apesar de, também, termos preparado do isotipo IgG. Através de experiências de ligação competitiva, o anticorpo parece ligar-se a epitopos de rhTNFa distintos dos ligados pelos Mabs neutralizantes de ratinho até agora descritos. As análises de especificidade indicam que o auto-anticorpo IgM humano se liga a TNFa recombinante humano e de ratinho, mas não a outros antigénios normalmente reconhecidos pelos auto-anticorpos IgM naturais polirreactivos. O elevado nível de identidade de aminoácidos entre as moléculas de TNFa humano e de ratinho sugere que o anticorpo seja monospecífico para um determinado epitopo partilhado por estas duas formas de TNFa. O anticorpo B5 também se liga ao TNFa da superfície celular (cs TNFa) de células T humanas, células B, monócitos, de uma variedade de linhas celulares de linhagens linfóides e de monócitos de origem humana, assim como de astrocitomas, de um carcinoma da mama e de um melanoma. O anticorpo também se liga a csTNFa dos linfócitos de chimpanzé e da linha celular de linfoma T de ratinho. A ligação do anticorpo ao csTNFa é específica uma vez que pode ser inibida por TNFa mas não por TNFP, mAb anti-TNFa neutralizante de ratinho, nem por uma forma recombinante do domínio extracelular do receptor de TNF p55 (TNFR). O auto-anticorpo B5 pode inibir a secreção de TNFa induzida por LPS pelas células da linha celular humana do tipo monócito, THP-1.

Na literatura têm sido descritos vários anticorpos monoclonais de ratinho anti-TNFa humano. No entanto, nenhum se liga também a TNFa de ratinho. A especificidade, a natureza do auto-anticorpo, a ligação ao TNFa da superfície celular e a capacidade para inibir a secreção de TNFa toma B5 um novo mAb. A caracterização dos anticorpos e a sua produção estão descritas abaixo.

BREVE DESCRICÃO DAS FIGURAS

As Figuras IA e 1B, no formato de gráfico, são uma comparação da ligação, no formato de ELISA em fase sólida, dos anticorpos monoclonais B5 (humano) e A10G10 (de murganho) a rh TNFa. As placas de ELISA foram revestidas com várias concentrações de TNF e doses tituladas de mAb foram ligadas. Estão apresentadas as curvas de ligação para cada um dos anticorpos e para várias concentrações do TNF de revestimento.

As figuras 2A e 2B mostram, no formato de gráfico, a ausência de competição para a ligação a TNFa entre mAbs de ratinho e o mAb B5. A Figura 2A mostra a ligação de três mAbs de ratinho anti-TNF e a ligação do mAb testemunha anti-rFVIII C7F7 a rhTNFa em fase sólida. A Figura 2B mostra a ausência de inibição da ligação de B5 ao TNF ligado à placa quando os mono-clonais de ratinho se ligam primeiro às placas com TNF e subsequentemente se adiciona o anticorpo B5. A Figura 3 mostra, no formato de gráfico de barras, a ligação de mAbs IgM humanos anti-TNF a rhTNFa capturado e apresentado como um complexo pela combinação de mAbs de ratinho A10G10, B6 e A6 ligados à placa. As placas de ELISA foram previamente revestidas com os três mAbs de ratinho e depois incubadas com rhTNFa. As placas foram lavadas e adicionados para ligação 20 pg/ml dos mAbs IgM humanos indicados. As barras a cheio mostram a ligação dos mAbs IgM humanos aos três mAbs de ratinho que foram incubados com TNF, as barras a tracejado mostram a ligação dos mAbs IgM quando os mAbs de ratinho ligados não foram expostos a TNF.

As Figuras 4A-4F mostram, no formato de múltiplos gráficos, os resultados de uma análise da especificidade de ligação de vários anticorpos monoclonais. As placas foram previamente revestidas com TNFa humano recombinante (B), linfotoxina humana recombinante (♦), insulina humana (□), tiroglobulina porcina (-*), BSA (O), ssDNA (B), dsDNA (□) ou fragmentos Fc de IgG humanos (Δ). O mAb de ratinho A10G10 está apresentado no painel A. Os mAbs IgM humanos B5, 7T1, H5, 1A6B5F e F.2.2.34 estão apresentados nos painéis B, C, D, E e F, respectivamente. A ligação do anticorpo foi avaliada por ELISA. A Figura 5 mostra, no formato de gráfico, a ligação de B5 a TNFa recombinante de ratinho. As placas de plástico foram previamente revestidas com um anticorpo monoclonal neutralizante de hamster anti-TNFa de ratinho a 8 μg/ml (quadrados), 4 μg/ml (triângulos) e 2 μg/ml (círculos). TNFa recombinante de ratinho foi então adicionado a 2 μg/ml (símbolos a cheio) ou não adicionado (símbolos não preenchidos). O mAb humano B5 nas concentrações indicadas foi então ligado. A ligação foi avaliada por ELISA usando anticorpo anti-IgM humana. A Figura 6 mostra, no formato de gráfico, uma comparação da ligação do mAb B5 (triângulos) e do mAb A10G10 (círculos) a rhTNFa solúvel. Os anticorpos foram ligados a placas de plástico previamente revestidas com anticorpo anti-humano ou anti-ratinho. Incubou-se então TNF biotinilado com os anticorpos. A ligação do TNFa solúvel foi detectada pelos conjugados de enzima-avidina. A Figura 7 mostra, no formato de gráfico, que o mAb B5 capturado se liga a TNFa solúvel e apresenta-o fracamente ao mAb A10G10. Os mAbs B5 anti- TNFa ou 6F11 (IgM humana anti-LPS) como testemunha, foram ligados a placas previamente revestidas com anticorpo anti-IgM humana. TNFa solúvel foi então ligado aos mAbs humanos complexados. O mAb A10G10 de ratinho foi adicionado e a sua ligação ao TNF complexado com o mAb B5 foi detectada pelo anticorpo anti-IgG de ratinho ligado a enzima. A Figura 8 mostra, no formato fotográfico de transferências Western, a ligação de vários anticorpos IgM humanos a TNFa de ratinho e a ligação do mAb B5 humano a TNFa humano. TNFa recombinante de ratinho (pistas A-G) e rhuTNFa (pistas Hei) foram sujeitos a electroforese em condições redutoras e transferidos para nitrocelulose. TNFa de ratinho foi incubado com os seguintes -7- anticorpos monoclonais: 7T1 (pista A), B5 (pista B), 1A6B5F (pista C), 6F11 (pista D), H5 (pista E), A8 (pista F) e sem anticorpo primário (pista G). TNFa humano foi sujeito a electroforese nas pistas H e I. A pista H foi então incubado com o mAb B5 e a pista I com o mAb 6F11. As pistas A-F, Hei foram então expostas a anticorpo biotinilado anti-IgM humana. A pista F foi exposta a anticorpo biotinilado anti-IgG, uma vez que A8 é um anticorpo IgG. Todas as pistas foram então expostas ao reagente de revelação peroxidase de rábano silvestre acoplado a avidina. Os padrões de pesos moleculares, variando entre 211 Kd e 15,4 Kd, foram corridos paralelamente e estão indicadas as suas posições. A Figura 9 mostra, no formato de gráfico, a neutralização de rhTNFa pelos mAbs humanos. As células WEHI 164 foram incubadas com uma dose citotóxica de rhTNFa na presença de concentrações tituladas do mAb. A viabilidade foi subsequentemente avaliada.

As Figuras 10A-10H mostram, em formato de histograma, os perfis de fluorescência de duas linhas celulares coradas com mAbs IgM humanos anti-TNFa. As células 8B9 (figura 10A, 10C, 10E, 10G) e as células TPH-1 (Figura 10B, 10D, 10F, 10H) foram coradas sem anticorpos (Figura 10A, 10B), com FL-F(ab)’2 anti-IgM humana (Figuras 10C, 10D), B5 IgM anti-TNFa+FL-anti-IgM (Figuras 10E, 10F) e 6F11 anti-LPS+FL-anti-IgM (Figuras 10G, 10H). Os números de intensidade de fluorescência dos canais, em unidades arbitrárias, estão representados em função das células por canal em ordenadas. Para cada uma das amostras foram acumuladas 5 000 células. Estão apresentadas as percentagens de células que caem dentro das marcas indicadas, contabilizadas como positivas relativamente à fluorescência.

As Figuras 11A-11B mostram, no formato de gráfico, a detecção da expressão na superfície celular de TNFa nas células THP-1 e U937 com o mAb Β5 anti-TNFa e o aumento da expressão com LPS e PMA. As células THP-1 (Figura 11 A) e U937 (Figura 11B) foram incubadas 3 horas com meio (círculos vazios), LPS (círculos a cheio) ou LPS+PMA (triângulos a cheio).

As Figuras 12A-12D mostram, no formato de gráfico, a mudança na intensidade de coloração quando o mAb IgM B5 anti-TNFa se liga às células coradas com o anticorpo Fl-anti-IgM. Estão apresentados os esplenócitos positivos para CD19. Estes foram corados com anti-CD19 conjugado com ficoeritrina e apenas as células positivas foram analisadas relativamente à coloração com anticorpo conjugado com fluoresceína. A Figura 12A mostra os esplenócitos Cl9+ não corados com FL-anti-IgM. A Figura 12B mostra a coloração destas células com B5+FL-anti-IgM, a Figura 12C mostra a coloração com FL-anti-hgM sozinho e a figura 12D mostra a coloração com 6F11 testemunha anti-LPS IgM+FL-anti-IgM. Estão apresentadas as percentagens de células dentro das marcas indicadas, indicando a percentagem de células com coloração positiva com anticoipo conjugado com fluoresceína. Estão também apresentados os números médios por canal para as populações positivas. Estes números reflectem a intensidade de coloração, medida em unidades arbitrárias, para as populações positivas relativamente a fluorescência.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Materiais e Métodos

Reagentes: rhTNFa foi fornecido pela Bayer AG., Wuppertal, Geimany. rmTNFa e rhLT foram adquiridos à Genzyme. Os fragmentos Fc de IgG humana foram adquiridos à Chemicon. A insulina foi adquirida à Novo Nordisk Labs e todos os outros antigénios usados em ELISAs foram adquiridos à Sigma. O Staph. Aureus estiipe Cowan foi adquirido à Calbiochem (San Diego, CA). 0 conjugado anti-IgD humana-Dextrano foi adquirido a uma fonte privada. O ácido mirístico de forbol, IgGi, enterotoxina B de estafilococos (SEB) e fito-hemaglutinina (PHA) foram adquiridos à Sigma. Os diferentes soros fetais bovinos (FBS) foram adquiridos à Hyclone.

As linhas celulares referidas na Tabela 2 foram todas adquiridas à American Type Culture Collection (ATCC), excepto para a linha 8B9 de células B humanas transformadas com EBV que foi adquirida à Genetic Systems Corporation. TNF foi biotinilado usando técnicas convencionais; resumidamente, o éster N-hidroxissuccinimidilo de biotina foi adicionado a TNF dissolvido em NaHC03, pH 8,5 durante 15 min, a reacção foi parada com NH4CI e depois dialisada para remover a biotina que não reagiu. O mAb IgG] de ratinho A10G10 anti-TNFa foi produzido em colaboração com a Chiron Corporation e tem uma designação ATCC número HB9736, identificado como a linha celular de hibridoma 2-2-3E3.

Os mAbs IgGi de ratinho A6 e B6 foram produzidos no nosso laboratório a partir de ratinhos hiperimunizados. Os três mAbs de ratinho neutralizam a citotoxicidade de TNF e foram descritos em Galloway et al “Monoclonal anti-Tumor Necrosis Factor (TNF) Antibodies Protect Mouse and Human Cells iram TNF cytotoxicity.” J. Immunol. Meth. 140:37-43, (1991) que aqui é incluído como referência. Estes mAbs foram purificados por cromatografia de afinidade.

Os mAbs IgM polirreactivos 1A6B5F e F2.2.34 foram produzidos e caracterizados por Kasain et al. “Identification and Analysis of a Novel Human Surface CD5- B Lymphocyte Subset Producing Natural Antibodies.” J. Immunol. 148:2690-702 (1990). O mAb IgM humano 7T1 foi produzido e fornecido em ascites por uma fonte privada. A linha linfoblastóide 6F11-E4 (6F11) de células B transformadas com EBV, tendo a designação ATCC número CRL 1869, produz um anticorpo IgM humano específico anti-LPS de Pseudomonas tipo 2 Fischer e foi adquirido à Genetic Systems Corporation. O anticorpo monoclonal desta linha celular foi produzido no nosso laboratório. Ele serve como um mAB para controlo de isotipo para os mAbs humanos anti-rhTNFa. O mA.b C7F7 é uma IgGi de ratinho anti-hFVIII desenvolvido em colaboração com a Genentech Inc. e usado como um mAb controlo do isotipo para os mAbs de ratinho anti-rhTNFa.

Anticorpos de cabra anti-IgG de ratinho e anticorpos de cabra anti-IgG humana biotinilados foram adquiridos à Jackson Labs. Anticorpos de cabra anti-IgG de ratinho biotinilados e anticorpos de ratinho anti-IgM humana biotinilados foram adquiridos à Zymed. HRP conjugada com avidina e fosfatase alcalina acoplada a avidina foram adquiridos à Zymed.

Anticorpos anti-CD3 e anti-CD19 conjugados com ficoeritrina foram adquiridos à Dakopatts. Anticorpos anti-LeuM3 conjugados com ficoeritrina foram adquiridos à Becton Dickinson. Anticorpos F(ab)’2 anti-IgM humana conjugado com fluoresceína (FL), FL-F(ab)’2 anti-IgG humana e FL-F(ab)’2 anti-IgG de ratinho foram adquiridos à Cappel. ETJSAs: Os antigénios ou anticorpos de captura (anticorpos anti-imunoglobulina) foram usados para revestir placas de plástico em tampão carbonato/bicarbonato ou PBS contendo 20 pg/ml de BSA, durante a noite a 4°C ou 3 horas a 37°C. As incubações secundárias foram realizadas durante a noite a h*·y^ I «'ji 4°C ou à temperatura ambiente durante um período de 2 lus ou menos. Os anticorpos secundários foram biotinilados e a sua ligação foi revelada usando HRP acoplada a avidina e fosfatase alcalina acoplada a avidina.

REALIZAÇÕES ESPECÍFICAS

Produção de Hibridomas: Os mAbs IgM humanos foram produzidos por fusão com o mieloma não secretor P3X63Ag8.653. Células mononucleadas do sangue periférico de um dador positivo para CMV foram separadas por centrifugação em Ficoll, tratadas com éster metílico de L-leucil leucina, incubados in vitro com antigénio e subsequentemente tratados com EBV. Os transformantes foram distribuídos por diluição limite e as células produtoras de anticorpos que se ligam a TNF foram fundidas e subsequentemente subclonadas. O hibridoma B5 foi subclonado pelo menos cinco vezes e foi depositado na ATCC 12301 Parklawn Drive, Rockvill, MD 20852 USA em 24 de Março, 1993 como depóssito CRL 11306. O hibridoma F448-1D1-A8 e F80-1B9-F12 foi depositado em 11 de Maio, 1993 como HB 11343 e HB 11344. Os mAbs H5 e 7T1 foram produzidos por fusão de células de amígdala humanas in vitro. Os anticorpos monoclonais IgM humanos foram purificados por afinidade segundo técnicas convencionais para usar em experiências subsequentes.

Ensaio de Citotoxicidade: Para avaliar a capacidade neutralizante de TNF dos vários mAbs, usou-se o ensaio descrito por Galloway et al (referido atrás) com pequenas modificações como se segue. Resumidamente, 20 pg/ml de TNF foram incubados durante a noite com 60 000 células WEHI 164 e com o mAb a testar. As células viáveis foram então detectadas por coloração com violeta de cristal e leitura da densidade óptica a 570 nm.

Transferência Western: huTNFa recombinante (100 pg/ml mais 100 pg/ml de BSA) e mTNFa recombinante (5 pg/ml com 100 pg/ml de BSA) foram sujeitos a eleelroforese na presença de β-mercaptoetanol c SDS em géis de 12% de poliacrilamida. As proteínas foram então electrotransferidas para nitrocelulose que foi então bloqueada com BSA. Os mAbs a testar ligaram-se e foram subsequentemente detectados com reagentes anti-imunoglobulina biotinilados. Adicionou-se então Estreptavidina-HRP seguido de substrato.

Análise de Fluorescência: Um milhão de células foram coradas com concentrações óptimas de anticorpo primário, geralmente 2,5-4,0 pg/ml a 4°C durante /2 hora em PBS contendo 1% de FBS e 0,02% de azida de sódio. As concentrações óptimas de anticorpos secundários fluorescentes foram adicionadas, após duas lavagens das células, durante um tempo semelhante e em tampão semelhante. Após lavagem, as células foram fixadas com uma solução a 2% de paraformaldeído. A fluorescência celular foi então analisada num FACSCAN (nome do instrumento).

Inibição da estimulação nor LPS da Secreção de TNFa: Um milhão de células THP-l/ml foram incubadas 4 hrs com 1 pg/ml de LPS de E. coli na presença ou ausência de 40 pg/ml de anticorpos IgM humanos. Os sobrenadantes foram colhidos, centrifugados, filtrados e testados relativamente à citotoxicidade de TNFa no ensaio WEHI164 atrás referido. Os sobrenadantes foram titulados e a viabilidade foi representada graficamente em função da diluição do sobrenadante. Estas curvas foram comparadas com a curva padrão usando rhuTNFa para determinar as concentrações de TNFa produzidas pelas células.

Resultados O anticorpo monoclonal IgM humano B5 liga-se a TNF humano recombinante (rhTNFa) em fase sólida. Vários hibridomas que secretam anticorpos monoclonais anti-rhTNFa foram estabelecidos no nosso laboratório. Realizou-se uma análise de titulação limite comparando um painel de 6 mAbs -13- /<&

IgM humanos e 3 mAbs IgG humanos com três mAbs de ratinho neutralizantes de elevada afinidade, A10G10, A6 e B6. As placas de ELISA foram revestidas com 2 pg/ml de rhTNFa. Os mAbs indicados foram adicionados em concentrações tituladas e a ligação foi avaliada espectrofotometricamente. Estão apresentadas as concentrações mínimas de mAb que dão ligação de rhTNFa detectável. B5 e F12 (F80-1B9-F12) foram dois dos melhores mAbs IgM humanos por este critério, apresentando títulos por diluição limite na gama de subnanograma/ml. A Tabela 1 abaixo apresenta os resultados. Φ

Tabela 1

Comparação da ligação de rhTNFa, no formato de ELISA em fase sólida, a diferentes anticorpos monoclonais humanos. MAb Título por diluição limite (ng/m) Classe de Ig A1-G10 0,6 IgG de ratinho A6 0,15 IgG de ratinho B6 0,08 IgG de ratinho F78-1A10-A1 0,3 IgM humana F78-1A10-B5 0,6 IgM humana F80-1B9-F12 0,15 IgM humana F81-4E3-D6 9,8 IgM humana F83-1D6-B6 625,0 IgM humana D83-1D6-F6 1250,0 IgM humana F83-1A7-G7 0,76 IgG humana F83-1G12-C1 1,5 IgG humana F83-4D3-D8 0,38 IgG humana F83-8D5-F10 0,76 IgG humana F84-6G9-D6 1563,0 IgG humana

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Deve-se notar que as gamas e títulos por diluição limile são semelhantes para os mAbs IgM anti-TNFa e IgG anti-TNFa. A Figura 1 apresenta uma comparação mais extensa dos mAbs humano B5 e de ratinho A10G10. A ligação de ambos os mAbs foi dependente da concentração, independentemente da concentração de TNF de revestimento. O mAb B5 liga-se ligeiramente melhor do que A10G10 com concentrações de revestimento de TNF elevadas. No entanto, como a concentração de revestimento de TNF foi reduzida, a ligação de B5 decresceu mais rapidamente do que a de A10G10. Isto é consistente com B5 ter uma afinidade mais baixa do que A10G10 para rhTNFa. Estes resultados mostram que o mAb B5 se liga a rhTNFa em fase sólida. O mAb B5 liga-se a um epitopo de rhTNFa diferente daqueles a que se ligam os três mAbs de ratinho anti-TNF. Experiências de ligação competitivas mostraram que A10G10 e B6 reconhecem epitopos semelhantes em rhTNFa, enquanto A6 reconhece um epitopo diferente (resultados não apresentados). Para examinar a especificidade de ligação de B5 ao epitopo, realizaram-se experiências de ligação competitiva usando os mAbs de ratinho e B5.

Os mAbs de ratinho foram adicionados em diferentes concentrações a placas de ELISA previamente revestidas com TNFa. Uma concentração óptima do mAb B5 foi então adicionada e a ligação foi subsequentemente detectada com anticorpos biotinilados anti-IgM humana. Se os mAbs de ratinho reconhecerem o mesmo epitopo do mAb B5 deverão inibir a ligação do mAb5 numa forma dependente da concentração.

Como se mostra na Figura 2A, a ligação dos mAbs de ratinho ao rhTNFa ligado à placa é dependente da concentração. A Figura 2B mostra que nenhum dos mAbs de ratinho interfere eom a ligação de uma quantidade fixa do mAb B5 a rhTNFa, mesmo em concentrações dos mAbs de ratinho sígnificativamente em excesso relativamente às necessárias para ligação máxima à placa. Estes resultados sugerem que B5 reconhece um epitopo de rhTNFa diferente dos reconhecidos por A10G10, A6 e B6.

Para confirmar este resultado, adicionou-se rhTNFa a placas de ELISA previamente revestidas com a combinação dos mAbs A10G10, B6 mais A6. O mAb B5 foi então adicionado para testar se se podia ligar a rhTNFa complexado, ou capturado, pelos mAbs de ratinho. A Figura 3 mostra que B5 e todos os outros mAbs IgM humanos, excepto 7T1, se ligam a rhTNFa complexado com os mAbs de ratinho. A ligação dos mAbs humanos não foi observada na ausência de rhTNFa, demonstrando especificidade para algum epitopo de rhTNFa. A incapacidade do mAb 7T1 se ligar ao TNF complexado pode ser simplesmente devido a uma baixa afinidade. Estes resultados apoiam a conclusão de que os mAbs IgM humanos B5, F12, Al, B6 e D6 e os três mAbs de ratinho reconhecem epitopos diferentes no rhTNFa. O mAb B5 não é polirreactivo. Uma vez que o mAb B5 é uma IgM humana que se liga a TNFa humana e portanto tem propriedades que o define como um autoanticorpo, foi importante determinar a qualidade deste mAb e avaliar a sua polirreactividade. Escolhemos um painel de antigénios humanos e não humanos tipicamente usados para definiar polirreactividade. Comparou-se a ligação destes antigénios a mAb B5, A10G10, dois mAbs IgM humanos polirreactivos testemunhas 1A6B5F e F2.2.34 e dois outros mAbs IgM humanos anti-TNF. Os resultados foram normalizados para cada um dos anticorpos para permitir comparação directa. - 16-

A Figura 4 apresenta os dados de uma de quatro experiências semelhantes. 0 mAb de ratinho A10G10 liga-se especificamente a rhTNFa e a nenhum dos outros antigénios. Pelo contrário, o mAb polirreactivo 1A6B5F liga-se virtualmente a todos os antigénios testados. O mesmo aconteceu para o outro mAb polirreactivo F2.2.34, se bem que a ligação a BSA e TNF fosse mais forte do que a observada com outros antigénios. O mAb B5 apresentou especificidade para rhTNFa. Não se observou ligação do mAb B5 a linfotoxina humana recombinante (rhTNFP) nem a qualquer outro antigénio testado. Estes dados proporcionam evidência de que o mAb B5 não é polirreactivo.

Pelo contrário, os mAbs IgM humanos 7T1 e H5 ligam-se aos fragmentos Fc humanos indicando uma natureza de factor reumatóide. Estes dois anticorpos também se ligam a insulina e 7T1 liga-se igualmente a BSA. Os mAbs testemunhas polirreactivos parecem definir duas classes de polirreactividade; uma sendo muito larga em especificidade e a outra sendo mais restricta nos antigénios reconhecidos. Os mAbs 7T1 e H5 pertencem à classe mais restricta dos mAbs polirreactivos. O mAb F12 anti-TNF liga-se a TNFa humano, mas apenas marginalmente a outros antigénios. O mAb B5 liga-se a TNFa recombinante de ratinho. No decurso da análise da especificidade do mAb B5, verificámos que ele também se liga a TNFa de ratinho. Para demonstrar isto, primeiro capturámos TNFa de ratinho com um anticorpo monoclonal neutralizante de hamster e depois deixámos B5 ligar-se a este complexo. A Figura 5 mostra os resultados deste tipo de experiência. A ligação de B5 foi dependente da concentração de B5 presente e da concentração do anticorpo de hamster usado para revestir as placas. Não se observou ligação quando o TNFa de ratinho foi adicionado, indicando a especificidade da ligação de B5 neste sistema. Outras experiências, não apresentadas, revelaram a ligação de TNFa de ratinho ao mAb F12. O mAb F5 liga-se a rhTNFct solúvel com afinidade detectável, mas baixa. Em seguida, avaliámos a capacidade do mAb se ligar ao rhTNFa solúvel. As placas de ELISA foram revestidas com IgM não humana e B5 foi depois adicionado. A capacidade do mAb B5 se ligar ao rhTNFa biotinilado de captura foi então determinada. A Figura 6 compara as capacidades de A10G10 e B5 se ligarem a TNFa solúvel nestas condições. Se bem que ambos os mAbs se liguem a rhTNFa, é necessária uma concentração cerca de 300 vezes superior do mAb B5 para uma ligação equivalente a A10G10. Ainda, a ligação de TNFa solúvel a B5 imobilizado não saturou com as concentrações de B5 testadas. Estes resultados são consistentes com uma baixa afinidade de ligação de B5 a rhTNFa. De facto, as tentativas feitas para medir a constante de ligação do mAb B5 revelou uma afinidade demasiado baixa para calcular pelos métodos convencionais (dados não apresentados). A ligação de B5 a rhTNFa solúvel foi também demonstrada pelo revestimento das placas com anti-IgM, captura de B5 e depois adição de rhTNFa solúvel não modificado. A10G10 foi em seguida adicionado e a sua ligação a esta forma complexada de B5 e rhTNFa foi detectada com anticorpo biotinilado anti-IgG de ratinho. A Figura 7 compara as capacidades de B5 e de uma IgM humana testemunha, 6F11, para capturar e apresentar rhTNFa solúvel a A10G10. Se bem que alguma ligação inespecífica fosse observada com o mAb testemunha, o mAb B5 liga aproximadamente quatro a oito vezes mais rhTNFa nesta experiência. Estes dados são consistentes com uma constante de ligação baixa de B5 e ainda apoiam mais o conceito de que o mAb B5 e o mAb A10G10 reconhecem epitopos diferentes em rhTNFa. O mAb B5 reconhece rhTNFa em transferências Western. A Figura 8 mostra os resultados de uma experiência que usa as transferências Western para demonstrar a ligação de B5 a TNFa desnaturado. As imagens foram aumentadas por uma questão de clareza. Nas pistas A-G foi examinada a ligação a TNFa de ratinho e nas pistas H e I foi examinada a ligação a TNFa humano. O anticoipo 6F11 não se liga a espécies de TNFa e assim proporciona um controlo de especificidade. Todos os mAbs IgM humanos, 7T1, H5 1A6B5F e B5 ligam-se a TNFa de ratinho. Ainda, o anticorpo B5 também se liga nestas condições a TNFa humano. Estes resultados sugerem que B5 pode reconhecer um epitopo linear de rhTNFa. O mAb B5 não neutraliza a citotoxicidade de rhTNFa. A linha celular WEHI 164 sensível a TNF foi usada para avaliar a capacidade do mAb B5 para neutralizar a citotoxicidade de TNFa. A Figura 9 mostra que A10G10 claramente neutraliza rhTNFa, numa forma dependente da dose, conforme previamente demonstrado por Galloway et al. (referido atrás). No entanto, em nenhuma concentração de B5 se observou qualquer neutralização de rhTNFa. O mesmo é verdadeiro para os outros três mAbs IgM humanos anti-TNFa B6, F12 e 7T1 que foram testados. Estes dados apoiam ainda a ideia de B5 e A10G10 se ligarem a diferentes epitopos de TNF e são consistentes com a capacidade do mAb B5 se ligar íracamente a rhTNFa solúvel. O mAb B5 anti-rhTNFa liga-se à superfície de várias linhas celulares diferentes. Uma vez que o mAb B5 se liga especificamente a rhTNFa, foram escolhidas várias linhas celulares para testar se o mAb se liga ou não às suas superfícies. A Figura 10 mostra os resultados de uma experiência típica usando duas linhas celulares. A linha celular linfoblastóide B humana transformada com EBV 8B9 e a linha celular monocitária humana THP-1 foram coradas com B5 anti-TNFa ou com o mAb 6F11 anti-LPS de Pseudomonas e depois com os fragmentos F(ab)*2 fluorescentes anti-IgM.

As células 8B9 foram bem coradas com o mAb B5 e não se observou ligação significativa à superfície celular com o mAb testemunha 6F11. A coloração com B5 foi também observada com as células THP-1. No entanto, nesta população menos células foram coradas e a coloração observada foi mais intensa do que a observada para as células 8B9. No entanto, quase 1/3 das células na população de THP-1 expressa TNFa na superfície celular (csTNFa), conforme detectado com o mAb B5. É pouco claro se este nível de coloração reflete alguma regulação da espressão de csTNFa ou se é devido a variação clonal dentro da linha celular. A dependência da ligação de B5 às superfícies celulares foi examinada mais estreitamente com as linhas celulares de monócitos THP-1 e de histiócitos U937. Estas células foram coradas com quantidades tituladas do anticorpo B5 após incubação sem estímulo, estímulo com LPS ou com LPS+PMA durante 3 horas. Os resultados estão apresentados na Figura 11. Em todos os casos, a ligação de B5 às células foi dependente da dose. É interessante que foi observada maior ligação para ambas as linhas celulares quando elas foram pré-incubadas com LPS ou com LPS+PMA. Isto foi especialmente aparente para a linha celular U937. Este aumento é consistente com a capacidade conhecida destes agentes para induzir a secreção de TNF pelas linhas celulares de monócitos. Quando da estimulação, foi aparente a ligação de B5 às células, mesmo a várias centenas de nanogramas/ml de anticorpo. A Tabela 2 mostra os resultados de duas experiências em que foi avaliada a ligação do mAb B5 anti-TNFa. As células foram coradas com os anticorpos primários indicados e com o anticorpo secundário anti-IgM humana marcado com fluoresceína (específico de μ). São apresentadas as percentagens de células coradas conforme determinado num aparelho FACSCAN.

Tabela 2

Ligação do mAb IgM humana B5 específico de TNFa a várias linhas celulares % de células coradas positivamente Anticorpo primário

Linha Fenótipo Nenhum B5 6F11 8B9-EBV Linfoblasto B humano 1,1 86,9 4,7 1A2-EBV Linfoblasto B humano 2,3 64,7 2,7 hpbl-EBV Linfoblasto B humano 2,0 96,2 2,3 cpbl-EBV Linfoblasto B de chimpanzé 6,6 76,1 6,2 Amígdala- EBV Linfoblasto B humano 4,6 91,2 4,9 Jurkat Linfoma T humano 0,7 17,9 1,2 LBRM33 Linfoma T de ratinho 3,1 72,7 3,8 DU4475 Carcinoma da mama humano 10,2 52,4 9,8 SW1088 Astrocitoma humano 11,2 15,3 10,9 U118MG Glioblastoma humano 6,2 7,3 6,2 U373 Glioblastoma humano/ astrocitoma 4,9 69,6 3,5 U937 Linfoma histiocítico humano 0,9 63,1 1,5 THP-1 Monócito humano 1,7 25,2 2,0 1A2-EBV Linfoblasto B humano 2,2 98,4 2,9 8B9-EBV Linfoblasto B humano 4,7 98,8 5,4 A375 Melanoma humano 1,7 8,5 2,5

Foi testada uma variedade de linhas celulares incluindo as originadas de linfócitos B e T humanos, carcinoma da mama, astrocitoma, glioblastoma, monócito, histiócito, melanoma e monoblastos. Foi igualmente testado um línfoma de células T de ratinho. Das 15 linhas testadas, apenas a de carcinoma da mama U118MG não mostrou ligação a B5. As outras apresentaram uma gama de percentagem de células dentro de cada população que expressa csTNFa desde 8% , para o melanoma A375, até cerca de 90%, para as células B transformadas com EBV. O mAb 6F11 anti-LPS da mesma classe não corou qualquer uma destas linhas celulares. Isto e a linha celular negativa indicam que a coloração de B5 observada é específica e não resulta de uma afinidade geral para todas as células.

Ausência de ligação do mAb neutralizante de ratinho anti- TNFa a cs TNFa

As experiências com ELISA demonstraram a especificidade de TNF do mAb B5 e demonstraram a sua ligação a um epitopo de TNFa diferente daquele a que se liga o mAb neutralizante de ratinho A10G10. Em seguida examinámos se o epitopo reconhecido pelo mAb A10GÍ0 é ou não expresso na superfície de células às quais se liga B5. A Tabela 3 apresenta os dados de cinco experiências abordando este tema usando as linhas celulares U937 e THP-1. As células foram coradas com os anticorpos primários indicados e com os anticorpos secundários anti-IgG de ratinho (γ-específico) ou anti-IgM humana (μ-específico) marcados com fluoresceína. Os asteriscos (*) indicam que foram usados os fragmentos F(ab)’2 do mAb A10G10. São apresentadas as percentagens de células coradas positivamente conforme determinado num aparelho FACSCAN. Não determinado é representado por nd. labela 3

Ligação de B5 humano e ausência de ligação do mAb anti-TNFa de ratinho A10G10 ao TNF da superfície celular em linhas celulares não estimuladas de monócitos e histiócitos % de células coradas positivamente Anticorpo primário

Exp. Linha celular Nenhum A10G10 mlgGi Nenhum B5 6F11 1 U937 0,3 0,4 Nd 2,9 15,1 2,7 2 THP-1 0,9 2,6 Nd 2,3 24,8 2,8 U937 0,8 2,4 Nd 2,7 99,1 2,8 3 THP-1 3,1 2,7 Nd 2,7 34,7 3,4 U937 1,6 1,9 Nd 1,6 35,7 1,8 4 THP-1 2,4 3,1 1,6 1,7 17,7 3,4 U937 2,8 2,9 2,8 2,2 20,2 2,7 5 THP-1 4,7 6,0* 6,7 4,6 56,3 Nd U937 1,5 9,9* 2,3 1,2 61,4 Nd

Nas cinco experiências o mAb B5 ligou-se a cada uma das linhas celulares. Por outro lado, o mAb A10G10 não se liga, num grau significativo, em quatro das experiências. Numa das cinco experiências, observou-se uma pequena quantidade de ligação por A10G10 às células U937. Em conjunto estes dados sugerem que TNFa está na superfície destas linhas celulares, mas o epitopo reconhecido por A10G10 está apenas raramente disponível para ligação pelos mAbs na ausência de estimulação exógena.

Indução por LPS da expressão de TNFa na superfície celular. LPS é um agente normalmente usado para induzir a secreção de TNFa por monócitos humanos. Incubámos células THP-1 e U937 com LPS para -23-

examinar se a expressão de csTNFa pode ser ou não aumenlada. A Tabela 4 mostra os resultados de três experiências. A estimulação foi realizada por 3 ou 4 horas de incubação com 100 ng/ml de LPS. As células foram coradas com os anticorpos primários indicados e com os anticorpos secundários anti-IgG de ratinho (γ-específíco) ou anti-IgM humana (μ-específico) marcados com fluoresceína. Os asteriscos (*) indicam que foram usados os fragmentos F(ab)’2 do mAb A10G10. As percentagens de células coradas positivamente estão apresentadas conforme determinado num aparelho FACSCAN. Não determinado é representado por nd.

Tabela 4

Análise da expressão na superfície celular de TNFa após indução com lipopolissacárido % de células coradas positivamente Anticorpo primário

Linha Exp. celular LPS Nenhum A10G10 MIgGl Nenhum B5 6F11 1 THP-1 3,1 2,7 Nd 2,7 34,7 3,4 + 6,9 16,5 Nd 3,7 43,8 3,6 U937 - 1,6 1,9 Nd 1,6 35,7 1,8 + 3,9 12,7 Nd 1,9 43,5 2,6 2 THP-1 _ 2,4 3,1 1,6 1,7 ,17,7 3,4 + 3,1 8,3 2,2 3,0 29,6 3,2 U937 - 2,8 2,9 2,8 2,2 20,2 2,7 + 3,6 11,8 2,4 2,4 28,4 3,2 3 THP-1 4,7 6,0* 6,7 4,6 56,3 Nd + 8,1 4,9* 5,4 5,0 65,9 Nd U937 - 1,5 9,9* 2,3 1,2 61,4 Nd + 1,0 13,1* 3,7 0,7 49,3 Nd -24-

Ath*.rfr C

Nas três experiências, LPS aumentou a quantidade de ligação de B5 a células THP-1. Isto foi também observado para as células U937 em duas das três experiências. Ao contrário das células não induzidas, a estimulação com LPS levou à capacidade de serem coradas pelo mAb A10G10 as linhas THP-1 e U937. No entanto, as percentagens das células, em qualquer uma das linhas expressando os epitopos de TNFa, reconhecidas por A10G10 foram pequenas, comparativamente com as percentagens observadas com o mAb B5. Estes dados sugerem que csTNFa pode ser aumentado pela incubação com LPS e que este aumento está correlacionado com a aquisição de epitopos TNFa reconhecidos pelos anticorpos neutralizantes.

Influência de outros factores, além de LPS, na expressão de csTNFa

No decurso das nossas experiências, algumas das nossas linhas celulares perderam alguma expressão espontânea de csTNFa. Para examinar a influência do soro fetal bovino (FBS) na expressão de csTNFa, as células THP-1 foram cultivadas quatro dias nos diferentes lotes de soro fetal bovino e analisadas relativamente à expressão de TNFa na superfície celular. A Tabela 5 mostra resultados típicos. Estão apresentadas as percentagens de células que coram positivamente com os anticorpos primário e secundário de coloração fluorescente indicados. As concentrações de endotoxina, em unidades de lisado de amebócitos de Limulus, para os lotes 1079, 1087, 2081 e 1026 de FBS são respectivamente 0,125, 0,250, 0,060 e 0,750. As análises foram realizadas com um aparelho FACSCAN.

Tabela 5

Influência do soro fetal bovino na expressão na superfície celular de TNFa pelas células THP-1

Lote de FBS # 1° Ab T Ab 1079 1087 2081 1026 % de iélulas que c< >ram positiva mente Nenhum Nenhum 0,2 0,3 0,1 0,2 Nenhum FL-anti-IgM 2,2 3,5 1,6 2,6 B5 FL-anti-IgM 29,5 15,1 6,8 14,1 6F11 FL-anti-IgM 6,7 7,1 4,2 5,2 O lote de FBS teve uma grande influência na expressão de csTNFa pelas células THP-1. A diferença na expressão variou por um factor de aproximadamente quatro, dependendo do lote de FBS particular usado. A comparação dos níveis de endotoxina nestes diferentes lotes não revelou correlação directa com os níveis de csTNFa. Estes dados sugerem que outros factores para além de LPS podem influenciar a expressão de csTNFa.

Especificidade da ligação do mAb B5 a csTNFa. A Tabela 6 representa dados que confirmam a especificidade da ligação do mAb B5 a células ΉΙΡ-1. O mAb B5 a 10 pg/ml foi incubado com as concentrações indicadas de inibidores antes da exposição a células THP-1 estimuladas com LPS. A sua ligação foi detectada com anticorpo F(ab)’2 anti-IgM humana conjugado com fluoresceína. LT é linfotoxina humana recombinante, ECD55 é o domínio extracelular recombinante de ligação a TNFa do receptor de TNF p55 eAlOGlOéo mAb neutralizante IgGj de ratinho anli-TNFa. As análises foram realizadas com o aparelho FACSCAN.

Tabela 6

Especificidade da ligação do mAb B5 anti-TNFa à superfície celular de THP-1 % de células que coram positivamente

Inibidor 0,0 0,03 TNFa 44,1 43,2 LT 44,1 39,8 A10G10 44,1 39,6 pg/ml de inibidor 0,30 3,0 30,0 35,9 22,2 15,8 40,0 40,0 29,7 40,9 44,4 41,9 A pré-incubação do mAb IgM B5 com TNFa inibiu a sua subsequente ligação à superfície celular, numa fornia dependente de dose, enquanto a pré-incubação com linfotoxina não inibiu, excepto para uma pequeno efeito na concentração mais alta. A ausência de inibição completa com as doses elevadas de TNFa é consistente com a baixa afinidade deste mAb, anteriormente documentada para TNFa solúvel. É interessante que a pré-incubação do mAb B5 com A10G10 e subsequente adição de ambos não diminuiu a ligação de B5. Estes dados sugerem que A10G10 neutralizante não compete para o mesmo epitopo no TNFa ao qual se liga o mAb B5. B5 liga-se a csTNFa na superfície de células de baço humano

As secções anteriores estabelecem a ligaçãode B5 a csTNFa nas diferentes linhas celulares. Para determinar se B5 se liga ou não a células não transformadas, realizaram-se experiências com esplenócitos humanos.

Para analisar a expressão de csTNFa em células B com B5, usámos IgM B5 não conjugada, uma vez que a fluoresceinação directa ou biotinilação deste anticoipo é muito ineficaz ou interfere com a sua capacidade de ligação a TNFa. Os fragmentos F(ab)’2 fluorescentes do anticoipo anti-IgM foram usados para detectar a ligação de B5. Uma vez que muitas células B normais já expressam slgM como receptor de antigénio, não foi sempre possível detectar csTNFa como um aumento da percentagem de células sIgM+. Pudémos, no entanto, detectar csTNFa através da medição do aumento da intensidade de coloração com anti-IgM fluorescente, quando as células são incubadas com o mAb B5, comparado com a incubação com o mAb IgM 6F11 testemunha ou sem anticorpo algum. A Figura 12 demonstra que esta alteração da intensidade de fluorescência observada quando o mAb B5 se liga a células B. A Figura 12A mostra o histograma de fluorescência de células coradas com anticorpo anti-IgM sozinho. A Figura 12B mostra um histograma destas mesmas células quando primeiro reagiram com o mAb B5 anti-TNFa e subsequentemente foram coradas com anticorpo fluorescente anti-IgM. A estatística mais útil para medir esta mudança é o canal médio de intensidade de fluorescência, ou simplesmente o canal mediano. Os números do canal mediano estão apresentados nas tabelas que se seguem quando da análise das células B.

A Tabela 7 apresenta os dados de duas experiências usando material de biópsia do baço. A expressão de csTNFa em monócitos, as células T e as células B foram examinadas através da análise de fluorescência com duas cores usando ficoeritrina conjugada com anti-LeuM3, anti-CD3 e anti-CD19, respectivamente, em conjunção com fluoresceína conjugada com anti-IgM humana. Os esplenócitos humanos recebidos um dia após a biópsia foram analisadas quanto ao aparecimento de coloração da superfície celular com os anticorpos monoclonais indicados. Os linfócitos pequenos foram separados pelas propriedades dispersantes e depois analisados. As células T, células B e monócitos foram corados com anticorpos anti-CD3, anti-CD19 e anti-LeuM3 conjugados com fícoeritrina, respectivamente. Foram então realizadas análises de duas cores nestas populações usando F(áb)’2 anti-IgM humana marcado com fluoresceína e os mAbs IgM indicados. Os valores sublinhados representam os que apresentam aumentos significativos na percentagem de células coradas positivamente ou que apresentam mais de duas vezes a intensidade de fluorescência da população testemunha adequada. As análises foram realizadas com um aparelho FACSCAN.

Tabela 7

Análise da expressão de TNFa na superfície celular em esplenócitos humanos frescos % de células com coloração positiva (canal de intensidade de fluorescência mediana) Células 1° Ab: Nenhum B5 7T1 H5 6 Fll analisadas 2° Ab anti-IgM Anti-IgM anti-IgM Anti-IgM anti-IgM Baço #1: Linfócitos 37,9 (86) 60.0(246) 44.6194) 48.0(95) 37,5(88) CD3+ 4,8(21) 28.9(491 10.5(29) IM(22) 3,9(24) LeuM3+ 7,4(125) 28,9(76) 77,1(106) 67,5(124) 8,6(84) Baco #2 CD3+ 8,8(32) 88.3(54) 25.5(46) 13,7(47) 7,1(28) CD 19+ 57,5(125) £L5(910) 7L2(145) 72.2(138) 55,7(124) Leu-M3+ 7,7(196) 49.8fl63) 66.8(2272) 58.9(1604) 9,1(173)

Em ambas as experiências os monócitos constituíram menos de 5% das populações totais de esplenócitos. Destes, uma fracção significativa em ambas as experiências foi corada com o mAb B5 anti-TNFa. Por outro lado, estas células não foram coradas com o mAb IgM testemunha 6F11. Estes resultados sugerem que alguns monócitos do baço expressem csTNFa. As células T CD3+ apresentam expressão variável de csTNFa. Se bem que as percentagens de células T positivas para csTNFa variem nestas experiências, a coloração com o mAb B5 foi muito mais fraca do que a observada para as células B e monócitos. A intensidade de fluorescência mediana para csTNFa de células T não chegou mesmo a duas vezes os controlos do fundo. Estes resultados sugerem que uma proporção variável das células T do baço expressem pequenas quantidades de csTNFa. A análise da expressão de csTNFa em células B revelou uma expressão de csTNFa muito forte. Como se pode ver no baço Z, a percentagem de células B IgM+ aumentou após incubação com o mAb B5. Ainda, a intensidade de coloração da totalidade da população de células B aproximadamente triplicou. Não se observou aumento da coloração com o anticorpo testemunha 6F11, indicando a especificidade da coloração das células B com B5.

Os mAbs polirreactivos 7T1 e H5 foram incluídos nestas análises. Para além de se ligarem a TNFa, estes anticorpos reagem com vários outros antigénios. Assim desconhecemos a especificidade da sua ligação à superfície celular. Incluimo-los para comparação não só porque eles se ligam a TNF, como -30- /<\ %

I , I ·' também porque existem poucos dados sobre a ligação de mAbs polirreactivos a células não fixadas. Estes anticorpos parecem reagir com as células T e células B mas reagem melhor com a superfície de monócitos. Para além de aumentos significativos nas percentagens de coloração de células B e T com estes anticorpos, a maioria dos monócitos em ambas as experiências foi corada.

Estes dados sugerem que o mAb B5 anti-TNFa pode reagir com linfócitos do baço das linhagens B e T assim como são capazes de reconhecer e ligar-se a monócitos do baço.

Ligação de B5 a csTNFa em células do baço humano em cultura

As células do baço de um indivíduo examinadas na Tabela 7 foram cultivadas in vitro durante 3 dias com vários estímulos e depois analisadas relativamente à ligação do mAb B5. Os resultados estão apresentados na Tabela 8. A cultura destas células resultou na perda de monócitos e portanto não são apresentados dados para as células Leu-M3+. As células foram coradas para CD3 ou CD 19 com anticorpos conjugados com ficoeritrina para permitir a análise de duas cores com F(ab)’2 anti-IgM conjugado com fluoresceína e os mAbs IgM humanos indicados. Todas as células foram analisadas quando não estava incluído activador na cultura, mas apenas células grandes activadas foram analisadas das culturas que incluíram activadores. Os valores sublinhados representam os que apresentam aumentos significativos na percentagem de células coradas positivamente ou que apresentam mais de duas vezes a intensidade de fluorescência da população testemunha adequada. As análises foram realizadas com um aparelho FACSCAN. m

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As células cultivadas no meio eram 55% CD 19+ (células B) e 22% CD3+ (células T). Das células CD19+, 85% eram sIgM+ com uma intensidade de canal mediana de 54. A coloração com o mAb B5 aumentou esta intensidade do canal mediano 294 - quase seis vexes superior. Este aumento não foi observado com os mAbs IgM polirreactivos ou testemunhas. Aumentos de percentagens de céulas T CD3+ que se ligam ao mAb B5 foram também observadas, se bem que a intensidade da coloração fosse baixa. Apesar do facto de anti-IgM sozinho revelar alguma coloração das células T, a adição de 6F11 a estas células T não resultou num aumento da coloração anti-IgM, mostrando a especificidade da coloração com B5 e sugerindo que o mAb B5 não se liga aos receptores de IgM expressos nas células T activadas. Estes receptores estão presumivelmente já ocupados e são responsáveis pela coloração de fundo observada com o anticorpo secundário anti-IgM. A estimulação com o superantigénio Enterotoxina B estafilocóccica (SEB) que activa células T e B, resultou em cerca de 24% de células T a ligarem o anticorpo secundário anti-IgM humana. No entanto, cerca de 66% das células T activadas com SEB ligaram o mAb B5 anti-TNFa. Não foi observado um aumento nas células T sIgM+ com o mAb testemunha 6F11. Estes dados indicam a indução da expressão de csTNFa quando as células T são activadas.

As células B activadas por anti-IgD-dextrano ou por Staphylococcus aureus Estirpe Cowan I (SAC), ambos mitogénios potentes das células B, demonstraram ligação do mAb B5 anti-TNFa. A intensidade de fluorescência mais alta na coloração com B5, observada após indução com SAC, sugere um nível mais elevado da expressão de TNFa na superfície das células B do que o observado nas células B actívadas com anti-IgD, ou células B cultivadas só em meio. Estes dados sugerem que ambas as células B e células T humanas actívadas expressam epitopos csTNFa reconhecidos pelo mAb B5.

Ligação do mAb B5 a linfócitos do sangue periférico humano e de chimpanzés.

Na continuação do resultado da expressão de csTNFa em linfócitos do baço humanos, linfócitos do sangue periférico humano e de chimpanzé foram também examinados. A Tabela 9 mostra os resultados obtidos com sangue de dois chimpanzés e de um homem. O sangue de chimpanzé foi recebido um dia após a colheita enquanto o sangue humano era fresco. O atraso na recepção do sangue parece resultar na perda de monócitos no sangue de chimpanzé. As células mononucleadas do sangue periférico foram preparadas por separação em Ficoll e coradas com anti-CD3, CD 19 ou LeuM3 derivatizado com PE. Para os chimpanzés 171 e 203, menos de 2% e 0,6% das células eram LeuM3+, respectivamente. Cerca de 20,2% das células humanas eram LeuM3+. As células T compreenderam 62% e 54% dos linfócitos de chimpanzé e 68% dos linfócitos humanos. As percentagens de células B form 2,8 e 5,4 para os chimpanzés e 16,4% para o homem. As células foram incubadas com qs anticorpos primários IgM indicados e subsequentemente corados com o reagente F(ab)’2 anti-IgM humana conjugados com fluoresceína. As análises foram realizadas com um aparelho FACSCAN. Os valores sublinhados representam os que apresentam aumentos significativos na percentagem de células coradas positivamente ou que apresentam mais de duas vezes a intensidade de fluorescência da população testemunha adequada.

Tabela 9

Análise da expressão de TNFa na superfície celular de células T e B de sangue periférico de chimpanzé e humano % de células positivas (intensidade do canal mediano)

Abprimário - - 6F11 B5 7T1 H5 Anti-IgM - + + + + + Chimn 171 CD3+ 0,1(25) 14,4(40) 14,8(41) 31.9(23) 18,2(39) 21,5(28) CD19+ 0,4(10) 98,6(196) 98,4(196) 99.6(704) 98,9(230) 99,6(312) ChimD 203 CD3+ 0,0(13) 30,9(26) 32,1(27) 53.6(27) 31,2(25) 42,0(24) CD 19+ 0,6(13) 92,3(70) 90,1(79) 99,4(491) 95,1(101) 98,0(196) Homem CD3+ 0,6(17) 1,7(24) 3,3(22) 17.1(15) 2,8(19) 4,5(16) CD 10+ 1,3(37) 83,5(75) 84,6(70) 99.4(316) 91,5(78) 96,1(96) LeuM3+ 1,2(26) 5,6(9) 4,2(84) 4,8(106) 35,3(74) 30,4(82)

Ao contrário dos resultados anteriores com baço humano, os monócitos periféricos humanos frescos não expressam csTNFa, conforme observado através do mAb B5. No entanto, uma fracção significativa destas células ligam os mAbs polirreactivos 7T1 e H5.

As células T humanas frescas não expressam IgM de superfície, enquanto as células T colhidas um dia antes fazem-no. No entanto, as células T de ambas as espécies expressam quantidades modestas de csTNFa detectado pelo mAb B5. Porém, esta coloração anti-TNFa era muito fraca e sugere a presença apenas de níveis baixos de csTNFa. As células T de qualquer uma das espécies não foram reconhecidas por 7T1 ou H5 polirreactivos.

Ao contrário das células T, as células B do sangue periférico de ambos os chimpanzés e do homem apresentam níveis elevados de csTNFa reconhecido pelo mAb B5. Esta expressão foi muito mais intensa do que a observada com as células T. Estes resultados sugerem que os monócitos do sangue periférico humano normal não expressem csTNFa enquanto os linfócitos T e a maior parte dos linfócitos B de ambas as espécies expressam esta dtoquina na superfície celular. MAb B5 anti-TNFa inibe a secreção de TNFa induzida por LPS em células THP-1.

Para examinar se a ligação do mAb B5 a csTNFa tem qualquer significado funcional, estimulámos a linha celular de monócitos humanos THP-1 com LPS na presença de B5 ou de outros mAbs IgM humanos. Testámos a secreção de TNFa biologicamente activo medindo a actividade citotóxica dos sobrenadantes da linha celular WEHI164 sensível a TNFa. Os resultados de duas de quatro dessas experiências estão apresentados na tabela 10. As células THP-1 foram estimuladas durante 4 horas com 100 ng/ml de LPS de E. coli na presença de 40 pg/ml dos mAbs IgM não neutralizantes de TNF indicados. Os sobrenadantes destas incubações foram então testados relativamente à citotoxicidade contra a linha celular WEHI 164 sensível a TNFa. Toda a citotoxicidade do sobrenadante foi dependente da concentração e foi neutralizada pelo mAb anti-TNFa A10G10, indicando que a citotoxicidade era devida a TNFa. As concentrações de TNFa secretado foram determinadas por comparação com uma curva padrão.

Tabela 10

Inibição pelo mAb B5 da secreção de TNFa induzida por LPS. MAb pg/ml Pg/mlTNFa % de inibição Nenhum 0 1003 0 6F11 40 990 1 7T1 40 976 3 B5 40 102 90 «« 20 409 59 «( 10 812 19 «« 5 962 4

Nenhum 0 2057 0 6F11 40 1992 3 B5 40 143 93 <6 20 783 62 it 10 1271 38 ti 5 2276 -10

Exp. 1 2

As células THP-1 estimuladas secretam TNFa activo e toda esta actividade citotóxica foi inibida através da inclusão de A10G10 no ensaio de citotoxicidade (dados não apresentados). Experiências anteriores, incluindo o mAb B5 no ensaio de citotoxicidade, mostraram que B5 não neutraliza TNFa (Fig. 9). A Tabela 10 mostra que a cocultura das células THP-1 com o mAb B5 inibe a secreção de TNFa induzida por LPS. Estes dados sugerem que a interacção do mAbB5 com csTNFa pode inibir a secreção de TNF induzida por -37- M b-rh

DISCUSSÃO

Tanto quanto sabemos, esta é a primeira descrição de autoanticorpo monclonal humano específico para TNFa humano e de ratinho. Não é claro se a origem do mAb B5 de um dador seropositivo para CMV é ou não significativa. O anticorpo é claramente diferente dos mAbs de ratinho que produzimos contra TNFa, todos eles neutralizantes, como mostrado anteriormente por Galloway et al (referido atrás).

Três linhas de evidência sugerem que o mAb B5 reconhece um epitopo diferente dos reconhecidos pelos mAbs de ratinho descritos. Primeiro, não há competição entre os mAbs humano e de ratinho. Relativamente à ligação a placas revestidas com TNF. Segundo, TNF ligado pelo mAb humano pode ser reconhecido pelos mAbs de ratinho e vice versa. Finalmente, o mAb B5 não neutraliza rhTNFa enquanto os mAbs de ratinho o fazem. Deve-se notar que TNFa é um trímero e, como tal, o TNFa ligado aos mAbs neutralizantes de ratinho ligados às placas pode ainda apresentar um epitopo idêntico para ser reconhecido pelo mAb B5. A ausência de competição entre os mAbs de ratinho e o mAb B5 relativamente ao TNFa ligado à placa é um forte argumento contra esta possibilidade. Os dados de competição em combinação com a ausência de actividade neutralizante do mAb B5 apoiam a interpretação do reconhecimento de epitopos distintos pelos mAbs de ratinho e humano. Os efeitos biológicos de TNFa, especialmente a sua capacidade para promover a secreção de Ig, podem impedir a produção de um autoanticorpo anti-TNFa humano, neutralizante, de elevada afinidade, pelas técnicas usadas. Esta capacidade pode também explicar as diferentes especificidades dos epitopos do mAbs B5 e dos três mAbs neutralizantes de ratinho. A base da molécula de TNFa trimérica, em forma de sino, que contem o extremo amina aposto ao extremo carboxilo, é a região da molécula que se liga aos receptores de TNF (MJ. Eck et al., “The structure of Tumor Necrosis Factor-α at 2.6Â Resolution, Implications for Receptor Binding.” J. Biol. Chem. 264:17595-605, 1989; e A. Corti et al. “Antigenic Regions of Tumor Necrosis Factor Alpha and Their Topographic Relationships with Structural/Functional Domains.” Molec. Immunol. 29:471-9, 1992). Uma vez que os mAbs de ratinho usados nesta descrição neutralizam TNFa e bloqueiam a ligação de TNFa aos seus receptores, é provável que um epitopo na base do trímero seja reconhecido por estes anticorpos. A partir dos dados apresentados nesta descrição pode-se especular que o mAb B5 reconhece uma região da molécula de TNFa mais perto do “topo” do trímero. A ligação fraca do mAb B5 a TNFa solúvel é consistente com uma constante de ligação baixa do mAb para o ligando. No entanto, a valência deste mAb IgM pode ultrapassar este desvantagem de forma a que B5 se possa ligar a TNFa em fase sólida assim como, ou melhor do que, os mAbs anti-TNFa neutralizantes de ratinho de elevada afinidade testados. Aparentemente, a ligação em múltiplos pontos permite que o mAb B5 adira fortemente a TNFa quando está disponível uma densidade de antigénio suficiente.

Se bem que B5 pareça ligar-se com baixa afinidade, mostrámos que se liga especificamente a TNFa e não se liga a qualquer um dos outros antigénios testados. Isto contrasta com a ligação observada de dois outros mAbs polirreactivos testemunhas. Assim, B5 parece ser monospecífico e não é poliireactivo. B5 parece ligar-se especificamente a um epitopo, mais provavelmente a um epitopo linear, partilhado por TNFa de ratinho e humano. Estas propriedades classificam B5 como um autoanticorpo e distinguem-no dos outros mAbs até agora descritos. O autoanticorpo Β5 humano liga-se ao TNFa de superfície numa larga gama de linhas celulares humanas e células linfóides. Não é surpreendente que reconheça TNFa de chimpanzé uma vez que não há diferença nas sequências de aminoácidos do TNFa de chimpanzé e humanas. Também mostrámos que B5 reconhece TNFa de ratinho o qual é cerca de 80% idêntico ao TNFa humano (D. Pennica et al “Cloning and expression in Escherichia coli of the cDNA for Murine Tumor Necrosis Factor”, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:6060-4, 1985). Assim, não é surpreendente que B5 reconheça csTNFa de ratinho.

Outros autores já descreveram certamente a produção de TNF pelas células B humanas (M. Jããtelã, “Biology of Disease. Biologic Activities and Mechanisms of Action of Tumor Necrosis Factor-a/Cachectin”, Lab. Invest. 64:724-42, 1991; e Smeland et al “Interleukin 4 Induces Selective Production of Interleukin 6 from Normal Human B Lymphocytes”, J. Exp. Med. 170:1463-68, 1989), células T (S.-SJ. Sung et al “Production of Tumor Necrosis Factor/Cachectin by Human T Cell Lines and Peripheral Blood T Lymphocytes Stimulated by Phorbol Myristate Acetate and Anti-CD3 Antibody”, J. Exp. Med. 167: 937-, 1988), monócitos (Beutler et al “TheBiology of Cachectin TNF-a: Primary Mediator of the Host Response”, Ann. Rev. Immunol. 7:625-55, 1989), linhas de células B (S. —SJ. Sung et al “Production of Tumor Necrosis Factor/Cachectin by Human T Cell Lines and Peripheral Blood T Lymphocytes Stimulated by Phorbol Myristate Acetate and Anti-CD3 Antibody”, J. Exp. Med. 167:937-, 1988; e GJ. Jochems et al “Heterogeneity in BothCytokine Production and Responsiveness of a Panei of Monoclonal Human Epstein-Barr Virus-Transformed B-Cell Lines”, Hum. Antibod. Hybridomas 2:57-64, 1991), astrócitos (A.P.Lieberman et al Production of tumor necrosis Factor and other Cytokines by Astrocytes Stimulated with Lipopolysaccharide or a Neurotropic Virus”, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:6348-52, 1989; e I.Y. Chung et al. “Tumor Necrosis Factor Alpha Production by Astrocytes: Induction by

Lippopolysaccharide, IFN-gama, and IL-1 beta”, J. hmmunol. 144:2999-3007, 1990; e K. Selmaj et al “Identification of lymphotoxin and tumor necrosis factor in Multiple Sclerosis Lesions”, J. Clin. Invest. 87:949-54, 1991) assim como algumas linhas celulares resistentes a TNF (B.Y. Rubin et al “Nonhematopoietic Cells Selected for Resistance to Tumor Necrosis Factor Produce Tumor Necrosis Factor”, J. Exp. Med. 164:1350-5, 1986). Aumentámos estes dados de forma a incluir pelo menos uma linha de carcinoma da mama produtor de mestástases, DU4475, um melanoma, A375 e o astrocitoma/glioblastoma U373. Também demonstrámos a expressão de csTNFa em células linfóides de baço humano. Isto, de certa forma, é surpreendente uma vez que a demonstração anterior de csTNFa por outros autores tendeu a empregar células activadas.

Se bem que tenhamos examinado pequenos linfócitos, de acordo com as propriedades de desvio da luz, é possível que muitas destas células estivessem parcialmente activadas ou numa fase de diferenciação onde pudesssem expressar esta molécula na superfície celular. As percentagens mais pequenas de linfócitos T e monócitos do sangue periférico humano expressando csTNFa é consistente com o restante fenótipo destas células. Em qualquer dos casos, a amplitude da expressão de csTNFa sugere que tenha um papel importante na superfície de muitas células.

Outros autores demonstraram que TNFa pode existir como proteína transmembranar integral e como proteína madura ligada ao seu receptor na superfície celular (B. Luettig et al “Evidence for the Existence of two Forms of Membrane Tumor Necrosis Factor: an Integral Protein and a Molecule Attached to its Receptor”, J. Immunol. 143:4034-38, 1989). Várias observações sugerem que o mAb B5 reconhece a proteína transmembranar integral. A ligação de B5 foi aumentada quando as células foram activadas com LPS ou PMA. Ambos os agentes, mas especialmente PMA, regulam negativamente a expressão do receptor de TNF numa variedade de tipos eelulares (A.H. Ding et al “Macrophages Rapidly Intemalize their Tumor Necrosis Factor Receptors in Response to Bacterial Lipopolysaccharide”, J. Biol. Chem. 264:3924-9, 1989; e B.A. Aggarwal et al “Effect of PhorbolEsters on Down-Regulation and redistribution of Cell Surface Receptors for Tumor Necrosis Factor a”, J. Biol. Chem. 262:16450-5, 1987). B5 liga-se a linhas celulares não estimuladas, apesar das linhas celulares normalmente necessitarem de ser induzidas para secretar TNF. Assim, seria de esperar que as linhas celulares não estimuladas apresentassem pouco receptor ligado a TNF. Mostrámos que a ligação de B5 às superfícies celulares foi inibida pela pré-incubação com TNFa, mas não com o mAb anti-TNFa A10G10. Isto demonstra a especificidade do anticorpo B5. TNFp liga-se aos mesmos receptores que TNFa e assim deverá competir excluindo algum TNFa ligado a receptores nas superfícies celulares. Os dados na Tabela 6 com doses elevadas de TNFP sugerem que isto ocorre e foi detectado por um decréscimo na coloração com B5. Por este motivo, é provável que B5 reconheça a forma transmembranar de 26 Kd do TNFa e possivelmente o TNF ligado aos receptores.

Um resultado algo confuso destes estudos é que o mAb B5 se liga a cs TNFa em muitas situações em que a ligação de A10G10 não se verifica ou é inferior ao observado com B5. É claro que estes dois anticorpos reconhecem epitopos não sobreponíveis. Uma vez que A10G10 neutraliza a citotoxicidade de TNFa e evita a ligação de TNFa ao seu receptor, este mAb de ratinho liga-se a TNFa perto do domínio de ligação ao receptor.

Outros autores mostraram que os mAbs que se ligam aos 15 aminoácidos do extremo amina bloqueiam a citotoxicidade de TNFa (S.H. Socher et al “Antibodies Against Amino Acids 1-15 of Tumor Necrosis Factor Block Its Binding to Cell-Surface Receptor” Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:8829-33, 1987). Assim, é possível que A10G10 se ligue a alguns aminoácidos do extremo amina, que são os mais próximos da membrana, na forma transmembranar do TNFa. Esta região pode não ser acessível a A10G10 para ligação, se bem que a própria molécula de TNF esteja presente e possa ser reconhecida pelo mAb B5.

As experiências de transferência Western sugerem que A10G10 não reconhece monómeros de TNFa e provavelmente reconhece um epitopo conformacional (dados não apresentados). Se o TNFa transmembranar for principalmente monomérico, os epitopos reconhecidos por A10G10 podem não estar presentes. Outras experiências poderão ajudar a decidir entre estas e outras possibilidades. É interesante que observámos a ligação de A10G10 à superfície celular quando as células foram activadas com LPS. Esta indução causa a secreção do trímero de TNFa biologicamente activo que pode então ligar-se aos restantes receptores de TNF. Uma vez que TNFa trimérico é multivalente, pode ligar-se a alguns receptores de forma a permitir que fiquem livres um ou mais dos restantes domínios de ligação ao receptor. Pode ser que seja esta forma de csTNFa que seja reconhecida por A10G10. De facto, outros autores demonstraram que a incubação de monócitos fixados com paraformaldeído, não activados, com TNFa resulta na ligação de TNFa aos seus receptores e toma estes monócitos citotóxicos. Ainda, esta citotoxicidade é abolida pelos anticorpos neutralizantes anti-TNF (A Nii et al “The incubation of Human Blood Monocytes with Tumor Necrosis Factor-Alpha Leads to Lysis of Tumor Necrosis Factor-Sensitive but. not Resistant Tumor Cells”, Lymphokine Res. 9:113-24, 1990).

Um modelo que explica muitos destes dados é que os monómeros de TNFa trasmembranares são reconhecidos por B5. Demonstrámos o reconhecimento do monómero solúvel por B5. Os monómeros de TNFa da superfície celular deverão apresentar uma conformação global diferente da do TNF trimérico. Eles poderão ainda expor os domínios de ligação do receptor de TNF e serem assim capazes de mediar citotoxicidade através do contacto celular. Células que expressem muitos monómeros poderão assim causar ligação cruzada do receptor de TNF nas células alvo. Um sinal de activação poderá causar polimerização dos monómeros de TNF na membrana celular, conduzindo a uma alteração conformacional que, por sua vez, deverá expor um sítio de clivagem proteolítica conduzindo à libertação de TNFa trimérico maduro e biologicamente activo. A libertação poderá ser seguida de interacção com os receptores de TNF e permitirá a ligação de A10G10, conforme sugerido atrás. B5 aparentemente liga-se aos domínios de TNF distais relativamente à membrana e, ao fazê-lo, poderá interferir com a polimerização de csTNFa, uma alteração conformacional subsequente ou ambas. B5 provavelmente não se liga ao sítio de clivagem proteolítica uma vez que se liga à molécula trimérica madura. Este modelo explicaria os resultados de coloração da superfície celular e também explicaria a inibição observada da secreção de TNF após activação por LPS das células THP-1. Deve-se notar que este modelo permite um papel do domínio citoplasmático na polimerização de csTNFa. Isto constitui apenas um modelo de trabalho e, como tal, é admitido como hipotético.

Lisboa, 13 de Setembro de 2001

Irv £—*Uj

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CÒRDON, 14 1200 LISBOA

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição compreendendo anticorpos monoclonais humanos que se ligam ao factor de necrose tumoral alfa humano.
2. 2. A composição da reivindicação 1, caracterizada por ser uma composição farmacêutica.
3. 3. A composição da reivindicação 1 ou 2, em que os anticorpos compreendem anticorpos do tipo IgM ou do tipo IgG.
4. 4. A composição da reivindicação 1 ou 2 num veículo farma-ceuticamente aceitável.
5. 5. A composição da reivindicação 1 ou 2, em que os anticorpos são adequados para administração intravenosa.
6. 6. A composição da reivindicação 1 ou 2, em que os anticorpos se ligam ao factor de necrose tumoral alfa na superfície de células humanas.
7. 7. A composição da reivindicação 1 ou 2, em que os anticorpos inibem a secreção do factor de necrose tumoral alfa.
8. 8. A composição da reivindicação 1, em que o anticorpo é expresso a partir de uma linha celular depositada na ATCC com a designação CRL 11306. -2-
9. 9. Utilização dos anticorpos da reivindicação 1 para a preparação de uma composição farmacêutica.
10. 10. Utilização dos anticorpos da reivindicação 1 para a preparação de uma composição farmacêutica para administração intravenosa.
11. 11. Utilização dos anticorpos da reivindicação 1 para a preparação de uma composição farmacêutica que inibe a secreção do TNF alfa induzida por LPS em células do tipo monócito. Lisboa, 13 de Setembro de 2001 • c—«Lj ALBERTO CANELAS f Agente Oficial da Propriedade Industriai RUA VICTOR ÒORDON, 14 1200 LISBOA