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PT2563813E - Anticorpos anti-c5a e métodos para utilização dos anticorpos - Google Patents

Anticorpos anti-c5a e métodos para utilização dos anticorpos Download PDF

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PT2563813E
PT2563813E PT117756700T PT11775670T PT2563813E PT 2563813 E PT2563813 E PT 2563813E PT 117756700 T PT117756700 T PT 117756700T PT 11775670 T PT11775670 T PT 11775670T PT 2563813 E PT2563813 E PT 2563813E
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PT
Portugal
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seq
amino acid
acid sequence
antibody
sequence shown
Prior art date
Application number
PT117756700T
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Inventor
Russell P Rother
Douglas L Sheridan
Paul P Tamburini
Yuchun Zhang
Original Assignee
Alexion Pharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Alexion Pharma Inc filed Critical Alexion Pharma Inc
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Description

DESCRIÇÃO
"ANTICORPOS ANTI-C5A E MÉTODOS PARA UTILIZAÇÃO DOS ANTICORPOS"
Referências Cruzadas a Pedidos Relacionados
Este pedido reivindica prioridade a e em beneficio do pedido de patente provisório U.S. com os nos. de série: 61/330,260, apresentado a 30 de abril de 2010 e 61/471,465, apresentado a 4 de abril de 2011.
Campo Técnico O campo da invenção é medicina, imunologia, biologia molecular e química de proteínas.
Antecedentes O sistema do complemento atua em conjunto com outros sistemas imunológicos do corpo para o defender contra a intrusão de patogénios celulares e virais. Existem pelo menos 25 proteínas do complemento, que se encontram como um conjunto complexo de proteínas do plasma e cofactores membranares. As proteínas do plasma constituem cerca de 10% das globulinas no soro dos vertebrados. Os componentes do complemento alcançam as suas funções de defesa imunitária através da interação numa série de eventos intricados mas precisos de clivagem enzimática e ligação à membrana. A cascata do complemento resultante leva à produção de produtos com funções opsónicas, imunorreguladoras, e líticas. Um resumo conciso das atividades biológicas associadas à ativação do complemento é proporcionado, por exemplo, em "The Merck Manual", 16a Edição. A cascata do complemento progride através da via clássica, da via alternativa, ou da via da lectina. Estas vias partilham muitos componentes, e embora difiram nas suas etapas iniciais, convergem e partilham os mesmos componentes do "complemento terminal" (C5 a C9) responsáveis pela ativação e destruição de células alvo. A via clássica (CP) é tipicamente iniciada através do reconhecimento do anticorpo de, e da ligação a, um local antigénico numa célula alvo. A via alternativa (AP) pode ser independente de anticorpos, e pode ser iniciada através de certas moléculas na superfície dos patogénios. Além disso, a via da lectina é tipicamente iniciada com a ligação da lectina que se liga a manose (MBL) a substratos ricos em manose. Estas vias convergem no ponto onde a componente do complemento C3 é clivada por uma protease ativa para produzir C3a e C3b. Outras vias que ativam o ataque do complemento podem atuar mais tarde na sequência de eventos que conduz a vários aspetos da função do complemento. C3a é uma anafilatoxina. C3b liga-se a células bacterianas e outras; bem como a certos vírus e complexos imunitários, e marca-os para remoção da circulação. (C3b neste papel é conhecida como opsonina). A função opsónica de C3b é geralmente considerada como sendo a ação anti-infeciosa mais importante do sistema do complemento. Os pacientes com lesões genéticas que bloqueiam a função de C3b são propensos a infeção através de uma ampla variedade de organismos patogénicos, enquanto se verifica que os pacientes com lesões posteriores na sequência de cascata do complemento, ou seja, pacientes com lesões que bloqueiam as funções de C5, são mais propensos apenas a infeção de Neisseria, e ainda assim, apenas um pouco mais propensos. C3b também forma um complexo com outros componentes únicos para cada via para formar a C5-convertase clássica ou alternativa, que cliva C5 em C5a e C5b. C3 é portanto considerada como a proteína central na sequência de reações do complemento, uma vez que é essencial tanto para a via alternativa como para a clássica. Esta propriedade de C3b é regulada pela protease sérica Fator I, que atua em C3b para produzir iC3b. Enquanto ainda funcional como opsonina, iC3b não pode formar uma C5-convertase ativa. C5 é uma beta-globulina de 190 kDa verificada em soro normal a uma concentração de aproximadamente 75 pg/mL (0,4 μΜ) . C5 é glicosilada, com cerca de 1,5 a 3 por cento da sua massa atribuída a hidratos de carbono. A C5 madura é um heterodímero de uma cadeia alfa de 999 aminoácidos de 115 kDa que é ligada por dissulfureto a uma cadeia beta de 655 aminoácidos de 75 kDa. C5 é sintetizada como um produto proteico precursor de cadeia simples de um gene de uma única cópia (Haviland et al. (1991) .J Immunol. 146:362-368). A sequência de ADNc do transcrito deste gene prevê um precursor pró-C5 segregado de 1658 aminoácidos juntamente com uma sequência líder de 18 aminoácidos (ver, p. ex., Patente U.S. No. 6,355,245). O precursor pró-C5 é clivado após os aminoácidos 655 e 659, para produzir a cadeia beta como um fragmento amino-terminal (resíduos de aminoácidos +1 a 655 da sequência de cima) e a cadeia alfa como um fragmento carboxi-terminal (resíduos de aminoácidos 660 a 1658 da sequência de cima) , com quatro aminoácidos (resíduos de aminoácidos 656-659 da sequência de cima) suprimidos entre as duas. C5a é clivada a partir da cadeia alfa de C5 através da C5-convertase alternativa ou clássica como um fragmento amino-terminal compreendendo os primeiros 74 aminoácidos da cadeia alfa (i.e., resíduos de aminoácidos 660-733 da sequência de cima). Aproximadamente 20 porcento da massa de 11 kDa de C5a são atribuídos a hidratos de carbono. O local de clivagem para a ação da convertase é em, ou imediatamente adjacente ao, resíduo de aminoácido 733 da sequência de cima. Um composto que se ligaria a, ou adjacente a, este local de clivagem teria o potencial de bloquear o acesso das enzimas C5-convertase ao local de clivagem e atuar assim como um inibidor do complemento. C5 pode também ser ativada por meio de outra atividade de C5-convertase. Digestão limitada com tripsina (ver, por exemplo., Minta e Man (1997) J. Immunol. 119:1597-1602 e Wetsel e Kolb (1982) J. Immunol. 128:2209-2216), trombina, e tratamento com ácido (Yamamoto e Gewurz (1978) J. Immunol. 120:2008 e Damerau et al. (1989) Molec. Immunol. 26:1133-1142) podem também clivar C5 e produzir C5b ativa. A clivagem de C5 liberta C5a, uma potente anafilatoxina e fator quimiotático, e C5b que através de uma série de interações proteicas leva à formação do complexo terminal do complemento lítico, C5b-9. C5a e C5b-9 têm também propriedades pleiotrópicas de ativação celular, amplificando a libertação de fatores inflamatórios a jusante, tais como enzimas hidrolíticas, espécies reativas de oxigénio, metabolitos do ácido araquidónico e várias citocinas. C5b combina com C6, C7 e C8 para formar o complexo C5b-8 na superfície da célula alvo. Após ligação de várias moléculas de C9, é formado o complexo de ataque membranar (MAC, C5b-9, complexo terminal do complemento - TCC) . Quando um número suficiente de MAC se insere em membranas de células alvo as aberturas que criam (poros de MAC) medeiam a rápida lise osmótica das células alvo. Concentrações baixas, não líticas de MAC podem produzir outros efeitos. Em particular, a inserção na membrana de um pequeno número de complexos C5b-9 em células endoteliais e plaquetas pode causar ativação celular prejudicial. Nalguns casos a ativação pode preceder a lise celular.
Tal como mencionado acima, C3a e C5a são anaf ilatoxinas. Estes componentes ativados do complemento podem desencadear a desgranulação de mastócitos, o que liberta histamina de basófilos e mastócitos, e outros mediadores de inflamação, resultando em contração do músculo liso, aumento da permeabilidade vascular, ativação de leucócitos, e outros fenómenos inflamatórios incluindo proliferação celular resultando em hipercelularidade. C5a funciona também como um péptido quimiotático que serve para atrair granulócitos pró-inflamatórios para o local de ativação do complemento.
Os recetores de C5a verificam-se nas superfícies de células epiteliais brônquicas e alveolares e de células do músculo liso brônquico. Recetores de C5a foram também verificados em eosinófilos, mastócitos, monócitos, neutrófilos e linfócitos ativados. A EP 0245 993 A2 divulga anticorpos monoclonais que se ligam a C5a. Larric: et al. ("Infection and Immunity",
American Society for Microbiology, USA, Vol. 55, No.8, 1987, páginas 1867-1872) divulgam a caracterização de anticorpos monoclonais de murideo que reconhecem epitopos de neutralização em C5a humana.
Sumário A presente divulgação refere-se, inter alia, à geração pelos inventores de uma série de anticorpos monoclonais humanizados que se ligam especificamente à proteína C5a livre (isto é, C5a que foi clivada proteoliticamente da proteína C5) , mas não aos fragmentos proteicos parálogos C4a livre ou C3a livre [os anticorpos são, frequentemente, aqui referidos como anticorpos anti-C5a ou anticorpos anti-neoepitopo de C5a]. Tal como aqui descrito e exemplificado nos exemplos de trabalho, os anticorpos anti-C5a gerados exibem uma elevada afinidade para C5a livre. Por exemplo, todos os anticorpos anti-C5a humanizados aqui descritos ligam-se a C5a livre com uma Kd que é inferior a 1,25 nanomolar. Muitos dos anticorpos ligam-se a C5a livre (p. ex., C5a livre humana) com uma Kd que é inferior a 300 picomolar; vários dos anticorpos ligam-se a C5a livre com uma Kd que é inferior a 100 picomolar. Além disso, os anticorpos anti-C5a humanizados aqui descritos inibem também a sinalização mediada por C5a. Outras propriedades estruturais e funcionais dos anticorpos aqui descritos são elaborados abaixo e exemplificadas nos exemplos de trabalho.
Os inventores demonstraram também, utilizando um modelo animal de artrite reumatoide (AR) e um anticorpo anti-5a de ratinho substituto com propriedades semelhantes às do anticorpo humanizado equivalente, eficácia dos anticorpos anti-C5a em tratamento de AR. São também mostradas nos exemplos de trabalho experiências que demonstram os efeitos terapêuticos positivos de um anticorpo anti-C5a humanizado num modelo animal de neutropenia induzida por C5a humana.
Por conseguinte, os inventores acreditam que os anticorpos anti-C5a, ou fragmentos de ligação ao antigénio destes, aqui descritos são úteis numa variedade de métodos de diagnóstico e terapêuticos relacionados com distúrbios nos quais a sinalização mediada por C5a contribui para a patogénese. Por exemplo, os inventores afirmam que os anticorpos anti-C5a humanizados aqui descritos são úteis para tratar ou prevenir AR e outros distúrbios associados ao complemento incluindo, mas não limitado a: síndroma hemolítica urémica atípica (aHUS), degeneração macular relacionada com a idade (DMRI), sepsia, queimadura (p. ex., queimadura grave), síndroma antifosfolipídica (APS), síndroma da dificuldade respiratória aguda (SDRA), dor relacionada com inflamação, asma, nefrite de lúpus, restrição do crescimento intrauterino (RCIU), síndroma HELLP (anemia hemolítica, enzimas hepáticas elevadas e baixa contagem de plaquetas), síndroma de Goodpasture, e doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC). Distúrbios adicionais que são particularmente passíveis de tratamento com um anticorpo anti-C5a humanizado, ou um fragmento de ligação ao antigénio deste, são conhecidos na técnica e aqui citados.
Os anticorpos anti-C5a humanizados aqui descritos apresentam várias vantagens, p. ex., em relação a agentes que se ligam a, e inibem a clivagem da, C5 inteira ou madura. Tal com esses agentes, os anticorpos anti-C5a (e fragmentos de ligação ao antigénio destes) aqui descritos são capazes de inibir os efeitos anafilatóxicos a jusante da ativação de C5 mediada através do fragmento C5a de C5. Isto é, os anticorpos anti-C5a aqui descritos podem inibir a resposta inflamatória mediada por C5a, que se sabe ter um papel essencial na patogénese de distúrbios associados ao complemento tais como, mas não limitados a, sepsia, AR, e asma. No entanto, uma vez que a concentração de C5 no soro humano é de aproximadamente 0,37 μΜ (Rawal e Pangqueimadura (2001) J. Immunol. 166(4):2635-2642), a utilização de elevadas concentrações e/ou a administração frequente de anticorpos anti-C5 é frequentemente necessária para inibir eficazmente C5, e assim inibir a resposta inflamatória mediada por C5a, num humano. Ao contrário de C5, C5a está presente no sangue a concentrações muito inferiores e está frequentemente restringida a áreas específicas do local de ativação do complemento tais como, p. ex., os pulmões em pacientes de asma, as articulações em pacientes de AR, ou as drusas nos olhos de pacientes com DMRI. Assim, os anticorpos anti-C5a aqui descritos podem ser administrados (p. ex., administrados localmente a locais de ativação do complemento) a um humano a uma dose muito mais baixa e/ou menos frequentemente que, p. ex., um anticorpo anti-C5, e proporcionar eficazmente a mesma ou maior inibição de C5a num humano. A capacidade de administrar uma dose mais baixa do anticorpo anti-C5a, em comparação com a dose requerida de um anticorpo anti-C5, permite também vias de distribuição adicionais tais como, p. ex., administração subcutânea, administração intramuscular, distribuição intrapulmonar, e administração através da utilização de microesferas biologicamente degradáveis. Uma concentração mais baixa de antigénio C5a contra C5 também favorece uma maior semivida do anticorpo anti-C5a, em comparação com, p. ex., a semivida de um anticorpo terapêutico que tenha como alvo o complemento terminal, devido a uma reduzida contribuição da eliminação de anticorpo mediada pelo antigénio.
Além disso, os anticorpos anti-C5a aqui descritos podem também ser distinguidos de agentes terapêuticos que inibem o complemento terminal (tais como inibidores de C5) através do seu perfil de segurança. Uma consequência notável da inibição dos componentes do complemento terminal tais como C5, C5b, C6, C7, C8, ou C9 é uma menor proteção pelo sistema imunitário do hospedeiro contra as bactérias encapsuladas que o complemento terminal vulgarmente lisa -por exemplo, Neisseria meningitides e Neisseria gonorrhoeae. Ver, p. ex., Haeney et al., (1980) Clin. Exp. Immunol. 40:16-24 e Brodsky (2009) Blood 113(26):6522-6527. Uma vez que os anticorpos anti-C5a inibem a resposta inflamatória mediada por C5a, mas não impedem a formação do complexo terminal do complemento que lisa tais bactérias encapsuladas, os pacientes que recebem um anticorpo anti-C5a terapêutico aqui descrito não requerem uma vacinação protetora, p. ex., uma vacinação contra Neisseria meningitides e Neisseria gonorrhoeae.
Por conseguinte, é proporcionado um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste que se liga a um polipéptido C5a livre, em que a C5a livre é um polipéptido humano (hC5a) possuindo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:l, e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste se liga ao polipéptido hC5a livre in vitro com uma Kd que é inferior a l,25xl0-9 M medido através de ressonância de plasmão de superfície (SPR) na presença de um excesso molar de C5 humana nativa, não clivada, e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreende: I. (a) um polipéptido de cadeia leve compreendendo: (i) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:21; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:22; ou (ii) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:38; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:2 2; e (b) um polipéptido de cadeia pesada compreendendo: (i) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:29; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:30; ou (ii) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:46; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo
a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:4 7; II. (a) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 37 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:27; (b) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 36 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:33; (c) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 19 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:27; (d) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 17 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:25; (e) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 42 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:27; (f) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 40 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:33; (g) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 17 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:33; (h) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 19 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:45; (i) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 17 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:44; (j) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 17 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:49; (k) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 37 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:45; ou (l) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 36 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:49; ou III. (a) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 42 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:45; (b) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 40 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:49; ou (c) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 21; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:22; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 4 6; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO :47.
Numa forma de realização, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreende: (a) um polipéptido de cadeia leve compreendendo: (i) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 21; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:22; e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo: (i) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:29; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:30.
Noutra forma de realização, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreende: (a) um polipéptido de cadeia leve compreendendo: (i) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 21; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:22; e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo: uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:46; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:47.
Noutra forma de realização, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreende: (a) um polipéptido de cadeia leve compreendendo: (i) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 38; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:22; e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo: (i) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:29; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO :30.
Noutra forma de realização, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreende: (a) um polipéptido de cadeia leve compreendendo: (i) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 38; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:22; e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo: uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:46; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO :47.
Assim, é descrito um anticorpo isolado, ou fragmentos de ligação ao antigénio deste, que se liga a C5a livre. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste pode ligar-se a C5a humana livre (hC5a; p. ex., uma proteína C5a humana compreendendo, ou consistindo em, a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID N0:1). Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo pode ligar-se a uma forma desarginada de C5a livre, p. ex., a forma desarginada da C5a humana compreendendo, ou consistindo em, a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:2. 0 anticorpo pode ligar-se a um neoepitopo de C5a livre, epitopo esse que não está presente na C5 não clivada ou está presente apenas numa pequena fração da C5 não clivada total.
Embora a divulgação não esteja de modo algum limitada a qualquer teoria ou mecanismo de ação particular, nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste liga-se a C5a livre (p. ex., hC5a livre) e pode também ligar-se a uma subpopulação de C5 não clivada, processada (p. ex., C5 plasmática) constituindo menos de 10 (p. ex., menos de 9,5, 9, 8,5, 8, 7,5, 7, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, ou menos de 0,1) % da população total de C5 inteira numa amostra (p. ex., uma amostra de sangue ou plasma ou uma amostra compreendendo C5 inteira recombinante) , cuja subpopulação é, no todo ou em parte, desnaturada de modo a que um neoepitopo de C5a de outo modo oculto, ao qual o anticorpo anti-C5a ou fragmento se liga, seja exposto. Assim, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito pode, nalguns aspetos da divulgação, ligar-se a C5a livre, mas não à proteína C5 não clivada dos 90% ou mais da população de C5 nativa, não clivada. Nalguns aspetos da divulgação, a subpopulação de C5 acima descrita parcialmente ou totalmente desnaturada é inativa ou tem atividade reduzida (p. ex., menos de 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5% da atividade da proteína C5 inteira, totalmente funcional) em qualquer número de ensaios adequados úteis para testar a atividade de C5, p. ex., um ensaio hemolítico ou um ensaio de CH50eq (ver abaixo). Os métodos adequados para testar a atividade da subpopulação menor à qual um anticorpo anti-C5a aqui descrito se pode ligar são conhecidos na técnica e aqui descritos.
Nalguns aspetos da divulgação, qualquer um dos anticorpos anti-C5a ou fragmentos de ligação ao antigénio destes aqui descritos não inibem a atividade de C5 num ensaio de hemólise in vitro ou num ensaio de CH50eq in vitro mesmo na presença de um excesso pelo menos, igual a, ou superior a 5 (p. ex., 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou 200) vezes do anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste para a C5 não clivada (p. ex., C5 nativa, não clivada) . Nalguns aspetos da divulgação, qualquer um dos anticorpos anti-C5a ou fragmentos de ligação ao antigénio destes aqui descritos não inibe a atividade de C5 num ensaio hemolítico in vitro nem num ensaio de CH50eq in vitro mesmo na presença de um excesso entre cerca de 5 vezes a 200 vezes (p. ex., entre cerca de 5 vezes e 100 vezes, entre cerca de 10 vezes e 100 vezes, entre cerca de 20 vezes e 100 vezes, ou entre cerca de 10 vezes e 150 vezes) do anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste para a C5 nativa, não clivada. Inibição, p. ex., quando se refere à atividade de C5, inclui pelo menos uma diminuição de 5 (p. ex., pelo menos 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, ou 60) % na atividade da C5 nativa, não clivada em, p. ex., um ensaio hemolítico ou ensaio de CH50eq em comparação com o efeito de um anticorpo de controlo (ou fragmento de ligação ao antigénio deste) sob condições semelhantes e a uma concentração equimolar. Inibição substancial, tal como aqui utilizado, refere-se à inibição de uma dada atividade (p. ex., atividade de C5) de pelo menos 40 (p. ex., pelo menos 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, ou 95 ou mais) %. Nalgumas formas de realização, a C5 é obtida a partir de plasma (p. ex., purificada a partir de ou presente no plasma, p. ex., plasma humano).
Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste liga-se a uma proteína C5a (p. ex., um proteína C5a humana) com uma Kd que é inferior a 2 nM. Nalguns aspetos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste liga-se a uma proteína C5a com uma Kd que é inferior a 1 nM [também referido aqui como "afinidade subnanomolar"].
Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste liga-se a C5a livre com uma afinidade subnanomolar [p. ex., uma KD de menos de ou igual a 9,9χ10"10 (p. ex, , menos de ou igual a 9χ10"10, 8 x 10-10, 7xl0-10, 6χ10“10, 5χ10“10, 4χ10“10, 3χ10“10, 2,5χ10“10, 2 χ 10“10, 1χ10-10, δ,ΟχΙΟ"11, 7,0x1ο-11, δ,ΟχΙΟ"11, 5,0x1ο-11, 4,0χ10-11, ou 3,0χ10-11) Μ] na presença de um excesso molar de C5 nativa, não clivada (p. ex., C5 purificada e/ou recombinante) . Nalguns aspetos da divulgação, qualquer um dos anticorpos anti-C5a ou fragmentos de ligação ao antigénio destes aqui descritos têm pelo menos uma afinidade 100 (p. ex., pelo menos 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, ou 10000) vezes maior (p. ex., representada pela sua Kd) para a C5a livre que para a proteína C5 nativa, não clivada.
Assim, noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste que (a) se liga a C5a livre (p. ex., hC5a) com uma afinidade subnanomolar e (b) se liga a C5a livre com uma afinidade que é pelo menos 100 (p. ex., pelo menos 110,120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, ou 10000) vezes superior à sua correspondente afinidade para a proteína C5 nativa, não clivada. Por exemplo, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito pode, nalgumas formas de realização, ligar-se a hC5a livre com uma Kd de 100 nM e a pelo menos uma subpopulação de proteína C5 não clivada humana com uma Kd que é pelo menos 100 vezes mais elevada (p. ex., pelo menos 10 nM).
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste que se liga a um polipéptido C5a humano livre possuindo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:l, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste se liga ao polipéptido C5a humano com uma Kd que é inferior a 1,25χ10-9 M na presença de um excesso molar (p. ex., um excesso molar de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, ou 500 vezes) de C5 humana nativa, não clivada, em relação à C5a humana (hC5a) . Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste liga-se a um polipéptido hC5a livre com uma afinidade subnanomolar (p. ex., qualquer uma das Kd subnanomolares aqui citadas) na presença de pelo menos, ou de mais de, um excesso molar de 2 vezes, mas não superior ou inferior a um excesso molar de 500 (p. ex., 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, ou 15) vezes de C5 nativa, não clivada em relação a hC5a livre. Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste liga-se a um polipéptido hC5a livre com uma afinidade subnanomolar (p. ex., qualquer uma das Kd subnanomolares aqui citadas) na presença de um excesso molar de entre 2 vezes e 20 vezes de C5 nativa, não clivada em relação a hC5a livre. Nalgum aspeto da divulgação, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste liga-se a um polipéptido hC5a livre com uma afinidade subnanomolar (p. ex., qualquer uma das Kd subnanomolares aqui citadas) na presença de um excesso molar de entre 10 vezes e 20 vezes de C5 nativa, não clivada em relação hC5a livre. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste liga-se a um polipéptido hC5a livre com uma afinidade subnanomolar (p. ex., qualquer uma das Kd subnanomolares aqui citadas) na presença de um excesso molar de entre 5 vezes e 15 vezes de C5 nativa, não clivada em relação a hC5a livre. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste liga-se a um polipéptido hC5a livre com uma afinidade subnanomolar (p. ex., qualquer uma das Kd subnanomolares aqui citadas) na presença de um excesso molar de pelo menos 2 vezes, mas não superior a 20 vezes de C5 nativa, não clivada em relação a hC5a livre. Tais medições podem ser medições in vitro utilizando, p. ex., técnicas padrão de determinação da afinidade, muitas dos quais são aqui citadas e/ou descritas.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste que se liga a um polipéptido C5a humano possuindo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:l, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste se liga ao polipéptido C5a humano com uma Kd que é inferior a 1,25χ10-9 M e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste não inibe substancialmente, em comparação com uma quantidade equimolar de um anticorpo de controlo ou fragmento de ligação ao antigénio deste, a atividade de C5 mesmo na presença de um excesso molar de menos de, ou igual a, 10 vezes do anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste para a C5 nativa, não clivada.
Nalguns aspetos da divulgação de qualquer um dos anticorpos anti-C5a ou fragmentos de ligação ao antigénio destes aqui descritos, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste liga-se a C5a humana livre e é reativo de forma cruzada com C5a livre de pelo menos uma espécie de mamífero não humano. Por exemplo, nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a (ou fragmento de ligação ao antigénio deste) liga-se a C5a livre de humano (p. ex., com uma afinidade subnanomolar) e liga-se também a C5a livre de um primata não humano (p. ex., macaco cinomolgo, macaco rhesus, macaco, babuíno, chimpanzé, orangotango, ou gorila), um roedor (p. ex., ratinho, rato, hamster, cobaia ou coelho), vaca, cabra, burro, porco, cão, gato ou cavalo.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito liga-se a hC5a livre com uma Kd de menos de, ou igual a, 9,9x10“ 10 (p. ex., menos de, ou igual a, 9χ10“10, 8χ10“10, 7χ10“10, 6 χ 10-10, 5χ1010, 4χ10“10, 3χ10“10, 2,5χ10“10, 2χ1010, 1χ10“10, δ,ΟχΙΟ-11, 7,0x1ο-11 β,ΟχΙΟ-11, 5,0χ10-11, 4,0x1ο-11, ou 3,0x10“ Χ1) Μ e liga-se também a C5a livre de macaco cinomolgo (ou outra espécie de primata não humano), em que a afinidade (p. ex., representada pela sua Kd) para C5a humana é não mais de 500 (p. ex., não mais de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, ou 475) vezes superior à afinidade para a C5a de macaco cinomolgo (ou outra espécie de primata não humano) . Por exemplo, nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo anti-C5a liga-se a hC5a livre com uma afinidade que é não mais de 50 vezes superior à correspondente afinidade do anticorpo para C5a de primata não humano (p. ex., uma Kd para hC5a livre de 100 nM e uma Kd para C5a de primata não humano de não mais de 5 nM). Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito liga-se a hC5a livre com uma Kd de menos de, ou igual a, 9,9χ10“10 (p. ex., menos de, ou igual a, 9χ1010, 8χ10“10, 7χ10“10, 6χ10“10, 5χ10“10, 4χ10“10, 3χ1010, 2,5χ10“10, 2 χ 10“10, 1χ10“10, 8,0χ10“η, 7,0χ10“η, 6,0χ10“η, 5,0χ10“1]-, 4,0χ10-11, ou 3,0χ10-11) Μ e liga-se também a C5a de um roedor (p. ex., ratinho, rato, ou coelho), em que a afinidade (p. ex., representada pela sua Kd) para C5a humana é não mais de 1000 (p. ex., não mais de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100,125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, ou 975) vezes superior à afinidade para C5a de roedor. Nalguns aspetos da divulgação, qualquer um dos anticorpos anti-C5a ou fragmentos de ligação ao antigénio destes aqui descritos liga-se com afinidade subnanomolar tanto à C5a humana como à C5a de um mamífero não humano (p. ex., um roedor ou primata não humano tal como macaco cinomolgo). Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste pode, nalguns aspetos da divulgação, ligar-se a C5a humana e C5a de primata não humano com igual afinidade (p. ex., uma Kd equivalente).
Por exemplo, a divulgação apresenta um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste que se liga a C5a humana livre com afinidade subnanomolar [p. ex., uma Kd de menos de, ou igual a, 9,9χ10_1° (p. ex., menos de, ou igual a, 9χ10“10, δχΙΟ"10, 7χ10-10, βχΙΟ"10, 5χ10“10, 4χ10“10, 3χ10“10, 2,5χ10-10, 2χ10“10, ΙχΙΟ"10, δ,ΟχΙΟ"11, 7,0x1ο-11, β,ΟχΙΟ-11, 5,0x1ο-11, 4,0x1ο-11, ou 3,0x1ο-11) Μ] e é reativo de forma cruzada com C5a livre de macaco cinomolgo (ou outro primata não humano), o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste que se liga a C5a de macaco cinomolgo (ou outro primata não humano) com uma Kd de menos de 10 x 10-9, 9 x 10-9, 8χ10“9, 7χ10“9, 6χ10“9, 5χ10~9, 4χ10~9, 3χ 10-9, 2χ 10-9, 1 χ 10-9, 9, 9χ10“10 (ρ. ex., menos de 9χ10“10, 8 χ 10_1°, 7χ10“10, 6χ10-10, 5χ10“10, 4χ10“10, 3χ10“10, 2,5χ10“10, 2χ10_1°, ΙχΙΟ-10, ou 8,0χ10-11) Μ], em que a afinidade para a C5a humana é não mais de 500 (p. ex., não mais de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, ou 475) vezes superior à afinidade para a C5a de macaco cinomolgo (ou primata não humano) (p. ex., KD para C5a humana de 100 nM e uma KD para C5a de primata não humano de não mais de 50 nM) . Métodos adequados para determinação da afinidade de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste para um dado antigénio são conhecidos na técnica e aqui descritos e exemplificados.
Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo anti-C5a reativo de forma cruzada ou fragmento de ligação ao antigénio deste inibe funcionalmente tanto hC5a livre como a C5a de mamífero não humano à qual se liga. Por exemplo, um anticorpo inibe em pelo menos 70 (p. ex., pelo menos 75, 80, 85, 90, ou 95 ou mais) % a ativação de neutrófilos humanos dependente de C5a humana a uma razão molar de 1:1 (local de ligação ao antigénio:C5a) e inibe em pelo menos 70 (p. ex., pelo menos 75, 80, 85, 90, ou 95 ou mais) % da ativação de neutrófilos dependente de C5a de mamífero não humano (sendo os neutrófilos da mesma espécie que a C5a de mamífero não humano à qual o anticorpo se liga) a uma razão molar de 1:1 (local de ligação ao antigénio:C5a).
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste que se liga a um polipéptido hC5a livre possuindo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:l, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste se liga ao polipéptido C5a humano com uma Kd que é inferior a 1,25χ10-9 M e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste se liga tanto a hC5a como a C5a de uma espécie de mamífero não humano. A espécie de mamífero não humano pode ser, p. ex., um primata não humano tal como macaco cinomolgo, macaco rhesus, ou babuíno. Nalguns aspetos da divulgação a espécie de mamífero não humano é um roedor tal como um ratinho, rato, coelho, Cobaia, gerbilo, ou hamster. Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste liga-se a hC5a com uma afinidade não superior a 100 vezes superior à correspondente afinidade para C5a da espécie de mamífero não humano. Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio inibe em pelo menos 50% a ativação de neutrófilos humanos dependentes de C5a humana a uma razão molar de 1:1 (local de ligação ao antigénio:C5a).
Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste liga-se a C5a livre de um primata não humano (p. ex., um macaco cinomolgo ou macaco rhesus), a proteína C5a livre possuindo uma sequência de aminoácidos compreendendo, ou consistindo na sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:179 ou SEQ ID NO:180.
Tal como descrito nos exemplos de trabalho, os inventores verificaram também um anticorpo anti-C5a bivalente, BNJ383, que se liga a C5a livre (neste caso C5a humana) com elevada afinidade e, com uma afinidade muito mais baixa, a C5 humana não clivada (hC5), em que, numa composição (p. ex., uma solução aquosa) sob condições fisiológicas em equilíbrio, e na presença de um excesso molar de C5 humana não clivada em comparação com a quantidade molar dos locais de ligação ao antigénio dos anticorpos, pelo menos 95% da pluralidade de anticorpos se ligam cada um a não mais de uma molécula de hC5. O segundo local de ligação ao antigénio dos pelo menos 95% da pluralidade de anticorpos permanece disponível (p. ex., substancialmente disponível) para se ligar a C5a livre. Embora a divulgação não seja de modo algum limitada por qualquer teoria ou mecanismo de ação particular, os inventores acreditam que o anticorpo anti-C5a bivalente se liga a C5 não clivada de modo a que (p. ex., num tal epitopo) o impedimento estereoquímico exclua, ou pelo menos iniba substancialmente, a ligação do segundo local de ligação ao antigénio do anticorpo anti-C5a a uma segunda proteína C5 não clivada, embora o anticorpo possa facilmente acomodar a ligação a duas moléculas de hC5a. Assim, o anticorpo, mesmo num excesso molar de C5 não clivada, mantém a capacidade para se ligar a C5a livre com elevada afinidade e mantém deste modo, mesmo nesse excesso molar, a capacidade para inibir a atividade pró-inflamatória de C5a.
Um vulgar perito na técnica apreciaria facilmente e prontamente a miríade de benefícios terapêuticos de um tal anticorpo anti-C5a. Por exemplo, tal como observado acima, a concentração de C5 em circulação em soro humano é muito elevada. Assim, quando introduzido num mamífero, um anticorpo anti-C5a que seja capaz de simultaneamente se ligar a duas moléculas de C5 não clivadas seria rapidamente inativado no excesso molar de C5 e deixaria então de ser capaz de se ligar a C5a livre no evento de ativação do complemento. E, tal como com os anticorpos anti-C5, a utilização de elevadas concentrações e/ou administração frequente deste tipo de anticorpo anti-C5a seria necessária para inibir eficazmente C5a, no caso de esta ser produzida. Em contraste, o anticorpo anti-C5a aqui descrito que mantém a capacidade para se ligar a C5a, mesmo num excesso molar de C5 não clivada, pode assim ser administrado a um humano a uma dose muito mais baixa e/ou menos frequentemente que, p. ex., um anticorpo anti-C5 e proporciona eficazmente a mesma inibição ou uma maior de C5a no humano.
Por conseguinte, é também aqui descrito um anticorpo isolado compreendendo dois locais de ligação ao antigénio, em que cada local de ligação ao antigénio se pode ligar independentemente a C5a humana livre (hC5a) ou C5 humana não clivada (hC5), em que, numa solução aquosa compreendendo: (i) uma pluralidade dos referidos anticorpos e (ii) um excesso molar de hC5 em comparação com a quantidade molar dos locais de ligação ao antigénio, em equilíbrio e sob condições fisiológicas, pelo menos 95 (p. ex., pelo menos 95,5, 96, 96, 5, 97, 97,5, ou 97,7) % da referida pluralidade de anticorpos se ligam a não mais de uma molécula de hC5, i.e., não mais de 5% dos anticorpos se ligam a duas moléculas de hC5 em equilíbrio.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo isolado compreendendo dois locais de ligação ao antigénio, em que cada local de ligação ao antigénio pode, independentemente, ligar-se a C5a humana livre (hC5a) ou a C5 humana não clivada (hC5), em que, em equilíbrio e sob condições fisiológicas, num solução aquosa compreendendo: (i) uma pluralidade dos referidos anticorpos e (ii) um excesso molar de hC5 em comparação com a quantidade molar dos locais de ligação ao antigénio (ou anticorpos) , pelo menos 95% da referida pluralidade de anticorpos mantêm pelo menos um local de ligação ao antigénio disponível para se ligar a hC5a livre.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo isolado compreendendo dois locais de ligação ao antigénio, em que cada local de ligação ao antigénio pode, independentemente, ligar-se a C5a humana livre (hC5a) ou a C5 humana não clivada (hC5), em que, em equilíbrio e sob condições fisiológicas, numa solução aquosa compreendendo: (i) uma pluralidade dos referidos anticorpos e (ii) um excesso molar de hC5 em comparação com a quantidade molar dos locais de ligação ao antigénio (ou anticorpos) , cada local de ligação ao antigénio de não mais de 5% da referida pluralidade de anticorpos está ligada a uma molécula de hC5 .
Nalguns aspetos da divulgação de qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos, o excesso molar é pelo menos um excesso molar de duas vezes (p. ex., pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, ou mesmo 10 vezes).
Nalguns aspetos da divulgação de qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos, a condição fisiológica é NalHNPCd 3,9 mM, Na2HP04 6, 1 mM e NaCl 150 mM, a pH 7,0.
Nalguns aspetos da divulgação de qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos, cada local de ligação ao antigénio pode, independentemente, ligar-se a hC5a livre com uma Kd que é inferior a 1,25χ10-9 M. Nalgumas formas de realização, cada local de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente a hC5a livre com uma afinidade subnanomolar (ver acima).
Nalgumas formas de realização de qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos, o anticorpo isolado compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:42 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO :45.
Nalgumas formas de realização de qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos, o anticorpo isolado compreende: (i) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:20; (ii) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:21; (iii) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:22; (iv) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:28; (v) uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 46; e (vi) uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO :47.
Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo isolado pode compreender qualquer um dos conjuntos de CDR de cadeia leve aqui descritos, qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve aqui descritas (p. ex., qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve humanizadas), qualquer um dos conjuntos de CDR de cadeia pesada aqui descritos, qualquer uma das regiões variáveis de cadeia pesada aqui descritas (p. ex., qualquer uma das regiões variáveis de cadeia pesada humanizadas), ou qualquer combinação adequada destas. Ver, p. ex., Tabelas 1 ou 2.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um método para tratamento de um humano afligido com um distúrbio associado ao complemento (p. ex. , um distúrbio do complemento associado a C5a), em que o método inclui a administração ao humano de qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos numa quantidade suficiente para tratar o distúrbio associado ao complemento.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um método para tratamento de um humano afligido com distúrbios do complemento associados a C5a, em que o método compreende a administração ao humano de pelo menos 0,6 (p. ex., pelo menos 0,7, 0,8, 0,9, ou 1) mg de qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos por kg de peso corporal do humano para deste modo ligar parcialmente ou completamente e sequestrar níveis de nanogramas de C5a livre durante mais de, igual a, ou pelo menos 12 (p. ex., 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25) dias.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um método para tratamento de um humano afligido com um distúrbio do complemento associado a C5a, em que o método compreende a administração ao humano de pelo menos 10 mg de qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos por kg de peso corporal do humano para deste modo ligar parcialmente ou completamente e sequestrar níveis de nanogramas de C5a livre durante pelo menos 24 dias.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um método para tratamento de um humano afligido com um distúrbio do complemento associado a C5a, em que o método compreende a administração ao humano de qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos (ou por exemplo uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos) numa quantidade suficiente para (a) alcançar valores molares da Cmáx iguais a, ou menores que a concentração molar fisiológica da hC5 não clivada e (b) ligar-se parcialmente ou completamente e sequestrar níveis fisiopatológicos de C5a livre.
Nalguns aspetos de qualquer um dos métodos aqui descritos, um anticorpo é administrado a um sujeito (p. ex. , um humano) numa quantidade suficiente para alcançar um valor molar de Cmáx que seja substancialmente inferior à concentração molar fisiológica de C5 não clivada (p. ex., hC5) .
Nalguns aspetos de qualquer um dos métodos aqui descritos, o valor de Cmáx é, p. ex., não superior a 80 nM (ou aproximadamente 0,6 mg/kg). Nalguns aspetos, os níveis de Cmáx não são superiores a 70 (p. ex., 60, 50, 40, 30, ou 20) nM. Nalguns aspetos, o valor de Cmáx não é superior a aproximadamente 100 nM.
Nalguns aspetos, o valor de Cmáx não é superior a 200 nM. Nalguns aspetos de qualquer um dos métodos aqui descritos, o valor de Cmáx não é, p. ex., superior a 400 nM (ou aproximadamente 3 mg/kg). Nalguns aspetos, o valor de Cmáx não é superior a 400 (p. ex., 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 ou 10) nM.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um método para tratamento de um humano afligido com um distúrbio do complemento associado a C5a, em que o método compreende administração ao humano de qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos (ou, por exemplo, uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos) numa quantidade suficiente para (a) alcançar valores molares da Cmáx iguais a, inferiores a, ou substancialmente inferiores à concentração fisiológica molar de hC5 não clivada e (b) ligar-se parcialmente ou completamente e sequestrar níveis de nanogramas de C5a livre durante pelo menos 12 dias (p. ex., pelo menos 24 dias). Valores de Cmáx adequados são descritos acima.
Nalguns aspetos de qualquer um dos métodos aqui descritos, o distúrbio do complemento associado a C5a pode ser, p. ex., um selecionado a partir do grupo que consiste em sepsia, síndroma da dificuldade respiratória aguda (SDRA), choque séptico, síndroma anti-fosfolipídica, síndroma anti-fosfolipídica catastrófica, coagulação intravascular disseminada, nefrite de lúpus, Síndroma de Goodpasture, queimadura ou queimadura grave, asma, síndroma HELLP (anemia hemolítica, enzimas hepáticas elevadas e baixa contagem de plaquetas), dor induzida por inflamação, neutropenia mediada por C5a, degeneração macular relacionada com a idade (DMRI), doença pulmonar obstrutiva crónica, e artrite reumatoide.
Ainda noutro aspeto, a divulgação apresenta uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, cada anticorpo da pluralidade compreendendo dois locais de ligação ao antigénio, em que cada local de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente a C5a humana livre (hC5a) ou a C5 humana não clivada (hC5), e em que, na presença de C5 humana (hC5) e sob condições fisiológicas, não mais de 5% dos anticorpos da pluralidade em equilíbrio compreendem dois locais de ligação ao antigénio simultaneamente ligados a hC5 não clivada.
Nalguns aspetos de qualquer uma das composições aqui descritas, a percentagem da pluralidade em qualquer configuração de ligação particular pode ser avaliada utilizando cromatografia líquida de alta resolução (HPLC). Nalguns aspetos da divulgação, as condições fisiológicas em que os anticorpos são avaliados compreendem as seguintes condições: incubação de hC5 (p. ex., um excesso molar (p. ex., um excesso molar de 2 vezes) de hC5) com a pluralidade de anticorpos a 4°C durante 84 horas numa solução aquosa compreendendo NafhPCh 3,9 mM, Na2HP04 6, 1 mM e NaCl 150 mM, a pH 7,0. Para os fins desta divulgação, a solução obtida às 84 horas a 4°C é considerada estar em equilíbrio.
Nalguns aspetos de qualquer uma das composições aqui descritas, não mais de 5% dos anticorpos da pluralidade compreendem dois locais de ligação ao antigénio simultaneamente ligados a hC5 não clivada sob condições fisiológicas e na presença de pelo menos um excesso molar de 2 vezes de hC5 para o anticorpo.
Nalguns aspetos de qualquer uma das composições aqui descritas, não mais de 5% dos anticorpos da pluralidade compreendem dois locais de ligação ao antigénio simultaneamente ligados a moléculas de hC5 não clivada tal como avaliado utilizando HPLC após incubação da pluralidade de anticorpos com hC5 a 4°C durante 84 horas numa solução aquosa compreendendo NafhPCh 3,9 mM, Na2HP04 6, 1 mM e NaCl 150 mM, a pH 7,0.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, cada anticorpo da pluralidade compreendendo dois locais de ligação ao antigénio, em que cada local de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente a C5a humana livre (hC5a) ou a C5 humana não clivada (hC5), e em que não mais de 5% dos anticorpos da pluralidade compreendem dois locais de ligação ao antigénio simultaneamente ligados a hC5 não clivada tal como avaliado (p. ex., utilizando HPLC) após incubação da pluralidade de anticorpos com hC5 a 4°C durante 84 horas numa solução aquosa compreendendo NaH2P04 3,9 mM, Na2HP04 6, 1 mM e NaCl 150 mM, a pH 7,0.
Ainda noutro aspeto, a divulgação apresenta uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, cada anticorpo da pluralidade compreendendo um primeiro local de ligação ao antigénio e um segundo local de ligação ao antigénio, em que cada local de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente a C5a humana livre (hC5a) ou a C5 humana não clivada (hC5) , em que cada local de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente ao polipéptido hC5a livre com uma Kd que é inferior a 1,25χ10“9 M, e em que, na presença de C5 humana (hC5) e tal como avaliado (p. ex., utilizando cromatografia líquida de alta resolução (HPLC)) sob condições fisiológicas, os dois locais de ligação ao antigénio de pelo menos 95% da pluralidade de anticorpos estão ocupados pela hC5 não clivada nas seguintes configurações: (i) o primeiro local de ligação ao antigénio liga-se a hC5 não clivada e o segundo local de ligação ao antigénio está ligado; ou (ii) o primeiro local de ligação ao antigénio está ligado e o segundo local de ligação ao antigénio liga-se a hC5 não clivada.
Ainda noutro aspeto, a divulgação apresenta uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, cada anticorpo da pluralidade compreendendo dois locais de ligação ao antigénio, em que cada local de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente a C5a humana livre (hC5a) ou a C5 humana não clivada (hC5), e em que, na presença de C5 humana (hC5) e tal como avaliado (p. ex., utilizando cromatografia líquida de alta resolução (HPLC)) sob condições fisiológicas, pelo menos 95% dos anticorpos da pluralidade compreendem pelo menos um local de ligação ao antigénio capaz de se ligar a hC5a livre.
Nalguns aspetos de qualquer uma das composições aqui descritas, a pluralidade de anticorpos é avaliada na presença de pelo menos um excesso molar de 2 vezes de hC5:anticorpo. Nalguns aspetos de qualquer uma das composições aqui descritas, a pluralidade de anticorpos é avaliada na presença de pelo menos um excesso molar de 2 vezes de hC5:locais de ligação ao antigénio.
Ainda noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo isolado compreendendo dois locais de ligação ao antigénio, em que o anticorpo se liga a C5a livre ou a C5 não clivada, e em que um dos locais de ligação ao antigénio do anticorpo permanece disponível para se ligar a C5a livre na presença de um excesso molar (p. ex., excesso molar de pelo menos ou superior a 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, ou mesmo 20 vezes) de C5 não clivada.
Nalguns aspetos da divulgação, os locais de ligação ao antigénio têm a mesma especificidade (p. ex., as CDR de cada um dos dois locais de ligação ao antigénio partilham sequências de aminoácidos idênticas). Nalgumas formas de realização, a C5a livre é C5a humana. Nalguns aspetos da divulgação o anticorpo é reativo de forma cruzada entre C5a humana e C5a de uma espécie de mamífero não humano. O anticorpo pode, nalguns aspetos, ligar-se a C5a livre com uma afinidade subnanomolar. Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo tem uma afinidade para C5a que é pelo menos 100 vezes superior à sua afinidade correspondente para C5 não clivada.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo isolado compreendendo dois locais de ligação ao antigénio, em que cada local de ligação ao antigénio liga-se independentemente a C5a humana livre (hC5a) ou a C5 humana não clivada (hC5), e em que, a qualquer concentração de hC5 não clivada (p. ex., num excesso molar de hC5 não clivada em relação a hC5a), pelo menos um dos locais de ligação ao antigénio do anticorpo permanece disponível para se ligar a hC5a livre (p. ex., sob condições fisiológicas humanas, p. ex., em sangue ou soro humano).
Noutro aspeto, a divulgação apresenta uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, em que cada anticorpo da pluralidade compreende dois locais de ligação ao antigénio, em que cada um dos locais de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente a C5a humana livre (hC5a) ou a C5 humana não clivada (hC5), e em que, a uma razão molar de 1:1 (anticorpo: hC5) , não mais de, ou menos de, 5 (p. ex., não mais de, ou menos de 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1, 4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1, 3,0, 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, ou 1) % dos anticorpos da pluralidade compreendem dois locais de ligação ao antigénio simultaneamente ligados a hC5 não clivada. Nalguns aspetos da divulgação, cada local de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente a hC5a livre com uma Kd que é inferior a 1,25><10“9 M (ou, por exemplo, com uma afinidade subnanomolar).
Noutro aspeto, a divulgação apresenta uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, em que cada anticorpo da pluralidade compreende dois locais de ligação ao antigénio, em que cada um dos locais de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente a C5a humana livre (hC5a) ou a C5 humana não clivada (hC5), e em que, na presença de níveis fisiológicos de hC5 não clivada, os anticorpos da pluralidade ligam-se parcialmente ou completamente e sequestram níveis de nanogramas de C5a livre durante mais de, igual a, ou pelo menos 12 (p. ex., 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25) dias quando administrados a um humano a doses de 1 mg/kg ou superiores.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, em que cada anticorpo da pluralidade compreende dois locais de ligação ao antigénio, em que cada um dos locais de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente a C5a humana livre (hC5a) ou a C5 humana não clivada (hC5), e em que, na presença de niveis fisiológicos de hC5 não clivada, os anticorpos da pluralidade ligam-se, parcialmente ou completamente, e sequestram niveis de nanogramas de C5a livre durante mais de, igual a, ou pelo menos 12 (p. ex., 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25) dias quando administrados a um humano a doses de 10 mg/kg ou superiores.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, em que cada anticorpo da pluralidade compreende dois locais de ligação ao antigénio, em que cada um dos locais de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente a C5a humana livre (hC5a) ou a C5 humana não clivada (hC5), e em que, na presença de niveis fisiológicos de hC5 não clivada, os anticorpos da pluralidade ligam-se, parcialmente ou completamente, e sequestram niveis de nanogramas de C5a livre durante mais de, igual a, ou pelo menos 12 (p. ex., 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25) dias quando administrados a doses alcançando valores molares de Cmáx substancialmente inferiores à concentração molar fisiológica de hC5 não clivada.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, em que cada anticorpo da pluralidade compreende dois locais de ligação ao antigénio, em que cada um dos locais de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente a C5a humana livre (hC5a) ou a C5 humana não clivada (hC5), e em que, na presença de níveis fisiológicos de hC5 não clivada, os anticorpos da pluralidade ligam-se e sequestram, parcialmente ou completamente níveis fisiopatológicos de C5a livre quando administrados a doses alcançando valores molares de Cmáx substancialmente inferiores à concentração molar fisiológica da hC5 não clivada.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo isolado compreendendo um primeiro local de ligação ao antigénio e um segundo local de ligação ao antigénio, em que cada local de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente a C5a humana livre (hC5a) ou a C5 humana não clivada (hC5), e em que, quando ambos os locais de ligação ao antigénio estão totalmente ocupados (e, p. ex., sob condições fisiológicas humanas, p. ex., no sangue ou soro humano), são possíveis as seguintes configurações de ligação: (i) o primeiro local de ligação ao antigénio liga-se a hC5a livre e o segundo local de ligação ao antigénio liga-se a hC5 não clivada; (ii) o primeiro local de ligação ao antigénio liga-se a hC5a livre e o segundo local de ligação ao antigénio liga-se a hC5a livre; ou (iii) o primeiro local de ligação ao antigénio liga-se a hC5 não clivada e o segundo local de ligação ao antigénio liga-se a hC5a livre.
Ainda noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo isolado compreendendo um primeiro local de ligação ao antigénio e um segundo local de ligação ao antigénio, em que cada local de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente a C5a humana livre (hC5a) ou a C5 humana não clivada (hC5), em que cada local de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente a hC5a livre com uma Kd que é inferior a 1,25 χ IO-9 M (ou, por exemplo, com uma afinidade subnanomolar), e em que, numa solução fisiológica contendo uma pluralidade dos anticorpos, pelo menos 95% dos anticorpos estão nas seguintes configurações: (i) o primeiro local de ligação ao antigénio liga-se a hC5a livre e o segundo local de ligação ao antigénio liga-se a hC5 não clivada; (ii) o primeiro local de ligação ao antigénio liga-se a hC5a livre e o segundo local de ligação ao antigénio liga-se a hC5a livre; (iii) o primeiro local de ligação ao antigénio liga-se a hC5 não clivada e o segundo local de ligação ao antigénio liga-se a hC5a livre; (iv) o primeiro local de ligação ao antigénio liga-se a hC5 não clivada e o segundo local de ligação ao antigénio não se liga; (v) o primeiro local de ligação ao antigénio liga-se a hC5a e o segundo local de ligação ao antigénio não se liga; (vi) o primeiro local de ligação ao antigénio não se liga e o segundo local de ligação ao antigénio liga-se a hC5 não clivada; (vii) o primeiro local de ligação ao antigénio não se liga e o segundo local de ligação ao antigénio liga-se a hC5a; e (viii) o primeiro local de ligação ao antigénio não se liga e o segundo local de ligação ao antigénio não se liga.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo isolado compreendendo dois locais de ligação ao antigénio, em que cada local de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente a C5a humana livre (hC5a) ou a C5 humana não clivada (hC5) , e em que, num excesso molar de hC5 não clivada em relação a hC5a, o anticorpo inibe em pelo menos 50% a ativação de neutrófilos humanos dependente de hC5a a uma razão molar de 1:1 (local de ligação ao antigénio: hC5a).
Nalguns aspetos de qualquer um dos anticorpos aqui descritos, as configurações são possíveis sob condições fisiológicas humanas com proteínas C5a e C5 humanas nativas, totalmente dobradas.
Nalguns aspetos de qualquer um dos anticorpos aqui descritos, o anticorpo liga-se a hC5a livre com uma Kd que é inferior a 1,25χ10-9 M (ou, por exemplo, com uma afinidade subnanomolar).
Ainda noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo que (a) se liga a C5a livre (p. ex., hC5a) com uma afinidade subnanomolar e (b) se liga a C5a livre com uma afinidade que é pelo menos 100 (p. ex., pelo menos 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, ou 10000) vezes superior à sua afinidade correspondente para a proteína C5 não clivada. Numa composição fisiológica compreendendo uma pluralidade dos anticorpos, para pelo menos 95% dos anticorpos, apenas um local de ligação ao antigénio do anticorpo se liga à proteína C5 não clivada, enquanto o segundo local de ligação ao antigénio permanece disponível para se ligar a C5a livre. (A hC5a pode ter a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:l.)
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um método para tratamento de um humano afligido com um distúrbio do complemento associado a C5a, o método compreendendo a administração ao humano da composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, em que cada anticorpo da pluralidade compreende dois locais de ligação ao antigénio, em que cada um dos locais de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente a C5a humana livre (hC5a) ou a C5 humana não clivada (hC5), em que pelo menos 1 mg dos anticorpos por kg de peso corporal do humano é administrado ao humano, e em que a administração dos anticorpos é eficaz para parcialmente ou completamente ligar e sequestrar niveis de nanogramas de C5a livre durante pelo menos 12 dias.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um método para tratamento de um humano afligido com um distúrbio associado ao complemento (p. ex., um distúrbio do complemento associado a C5a), o método compreendendo a administração ao humano de uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, em que cada anticorpo da pluralidade compreende dois locais de ligação ao antigénio, em que cada um dos locais de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente a C5a humana livre (hC5a) ou a C5 humana não clivada (hC5) , em que pelo menos 10 mg dos anticorpos por kg de peso corporal do humano são administrados ao humano, e em que a administração dos anticorpos é eficaz para parcialmente ou completamente ligar e sequestrar niveis de nanogramas de C5a livre durante pelo menos 24 dias.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um método para tratamento de um humano afligido com um distúrbio associado ao complemento (p. ex., um distúrbio do complemento associado a C5a), o método compreendendo a administração ao humano de uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, em que cada anticorpo da pluralidade compreende dois locais de ligação ao antigénio, em que cada um dos locais de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente a C5a humana livre (hC5a) ou a C5 humana não clivada (hC5), em que os anticorpos são administrados a uma dose suficiente para: (a) alcançar valores molares da Cmáx substancialmente inferiores à concentração molar fisiológica de hC5 não clivada e (b) parcialmente ou completamente ligar e sequestrar níveis de nanogramas de C5a livre durante pelo menos 12 dias.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um método para tratamento de um humano afligido com um distúrbio associado ao complemento (p. ex., um distúrbio do complemento associado a C5a), o método compreendendo a administração ao humano de uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, em que cada anticorpo da pluralidade compreende dois locais de ligação ao antigénio, em que cada um dos locais de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente a C5a humana livre (hC5a) ou a C5 humana não clivada (hC5), em que os anticorpos são administrados a uma dose suficiente para: (a) alcançar valores molares da Cmáx substancialmente inferiores aos da concentração molar fisiológica de hC5 não clivada e (b) parcialmente ou completamente ligar e sequestrar níveis de nanogramas de C5a livre durante pelo menos 24 dias.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um método para tratamento de um humano afligido com um distúrbio associado ao complemento (p. ex., um distúrbio do complemento associado a C5a), o método compreendendo a administração ao humano de uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, em que cada anticorpo da pluralidade compreende dois locais de ligação ao antigénio, em que cada um dos locais de ligação ao antigénio pode ligar-se independentemente a C5a humana livre (hC5a) ou a C5 humana não clivada (hC5), em que os anticorpos são administrados a uma dose suficiente para: (a) alcançar valores molares da
Cmáx substancialmente inferiores aos da concentração molar fisiológica de hC5 não clivada e (b) parcialmente ou completamente ligar e sequestrar níveis patofisiológicos de C5a livre.
Entende-se que qualquer uma das composições (p. ex., compreendendo uma pluralidade de anticorpos) ou dos anticorpos isolados (p. ex., que mantêm, na presença de C5 ou excesso molar de C5, um braço livre de Fab capaz de se ligar a C5a livre) aqui descritos pode ser: (a) formulada como composições farmacêuticas de acordo com a divulgação, (b) incluídas em estojos terapêuticos (aqui descritos), ou (c) incluídos nas seringas previamente enchidas aqui descritas.
Tal como descrito nos exemplos de trabalho aqui proporcionados, os inventores verificaram também um anticorpo, BNJ383 (ver abaixo) , que não só se liga com elevada afinidade (afinidade subnanomolar) a hC5a livre, como também a concentrações em excesso de C5 não clivada inibe também a formação do complexo terminal do complemento (TCC) de um modo dependente da dose. Mesmo a concentrações do anticorpo anti-C5a superiores a um excesso de 6,5 vezes de C5, no entanto, a inibição de TCC não é completa. Embora a divulgação não esteja de modo algum limitada por qualquer teoria ou mecanismo de ação particular, o anticorpo pode inibir a formação de TCC ligando-se a pelo menos uma fração de C5 não clivada e impedindo a sua clivagem e/ou impedindo de outro modo a associação bem-sucedida de C5 com componentes adicionais de TCC. Os inventores apreciaram que um tal anticorpo é útil para tratamento de distúrbios associados ao complemento, p. ex., nos quais C5a tem um papel significativo e o TCC contendo C5b pode ter um papel menos substancial. Tais distúrbios podem incluir, p. ex., sepsia, síndroma da dificuldade respiratória aguda (SDRA), choque séptico, síndroma anti-fosfolipídica, síndroma anti-fosfolipídica catastrófica, coagulação intravascular disseminada, nefrite de lúpus, Síndroma de Goodpasture, queimadura ou queimadura grave, asma, síndroma HELLP (Anemia hemolítica, Enzimas hepáticas elevadas e Baixa contagem de plaquetas) , dor induzida por inflamação, neutropenia mediada por C5a, degeneração macular relacionada com a idade (AMD), doença pulmonar obstrutiva crónica, e artrite reumatoide.
Os inventores apreciaram também que a utilização de um tal anticorpo anti-C5a para tratar estas condições, entre outras, pode proporcionar um perfil de segurança ainda mais vantajoso em comparação com a utilização de fármacos inibidores do complemento terminal. Tal como observado acima, uma consequência notável da inibição de componentes do complemento terminal tais como C5, C5b, C6, C7, C8, ou C9 é uma menor proteção pelo sistema imunitário do hospedeiro contra as bactérias encapsuladas que o complemento terminal vulgarmente lisa - por exemplo, Neisseria meningitides e Neisseria gonorrhoeae. Uma vez que os anticorpos anti-C5a descritos nesta secção inibem a resposta inflamatória mediada por C5a, mas não inibem completamente a formação do complexo terminal do complemento que lisa essas bactérias encapsuladas, os pacientes que recebem um anticorpo terapêutico anti-C5a aqui descrito podem não requerer uma vacinação protetora, p. ex., uma vacinação contra Neisseria meningitides e Neisseria gonorrhoeae. A inibição parcial do TCC, embora não revogue totalmente a resposta antimicrobiana do complemento terminal, pode, de facto, reduzir a inflamação induzida por TCC como lesão tecidual. Crê-se que a inibição parcial de TCC, em combinação com a inibição de C5a, torne o anticorpo anti-C5a um composto anti-inflamatório ainda mais potente.
Por conseguinte, noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste que se liga a C5a livre, em que a C5a livre é C5a humana possuindo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID N0:1, em que o anticorpo inibe a ligação de C5a ao recetor de C5a, e em que o anticorpo inibe parcialmente a formação do complexo terminal do complemento (TCC). A inibição parcial através de um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito pode ser, p. ex., uma atividade do complemento que seja, na presença do anticorpo, até, ou não superior a, 80 (p. ex., 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, ou 25) % da atividade do complemento na ausência do anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste. Nalgumas formas de realização, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste liga-se a C5a livre (p. ex., hC5a livre) com uma afinidade subnanomolar. Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste tem uma afinidade para C5a livre que é pelo menos 100 vezes superior à afinidade correspondente do anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio para C5 não clivada. Nalgumas formas de realização, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste inibe em pelo menos 50% a formação de TCC a concentrações que excedem 200 (p. ex., 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, ou 400 ou mais) yg/mL medidas utilizando um ensaio de CH50eq. Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste inibe em pelo menos 50% a ativação da via clássica do complemento a concentrações excedendo 200 (p. ex., 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, ou 400 ou mais) yg/mL medidas utilizando o Wieslab® Classical Pathway Complement Kit tal como descrito nos exemplos de trabalho.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um método para tratamento de um humano afligido com um distúrbio associado ao complemento (p. ex., um distúrbio do complemento associado a C5a ou um distúrbio inflamatório associado ao complemento). O método inclui a administração ao humano de uma quantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste que inibe a ligação de C5a ao recetor de C5a, e em que o anticorpo inibe parcialmente a formação do complexo terminal do complemento (TCC). Ver acima. O distúrbio pode ser qualquer um daqueles conhecidos na técnica ou aqui descritos.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste que se liga a um polipéptido C5a humano possuindo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:l, mas não se liga à cadeia alfa da C5 nativa, não clivada, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste se liga ao polipéptido C5a humano com uma Kd que é inferior a 1,25χ10-9 M.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste que se liga a um polipéptido C5a humano possuindo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID N0:1, mas não se liga à cadeia alfa de C5 nativa, não clivada, em que o anticorpo inibe em pelo menos 50% a ativação de neutrófilos humanos dependente de C5a humana a uma razão molar de 1:1 (local de ligação ao antigénio:C5a). Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo inibe em pelo menos 50% a migração de neutrófilos humanos dependente de C5a humana num ensaio em que 0,4 nM do anticorpo é utilizado para inibir a atividade de ativação dos neutrófilos de C5a humana 2 nM tal como descrito no Exemplo 5. Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo não compreende o emparelhamento de CDR 3 exemplar representado na Tabela 1. Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo não é BNJ371.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito liga-se a um polipéptido C5a humano possuindo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:2.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo: uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 21; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:22.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo: uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 38; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:22.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia pesada compreendendo: uma CDRl de cadeia pesada compreendendo: uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:29; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:30.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia pesada compreendendo: uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 67; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:30.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia pesada compreendendo: uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 46; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:47.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:37 ou SEQ ID NO:36.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:27 ou SEQ ID NO:33.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:37 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO :27.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:36 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO :33.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:19 ou SEQ ID NO:17.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:27 ou SEQ ID NO:25.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:19 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO :27.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:17 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO :25.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:42 ou SEQ ID NO:40.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:27 ou SEQ ID NO:33.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:42 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO :27.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:40 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO :33.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:17 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO :33.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma de SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:44, ou SEQ ID NO:49.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:19 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO :45.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:17 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO :44.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:17 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:49.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:37 ou SEQ ID NO:36.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:45 ou SEQ ID NO:4 9.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:37 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO :45.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:36 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:49.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:42 ou SEQ ID NO:40.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:45 ou SEQ ID NO:4 9.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:42 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO :45.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:40 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:49.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito liga-se a hC5a com uma Kd que é inferior a 7χ10-10 M.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito liga-se a hC5a com uma Kd que é inferior a 5><10“10 M.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito liga-se a hC5a com uma Kd que é inferior a 3><10“10 M.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito liga-se a hC5a a com uma Kd que é inferior a 2,5><10“10 M.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito liga-se a hC5a com uma Kd que é inferior a 1,5><10“10 M.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito liga-se a hC5a com uma Kd que é inferior a Ι,ΟχΙΟ-10 M.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito liga- se a hC5a com uma Kd que é inferior a δ,ΟχΙΟ-11 M.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo inibe em pelo menos 70 (p. ex., pelo menos 75, 80, 85, 90, ou 95 ou mais) % a ativação de neutrófilos humanos dependentes de C5a humana a uma razão molar de 1:1 (local de ligação ao antigénio:C5a). Nalguns aspetos, o anticorpo não compreende a emparelhamento de CDR3 exemplar representado na Tabela 1. Nalguns aspetos, o anticorpo não é BNJ371.
Ainda noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste que compreende um conjunto de CDR de cadeia leve tal como exposto na Tabela 3 ou na Tabela 7. Por exemplo, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste da divulgação pode compreender um polipéptido de cadeia leve compreendendo: (i) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 140; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:96; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:142; (ii) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 156; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 157; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:158; (iii) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 164; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 165; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:166; (iv) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:172; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 173; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:174; (v) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 84; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:85; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:86; (vi) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 92; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 89; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:93; (vii) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 88; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 89; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:90; (viii) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:95; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 96; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 97; (ix) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 99; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:100; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:101; (x) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 84; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 85; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:103; (xi) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 105; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 10 6; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:107; (xii) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:92; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 89; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 108; (xiii) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:110; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:111; ou (xiv) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 21; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:113. Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreendendo o conjunto de CDR de cadeia leve, compreende também um polipéptido de cadeia pesada compreendendo qualquer um dos conjuntos de CDR de cadeia pesada tal como exposto na Tabela 8.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste que compreende um conjunto de CDR de cadeia pesada tal como exposto na Tabela 3 ou Tabela 8. Por exemplo, nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito, compreende um polipéptido de cadeia pesada compreendendo: (i) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:144; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:117; (ii) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:67; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:30; (iii) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 160; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:161; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:162; (iv) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:168; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 169; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 17 0; (v) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 17 6; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:177; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:178; (vi) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:116; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 117; (vii) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:119; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:120; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:121; (viii) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:123; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:117; (ix) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:124; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:117; (x) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:119; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 126; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 127; (xi) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:129; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:117; (xii) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 131; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:132; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 133; (xiii) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:46; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:47; ou (xiv) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 136; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:137; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID No: 138. Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreendendo o conjunto de CDR de cadeia pesada compreende também um polipéptido de cadeia leve compreendendo qualquer um dos conjuntos de CDR de cadeia leve tal como exposto na Tabela 7.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreendendo um conjunto de CDR de cadeia leve da Tabela 7 e o seu conjunto de CDR de cadeia pesada cognato tal como exposto na Tabela 8. Noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreendendo um conjunto de CDR de cadeia leve e de cadeia pesada emparelhadas tal como exposto na Tabela 3 ou Tabela 9. Por exemplo, nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação ao antigénio deste, aqui descrito compreende: (i) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 140; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:96; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 142; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:144; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:117; (ii) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 21; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:22; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 67; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:30; (iii) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 156; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:157; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 158; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 160; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:161; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:162; (iv) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 164; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 165; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:166; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:168; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 169; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 17 0; (v) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 172; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:173; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 174; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 17 6; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:177; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:178; (vi) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 88; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 89; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:90; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:119; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 120; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 121; (vii) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:105; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:106; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 107; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 124; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:117; (viii) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 84; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 85; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:86; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 116; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:117; (ix) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:110; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 111; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 136; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:137; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:138; (x) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 21; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:113; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 4 6; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:47; (xi) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 99; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:100; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 101; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 119; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:126; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:127; (xii) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 95; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 96; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:97; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 144; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 117; (xiii) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:140; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:96; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 142; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:123; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:117; (xiv) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 105; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 10 6; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:107; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 123; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:117; (xv) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 92; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:89; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 108; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:144; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:117; (xvi) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 92; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 89; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:93; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 123; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 117; (xvii) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 92; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:89; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 93; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:144; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:117; (xviii) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 84; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 85; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:103; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 12 9; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 117; (xix) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 95; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:96; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 97; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:123; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:117; (xx) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 84; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 85; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:103; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 144; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:117; ou (xxi) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:21; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 113; uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 131; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:132; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:133.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreende um conjunto de CDR de cadeia leve e um conjunto de CDR de cadeia pesada emparelhados tal como exposto na Tabela 3. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreende um conjunto de CDR de cadeia leve e um conjunto de CDR de cadeia pesada emparelhados tal como exposto na Tabela 2. Por exemplo, a divulgação apresenta um anticorpo compreendendo: (i) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:20; (ii) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:21; e (iii) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:22; (iv) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 28; (v) uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 4 6; e (vi) uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO :47.
Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreende uma região variável de cadeia leve exposta na Tabela 2, cadeia leve que é emparelhada com qualquer uma das regiões variáveis de cadeia pesada expostas na Tabela 2. Por exemplo, a divulgação apresenta um anticorpo (ou um fragmento de ligação ao antigénio deste) compreendendo: (a) uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 42 e (b) uma região variável de cadeia pesada possuindo uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:45.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende: (i) uma região estrutural 1 de região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:68 ou SEQ ID NO:69; (ii) uma região estrutural 2 de região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:70 ou SEQ ID NO:71; e uma região estrutural 3 de região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma de SEQ ID Nos:72 a 74. Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreende uma região estrutural 4 de região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO :75. Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma de SEQ ID NOs:76 a 80. A cadeia pesada do anticorpo pode compreender qualquer um dos conjuntos de CDR de cadeia pesada aqui descritos. A região variável de cadeia pesada pode ser, nalgumas formas de realização, emparelhada com o polipéptido da região variável compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:16.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste liga-se a uma proteína C5a não humana. Por exemplo, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste pode ligar-se a proteína C5a de ratinho e/ou C5a de ratinho desarginada. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste pode ligar-se a C5a de ratinho (e/ou C5a de ratinho desarginada) e compreender: (i) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:54; (ii) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:55; (iii) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:56; (iv) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:62; (v) uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 63; e (vi) uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO :64. Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo anti-C5a de ratinho pode compreender um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:59; e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:66.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito inibe a interação entre C5a e um recetor de C5a. 0 recetor de C5a pode ser, p. ex., C5aRl ou C5L2.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito não inibe substancialmente a hemólise mediada pelo complemento de glóbulos vermelhos in vitro e/ou in vivo.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo isolado (e por conseguinte qualquer fragmento de ligação ao antigénio deste) é um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo totalmente humano.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito é selecionado a partir do grupo que consiste num anticorpo recombinante, um anticorpo de cadeia simples, um diacorpo, um intracorpo, um anticorpo quimerizado ou quimérico, um anticorpo humano desimunizado, um fragmento Fv, um fragmento Fd, um fragmento Fab, um fragmento Fab', e um fragmento F(ab')2.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito é multiespecifico (p. ex., biespecifico) por o anticorpo ou fragmento se ligar a pelo menos dois epitopos diferentes. Os dois epitopos diferentes podem ser, p. ex., dois epitopos diferentes da mesma proteína (p. ex., C5a) ou o anticorpo pode ligar-se a um primeiro epitopo de uma primeira proteína (p. ex., C5a) e um segundo epitopo de uma segunda proteína.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito compreende uma porção heteróloga. A porção heteróloga pode ser, p. ex., um açúcar. Por exemplo, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste pode estar glicosilado. A porção heteróloga pode ser, p. ex., um marcador detetável tal como, mas não limitado a, um marcador fluorescente, um marcador luminescente, um marcador de metal pesado, um marcador radioativo, ou um marcador enzimático.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo isolado anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito é modificado com uma porção que melhora a estabilização e/ou retenção do anticorpo em circulação. Por exemplo, a modificação pode ser PEGuilação ou hesilação. Noutra forma de realização, o anticorpo anti-C5a pode conter uma região constante alterada que tenha função efetora reduzida (ou não tenha nenhuma), em comparação com a função efetora da sua região constante não alterada correspondente. Nalgumas formas de realização, o anticorpo anti-C5a contém uma região constante alterada que possui entre cerca de 0 a cerca de 20% da função efetora da região constante inalterada. Formas de realização exemplares de tais anticorpos com função efetora diminuída são aqui descritas.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste que bloqueia de forma cruzada a ligação de qualquer um dos anticorpos anteriores.
Ainda noutro aspeto, a divulgação apresenta uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais de qualquer um dos anticorpos isolados ou fragmentos de ligação ao antigénio destes aqui descritos e um transportador, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta: (i) um ácido nucleico codificando um ou mais de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigénio destes aqui descritos; (ii) um vetor compreendendo o ácido nucleico; (iii) um vetor de expressão compreendendo o ácido nucleico; e/ou (iv) uma célula compreendendo o vetor ou o vetor de expressão. Noutro aspeto, a divulgação apresenta um método para produção de um polipéptido (tal como qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigénio destes aqui descritos). 0 método compreende a cultura da célula acima mencionada (compreendendo o vetor de expressão) sob condições e durante um tempo suficiente para permitir a expressão pela célula do anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio codificado pelo ácido nucleico no vetor. 0 método pode também incluir isolamento do anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio a partir da célula ou do meio em que a célula é cultivada.
Noutro aspeto, a divulgação apresenta um ácido nucleico isolado codificando qualquer uma das sequências de aminoácidos aqui descritas ou um polipéptido possuindo uma sequência de aminoácidos compreendendo, ou consistindo em, qualquer uma das sequências de aminoácidos aqui expostas. 0 ácido nucleico pode ser incluído num vetor, p. ex., um vetor de expressão, e/ou pode estar presente numa célula.
Ainda noutro aspeto, a divulgação apresenta um estojo terapêutico compreendendo: (i) um ou mais dos anticorpos isolados ou fragmentos de ligação ao antigénio aqui descritos (p. ex., um ou mais de qualquer um dos anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação ao antigénio destes aqui descritos); e (ii) meios para distribuição do anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio a um sujeito. Os meios podem ser adequados para, p. ex., distribuição subcutânea, distribuição intraocular, ou distribuição intra-articular do anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste ao sujeito. Os meios podem ser, p. ex., uma seringa, uma seringa de corpo duplo, ou duas seringas separadas incorporadas para utilização na administração de um anticorpo terapêutico ou fragmento de ligação ao antigénio, enquanto se tira fluido do joelho (p. ex., para análise) de um modo injeção-sucção. Nalguns aspetos da divulgação, o meio é para distribuição ocular e compreende um penso trans-esclerótico ou uma lente de contacto, cada um dos quais compreendendo o fragmento de ligação de anticorpo deste. Nalguns aspetos da divulgação, o meio é adequado para distribuição intrapulmonar. Por exemplo, o meio pode ser um inalador ou um nebulizador. Nalguns aspetos da divulgação, o meio é uma seringa previamente enchida tal como um dispositivo de caneta. A seringa previamente enchida pode conter, p. ex., pelo menos uma forma de dosagem unitária farmacêutica de um ou mais dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigénio destes aqui proporcionados.
Nalguns aspetos da divulgação, os estojos terapêuticos aqui descritos podem conter pelo menos um agente ativo adicional para utilização no tratamento de um distúrbio associado ao complemento num sujeito. 0 agente ativo adicional pode ser, p. ex., qualquer um dos agentes adicionais aqui descritos.
Ainda noutro aspeto, a divulgação apresenta um método para tratamento ou prevenção de um distúrbio associado ao complemento. 0 método inclui a administração a um humano a necessitar desta de um anticorpo terapêutico ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito numa quantidade suficiente para tratar um distúrbio associado ao complemento afligindo o humano. 0 método pode também incluir a identificação do sujeito como tendo um distúrbio associado ao complemento. 0 distúrbio associado ao complemento pode ser, p. ex. , um distúrbio inflamatório associado ao complemento, síndroma hemolítica urémica atípica, degeneração macular relacionada com a idade, artrite reumatoide, sepsia, ou síndroma antifosfolipídica. Nalgumas formas de realização, o distúrbio associado ao complemento é um distúrbio pulmonar associado ao complemento. Por exemplo, o distúrbio pulmonar associado ao complemento pode ser, p. ex., asma ou doença pulmonar obstrutiva crónica. Outros distúrbios associados ao complemento passíveis de tratamento ou prevenção tal como exposto no método são aqui descritos. 0 modo de administração, que pode variar dependendo do tipo de distúrbio associado ao complemento a tratar, pode ser, p. ex., administração intravenosa, administração intrapulmonar, administração intraocular, administração subcutânea; ou administração intra-articular.
Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste é administrado ao humano numa quantidade e com uma frequência suficiente para manter um nível reduzido de atividade sistémica de C5a durante a duração do tratamento. Nalguns aspetos da divulgação, os métodos podem incluir após a administração, a monitorização do humano quanto a uma melhoria num ou mais sintomas do distúrbio associado ao complemento.
Nalguns aspetos da divulgação, os métodos podem incluir a administração ao humano de um ou mais agentes terapêuticos adicionais.
Ainda noutro aspeto, a divulgação apresenta um artigo de fabrico, que compreende: (i) um recipiente com um rótulo e (ii) uma composição compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito. 0 rótulo pode indicar que a composição é para ser administrada a um humano possuindo, suspeito de possuir, ou em risco de desenvolver, um distúrbio associado ao complemento. 0 artigo de fabrico pode também incluir um ou mais agentes ativos adicionais.
Tal como utilizado ao longo da presente divulgação, o termo "anticorpo" refere-se a uma molécula de anticorpo inteira ou intacta (p. ex., IgM, IgG, IgA, IgD, ou IgE) que seja gerada através de qualquer um de uma variedade de métodos que são conhecidos na técnica e aqui descritos. 0 termo "anticorpo" inclui um anticorpo policlonal, um monoclonal anticorpo, um anticorpo quimerizado ou quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano desimunizado, e um anticorpo totalmente humano. 0 anticorpo pode ser produzido numa, ou derivado de qualquer uma, de uma variedade de espécies, p. ex., mamíferos tais como humanos, primatas não humanos (p. ex., macacos, babuínos, ou chimpanzés), cavalos, gado, porcos, ovelhas, cabras, cães, gatos, coelhos, cobaias, gerbilos, hamsters, ratos e ratinhos. 0 anticorpo pode ser um anticorpo purificado ou recombinante.
Tal como aqui utilizado, o termo "fragmento de anticorpo", "fragmento de ligação ao antigénio", ou termos semelhantes referem-se a um fragmento de um anticorpo que mantém a capacidade para se ligar a um antigénio (p. ex., um epitopo presente em C5a, mas não na cadeia alfa da proteína C5 nativa, não clivada), p. ex., um anticorpo de cadeia simples (scFv) , e um fragmento Fd, um fragmento Fab, um fragmento Fab', ou um fragmento F(ab')2. Um scFv é uma cadeia polipeptídica simples que inclui ambas as regiões variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo do qual o scFv é derivado. Além disso, os diacorpos (Poljak (1994) Structure 2 (12) : 1121-1123; Hudson et al. (1999) J. Immunol.
Methods 23(1-2):177-189), minicorpos, triacorpos (Schoonooghe et al. (2009) BMC Biotechnol 9:70), anticorpos de domínio (também conhecidos como "imunoglobulinas de cadeia pesada" ou camelídeos; Holt et al. (2003) Trends Biotechnol 21 (11) :484-490); e intracorpos (Huston et al. , (2001) Hum. Antibodies 10(3-4):127-142; Wheeler et al. (2003) Mol. Ther. 8 (3) : 355-366; Stocks (2004) Drug Discov. Today 9(22): 960-966) estão incluídos na definição de fragmentos de anticorpo e podem ser incorporados nas composições, e utilizados nos métodos, aqui descritos. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um vulgar perito na técnica à qual esta divulgação pertence. Em caso de conflito, o presente documento, incluindo definições, prevalecerá. Os métodos e materiais preferidos são descritos abaixo, embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam também ser utilizados na prática ou teste dos métodos e composições presentemente divulgados. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência na sua totalidade.
Outras caracteristicas e vantagens da presente invenção, p. ex., métodos para tratamento de distúrbios associados ao complemento num sujeito, serão evidentes a partir da seguinte descrição, dos exemplos, e das reivindicações.
Breve Descrição dos Desenhos A Fig. 1 é um diagrama de Venn que apresenta o grau de sobreposição dos epitopos da C5a humana que se ligam a um conjunto selecionado de anticorpos de murideo anti-C5a humana: 5anl0lME, 5anl80ME, 5an048ME, 5anl79ME, e 5anl78ME. A Fig. 2 é um gráfico linear que representa o antagonismo da sinalização mediada por C5a in vitro utilizando um ensaio de ativação de neutrófilos. 0 eixo dos YY representa a medição da densidade ótica (DO) de um substrato cromogénico em função da libertação de mieloperoxidase por neutrófilos humanos isolados de fresco. 0 eixo dos XX representa a concentração do anticorpo incubado com as células. Os anticorpos humanizados testados - BNJ367, BNJ369, BNJ371, BNJ378, BNJ381, BNJ383, e um anticorpo anti-C5 humanizado - são identificados na legenda inserida. A Fig. 3 é um gráfico linear que representa o efeito de vários anticorpos terapêuticos na inflamação das articulações num modelo de ratinho de artrite reumatoide. 0 eixo dos YY representa a espessura da articulação do joelho inicialmente inflamada em milímetros. 0 eixo dos XX representa os dias após o surgimento da doença. Os anticorpos terapêuticos testados - 5anl95ME (um anticorpo anti-5a de ratinho) e um anticorpo de controlo com a mesma região Fc que o anticorpo anti-C5a - são identificados na legenda inserida. A Fig. 4 é um gráfico linear que representa o efeito de vários anticorpos terapêuticos na gravidade geral da doença num modelo de ratinho de artrite reumatoide. 0 eixo dos YY representa o índice de artrite. 0 eixo dos XX representa os dias após o surgimento da doença. Os anticorpos terapêuticos testados - 5anl95ME (um anticorpo anti-5a de ratinho) e um anticorpo de controlo com a mesma região Fc que o anticorpo anti-C5a - são identificados na legenda inserida. A Fig. 5 expõe uma série de sequências humanizadas da região variável de cadeia pesada. Por ordem da mais acima para a mais abaixo: a região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-C5a humanizado BNJ345 (SEQ ID NO:76); a região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-C5a humanizado BNJ346 (SEQ ID NO:77); a região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-C5a humanizado BNJ347 (SEQ ID NO:78); a região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-C5a humanizado BNJ354 (SEQ ID NO:79); e a região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-C5a humanizado BNJ350 (SEQ ID NO:80). O perito na técnica apreciará a delimitação entre as regiões estruturais de cadeia pesada 1, 2, 3, e 4 e as CDR de cadeia pesada 1, 2, e 3. Tais delimitações, tal como definido por Rabat et al. (infra), são mostradas na figura. "FRl de HC" refere-se à região estrutural 1 da região variável de cadeia pesada, "FR2 de HC" refere-se à região estrutural 2 da região variável de cadeia pesada, "FR3 de HC" refere-se à região estrutural 3 da região variável de cadeia pesada, e "FR4 de HC" refere-se à região estrutural 4 da região variável de cadeia pesada. "CDRl de HC" refere-se à região determinante de complementaridade (CDR) 1 da região variável de cadeia pesada, "CDR2 de HC" refere-se à CDR2 da região variável de cadeia pesada, e "CDR3 de HC" refere-se à CDR3 da região variável de cadeia pesada. A Fig. 6 é um gráfico linear que representa a percentagem de neutrófilos em circulação no sangue de ratinhos após administração de hC5a aos ratinhos. No eixo dos YY, as contagens de neutrófilos são expressas como percentagem do "limiar, " que é a contagem de neutrófilos no tempo 0 (ou 100% de neutrófilos) . O eixo dos XX representa o tempo em minutos. Às coortes de ratinhos foi administrado por via intravenosa um anticorpo de controlo [antigénio protetor anti-antraz 63, isotipo IgG2/G4] ("controlo"; cinco ratinhos) ou o anticorpo anti-C5a humana BNJ383 numa das seguintes doses: 24 mg/kg (cinco ratinhos); 12 mg/kg (cinco ratinhos); 6 mg/kg (cinco ratinhos); e 3 mg/kg (cinco ratinhos) e depois mais tarde foi administrada hC5a. Ver Exemplo 13. A seis ratinhos, "simulados", não foi administrada C5a humana. A Fig. 7 é um gráfico de barras que representa o nivel de mieloperoxidase (MPO) no plasma de ratinhos antes e após a
administração de C5a humana aos ratinhos. O eixo dos YY representa a concentração (ng/mL) de MPO no plasma de ratinho. 0 eixo dos XX representa o tempo em minutos. Às coortes de ratinhos foi administrado por via intravenosa um anticorpo de controlo [antigénio protetor anti-antraz 63, isotipo IgG2/G4] ("controlo"; oito ratinhos) ou o anticorpo anti-C5a humana BNJ383 numa das seguintes doses: 24 mg/kg (cinco ratinhos); 12 mg/kg (cinco ratinhos); 6 mg/kg (cinco ratinhos); e 3 mg/kg (cinco ratinhos) e depois mais tarde foi administrada hC5a. A quatro ratinhos, "simulados", não foi administrada C5a humana. A Fig. 8 é um gráfico linear que representa uma alteração no nível da C5a humana no plasma de ratinhos (C5a humana administrada) na presença ou ausência de concentrações diferentes de um anticorpo anti-hC5a (BNJ383) . 0 eixo dos YY representa a concentração (ng/mL) de hC5a no plasma de ratinho. 0 eixo dos XX representa o tempo em minutos. Às coortes de ratinhos foi administrado por via intravenosa um anticorpo de controlo [antigénio protetor anti-antraz 63, isotipo IgG2/G4] ("controlo"; seis ratinhos) ou o anticorpo anti-C5a humana BNJ383 numa das seguintes doses: 24 mg/kg (três ratinhos); 12 mg/kg (três ratinhos); 6 mg/kg (três ratinhos); e 3 mg/kg (três ratinhos) e depois mais tarde foi administrada hC5a. A quatro ratinhos, "simulados", não foi administrada C5a humana. A Fig. 9 é um gráfico linear que representa a competição pela ligação a C5a humana in vitro. 250 pM de anticorpo anti-C5a (BNJ383) marcado com ruténio foram incubados com hC5a biotinilada 1 nM, juntamente com várias concentrações (p. ex., 400, 133, 44,4, 14, 8, 4, 9, 1, 6, e 0,5 nM) de um dos seguintes: (a) proteína C5a humana desarg em solução salina tamponada com fosfato, (b) plasma humano, (c) plasma de macaco cinomolgo, (d) plasma de Balb/C (ratinho), ou (e) plasma de DBA/2J (ratinho). Em relação aos componentes do plasma (b) , (c) , (d) , e (e) , a concentração refere-se à concentração final aproximada de antigénio C5 na mistura de incubação. 0 eixo dos YY representa unidades arbitrárias de fluorescência em função da quantidade de anticorpo anti-C5a marcado com ruténio detetado. 0 eixo dos XX representa a concentração (nM) do antigénio competidor. A Fig. 10 é um gráfico linear que representa o efeito de várias proteínas inibidoras do complemento na via alternativa (VA) do complemento. 0 eixo dos YY representa a percentagem de atividade de VA do complemento em comparação com o limiar (L; o nível de atividade na ausência de um inibidor do complemento). 0 eixo dos XX representa a concentração de um dado inibidor do complemento (μΜ) . Os efeitos do anticorpo anti-hC5a, BNJ383, juntamente com um anticorpo anti-C5 na atividade de VA foram avaliados individualmente. A Fig.11 é um gráfico linear que representa o efeito de várias proteínas inibidoras do complemento na via clássica (VC) do complemento. 0 eixo dos YY representa a percentagem de atividade de VC do complemento em comparação com o limiar (L; o nível de atividade na ausência de um inibidor do complemento). 0 eixo dos XX representa a concentração de um dado inibidor do complemento (μΜ). Os efeitos do anticorpo anti-hC5a, BNJ383, juntamente com um anticorpo anti-C5 na atividade da VC foram avaliados independentemente.
As Figs. 12A, 12B, 12C, e 12D são uma série de cromatografias que representam os tempos de retenção do anticorpo anti-C5a (BNJ383) e um anticorpo anti-hC5 na presença ou ausência de proteína hC5. Para todos os painéis, o eixo dos XX representa o tempo de retenção em minutos e o eixo dos YY representa as unidades de absorvância a um comprimento de onda de 214 nm. Em cada painel, o subpainel subjacente representa uma vista aumentada dos picos apresentados. A Fig. 12A representa o tempo de retenção para BNJ383 na ausência da proteína hC5. A Fig. 12B representa o tempo de retenção para o anticorpo anti-C5 na ausência da proteína hC5. A Fig. 12C representa o tempo de retenção para BNJ383 na presença de hC5 (excesso molar de 2,1 vezes de hC5 em relação a BNJ383) . Da direita para a esquerda, os picos enumerados representam: (a) BNJ383 não complexado ou hC5; (b) BNJ383 com um local de ligação ao antigénio ligado a hC5 não clivada; e (c) uma fração menor consistente com a dupla ocupação de BNJ383 com hC5 não clivada. A Fig. 12D representa o tempo de retenção para o anticorpo anti-C5 na presença de uma quantidade equimolar de hC5. Da direita para a esquerda, os picos enumerados representam: (a) anticorpo anti-C5 incompleto ou hC5; (b) o anticorpo anti-C5 com um local de ligação ao antigénio ligado a hC5 não clivada; e (c) o anticorpo anti-C5 ligado a duas moléculas de C5 não clivadas. A Fig. 13 é um gráfico linear que representa a ligação do anticorpo anti-C5a BNJ383 a hC5a desarg na presença de hC5 utilizando um ELISA. 0 eixo dos XX representa a concentração (ng/mL) do anticorpo. 0 eixo dos YY representa a densidade ótica a um comprimento de onda de 450 nm. A Fig. 14 é um gráfico de dispersão que representa a concentração de C5a livre/C5a desarg presente no plasma de macacos cinomolgos em função da concentração no plasma do anticorpo anti-C5a (BNJ383). 0 eixo dos YY representa a concentração (pg/mL) de C5a/C5a desarg detetada em amostras de plasma de macacos cinomolgos a pontos de tempo variando de 1 dia a 30 dias após uma única dose de administração intravenosa de BNJ383 a 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg, 250 mg/kg, ou 400 mg/kg de peso corporal dos animais. O eixo dos XX representa a concentração do BNJ383 (yg/mL) em cada uma das amostras. A Fig. 15A é um gráfico de dispersão que representa a percentagem de atividade hemolítica em amostras de soro relativamente aos valores limiares (eixo dos YY) iniciada através da via clássica em função da concentração de anticorpo anti-C5a (BNJ383) em circulação (eixo dos XX) . A Fig. 15B é um gráfico de dispersão que representa a percentagem de formação do complexo do complemento terminal iniciada através da via clássica em amostras de soro medidas através de um ensaio de CH50eq relativamente aos valores limiares (eixo dos YY) em função da concentração de anticorpo anti-C5a (BNJ383) em circulação (eixo dos XX). A Fig.l5C é um gráfico de dispersão que representa a percentagem de formação de complexo do complemento terminal iniciada através da via clássica em amostras de soro medidas através de um ensaio de CCP relativamente aos valores limiares (eixo dos YY) em função da concentração de anticorpo anti-C5a (BNJ383) em circulação (eixo dos XX).
Descrição Detalhada A presente divulgação proporciona anticorpos e fragmentos de ligação ao antigénio destes que se ligam a C5a livre (p. ex., C5a humana livre), composições contendo os anticorpos ou seus fragmentos, e métodos para utilização de qualquer um dos anteriores para tratar ou prevenir distúrbios associados ao complemento tais como, mas não limitado a, SHUa, degeneração macular (p. ex., DMI), AR, sepsia, sindroma antifosfolipidica, queimadura (p. ex., queimadura grave), sindroma de Goodpasture, nefrite de lúpus, ou um distúrbio pulmonar associado ao complemento tal como asma ou doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC). A divulgação proporciona também anticorpos anti-C5a (e fragmentos destes) que são reativos de forma cruzada entre C5a livre de humano e C5a livre de uma espécie de mamífero não humano tal como um primata não humano (p. ex., macaco cinomolgo ou macaco rhesus). Embora não se pretendendo de forma alguma ser limitante, anticorpos (e fragmentos de ligação ao antigénio), composições (p. ex., composições e formulações farmacêuticas), e métodos exemplares para utilização das composições são aprofundados abaixo e exemplificados nos Exemplos de trabalho.
Anticorpos Anti-C5a e Fragmentos de Ligação ao Antigénio Destes A divulgação proporciona anticorpos que se ligam ao componente do complemento C5a. Tal como discutido acima, a pró-forma de C5, uma proteína precursora de 1676 resíduos de aminoácidos, é processada através de uma série de eventos de clivagem proteolítica. Os primeiros 18 péptidos (numerados de -18 a -1) constituem um péptido sinal que é clivado a partir da proteína precursora. A proteína de 1658 aminoácidos restante é clivada em dois locais para formar as cadeias alfa e beta. 0 primeiro evento de clivagem ocorre entre os resíduos de aminoácidos 655 e 656. A segunda clivagem ocorre entre os resíduos de aminoácidos 659 e 660. Os dois eventos de clivagem resultam na formação de três fragmentos polipeptídicos distintos: (i) um fragmento compreendendo os aminoácidos 1 a 655, que é referido como a cadeia beta; (ii) um fragmento compreendendo os aminoácidos 660 a 1658, que é referido como a cadeia alfa; e (iii) um fragmento tetra-peptídico consistindo nos aminoácidos 656 a 659. Os fragmentos polipeptídicos da cadeia alfa e da cadeia beta são ligados uns aos outros através de ligação dissulfureto e constituem a proteína C5 madura. A C5-convertase da VC ou da VA ativa a C5 madura através da clivagem da cadeia alfa entre os resíduos 733 e 734, o que resulta na libertação do fragmento C5a (aminoácidos 660 a 733). A porção restante da C5 madura é o fragmento C5b, que contém os resíduos 734 a 1658 da cadeia alfa ligados através de dissulfureto à cadeia beta.
In vivo, a C5a é rapidamente metabolizada através de uma enzima sérica, carboxipeptidase B, numa forma de 73 aminoácidos designada "C5a desarg", que perdeu o resíduo de arginina carboxi-terminal. Por conseguinte, nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo que se liga a C5a livre liga-se também a C5a desarginada. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo que se liga a C5a não se liga a C5a desarginada.
Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo anti-C5a liga-se a um neoepitopo presente em C5a, i.e., um epitopo que se torna exposto após a libertação de C5a do fragmento de cadeia alfa da C5 madura. Isto é, nalguns aspetos, um anticorpo anti-C5a aqui descrito liga-se a C5a e/ou C5a desarg, mas não à C5 não clivada, nativa (totalmente dobrada).
Tal como descrito acima, nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste pode ligar-se a uma subpopulação de C5 não clivada, processada (p. ex., C5 plasmática) constituindo menos de 10 (p. ex., menos de 9,5, 9, 8,5, 8, 7,5, 7, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, ou menos de 0,1) % da população total de C5 inteira numa amostra (p. ex., uma amostra de sangue ou plasma ou uma amostra compreendendo C5 inteira recombinante), subpopulação essa que é no todo ou em parte desnaturada de modo a que o neoepitopo de C5a de outro modo obstruído fique exposto. Assim, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito pode, nalgumas formas de realização, ligar-se a C5a livre, mas não a C5 de 90% ou mais da população de C5 nativa, não clivada. Nalgumas formas de realização, a subpopulação parcialmente ou totalmente desnaturada é inativa ou tem atividade reduzida (p. ex., menos de 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5% da atividade da proteína C5 inteira, totalmente funcional) em qualquer número de ensaios adequados úteis para testar a atividade de C5, p. ex., um ensaio hemolítico ou um ensaio de CH50eq. Os métodos adequados para testar a atividade da subpopulação menor à qual um anticorpo anti-C5a aqui descrito se pode, nalgumas formas de realização, ligar são conhecidos na técnica e aqui descritos.
Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo anti-C5a liga-se a uma proteína C5 de mamífero (p. ex., humana) . Por exemplo, o anticorpo anti-C5a pode ligar-se a uma proteína C5a humana possuindo a seguinte sequência de aminoácidos: TLQKKIEEIAAKYKHSVVKKCCYDGACVNNDETCEQRAARISLGPRCIKAFTECCVVAS QLRANISHKDMQLGR (SEQ ID NO:1). Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a pode ligar-se a uma proteína C5a humana desarginada possuindo a seguinte sequência de aminoácidos: TLQKKIEEIAAKYKHSVVKKCCYDGACVNNDETCEQRAARISLGPRCIKAFTECCVVAS QLRANISHKDMQLG (SEQ ID NO:2). Um anticorpo anti-C5a aqui descrito pode ligar-se tanto à C5 humana inteira como à C5a humana desarginada.
Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo pode ligar-se a C5a humana num epitopo dentro ou sobreposto a um fragmento estrutural da proteína possuindo a sequência de aminoácidos: TLQKKIEEIAAKYK (SEQ ID N0:3); HSVVKKCCYDGAC (SEQ ID NO:4); VNNDE (SEQ ID NO:5); TCEQRAAR (SEQ ID NO:6); ISLG (SEQ ID NO : 7) ; PRCIKAFTECCVVASQLRANIS (SEQ ID NO : 8) ; HKDMQLG (SEQ ID NO:9); ou HKDMQLGR (SEQ ID NO:10), Ver, p. ex., Cook et al. (2010) Acta Cryst D66:190-197. Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo pode ligar-se a C5a num epitopo dentro ou sobreposto a uma sequência de aminoácidos de um fragmento peptídico de C5a compreendendo pelo menos dois dos resíduos de cisteína emparelhados. Por exemplo, um anticorpo anti-C5a pode ligar-se a um fragmento compreendendo, ou consistindo em, a sequência de aminoácidos: CCYDGACVNNDETC (SEQ ID NO:ll); CYDGACVNNDETCEQRAARISLGPRCIKAFTEC (SEQ ID NO:12; e CEQRAARISLGPRCIKAFTECC (SEQ ID NO:13), em que, em cada um dos fragmentos peptídicos, o primeiro e o último resíduo de cisteína são emparelhados através de ligações dissulfureto.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a aqui descrito pode ligar-se a uma proteína C5a humana num epitopo dentro, ou sobreposto à, sequência de aminoácidos: YDGACVNNDETCEQRAAR (SEQ ID NO:14) ou CYDGACVNNDETCEQRAA (SEQ ID No :15) . Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo pode ligar-se a uma proteína C5a humana ou fragmento desta contendo uma sequência de aminoácidos que contém, ou consistem em, pelo menos quatro (p. ex., pelo menos quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ou 17 ou mais) aminoácidos consecutivos representados em qualquer uma das SEQ ID Nos:l a 15. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a aqui descrito liga-se a um epitopo ternário compreendendo dois ou mais (p. ex., pelo menos dois, três, ou quatro) regiões peptídicas descontínuas da proteína C5a, p. ex., duas ou mais regiões peptídicas de C5a unidas por meio de uma ligação dissulfureto.
Os métodos para identificação do epitopo ao qual um determinado epitopo (p. ex., um anticorpo anti-C5a) se liga são também conhecidos na técnica. Por exemplo, o epitopo de ligação dentro de C5a (ou C5a desarginada) ao qual um anticorpo anti-C5a se liga pode ser identificado através da medição da ligação do anticorpo a vários (p. ex., três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 15, 20, ou 30 ou mais) fragmentos peptídicos sobrepostos de uma proteína C5a componente do complemento (p. ex., vários fragmentos sobrepostos de uma proteína C5a humana possuindo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:l ou SEQ ID NO:2). Cada um dos diferentes péptidos sobrepostos liga-se então a um endereço único num suporte sólido, p. ex., poços separados de uma placa de ensaio de múltiplos poços. Em seguida, o anticorpo anti-C5a é questionado através do seu contato com cada um dos péptidos na placa de ensaio durante um período de tempo e sob condições que permitam que o anticorpo se ligue ao seu epitopo. 0 anticorpo anti-C5a não ligado é removido através de lavagem de cada um dos poços. Em seguida, um anticorpo secundário marcado de forma detetável que se liga ao anticorpo anti-C5a, se estiver presente num poço da placa, é colocado em contato com cada um dos poços, e o anticorpo secundário não ligado é removido através de passos de lavagem. A presença ou a quantidade de sinal detetável produzido pelo anticorpo secundário marcado de forma detetável num poço é uma indicação de que o anticorpo anti-C5a se liga ao fragmento peptídico particular associado ao poço. Ver, p. ex., Harlow e Lane (supra), Benny K.C. Lo (supra), e Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 20060153836.
Um epitopo particular ao qual um anticorpo se liga pode também ser identificado utilizando técnicas de cromatografia BIAcore (ver, p. ex., "Pharmacia BIAtechnology Handbook", "Epitope Mapping", Seção 6.3.2 (maio de 1994); e Johne et al. (1993) J. Immunol. Methods 160:20191-8).
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a aqui descrito contém um conjunto específico de regiões determinantes de complementaridade (CDR) de cadeia leve e/ou um conjunto específico de CDR de cadeia pesada. Por exemplo, nalguns aspetos da divulgação um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito pode compreender um conjunto de CDR de cadeia leve obtido a partir de um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma de SEQ ID NOs:19, 37, ou 42. Nalgumas formas de realização, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito pode compreender um conjunto de CDR de cadeia pesada obtido a partir de um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:27 ou 45. Conjuntos de CDR de cadeia leve e cadeia pesada exemplares obtidos a partir das regiões variáveis de cadeia leve e regiões variáveis de cadeia pesada acima mencionadas são descritos abaixo em maior detalhe (ver Tabela 1).
Os limites exatos das CDR, e regiões estruturais, foram definidos de forma diferente de acordo com métodos diferentes. Nalguns aspetos da presente divulgação, as posições das CDR ou regiões estruturais dentro de um domínio variável de cadeia leve ou pesada pode ser tal como definido por Rabat et al., [(1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest". Publicação NIH No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, MD]. Em tais casos, as CDR podem ser referidas como "CDR de Rabat" (p. ex., "LCDR2 de Rabat" ou "HCDRl de Rabat"). Nalguns aspetos da divulgação, as posições das CDR de uma região variável de cadeia leve ou pesada podem ser tal como definido por Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883. Por conseguinte, estas regiões podem ser referidas como "CDR de Chothia" (p. ex., "LCDR2 de Chothia" ou "HCDR3 de Chothia"). Nalguns aspetos da divulgação, as posições das CDR das regiões variáveis de cadeia leve e pesada podem ser tal como definido por uma definição combinada de Rabat-Chothia. Em tais aspetos da divulgação, estas regiões podem ser referidas como "CDR combinadas de Rabat-Chothia". Nalguns aspetos da divulgação, as posições das CDR e/ou regiões estruturais dentro de um domínio variável de cadeia leve ou pesada podem ser tal como definidas por Honnegger e
Pluckthun (2001) J. Mol. Biol. 309: 657-670. A identificação das CDR dentro de uma região variável de cadeia leve ou cadeia pesada utilizando as definições acima mencionadas é bem conhecida na técnica de engenharia de anticorpos. Por exemplo, Thomas et al. [(1996) Mol. Immunol. 33(17/18):1389-1401] exemplifica a identificação dos limites das CDR de cadeia leve e de cadeia pesada de acordo com as definições de Rabat e Chothia.
Por conseguinte, nalguns aspetos da divulgação um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito pode compreender um conjunto de CDR de cadeia leve definido por Rabat, definido por Chothia, ou combinado definido por Rabat-Chothia, obtido a partir de um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID NOs:19, 37, ou 42. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito pode compreender um conjunto de CDR de cadeia pesada definido por Rabat, definido por Chothia, ou combinado definido por Rabat-Chothia, obtido a partir de um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:27 ou 45.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreende uma região variável de cadeia leve contendo um ou mais de uma CDRl de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID NO:20); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: RASNLES (SEQ ID NO:21); e uma
CDR3 de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: QQSNEDPYT (SEQ ID NO:22) . Nalgumas formas de realização, um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreende uma região variável de cadeia leve contendo cada uma de uma CDRl de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID NO:20); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: RASNLES (SEQ ID N0:21); e uma
CDR3 de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: QQSNEDPYT (SEQ ID NO:22). Anticorpos anti-C5a exemplares compreendendo um tal domínio variável de cadeia leve incluem, p. ex., os anticorpos anti-C5a BNJ364, BNJ367, BNJ378, BNJ366, BNJ369, e BNJ383 aqui descritos (vide infra; Tabela 2).
Nalgumas formas de realização, um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreende uma região variável de cadeia leve contendo um ou mais de: uma CDRl de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID NO:20); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: WASTRES (SEQ ID NO:38); e uma
CDR3 de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: QQSNEDPYT (SEQ ID NO:22). Nalgumas formas de realização, um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreende uma região variável de cadeia leve contendo cada uma de uma CDRl de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID NO:20); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: WASTRES (SEQ ID NO:38); e uma
CDR3 de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: QQSNEDPYT (SEQ ID NO:22). Anticorpos anti-C5a exemplares compreendendo um tal domínio variável de cadeia leve incluem, p. ex., os anticorpos anti-C5a BNJ371 e BNJ381 aqui descritos (vide infra; Tabela 2).
Nalgumas formas de realização, um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreende uma região variável de cadeia pesada contendo uma ou mais de: uma CDRl de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: DYSMD (SEQ ID NO:28); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: AINPNSGGTNYNQKFKD (SEQ ID NO:29); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na
seguinte sequência de aminoácidos: SGSYDGYYAMDY (SEQ ID NO:30). Nalgumas formas de realização, um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreende uma região variável de cadeia pesada contendo cada uma de uma CDRl de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: DYSMD (SEQ ID NO:28); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: AINPNSGGTNYNQKFKD (SEQ ID NO:29); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na
seguinte sequência de aminoácidos: SGSYDGYYAMDY (SEQ ID NO:30). Anticorpos anti-C5a exemplares compreendendo um tal domínio variável de cadeia pesada incluem, p. ex., os anticorpos anti-C5a BNJ364, BNJ367, BNJ371, e BNJ378 aqui descritos (vide infra; Tabela 2).
Nalgumas formas de realização, um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreende uma região variável de cadeia pesada contendo uma ou mais de: uma CDRl de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: DYSMD (SEQ ID NO:28); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: AIHLNTGYTNYNQKFKG (SEQ ID NO:46); e uma
CDR3 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: GFYDGYSPMDY (SEQ ID NO:47). Nalgumas formas de realização, um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreende uma região variável de cadeia pesada contendo cada uma de uma CDRl de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: DYSMD (SEQ ID NO:28); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: AIHLNTGYTNYNQKFKG (SEQ ID NO:46); e uma
CDR3 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: GFYDGYSPMDY (SEQ ID NO:47). Anticorpos anti-C5a exemplares compreendendo um tal domínio variável de cadeia pesada incluem, p. ex., os anticorpos anti-C5a BNJ366, BNJ369, BNJ381, e BNJ383 aqui descritos (vide infra; Tabela 2).
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito pode conter uma região CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos: AINPNSGGTNYSQKFKD (SEQ ID NO:67). Por exemplo, um anticorpo anti-C5a aqui descrito pode compreender uma região variável de cadeia pesada contendo uma ou mais de uma CDRl de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: DYSMD (SEQ ID NO:28); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: AINPNSGGTNYSQKFKD (SEQ ID NO: 67); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: SGSYDGYYAMDY (SEQ ID NO:30). Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreende uma região variável de cadeia pesada contendo cada uma de uma CDRl de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: DYSMD (SEQ ID NO:28); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: AINPNSGGTNYSQKFKD (SEQ ID NO: 67); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: SGSYDGYYAMDY (SEQ ID NO:30). Um exemplo de um anticorpo anti-C5a aqui descrito, que contém um tal polipéptido de cadeia pesada e se liga a C5a humana com uma Kd que é inferior a 1 nM é o anticorpo 5anl0lME descrito abaixo.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito contém um dos emparelhamentos de conjunto de CDR de cadeia leve e conjunto de CDR de cadeia pesada exemplares 1 a 4 representados na Tabela 1.
Nalgumas formas de realização, o anticorpo anti-C5a não compreende um emparelhamento de CDR3 exemplar. Nalgumas formas de realização, o anticorpo anti-C5a não é BNJ371.
Nalgumas formas de realização, o polipéptido de cadeia leve de um anticorpo anti-C5a aqui descrito pode ser um polipéptido de cadeia leve λ (p. ex., um polipéptido de cadeia leve λ totalmente humano ou humanizado). Nalgumas formas de realização, o polipéptido de cadeia leve de um anticorpo anti-C5a aqui descrito é um polipéptido de cadeia leve k (p. ex., um polipéptido de cadeia leve κ totalmente humano ou humanizado). As sequências de aminoácidos de numerosos polipéptidos de cadeia leve (p. ex., numerosos polipéptidos de cadeia leve humanos) são bem conhecidas na técnica e expostas em, p. ex., Rabat et ai. (1991), supra. Sequências de aminoácidos de polipéptidos de cadeia leve κ exemplares são expostas na Tabela 2.
Nalgumas formas de realização, um anticorpo anti-C5a aqui descrito pode compreender uma região constante de cadeia leve. Por exemplo, a região constante de cadeia leve pode ser uma região constante de um polipéptido de cadeia leve ou uma região constante de cadeia leve κ. A sequência de aminoácidos para várias regiões constantes de cadeia leve λ e κ humanas são conhecidas na técnica e descritas em, p. ex., Rabat et al. (1991), supra. Sequências de aminoácidos de polipéptidos de cadeia leve κ exemplares são expostas na Tabela 2. 0 polipéptido de cadeia pesada pode compreender uma região constante (p. ex., uma região constante de cadeia pesada 1 (CHI), região constante de cadeia pesada 2 (CH2), região constante de cadeia pesada 3 (CH3), uma região constante de cadeia pesada 4 (CH4), ou uma combinação de qualquer uma das anteriores). 0 polipéptido de cadeia pesada pode compreender uma porção Fc de uma molécula de imunoglobulina. A região Fc pode ser, p. ex., uma região Fc de uma molécula de imunoglobulina IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, igE, ou IgD ou uma combinação de porções de cada uma destas. Para ser claro, os anticorpos anti-C5a aqui descritos podem ser, p. ex., do isotipo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, ou IgD. As sequências de aminoácidos para várias regiões constantes de cadeia pesada humanas são conhecidas na técnica e descritas em, p. ex., Rabat et al. (19 91), s upra.
Nalgumas formas de realização, o polipéptido de cadeia pesada pode compreender uma região constante híbrida, ou uma porção desta, tal como uma região constante híbrida G2/G4 (ver p. ex., Burton et al. (1992) Adv. Immun. 51:1-18; Canfield et al. (1991) J. Exp. Med. 173:14 83-14 91; e Mueller et al. (1997) Mol. Immunol. 34(6):441-452). Por exemplo (e de acordo com a numeração de Rabat), as regiões constantes de IgGl e IgG4 compreendem os resíduos G249G250 enquanto a região constante de IgG2 não compreende o resíduo 249, mas compreende G250. Numa região constante híbrida G2/G4, onde a região 249-250 provém da sequência de G2, a região constante pode ainda ser modificada para introduzir um resíduo de glicina na posição 249 para produzir uma fusão G2/G4 possuindo G249/G250. Outros domínios constantes híbridos que compreendem G249/G250 podem também fazer parte de anticorpos modificados de acordo com a divulgação. Sequências de aminoácidos de polipéptidos de cadeia pesada exemplares são expostas na Tabela 2. 0 anticorpo anti-C5a pode ser, p. ex., um dos anticorpos específicos exemplificados nos exemplos de trabalho: BNJ364, BNJ367, BNJ378, BNJ366, BNJ369, BNJ383, BNJ371, ou BNJ381. As sequências de aminoácidos para estes anticorpos anti-C5a exemplificados, que podem ser utilizadas em conjunto com qualquer um dos métodos aqui descritos, são expostas na Tabela 2.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreende um conjunto de CDR de cadeia leve definido por Chothia ou um conjunto de CDR de cadeia leve combinado definido por Kabat-Chothia obtido a partir de qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve descritas nas Tabelas 2 ou 3. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a, ou fragmento de ligação ao antigénio deste, aqui descrito compreende um conjunto de CDR de cadeia pesada definido por Chothia ou um conjunto de CDR de cadeia pesada combinado definido por Kabat-Chothia obtido a partir de qualquer uma das regiões variáveis de cadeia pesada descritas nas Tabelas 2 ou 3.
Em aspetos preferidos da divulgação, um anticorpo anti-C5a descrito liga-se a C5a, mas não a C5 nativa, inteira. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a liga-se a C5a, mas não se liga à cadeia alfa de C5 nativa, não clivada. Tal como aqui utilizado, "C5 não clivada" refere-se a uma proteína C5 que não tenha sido clivada nos fragmentos C5a e C5b através da C5-convertase da VA ou VC. Uma sequência de aminoácidos exemplar para uma cadeia alfa de C5 humana é exposta em Haviland et al. (1991), supra.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a aqui descrito não se liga a parálogos de C5 humana tais como C3a humana ou C4a humana. A divulgação apresenta também anticorpos que bloqueiam de forma cruzada a ligação de um anticorpo anti-C5a aqui descrito (p. ex., bloqueia de forma cruzada qualquer um de BNJ364, BNJ367, BNJ378, BNJ366, BNJ369, BNJ371, BNJ381, ou BNJ383). Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo de bloqueio de forma cruzada" refere-se a um anticorpo que baixa a quantidade de ligação (ou impede a ligação) de um anticorpo anti-C5a a um epitopo numa proteína C5a componente do complemento relativamente à quantidade de ligação do anticorpo anti-C5a ao epitopo na ausência do anticorpo de bloqueio de forma cruzada. Os métodos adequados para determinação se um primeiro anticorpo bloqueia de forma cruzada a ligação de um segundo anticorpo a um epitopo são conhecidos na técnica. Por exemplo, os anticorpos de bloqueio de forma cruzada podem ser identificados através da comparação da ligação do anticorpo monoclonal anti-C5a BNJ364 na presença e ausência de um anticorpo de teste. A menor ligação do anticorpo BNJ364 na presença do anticorpo de teste em comparação com a ligação do anticorpo BNJ364 na ausência do anticorpo de teste indica que o anticorpo de teste é um anticorpo de bloqueio de forma cruzada.
Nalguns aspetos da divulgação, a ligação de um anticorpo a C5a pode inibir a atividade biológica de C5a. Métodos para medição da atividade de C5a incluem, p. ex., ensaios de quimiotaxia, radioimunoensaios (RIA) ou ensaios imunoespecíficos ligados a enzima (ELISA) (ver, p. ex., Ward e Zvaifler (1971) J. Clin. Invest. 50(3):606-16 e Wurzner et ai. (1991) Complement. Inflamm. 8:328-340). Nalguns aspetos da divulgação, a ligação de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste a C5a pode inibir a ativação de neutrófilos in vitro. Os métodos adequados para determinação de se um anticorpo anti-C5a inibe a ativação de neutrófilos mediada por C5a in vitro, ou da extensão à qual o anticorpo inibe a ativação, são conhecidos na técnica e exemplificados nos exemplos de trabalho abaixo. Por exemplo, neutrófilos humanos obtidos a partir de dadores saudáveis podem ser isolados e colocados em contacto com C5a humana isolada na presença ou ausência de um anticorpo de teste anti-C5a. A ativação de neutrófilos humanos dependente de C5a pode ser medida em função da libertação de mieloperoxidase (MPO) das células na presença de C5a. Uma inibição da quantidade de MPO libertada das células na presença de C5a e do anticorpo de teste, em comparação com a quantidade de MPO libertada das células na presença de C5a e de um anticorpo de controlo, indica que o anticorpo de teste inibe a ativação de neutrófilos mediada por C5a.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste não inibe (ou não inibe substancialmente) a atividade do componente do complemento C5, em comparação com o nivel de inibição observado (se alguma) através de um anticorpo de controlo correspondente ou fragmento de ligação ao antigénio deste (i.e., um anticorpo que não se liga a C5a livre ou CS) . A atividade de C5 pode ser medida em função da sua capacidade de lise celular nos fluidos corporais de um sujeito. A capacidade de lise celular, ou uma redução desta, de C5 pode ser medida através de métodos bem conhecidos na técnica tais como, por exemplo, através de um ensaio hemolitico convencional tal como o ensaio hemolitico descrito por Rabat e Mayer (eds), "Experimental Immunochemistry, 2nd Edition", 135-240, Springfield, IL, CC Thomas (1961), páginas 135-139, ou uma variação convencional desse ensaio tal como o método de hemólise de eritrócitos de galinha tal como descrito, p. ex., em Hillmen et al. (2004) N. Engl. J. Med. 350(6):552.
Nalguns aspetos da divulgação, a atividade de C5, ou inibição desta, é quantificada utilizando um ensaio de CH50eq. 0 ensaio de CH50eq é um método para medir a atividade total clássica do complemento no soro. Este teste é um ensaio litico, que utiliza eritrócitos sensibilizados com anticorpo como ativador da via clássica do complemento e várias diluições do soro de teste para determinar a quantidade necessária para dar 50% de Use (CH50) . A percentagem de hemólise pode ser determinada, por exemplo, utilizando um espectrofotómetro. O ensaio de CH50eq proporciona uma medida indireta da formação do complexo terminal do complemento (TCC), uma vez que os TCC são em si mesmos diretamente responsáveis pela hemólise que é medida. O ensaio é bem conhecido e praticado pelos peritos na técnica. Resumidamente, para ativar a via clássica do complemento, amostras de soro não diluído (p. ex., amostras de soro humano) são adicionadas a poços de microensaio contendo os eritrócitos sensibilizados com anticorpo para deste modo gerar TCC. Em seguida, os soros ativados são diluídos em poços de microensaio, que são revestidos com um reagente de captura (p. ex., um anticorpo que se liga a um ou mais componentes do TCC) . O TCC presente nas amostras ativadas liga-se aos anticorpos monoclonais que revestem a superfície dos poços de microensaio: Os poços são lavados e, a cada poço, é adicionado um reagente de deteção que é marcado de forma detetável e reconhece o TCC ligado. O marcador detetável pode ser, p. ex., um marcador fluorescente ou um marcador enzimático. Os resultados do ensaio são expressos em equivalentes de unidades de CH50 por mililitro (U Eq CH50/mL). Métodos adicionais para deteção e/ou medição da atividade de C5 in vitro são expostos e exemplificados nos exemplos de trabalho.
Nalguns aspetos da divulgação, a ligação de um anticorpo a C5a pode inibir a interação entre C5a e C5aRl. Os métodos adequados para deteção e/ou medição da interação entre C5a e C5aRl (na presença e ausência de um anticorpo) são conhecidos na técnica e descritos, p. ex., em Mary e Boulay (1993) Eur. J. Haematol. 51 (5) :282-287; Kaneko et al. (1995) Immunology 86 (1) : 149-154; Giannini et al. (1995) J. Biol. Chem. 270 (32) : 19166-19172; e Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 20060160726. Por exemplo, a ligação da C5a marcada de forma detetável (p. ex., marcada radioativamente) a células mononucleares do sangue periférico expressando C5aRl pode ser avaliada na presença e ausência de um anticorpo. Uma diminuição da quantidade de C5a marcada de forma detetável que se liga a C5aRl na presença do anticorpo, em comparação com a quantidade que se liga na ausência do anticorpo, é uma indicação de que o anticorpo inibe a interação entre C5a e C5aRl.
Nalguns aspetos da divulgação, a ligação de um anticorpo a C5a pode inibir a interação entre C5a e C5L2. Os métodos para deteção e/ou medição da interação entre C5a e C5L2 são conhecidos na técnica e descritos, p. ex., em Ward (2009) J. Mol. Med. 87(4):375-378 e Chen et al. (2007) Nature 446(7132):203-207. Métodos adicionais para avaliar o efeito biológico de um anticorpo anti-C5a aqui descrito são exemplificados nos exemplos de trabalho abaixo.
Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo anti-C5a liga-se especificamente a uma proteína C5a componente do complemento humano (p. ex., a proteína C5a humana possuindo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:l ou SEQ ID NO:2) . Os termos "ligação específica", "liga-se especificamente", e termos gramaticamente semelhantes, tal como aqui utilizado, refere-se a duas moléculas formando um complexo (p. ex., um complexo entre um anticorpo e uma proteína C5a componente do complemento) que é relativamente estável sob condições fisiológicas. Tipicamente, a ligação é considerada específica quando a constante de associação (ka) é superior a 106 M1s_1. Assim, um anticorpo pode ligar-se especif icamente a uma proteína C5a com uma ka de pelo menos (ou mais de) 106 (p. ex., pelo menos ou superior a ΙΟ7, ΙΟ8, ΙΟ9, ΙΟ10, ΙΟ11, ΙΟ12, ΙΟ13, 1014, ou 1015 ou mais) M~ 1s_1. Nalgumas formas de realização, um anticorpo anti-C5a aqui descrito tem uma constante de dissociação (kd) de menos de, ou igual a, IO-3 (p. ex., 8χ10-4, 5χ104, 2χ10-4, IO'4; ou ΙΟ'5) s"1.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a aqui descrito tem uma Kd de menos de ΙΟ-8, ΙΟ-9, ΙΟ-10, IO-11, ou ΙΟ-12 Μ. A constante de equilíbrio Kd é a razão das constantes de velocidades cinéticas - kd/ka. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a aqui descrito tem uma Kd de menos de 1,25^10-9 M. Exemplos de anticorpos anti-C5a que se ligam a C5a com uma Kd que é inferior a l,25xl0-9 M incluem, p. ex., os anticorpos anti-C5a BNJ364, BNJ367, BNJ371, BNJ378, BNJ366, BNJ369, BNJ381, e BNJ383.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a aqui descrito tem uma Kd de menos de ΙχΙΟ-9 M. Exemplos de anticorpos anti-C5a que se ligam a C5a com uma KD que é inferior a IO-9 M incluem, p. ex., os anticorpos anti-C5a BNJ364, BNJ367, BNJ378, BNJ366, BNJ369, BNJ381, e BNJ383.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a aqui descrito tem uma Kd de menos de 5χ10-10 M. Exemplos de anticorpos anti-C5a que se ligam a C5a com uma Kd que é inferior a 5><10“10 M incluem, p. ex., os anticorpos anti-C5a BNJ367, BNJ378, BNJ366, BNJ369, BNJ381, e BNJ383.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a aqui descrito tem uma Kd de menos de 2χ10-10 M. Exemplos de anticorpos anti-C5a que se ligam a C5a com uma Kd que é inferior a 2χ10“10 M incluem, p. ex., os anticorpos anti-C5a BNJ367, BNJ366, BNJ369, BNJ381, e BNJ383.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a aqui descrito tem uma Kd de menos de ΙχΙΟ-10 M. Exemplos de anticorpos anti-C5a que se ligam a C5a com uma Kd que é inferior a ΙχΙΟ-10 M incluem, p. ex., os anticorpos anti-C5a BNJ369, BNJ381, e BNJ383.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a aqui descrito tem uma Kd de menos de 7,5χ10-11 M. Exemplos de anticorpos anti-C5a que se ligam a C5a com uma Kd que é inferior a 7,5χ10-11 M incluem, p. ex., os anticorpos anti-C5a BNJ369 e BNJ383. Métodos para determinação da afinidade de um anticorpo para um antigénio proteico são conhecidos na técnica. Por exemplo, a afinidade de um anticorpo para um antigénio proteico pode ser quantificada utilizando uma variedade de técnicas tais como, mas não limitadas a, Western blot, dot blot, Interferometria de Biocamadas, método de Ressonância de Plasmão de Superfície (SPR) (p. ex., sistema BIAcore; Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, N.J.), ou ensaios imunoespecíficos ligados a enzima (ELBA). Ver, p. ex., Harlow e Lane (1988) "Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, N.Y.; Benny K. C. Lo (2004) "Antibody Engineering: Methods and Protocols", Humana Press (ISBN: 1588290921); Borrebaek (1992) "Antibody Engineering, A Practical Guide", W.H: Freeman, e Co., NY; Borrebaek (1995) "Antibody Engineering", 2a Edição, Oxford University Press, NY, Oxford; Johne et al. (1993) Immunol. Meth. 160:191-198; Jonsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; e Jonsson et al. (1991) Biotechniques 11:620-627.
Qualquer um dos conjuntos de CDR de cadeia leve ou regiões variáveis de cadeia leve aqui descritos pode ser emparelhado com qualquer um dos conjuntos de CDR de cadeia pesada ou regiões variáveis de cadeia pesada aqui descritos. Está bem dentro do alcance do perito na técnica, p. ex., confirmar (testar) que um anticorpo anti-C5a gerado através de um tal emparelhamento possui a afinidade ou atividade desejada. Os métodos adequados para confirmação da atividade e/ou afinidade de um anticorpo anti-C5a são aqui descritos.
Nalguns aspetos da divulgação, os anticorpos anti-C5a aqui descritos ligam-se tanto à C5a humana (hC5a) como à C5a de um mamífero não humano tal como um primata não humano (p. ex., macaco cinomolgo). Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito não se liga a parálogos da C5a humana tais como C3a ou C4a da mesma espécie de mamífero não humano.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito liga-se a hC5a livre e à proteína C5a de macaco cinomolgo compreendendo, ou consistindo, na seguinte sequência de aminoácidos: MLQEKIEEJAAKYKHLVVKK CCYDGVRINH DETCEQRAAR ISVGPRCVKA FTECCVVASQLRANNSHKDLQLGR (SEQ ID NO:179). Nalguns aspetos das divulgações, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito liga-se a hC5a livre e a uma proteína C5a de macaco rhesus compreendendo, ou consistindo, na sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:179.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antigénio deste, pode ligar-se a uma forma desarginada da proteína C5a de uma espécie de mamífero não humano (p. ex., uma espécie de primata não humano) . Por exemplo, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste pode ligar-se a uma proteína C5a desarg livre de macaco cinomolgo ou macaco rhesus, a proteína compreendendo, ou consistindo, na seguinte sequência de aminoácidos: MLQEKIEEIAAKYKHLVVKK CCYDGVRINH DETCEQRAAR ISVGPRCVKA FTECCVVASQLRANNSHKDLQLG (SEQ ID NO:180).
Nalguns aspetos da divulgação, os anticorpos anti-C5a aqui descritos ligam-se à C5a de ratinho (i.e., a C5a livre de ratinho). Nalguns aspetos da divulgação, os anticorpos anti-C5a aqui descritos ligam-se à C5a de ratinho, mas não à C5a humana. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a aqui descrito não se liga à C5 de ratinho nativa, não clivada (totalmente dobrada). Nalguns aspetos das divulgações, um anticorpo anti-C5a descrito não se liga a parálogos de C5a de ratinho tais como C3a de ratinho ou C4a de ratinho.
Um anticorpo anti-5a de ratinho, ou um fragmento de ligação ao antigénio deste, pode ligar-se a uma proteína C5a de ratinho compreendendo, ou consistindo, na seguinte sequência de aminoácidos: LRQKIEEQAAKYKHSVPKKCCYDGARVNFYETCEERVARVTIGPLCIRAFNECCTIANK IRKESPHKPVQLGR (SEQ ID N0:51). Ver também, p. ex., Wetsel et al. (1987) Biochem 26:737-743. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-5a de ratinho, ou um fragmento de ligação ao antigénio deste, pode ligar-se a uma forma desarginada da proteína C5a de ratinho compreendendo, ou consistindo, na seguinte sequência de aminoácidos: LRQKIEEQAAKYKHSVPKKCCYDGARVNFYETCEERVARVTIGPLCIRAFNECCTIANK IRKESPHKPVQLG (SEQ ID NO:52). Nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo anti-5a de ratinho liga-se tanto à proteína C5a de ratinho inteira como à forma desarginada da proteína C5a de ratinho.
Um anticorpo anti-5a de ratinho aqui descrito pode, p. ex., conter um conjunto de CDR de cadeia leve obtido a partir de um polipéptido da região variável de cadeia leve compreendendo a seguinte sequência de aminoácidos: EIVLTQSPAIMSASLGEKVTMSCRASSSVNYTYWYQQKSDASPKLWIYYTSNLAPGVPA RFSGSGSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQQFTSSPLTFGVGTKLELKR (SEQ ID NO:53). Por exemplo, um anticorpo anti-5a de ratinho pode conter: (i) uma CDRl de cadeia leve definida por Rabat compreendendo, ou consistindo, na seguinte sequência de aminoácidos: RASSSVNYIY (SEQ ID NO:54); (ii) uma CDR2 de cadeia leve definida por Rabat compreendendo, ou consistindo, na seguinte sequência de aminoácidos: YTSNLAP (SEQ ID NO:55); e/ou (iii) uma CDR3 de cadeia leve definida por Rabat compreendendo, ou consistindo, na seguinte sequência de aminoácidos: QQFTSSPLT (SEQ ID NO:56). 0 anticorpo anti-5a de ratinho pode conter uma região constante de cadeia leve, p. ex., uma região constante de cadeia leve capa de ratinho compreendendo, ou consistindo, na seguinte sequência de aminoácidos: ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQD SKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNKNEC (SEQ ID NO:57).
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-5a de ratinho aqui descrito pode conter um péptido sinal amino-terminal, p. ex., um péptido sinal compreendendo, ou consistindo, na seguinte sequência de aminoácidos: MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO:58).
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-5a de ratinho aqui descrito pode conter um polipéptido de cadeia leve compreendendo, ou consistindo, na seguinte sequência de aminoácidos: REIVLTQSPAIMSASLGEKVTMSCRASSSVNYIYWYQQKSDASPKLWIYYTSNLAPGVP ARFSGSGSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQQFTSSPLTFGVGTKLELKRADAAPTVSIF PPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSS TLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:59) ou MGWSCIILFLVATATGVHSREIVLTQSPAIMSASLGEKVTMSCRASSSVNYIYWYQQKS DASPKLWIYYTSNLAPGVPARFSGSGSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQQFTSSPLTFG VGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNG VLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:60). Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-5a de ratinho aqui descrito contém um polipéptido de cadeia leve compreendendo os aminoácidos 2 a 214 de SEQ ID NO:59. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-5a de ratinho aqui descrito contém um polipéptido de cadeia leve compreendendo os aminoácidos 1 a 19 e 21 a 233 de SEQ ID NO:60.
Um anticorpo anti-5a de ratinho aqui descrito pode conter, p. ex., um conjunto de CDR de cadeia pesada obtido a partir de um polipéptido de região variável de cadeia pesada compreendendo a seguinte sequência de aminoácidos: LEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYYINWVKQSHGKSLEWIGYIYPNDGD TNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARPYYSDYGMDYWGQGTSVT VSS (SEQ ID NO: 61) . Por exemplo, um anticorpo anti-C5a de ratinho pode conter: (i) uma CDRl de cadeia pesada definida por Rabat compreendendo, ou consistindo, na seguinte sequência de aminoácidos: DYYYIN (SEQ ID NO:62); (ii) uma CDR2 de cadeia pesada definida por Rabat compreendendo, ou consistindo, na seguinte sequência de aminoácidos: YIYPNDGDTNYNQRFRG (SEQ ID NO: 63); e/ou (iii) uma CDR3 de cadeia pesada definida por Rabat compreendendo, ou consistindo, na seguinte sequência de aminoácidos: PYYSDYGMDY (SEQ ID NO:64). 0 anticorpo anti-5a de ratinho pode conter uma região constante de cadeia pesada. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-5a de ratinho aqui descrito pode conter um péptido sinal amino-terminal, p. ex., um péptido sinal compreendendo, ou consistindo, na seguinte sequência de aminoácidos: MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ IDNO:65).
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a de ratinho aqui descrito pode conter um polipéptido de cadeia pesada compreendendo, ou consistindo, na seguinte sequência de aminoácidos: LEVQLQQSGPELVRPGASVRISCRASGYTFTDYYYINWVRQSHGRSLEWIGYIYPNDGD TNYNQRFRGRATLTVDRSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARPYYSDYGMDYWGQGTSVT VSS (SEQ ID NO:66) ou MGWSCIILFLVATATGVHSLEVQLQQSGPELVRPGASVRISCRASGYTFTDYYYINWVR QSHGRSLEWIGYIYPNDGDTNYNQRFRGRATLTVDRSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCA RPYYSDYGMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:67). Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a de ratinho aqui descrito contém um polipéptido de cadeia pesada compreendendo os aminoácidos 2 a 121 de SEQ ID NO: 66. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a de ratinho aqui descrito contém um polipéptido de cadeia pesada compreendendo os aminoácidos 1 a 19 e 21 a 140 de SEQ ID NO: 67. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a de ratinho aqui descrito contém um polipéptido da região constante de cadeia pesada compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos a partir da sequência acima descrita.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a de ratinho aqui descrito contém um polipéptido de cadeia leve compreendendo: (i) uma CDRl de cadeia leve compreendendo, ou consistindo, na sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 54; (ii) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo, ou consistindo, na sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 55; e (iii) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo, ou consistindo, na sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 56; (iv) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo, ou consistindo, na sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 62; (v) uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo, ou consistindo, na sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:63; e/ou (vi) uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo, ou consistindo, na sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:64.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a de ratinho aqui descrito contém um polipéptido de cadeia leve compreendendo, ou consistindo, na sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:59 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo, ou consistindo, na sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:66.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a aqui descrito pode ligar-se a C5a humana e a C5a de ratinho. Métodos para a Produção dos Anticorpos Anti-C5a e Fragmentos de Ligação ao Antigénio Destes A divulgação apresenta também métodos para produção de qualquer um dos anticorpos anti-C5a ou fragmentos de ligação ao antigénio destes aqui descritos. Nalguns aspetos da divulgação, os métodos para preparação de um anticorpo aqui descrito podem incluir imunização de um sujeito (p. ex., um mamífero não humano) com um imunogénio apropriado. Imunogénios adequados para a geração de qualquer um dos anticorpos aqui descritos são expostos aqui. Por exemplo, para gerar um anticorpo que se ligue a C5a, um perito pode imunizar um sujeito adequado (p. ex., um mamífero não humano tal como um rato, um ratinho, um gerbilo, um hamster, um cão, um gato, um porco, uma cabra, um cavalo, ou um primata não humano) com um polipéptido C5a inteiro tal como um polipéptido C5a inteiro compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID N0:1 ou a forma desarginada de C5a (p. ex., a C5a humana desarg compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:2). Nalguns aspetos da divulgação, o mamífero não humano é deficiente para C5, p. ex., um ratinho deficiente para C5 descrito em, p. ex., Levy e Ladda (1971) Nat. New Biol. 229 (2):51-52; Crocker et ai. (1974) J. Clin. Pathol. 27(2):122-124; Wetsel et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:2435-2440; e Jungi e Pepys (1981) Immunology 43(2):271-279. A C5a humana pode ser purificada a partir de soro humano tal como descrito em, p. ex., McCarthy e Henson (1979) J. Immunol. 123(6):2511-2517 e Manderino et al. (1982) J. Immunol. Methods 53(1):41-50. Ver também os exemplos de trabalho. A C5a humana pode também ser gerada in vitro tal como descrito em, p. ex., Vallota e Muller-Eberhard (1973) J. Exp. Med. 137:1109. C5a humana purificada está também comercialmente disponível em, p. ex., Complement Technology, Inc. (número de catálogo A144; Tyler, Texas). C5a recombinante pode também ser gerada por um vulgar perito na técnica tal como descrito, p. ex., em Tothe et al. (1994) Prot. Sei. 3:1159-1168.
Um sujeito adequado (p. ex., um mamífero não humano) pode ser imunizado com o antigénio apropriado juntamente com imunizações de reforço subsequentes um número de vezes suficiente para desencadear a produção de um anticorpo pelo mamífero. O imunogénio pode ser administrado a um sujeito (p. ex., a mamífero não humano) com um adjuvante. Adjuvantes úteis na produção de um anticorpo num sujeito incluem, mas não estão limitados a, adjuvantes proteicos; adjuvantes bacterianos, p. ex., bactérias inteiras (BCG, Corynehacterium parvum ou Salmonella minnesota) e componentes bacterianos incluindo esqueleto da parede celular, dimicolato de trealose, monofosforil-lípido A, resíduo extraível com metanol (MER) do bacilo da tuberculose, adjuvante completo ou incompleto de Freund; adjuvantes virais; adjuvantes químicos, p. ex., hidróxido de alumínio, e iodoacetato e hemissuccinato de colesterilo. Outros adjuvantes que podem ser utilizados nos métodos para indução de uma resposta imunitária incluem, p. ex., toxina da cólera e proteínas de parapoxvírus. Ver também Bieg et al. (1999) Autoimmunity 31(1):15-24. Ver também, p. ex., Lodmell et al. (2000) Vaccine 18:1059-1066; Johnson et al. (1999) J. Med. Chem. 42:4640-4649; Baldridge et al. (1999)
Methods 19:103-107; e Gupta et al. , (1995) Vaccine 13(14): 1263-1276.
Nalguns aspetos da divulgação, os métodos incluem a preparação de uma linha celular de hibridoma que segregue um anticorpo monoclonal que se ligue ao imunogénio. Por exemplo, um mamífero adequado tal como um ratinho de laboratório é imunizado com um polipéptido C5a tal como descrito acima. Células produtoras de anticorpo (p. ex., células B do baço) do mamífero imunizado podem ser isoladas dois a quatro dias após pelo menos uma imunização de reforço do imunogénio e depois criadas brevemente em cultura antes da fusão com células de uma linha celular de mieloma adequada. As células podem ser fundidas na presença de um promotor de fusão tal como, p. ex., vírus vacínia ou polietilenoglicol. As células híbridas obtidas na fusão são clonadas, e os clones celulares segregando os anticorpos desejados são selecionados. Por exemplo, células do baço de ratinhos Balb/c imunizados com um imunogénio adequado podem ser fundidas com células da linha celular de mieloma PAI ou a linha celular de mieloma Sp2/0-Ag 14. Após a fusão, as células são expandidas em meio de cultura adequado, que é suplementado com um meio de seleção, por exemplo meio HAT, a intervalos regulares para impedir que as células de mieloma normais cresçam mais que as células de hibridoma desejadas. As células híbridas obtidas são então rastreadas quanto a secreção dos anticorpos desejados, p. ex., um anticorpo que se liga a C5a e inibe a interação entre C5a e um receptor de C5a (p. ex., C5aRl).
Nalguns aspetos da divulgação, um perito pode identificar um anticorpo anti-C5a a partir de uma biblioteca sem tendência imunitária tal como descrito, p. ex., na patente U.S. no. 6, 300,064 (para Knappik et al.; Morphosys AG) e
Schoonbroodt et al., (2005) Nucleic Acids Res. 33(9) :e81.
Nalguns aspetos da divulgação, os métodos aqui descritos podem envolver, ou ser utilizados em conjunto com, p. ex., tecnologias de apresentação fágica, apresentação bacteriana, apresentação à superfície de leveduras, apresentação em vírus de eucariotas, apresentação em células de mamífero, e técnicas de pesquisa de anticorpos sem células (p. ex., apresentação em ribossomas) (ver, p. ex., Etz et al. (2001) J. Bacteriol. 183:6924-6935; Comelis (2000) Curr. Opin. Biotechnol. 11:450-454; Klemm et al. , (2000) Microbiology 146:3025-3032; Kieke et al., (1997) Protein Eng. 10:1303-1310; Yeung et al., (2002) Biotechnol.
Prog. 18:212-220; Boder et al. (2000) Methods Enzymology 328:430-444; Grabherr et al. (2001) Comb. Chem. High. Throughput Screen 4:185-192; Michael et al., (1995) Gene Ther. 2:660-668; Pereboev et al. (2001) J. Virol. 75:7107-7113; Schaffitzel et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:119-135; e Hanes et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18 :1287-1292) .
Os métodos para identificação de anticorpos utilizando vários métodos de apresentação fágica são conhecidos na técnica. Nos métodos de apresentação fágica, os domínios funcionais do anticorpo são apresentados à superfície de partículas fágicas que transportam as sequências polinucleotídicas que as codificam. Tais fagos podem ser utilizados para apresentação de domínios de ligação ao antigénio de anticorpos, tais como Fab, Fv, ou fragmentos de anticorpo Fv estabilizados com ligações dissulfureto, expressos a partir de um repertório ou biblioteca combinatória de anticorpos (p. ex., humana ou de murideo). Os fagos utilizados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos tais como fd e M13. Os domínios de ligação ao antigénio são expressos como uma proteína fundida de forma recombinante a qualquer uma das proteínas de revestimento dos fagos pill, pVIII, ou pIX. Ver, p. ex., Shi et al. (2010) JMB 397:385-396. Exemplos de métodos de apresentação fágica que podem ser utilizados para produzir as imunoglobulinas, ou fragmentos destas, aqui descritos incluem os divulgados em Brinkman et al. (1995) J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al. (1995) J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al. (1997) Gene 187:9-18; Burton et al. (1994) Advances in Immunology 57:191-280; e publicações PCT nos. WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, e WO 95/20401. Os métodos adequados são também descritos, p. ex., nas patentes U.S. nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 e 5, 969, 108 .
Nalguns aspetos da divulgação, as bibliotecas de apresentação fágica de anticorpos podem ser geradas utilizando ARNm colhido a partir de células B dos mamíferos imunizados. Por exemplo, uma amostra de esplenócitos compreendendo células B pode ser isolada de ratinhos imunizados com polipéptido C5a tal como descrito acima. O ARNm pode ser isolado das células e convertido em ADNc utilizando técnicas de biologia molecular padrão. Ver, p. ex., Sambrook et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Harlow e Lane (1988), supra; Benny K. C. Lo (2004), supra; e Borrebaek (1995), supra. O ADNc codificando para as regiões variáveis dos polipéptidos da cadeia pesada e cadeia leve das imunoglobulinas é utilizado para construir a biblioteca de apresentação fágica. Os métodos para a geração de uma tal biblioteca são descritos, p. ex., em Merz et al. (1995) J. Neurosci. Methods 62 (1-2) : 213-9; Di Niro et al., (2005) Biochem. J. 388 (Pt3) : 889-894; e Engberget al. (1995) Methods Mol. Biol. 51:355-376.
Nalguns aspetos da divulgação, uma combinação de seleção e pesquisa pode ser empregue para identificar um anticorpo de interesse, p. ex., uma população de anticorpos derivados de hibridoma ou uma biblioteca de anticorpos de apresentação fágica. Métodos adequados são conhecidos na técnica e são descritos, p. ex., em Hoogenboom (1997) Trends in Biotechnology 15:62-70; Brinkman et al. (1995), supra; Ames et al., (1995), supra; Kettleborough et al. (1994), supra; Persic et al. (1997), supra; e Burton et al. (1994), supra. Por exemplo, uma pluralidade de vetores fagomidicos, cada um codificando uma proteína de fusão de uma proteína de revestimento de bacteriófagos (p. ex., pill, pVIII, ou pIX do fago M13) com uma região de combinação com o antigénio diferente é produzida utilizando técnicas padrão de biologia molecular e depois introduzida numa população de bactérias (p. ex., E. coll). A expressão do bacteriófago nas bactérias pode, nalgumas formas de realização, requerer a utilização de um fago ajudante. Nalgumas formas de realização, não é necessário fago ajudante (ver, p. ex., Chasteen et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34 (21) : el 45) . Ο fago produzido a partir das bactérias é recuperado e depois colocado em contato com, p. ex., um antigénio alvo ligado a um suporte sólido (imobilizado) . O fago pode também ser colocado em contacto com antigénio em solução, e o complexo ser subsequentemente ligado a um suporte sólido.
Nalguns aspetos da divulgação, os fagos imobilizados são os fagos de interesse. Por conseguinte, os fagos não ligados são removidos através de lavagem do suporte. Após o passo de lavagem, os fagos ligados são então eluídos do suporte sólido, p. ex., usando um tampão de pH baixo ou um competidor do antigénio alvo livre, e recuperados através da infeção de bactérias. Nalguns aspetos da divulgação, os fagos que não estão imobilizados são os fagos de interesse. Em tais aspetos da divulgação, a população de fagos pode ser colocada em contacto com o antigénio duas ou mais vezes para esgotar a população de qualquer fago que se ligue ao suporte. Os fagos não ligados são então colhidos e utilizados para subsequentes passos de pesquisa.
Para enriquecer a população de fagos em partículas fágicas que contêm anticorpos possuindo uma afinidade mais elevada para o antigénio alvo (reduzindo ao mesmo tempo a proporção de fagos que se podem ligar ao antigénio de forma não específica), o fago eluído (descrito acima) pode ser utilizado para reinfectar uma população de células hospedeiras bacterianas. Os fagos expressos são depois isolados a partir das bactérias e novamente colocados em contacto com um antigénio alvo. A concentração de antigénio, o pH, a temperatura e a inclusão de detergentes e adjuvantes durante o contacto podem ser modulados para enriquecer em fragmentos de anticorpo de maior afinidade. Os fagos não ligados são removidos através de lavagem do suporte sólido. 0 número de ciclos, a duração, o pH, a temperatura e a inclusão de detergentes e adjuvantes durante a lavagem podem ser modulados para enriquecer em fragmentos de anticorpo de maior afinidade. Após o passo de lavagem, os fagos ligados são então eluídos do suporte sólido. Podem ser utilizados entre um e seis ciclos iterativos de peneiração para enriquecer em fagos contendo anticorpos possuindo maior afinidade para o antigénio alvo. Nalgumas formas de realização, um passo de desseleção pode também ser realizado em conjunto com qualquer uma das abordagens aqui descritas.
Os fagos individuais da população podem ser isolados através da infeção de bactérias e depois plaqueamento a uma densidade que permita a formação de anticorpos monoclonais.
Por exemplo, para identificar utilizando técnicas de apresentação fágica um anticorpo que se ligue a C5a, mas não a C5, pode ser empregue a seguinte abordagem de peneiração. A população pode primeiro ser colocada em contacto com uma superfície contendo C5 humana nativa, inteira ligada. 0 processo pode ser repetido duas ou mais vezes, de cada vez colhendo o fago não ligado. A população pode também ser colocada em contacto com um suporte sólido contendo proteínas C4 e/ou C3 ligadas à superfície. Os fagos não ligados dos passos anteriores são então colocados em contacto com uma superfície contendo C5a ligada ou C5a desarginada. Os fagos que se ligam a C5a são eluídos da superfície e recuperados através da infeção de bactérias. Podem ser realizados ciclos iterativos de seleção em fagos. Após um a seis ciclos de seleção, os fagomídeos individuais recuperados podem ser rastreados quanto à expressão de fragmentos de anticorpo com a especificidade e afinidade desej adas.
Uma subpopulação de anticorpos pesquisados utilizando os métodos acima pode ser caracterizada quanto à sua especificidade e afinidade de ligação a uma determinada partícula (p. ex., C5a) utilizando qualquer método de base imunológica ou bioquímica conhecido na técnica. Por exemplo, a ligação específica de um anticorpo a C5a, em comparação com a C5 nativa inteira pode ser determinada por exemplo utilizando métodos de base imunológica ou bioquímica tais como, mas não limitados a, um ensaio ELISA, ensaios SPR, ensaio de imunoprecipitação, cromatografia de afinidade, e diálise em equilíbrio tal como descrito acima. Imunoensaios que podem ser utilizados para analisar a ligação imunoespecífica e a reatividade cruzada dos anticorpos incluem, mas não estão limitados a, sistemas de ensaio competitivos e não competitivos utilizando técnicas tais como Western blots, RIA, ELISA (ensaio imunossorvente ligado a enzimas), imunoensaios em "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação do complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes, e imunoensaios de proteína A. Tais ensaios são rotineiros e bem conhecidos na técnica.
Os anticorpos podem também ser ensaiados utilizando quaisquer ensaios baseados em SPR conhecidos na técnica para caracterização dos parâmetros cinéticos da interação do anticorpo com C5a. Qualquer instrumento de SPR disponível comercialmente, incluindo, mas não se limitando a, BIAcore Instruments (Biacore AB; Uppsala, Suécia); IAsys instruments (Afinidade Sensors; Franklin, Massachussetts); IBIS system (Windsor Scientific Limited; Berks, UK) , SPR-CELLIA systems (Nippon Laser and Electronics Lab; Hokkaido, Japan), e SPR Detector Spreeta (Texas Instruments; Dallas,
Texas), pode ser utilizado nos métodos aqui descritos. Ver, p. ex., Mullett et al. (2000) Methods 22:77-91; Dong et al. (2002) Reviews in Mol. Biotech. 82:303-323; Fivash et al. (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:97-101; e Rich et al., (2000) Curr. Opin. Biotechnol. 11:54-61.
Entende-se que os métodos acima podem também ser utilizados para determinar se, p. ex., um anticorpo anti-C5a não se liga ás proteínas C5, C3, e/ou C4 inteiras, nativas. Os métodos acima podem também ser utilizados para determinar se um anticorpo que se liga a C5a inibe também a interação entre C5a e um recetor de C5a. Os métodos acima podem também ser utilizados para determinar se um anticorpo que se liga a C5a inibe também a atividade de C5a.
Tal como descrito nas referências acima, após a seleção dos fagos, as regiões codificando o anticorpo do fago podem ser isoladas e utilizadas para gerar anticorpos inteiros, incluindo anticorpos humanos, ou quaisquer fragmentos desejados, e expressas em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamífero, células de inseto, células vegetais, leveduras e bactérias, p. ex., tal como descrito em detalhe abaixo. Por exemplo, as técnicas para produzir de modo recombinante fragmentos Fab, Fab' e F(ab')2 podem também ser empregues utilizando métodos conhecidos na técnica tais como os divulgados na publicação PCT no. WO 92/22324; Mullinax et al. (1992) BioTechniques 12(6):864-869; e Sawai et al. (1995) Am. J. Repr. Immunol. 34:26-34; e Better et al. (1988) Science 240:1041-1043. Exemplos de técnicas que podem ser utilizadas para produzir Fv de cadeia simples e anticorpos incluem os descritos nas patentes U.S. nos. 4,946,778 e 5,258,498; Huston et al. (1991) Methods in Enzymology 203:46-88; Shu et al. (1993)
Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:7995-7999; e Skerra et al. (1988) Science 240:1038-1040. A tecnologia de apresentação fágica pode também ser usada para, p. ex., aumentar a afinidade de um anticorpo para o seu antigénio cognato. A tecnologia, referida como maturação de afinidade, pode empregar mutagénese ou percurso de CDR e nova seleção para identificar anticorpos que se liguem com maior afinidade a um antigénio, em comparação com o anticorpo inicial ou parental. Ver, p. ex., Glaser et al. (1992) J. Immunol. 149:3903-3913. As bibliotecas podem ser construídas consistindo num banco de clones variantes, cada um diferindo em uma ou mais substituições de aminoácidos. Mutantes com maior afinidade de ligação para o antigénio podem ser selecionados através do contacto dos mutantes imobilizados com antigénio marcado ou qualquer combinação dos métodos descritos acima. Qualquer método de pesquisa conhecido na técnica pode ser usado para identificar anticorpos mutantes com maior afinidade para o antigénio (p. ex., técnicas de SPR ou ELISA).
Nalguns aspetos da divulgação, pode ser utilizado mapeamento de epitopos para identificar, p. ex., a região de C5a que interage com um anticorpo, p. ex., uma região de C5a que se liga a C5aRl. Os métodos para identificação do epitopo ao qual um determinado anticorpo se liga são também conhecidos na técnica e são descritos acima.
Os anticorpos e fragmentos destes aqui identificados podem ser ou podem ser tornados "quiméricos". Anticorpos quiméricos e fragmentos de ligação ao antigénio destes compreendem porções de duas ou mais espécies diferentes (p. ex., ratinho e humano). Os anticorpos quiméricos podem ser produzidos com regiões variáveis de ratinho de especificidade desejada fundidas com domínios constantes humanos (por exemplo, Patente U.S. No. 4,816,567). Deste modo, anticorpos não humanos podem ser modificados para os tornar mais adequados para aplicação clínica em humanos (p. ex., métodos para tratamento ou prevenção de um distúrbio mediado pelo complemento num sujeito).
Anticorpos monoclonais da presente divulgação incluem formas "humanizadas" dos anticorpos não humanos (p. ex., ratinho). mAb humanizados ou com CDR enxertadas são particularmente úteis como agentes terapêuticos para humanos porque não são eliminados da circulação tão rapidamente como os anticorpos de ratinho e tipicamente não provocam uma reação imunitária adversa. Em geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele de uma fonte não humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente referidos como resíduos de "importação", que são tipicamente retirados de um domínio variável de "importação". Os métodos de preparação de anticorpos humanizados são geralmente bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (ver, p. ex., Jones et al. , (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et ai. (1988) Nature 332:323-327; e Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), através da substituição de estruturas de roedor ou sequências de CDR pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Ver também, p. ex., Staelens et al. (2006) Mol. Immunol. 43:1243-1257. Nalgumas formas de realização, formas humanizadas de anticorpos não humanos (p. ex. , ratinho) são anticorpos humanos (anticorpos aceitadores) em que os resíduos de aminoácidos da região CDR do anticorpo não humano (p. ex., anticorpo de ratinho, rato, coelho, ou primata não humano) possuindo a especificidade, afinidade, e capacidade de ligação desejadas são enxertados na armação estrutural de um anticorpo humano. Métodos de humanização adicionais são descritos abaixo nos exemplos de trabalho.
Os métodos para enxerto de sequências de CDR de um anticorpo dador (p. ex., um anticorpo não humano) nas regiões estruturais de um anticorpo aceitador (p. ex., um anticorpo humano) são bem conhecidos na técnica e são descritos, p. ex., em Jones et ai. (1986) Nature 321:522-525; Verhoeyen et al. (1988) Science 239 (4847) : 1534-1536; Riechmann et al. , (1988) Nature 332:323-327; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:10029-10033; publicação PCT no. WO 93/011237; Kettleborough et al. (1991) Protein Engineering, Design and Selection 4:773-783; Benny K.C. Lo (2004) "Antibody Engineering: Methods and Protocols", Humana Press (ISBN: 1588290921); Borrebaek (1992) "Antibody Engineering, A Practical Guide", W.H. Freeman e Co., NY; e Borrebaek (1995) "Antibody Engineering", 2a Edição, Oxford University Press, NY, Oxford. Por exemplo, CDR de um anticorpo dador podem ser enxertadas em regiões estruturais de um anticorpo aceitador utilizando técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) de prolongamento de sobreposições tal como descrito, p. ex., em Daugherty et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19 ( 9) : 2471-2476; Roguska et al. (1996) Protein Engineering 9(10):895-904,- e Yazaki et al. (2004) Protein Engineering Design & Selection 17(5):481-489.
Em aspetos da divulgação onde as sequências de aminoácidos de CDR selecionadas são sequências curtas (p. ex., menos de 10-15 aminoácidos de comprimento), ácidos nucleicos codificando as CDR podem ser sintetizados quimicamente tal como descrito, p. ex., em Shiraishi et ai. (2007) Nucleic Acids Symposium Series 51(1):129-130 e Patente U.S. No. 6,995,259. Para uma dada sequência de ácido nucleico codificando um anticorpo aceitador, a região da sequência de ácido nucleico codificando as CDR pode ser substituída com os ácidos nucleicos quimicamente sintetizados utilizando técnicas padrão de biologia molecular. As extremidades 5' e 3' dos ácidos nucleicos quimicamente sintetizados podem ser sintetizadas para compreender locais de enzimas de restrição de extremidades coesivas para utilização em clonagem dos ácidos nucleicos no ácido nucleico codificando a região variável do anticorpo dador.
Nalguns casos, um ou mais resíduos de aminoácidos da região estrutural da imunoglobulina humana são também substituídos por resíduos de aminoácido correspondentes do anticorpo não humano (as chamadas "retromutações")· Além disso, bibliotecas de apresentação fágica podem ser utilizadas para variar os aminoácidos em posições escolhidas dentro da sequência do anticorpo. As propriedades de um anticorpo humanizado são também afetadas pela escolha da estrutura humana. Além disso, os anticorpos humanizados e quimerizados podem ser modificados para compreender resíduos que não se verificam no anticorpo aceitador nem no anticorpo dador para melhorar mais as propriedades do anticorpo, tais como, por exemplo, a afinidade ou a função efetora.
Anticorpos totalmente humanos são também proporcionados na divulgação. 0 termo "anticorpo humano" inclui anticorpos possuindo regiões variáveis e constantes (se presentes) derivadas de sequências de imunoglobulina humanas, de preferência sequências da linha germinativa humana. Os anticorpos humanos podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana (p. ex., mutações introduzidas através de mutagénese aleatória ou específica do local in vitro ou através de mutação somática in vivo) . No entanto, o termo "anticorpo humano" não inclui anticorpos em que as sequências CDR derivadas de uma outra espécie de mamífero, tal como um ratinho, foram enxertadas em sequências estruturais humanas (ou seja, anticorpos humanizados). Os anticorpos humanos ou totalmente humanos podem ser derivados de ratinhos transgénicos portadores de genes de anticorpos humanos (transportando os exões variável (V), de diversidade (D) , de união (J) e constante (C) ) ou a partir de células humanas. Por exemplo, é agora possível produzir animais transgénicos (p. ex., ratinhos) que sejam capazes, após imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Ver, p. ex., Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:2551; Jakobovits et al. (1993) Nature 362:255-258; Bruggemann et al. (1993) Year in Immunol. 7:33; e Duchosal et al. (1992) Nature 355:258. Estirpes de ratinhos transgénicos podem ser modificadas para conter sequências génicas de genes de imunoglobulinas humanas não rearranjadas. Um exemplo de um tal ratinho é o HuMAb Mouse® (Medarex, Inc.), que contém miniloci de transgenes de imunoglobulina humana que codificam as sequências de imunoglobulina não rearranjadas da cadeia pesada μ e da cadeia leve κ humanas, juntamente com mutações alvo que inativam os loci da cadeia μ e κ endógenas. Ver, p. ex., Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474):856-859. A preparação e utilização de ratinhos HuMab, e as modificações genómicas transportadas por tais ratinhos, são ainda descritas em Taylor et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:1 17-123; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor et al. (1994) International Immunology 6:579-591; e Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:845-851. Um sistema de ratinho transgénico alternativo para expressão de genes de imunoglobulina humana é referido como XenoMouse (Abgenix, Inc.) e é descrito, p. ex., nas patentes U.S. nos. 6, 075, 181; 6,114,598; 6,150,584; e 6,162,963. Tal como o sistema HuMAb Mouse®, o sistema de Xenomouse envolve a rutura dos genes da cadeia pesada e leve endógenas de ratinho e a inserção no genoma do ratinho de transgenes transportando loci de cadeia pesada e leve de imunoglobulina humana não rearranjados que contêm sequências de região variável e constante humanas. Outros sistemas conhecidos na técnica para expressão de genes de imunoglobulina humana incluem o sistema KM Mouse®, descrito em detalhe na Publicação PCT WO 02/43478 e o sistema ratinho TC descrito em Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727.
As sequências humanas podem codificar tanto para as cadeias pesadas como para as cadeias leves de anticorpos humanos e funcionarão corretamente nos ratinhos, sofrendo rearranjo para proporcionar um amplo repertório de anticorpos semelhante ao dos humanos. Os ratinhos transgénicos podem ser imunizados com o imunogénio proteico alvo para criar uma matriz diversa de anticorpos específicos e o seu ARN de codificação. Os ácidos nucleicos codificando os componentes das cadeias de anticorpo de tais anticorpos podem então ser clonados a partir do animal para um vetor de apresentação. Tipicamente, populações separadas de ácidos nucleicos codificando sequências de cadeias pesadas e leves são clonadas, e as populações separadas são então recombinadas ao inserir no vetor, de modo a que qualquer dada cópia do vetor receba uma combinação aleatória de uma cadeia pesada e uma leve. 0 vetor é desenhado para expressar cadeias de anticorpo de modo a que possam ser montadas e apresentadas na superfície externa de um pacote de apresentação contendo o vetor. Por exemplo, as cadeias de anticorpo podem ser expressas como proteínas de fusão com uma proteína de revestimento fágica da superfície externa do fago. Em seguida, os pacotes de apresentação podem ser selecionados e rastreados para apresentação de anticorpos que se ligam a um alvo.
Além disso, as bibliotecas de apresentação fágica pesquisadas acima podem incluir anticorpos humanos (Hoogenboom et al. , (1992) J. Mol. Biol. 222:581-597; e Vaughan et al., (1996) Nature Biotech. 14:309) . Podem ser criadas bibliotecas fágicas sintéticas que utilizam combinações aleatórias de regiões V sintéticas de anticorpo humano. Através da seleção do antigénio, podem ser preparados anticorpos totalmente humanos em que as regiões V são muito semelhantes às humanas na natureza. Ver, p. ex., Patentes U.S. Nos. 6,794,132; 6,680,209; 4,634,666; e Ostberg et al., (1983) Hybridoma 2:361-367.
Para a geração de anticorpos humanos, ver também Mendez et al. (1998) Nature Genetics 15: 146-156 e Green e Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188: 483-495.
Os anticorpos humanos são ainda discutidos e delineados nas Patentes U.S. Nos.: 5,939,598; 6,673,986; 6,114,598; 6,075,181; 6,162,963; 6,150,584; 6,713,610; e 6,657,103 bem como nas Publicações de Patente U.S. Nos. 20030229905 Al, 20040010810 Al, 20040093622 Al, 20060040363 Al, 20050054055 Al, 20050076395 Al, e 20050287630 Al. Ver também as Publicações Internacionais Nos. WO 94/02602, WO 96/34096, e WO 98/24893, e a Patente Europeia No. EP 0 463 151 Bl.
Numa abordagem alternativa, outros, incluindo GenPharm International, Inc., utilizaram uma abordagem de "minilocus". Na abordagem de minilocus, um locus de Ig exógeno é imitado através da inclusão de partes (genes individuais) do locus de Ig. Assim, um ou mais genes de Vh, um ou mais genes de Dh, um ou mais genes de Jh, uma região constante mu, e uma segunda região constante (de preferência uma região constante gama) são formados numa construção para inserção num animal. Esta abordagem é descrita, p. ex., nas Patentes U.S. Nos.: 5,545,807; 5,545,806; 5,625,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; 5,770,429; 5,789,650; e 5,814,318; 5,591,669; 5,612,205; 5,721,367; 5,789,215; 5,643,763; 5,569,825; 5,877,397; 6,300,129; 5,874,299; 6,255,458; e 7,041,871.
Ver também a Patente Europeia No. 0 546 073 Bl, as Publicações de Patente Internacional Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, e WO 98/24884 .
Ver ainda Taylor et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 6287; Chen et al., (1993) Int. Immunol. 5: 647; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3720-4; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 117; Lonberg et al. (1994) Nature 368: 856-859; Taylor et al. (1994) International Immunology 6:579-591; Tuaillon et al. (1995) J. Immunol. 154: 6453-65; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845; e Tuaillon et al. (2000) Eur. J. Immunol. 10: 2998-3005.
Em certos aspetos da divulgação, são proporcionadas formas desimunizadas dos anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antigénio aqui descritos. Anticorpos desimunizados ou fragmentos de ligação ao antigénio destes são anticorpos que foram modificados de modo a tornar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste não imunogénico, ou menos imunogénico, para uma dada espécie. A desimunização pode ser alcançada através da modificação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste utilizando qualquer uma de uma variedade de técnicas conhecidas dos peritos na técnica (ver, p. ex., Publicações PCT Nos. WO 04/108158 e WO 00/34317) . Por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste pode ser desimunizado através da identificação de potenciais epitopos de células T e/ou epitopos de células B dentro da sequência de aminoácidos do anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste, e da remoção de um ou mais dos potenciais epitopos de células T e/ou epitopos de células B do anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste, por exemplo, utilizando técnicas recombinantes. O anticorpo modificado ou fragmento de ligação ao antigénio deste pode então ser opcionalmente produzido e testado para identificar anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigénio destes que tenham mantido uma ou mais atividades biológicas desejadas, tais como, por exemplo, afinidade de ligação, mas tenham imunogenicidade reduzida. Os métodos para identificação de potenciais epitopos de células T e/ou epitopos de células B podem ser realizados utilizando técnicas conhecidas na área, tais como, por exemplo, métodos computacionais (ver p. ex., Publicação PCT No. WO 02/069232), técnicas in vitro ou in silico, e ensaios biológicos ou métodos físicos (tais como, por exemplo, determinação da ligação de péptidos a moléculas de MHC, determinação da ligação de complexos péptido:MHC aos recetores de células T da espécie a receber o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste, teste da proteína ou partes peptídicas desta utilizando animais transgénicos com as moléculas de MHC da espécie a receber o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste, ou teste com animais transgénicos reconstituídos com células do sistema imunitário da espécie a receber o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste, etc.). Em vários aspetos da divulgação, os anticorpos desimunizados aqui descritos incluem fragmentos de ligação ao antigénio desimunizados, Fab, Fv, scFv, Fab' e F(ab')2, anticorpos monoclonais, anticorpos de murídeo, anticorpos totalmente humanos, anticorpos modificados (tais como, por exemplo, anticorpos quiméricos, de cadeia simples, com CDR enxertada, humanizados, e selecionados artificialmente), anticorpos sintéticos e anticorpos semissintéticos.
Nos aspetos terapêuticos da presente divulgação, estão contemplados anticorpos biespecíficos. Anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais, de preferência humanos ou humanizados, possuindo especificidades de ligação para pelo menos dois antigénios diferentes. No presente caso, uma das especificidades de ligação é para C5a, a outra é para qualquer outro antigénio.
Os métodos para a produção de anticorpos biespecíficos estão dentro da competência dos peritos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecificos baseia-se na coexpressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina, em que os dois pares de cadeia pesada/cadeia leve têm especificidades diferentes (Milstein e Cuello (1983) Nature 305:537-539). Domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação anticorpo-antigénio) podem ser fundidos com sequências de domínios constantes de imunoglobulina. A fusão da região variável de cadeia pesada é de preferência com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo pelo menos parte das regiões charneira, Ch2, e Ch3. ADN codificando as fusões da cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina são inseridos em vetores de expressão separados, e são cotransfetados para um organismo hospedeiro adequado. Para mais detalhes de métodos atualmente conhecidos ilustrativos para geração de anticorpos biespecíficos ver, p. ex., Suresh et al. (1986) Methods in Enzymology 121:210; Publicação PCT No. WO 96/27011; Brennan et al. (1985) Science 229:81; Shalaby et al., J. Exp. Med. (1992) 175:217-225; Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148 (5) :1547-1553; Hollinger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448; Gruber et al. (1994) J. Immunol. 152:5368; e Tutt et al., (1991) J. Immunol. 147:60. Anticorpos biespecíficos incluem também anticorpos reticulados ou heteroconjugados. Os anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos utilizando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica, e são divulgados na Patente U.S. No. 4,676,980, juntamente com várias técnicas de reticulação. Várias técnicas para produção e isolamento de fragmentos de anticorpo biespecificos diretamente a partir de uma cultura de células recombinantes foram também descritas. Por exemplo, foram produzidos anticorpos biespecificos utilizando fechos de leucina. Ver, p. ex., Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148(5):1547-1553. Os péptidos com fecho de leucina das proteínas Fos e Jun podem ser ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes através de fusão génica. Os homodímeros de anticorpos podem ser reduzidos na região charneira para formar monómeros e depois reoxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpos. A tecnologia de "diacorpos" descrita por Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448 proporcionou um mecanismo alternativo para a produção de fragmentos de anticorpo biespecificos. Os fragmentos compreendem o domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) através de um ligador que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Por conseguinte, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, formando assim dois locais de ligação ao antigénio. Outra estratégia para a produção de fragmentos de anticorpo biespecificos através da utilização de dímeros de Fv de cadeia simples (scFv) foi também relatada. Ver, p. ex., Gruber et al. (1994) J. Immunol. 152:5368. Alternativamente, os anticorpos podem ser "anticorpos lineares" tal como descrito, p. ex., em Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062. Resumidamente, estes anticorpos compreendem um par de segmentos Fd em tandem (Vh-Ch1-Vh-Ch1) que formam um par de regiões de ligação ao antigénio. Os anticorpos lineares podem ser biespecificos ou monoespecificos.
Anticorpos com mais de duas valências (p. ex., anticorpos triespecificos) estão contemplados e descritos, p. ex., em Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60. A divulgação engloba também formas variantes de anticorpos multiespecificos tais como as moléculas de imunoglobulina de duplo dominio variável (DVD-Ig) descritas em Wu et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1290-1297. As moléculas de DVD-Ig são concebidas de modo a que dois domínios variáveis de cadeia leve (VL) diferentes de dois anticorpos parentais diferentes sejam ligados diretamente em tandem ou através de um curto ligador através de técnicas de ADN recombinante, seguido pelo dominio constante de cadeia leve. De forma semelhante, a cadeia pesada compreende dois domínios variáveis de cadeia pesada diferentes (VH) ligados em tandem, seguidos pelo domínio constante ChI e pela região Fc. Os métodos para a produção de moléculas de DVD-Ig a partir de dois anticorpos parentais são ainda descritos, p. ex., nas Publicações PCT Nos. WO 08/0241188 e WO 07/024715. A divulgação proporciona também anticorpos de camelídeos ou dromedários (p. ex., anticorpos derivados de Camelus bactrianus, Camelus dromaderius, ou Lama paccos) . Tais anticorpos, ao contrário dos típicos anticorpos de duas cadeias (fragmento) ou quatro cadeias (anticorpo completo) da maioria dos mamíferos, geralmente não têm cadeias leves. Ver patente U.S. no. 5,759,808; Stijlemans et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:1256-1261; Dumoulin et al., (2003) Nature 424:783-788; e Pleschberger et al. (2003) Bioconjugate
Chem. 14:440-448. Bibliotecas concebidas de anticorpos e fragmentos de anticorpo de camelídeos estão comercialmente disponíveis, por exemplo, em Ablynx (Ghent, Bélgica) . Tal como com outros anticorpos de origem não humana, uma sequência de aminoácidos de anticorpo de camelídeo pode ser alterada de forma recombinante para obter uma sequência que se assemelhe mais a uma sequência humana, i.e., o nanocorpo pode ser "humanizado" para deste modo reduzir mais a potencial imunogenicidade do anticorpo.
Nalguns aspetos da divulgação, os anticorpos anti-C5a aqui compreendem uma região constante de cadeia pesada alterada que tem reduzida (ou nenhuma) função efetora relativamente à sua correspondente região constante não alterada. As funções efetoras envolvendo a região constante do anticorpo anti-C5a podem ser moduladas através da alteração das propriedades da região constante ou Fc. Funções efetoras alteradas incluem, por exemplo, uma modulação numa ou mais das seguintes atividades: citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), citotoxicidade dependente do complemento (CDC), apoptose, ligação a um ou mais recetores de Fc, e respostas pró-inflamatórias. A modulação refere-se a um aumento, uma diminuição, ou uma eliminação de uma atividade de função efetora exibida por um anticorpo sujeito contendo uma região constante alterada em comparação com a atividade da forma inalterada da região constante. Em aspetos particulares da divulgação, a modulação inclui situações em que uma atividade é abolida ou está completamente ausente.
Uma região constante alterada com afinidade de ligação a
FcR alterada e/ou atividade de ADCC e/ou atividade de CDC alterada é um polipéptido que possui atividade de ligação a
FcR aumentada ou diminuída e/ou atividade de ADCC e/ou atividade de CDC em comparação com a forma inalterada da região constante. Uma região constante alterada que apresente ligação aumentada a um FcR liga-se a pelo menos um FcR com maior afinidade que o polipéptido inalterado. Uma região constante alterada que apresente ligação diminuída a FcR liga-se a pelo menos um FcR com afinidade inferior à da forma inalterada da região constante. Tais variantes que apresentam ligação diminuída a um FcR podem possuir pouca ou nenhuma ligação apreciável a um FcR, p. ex., 0 a 50% (p. ex., menos de 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1%) da ligação ao FcR em comparação com o nível de ligação de uma região constante ou Fc de imunoglobulina de sequência nativa ao FcR. De forma semelhante, uma região constante alterada que apresente atividade de ADCC e/ou CDC modulada pode exibir atividade de ADCC e/ou CDC aumentada ou reduzida em comparação com a região constante inalterada. Por exemplo, nalguns aspetos da divulgação, o anticorpo anti-C5a compreendendo uma região constante alterada pode exibir aproximadamente 0 a 50% (p. ex., menos de 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1%) da atividade de ADCC e/ou CDC da forma inalterada da região constante. Um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreendendo uma região constante alterada apresentando ADCC e/ou CDC reduzida pode exibir atividade de ADCC e/ou CDC reduzida ou nula tal como aqui exemplificado.
Em certos aspetos da divulgação, a região constante alterada tem pelo menos uma substituição, inserção, e/ou deleção de um aminoácido, em comparação com uma região constante de sequência nativa ou com a região constante inalterada, p. ex., de cerca de uma a cerca de uma centena de substituições, inserções, e/ou deleções de aminoácidos numa região constante de sequência nativa ou na região constante do polipéptido parental. Nalguns aspetos da divulgação, a região constante alterada aqui possuirá pelo menos cerca de 70% de homologia (semelhança) ou identidade com a região constante inalterada e nalguns casos pelo menos cerca de 75% e noutros casos pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade com ela, e noutras formas de realização pelo menos cerca de 85%, 90% ou 95% de homologia ou identidade com ela. A região constante alterada pode também conter uma ou mais deleções ou inserções de aminoácidos. Adicionalmente, a região constante alterada pode conter uma ou mais substituições, deleções, ou inserções de aminoácidos que resultem em modificações pós-tradução alteradas, incluindo, por exemplo, um padrão de glicosilação alterado (p. ex., a adição de um ou mais componentes açúcar, a perda de um ou mais componentes açúcar, ou uma mudança na composição de um ou mais componentes açúcar relativamente à região constante inalterada).
Anticorpos com funções efetoras alteradas ou nulas podem ser gerados através da concepção ou produção de anticorpos com regiões constantes, Fc, ou de cadeia pesada variantes; tecnologia de ADN recombinante e/ou cultura celular e condições de expressão podem ser utilizadas para produzir anticorpos com função e/ou atividade alteradas. Por exemplo, tecnologia de ADN recombinante pode ser utilizada para conceber uma ou mais substituições, deleções, ou inserções de aminoácidos em regiões (tais como, por exemplo, regiões Fc ou constantes) que afetem a função do anticorpo incluindo funções efetoras. Alternativamente, mudanças em modificações pós-tradução, tais como, p. ex., padrões de glicosilação, podem ser alcançadas através da manipulação da cultura celular e das condições de expressão através das quais o anticorpo é produzido. Os métodos adequados para introdução de uma ou mais substituições, adições, ou deleções numa região Fc de um anticorpo são bem conhecidos na técnica e incluem, p. ex., técnicas de mutagénese de ADN padrão tal como descrito, p. ex., em
Sambrook et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2a Edição", Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N.Y.; Harlow e Lane (1988), supra; Borrebaek (1992), supra; Johne et al. (1993), supra; publicação PCT no., WO 06/53301; e patente U.S. no. 7,704,497.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a aqui descrito exibe função efetora reduzida ou nula. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a compreende uma região constante híbrida, ou uma porção desta, tal como uma região constante híbrida G2/G4 (ver p. ex., Burton et al., (1992) Adv. Immun. 51:1-18; Canfield et al. (1991) J. Exp. Med. 173:1483-1491; e Mueller et al. (1997) Mol. Immunol. 34(6):441-452). Ver acima.
Para além da utilização de uma construção G2/G4 tal como descrito acima, um anticorpo anti-C5a aqui descrito possuindo reduzida função efetora pode ser produzido através da introdução de outros tipos de mudanças na sequência de aminoácidos de certas regiões do anticorpo.
Tais mudanças na sequência de aminoácidos incluem mas não estão limitadas à mutação Ala-Ala descrita em, p. ex., Publicações PCT nos. WO 94/28027 e WO 98/47531; e Xu et al., (2000) Cell Immunol. 200:16-26. Assim, nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a com uma ou mais mutações dentro da região constante incluindo a mutação Ala-Ala tem função efetora reduzida ou nula. De acordo com estes aspetos, a região constante do anticorpo pode compreender uma substituição numa alanina na posição 234 ou uma mutação numa alanina na posição 235. Adicionalmente, a região constante alterada pode conter uma mutação dupla: uma mutação numa alanina na posição 234 e uma segunda mutação numa alanina na posição 235. Num aspeto da divulgação, um anticorpo anti-C5a compreende uma estrutura de IgG4, em que a mutação Ala-Ala descreverá uma ou mais mutações de fenilalanina para alanina na posição 234 e/ou uma mutação de leucina para alanina na posição 235. Noutro aspeto da divulgação, o anticorpo anti-C5a compreende uma estrutura de IgGl, em que a mutação Ala-Ala descreverá uma ou mais mutações de leucina para alanina na posição 234 e/ou uma mutação de leucina para alanina na posição 235. Um anticorpo anti-C5a pode alternativamente ou adicionalmente transportar outras mutações, incluindo a mutação pontual K322A no domínio CH2 (Hezareh metal. (2001) J. Virol. 75:12161-12168). Um anticorpo com a ou as referidas mutações na região constante pode além disso ser um anticorpo bloqueador ou não bloqueador.
Substituições adicionais que, quando introduzidas numa região constante de cadeia pesada, resultam em função efetora diminuída são expostas, p. ex., em Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604. Ver particularmente a Tabela 1 ("Binding of human IgGl variants to human FcRn and FcyR) de Shields et al. , a divulgação da qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Ao pesquisar uma biblioteca de anticorpos anti-IgE, cada anticorpo da biblioteca diferindo em uma ou mais substituições na região constante de cadeia pesada, quanto à ligação a um painel de recetores de Fc (incluindo FcRn, FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, e FcyRIIIA), os autores identificaram várias substituições que modulam interações especificas Fc-receptor de Fc. Por exemplo, uma região constante de cadeia pesada de IgG2a variante em que o dominio CH2 contém uma substituição D265A (numeração de aminoácidos da cadeia pesada de acordo com Rabat et al., (supra)) resulta numa perda completa da interação entre a região constante variante e os recetores de Fc de IgG, FcyRIIB, FcyRIII, FcyRI, e FcyRIV. Shields et al. (2001) na página 6595, Tabela 1. Ver também Baudino et al. (2008) J. Immunol. 181:6664-6669 (supra).
Mudanças dentro da região charneira também afetam as funções efetoras. Por exemplo, a deleção da região charneira pode reduzir a afinidade para recetores de Fc e pode reduzir a ativação do complemento (Klein et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 524-528) . A presente divulgação refere-se portanto também a anticorpos com alterações na região charneira.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a pode conter uma região constante alterada exibindo citotoxicidade dependente do complemento (CDC) aumentada ou reduzida. Atividade de CDC modulada pode ser alcançada através da introdução de uma ou mais substituições, inserções, ou deleções de aminoácidos numa região Fc do anticorpo. Ver, p. ex., patente U.S. no. 6,194,551. Alternativamente ou adicionalmente, o ou os resíduos de cisteína podem ser introduzidos na região Fc, permitindo assim a formação de ligação dissulfureto intercadeias nesta região. 0 anticorpo homodimérico assim gerado pode ter capacidade de internalização melhorada ou reduzida e/ou morte celular mediada pelo complemento aumentada ou diminuída. Ver, p. ex., Caron et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1191-1195 e Shopes (1992) Immunol. 148:2918-2922; publicações PCT nos. WO 99/51642 e WO 94/29351; Duncan e Winter (1988) Nature 322:738-40; e Patentes U.S. Nos. 5, 648,260 e 5, 624,821.
Outros potenciais meios de modulação da função efetora de anticorpos incluem mudanças na glicosilação, que são resumidas, p. ex., em Raju (2003) BioProcess International 1(4):44-53. De acordo com Wright e Morrison, a micro-heterogeneidade dos oligossacáridos das IgG humanas pode afetar funções biológicas tais como CDC e ADCC, ligando-se a vários recetores de Fc, e ligando-se à proteína Clq. (1997) TIBTECH 15:26-32. Os padrões de glicosilação dos anticorpos podem diferir dependendo da célula produtora e das condições da cultura celular (Raju, supra). Tais diferenças podem levar a mudanças tanto na função efetora como na farmacocinética. Ver, p. ex., Israel et al. (1996) Immunology 89 (4) : 57 3-578; Newkirk et al. (1996) Clin. Exp. Immunol. 106(2):259-264. Diferenças na função efetora podem estar relacionadas com a capacidade da IgG para se ligar aos recetores de Fcy (FcyRs) nas células efetoras. Shields et al. mostraram que uma IgG, com alterações na sequência de aminoácidos que tenham melhorado a ligação a FcyR, pode exibir até 100% de aumento da ADCC utilizando células efetoras humanas. (2001) J. Biol. Chem. 27 6(9):6591-6604. Embora estas alterações incluam mudanças em aminoácidos não verificados na interface de ligação, tanto a natureza do componente açúcar como o seu padrão estrutural podem também contribuir para as diferenças observadas. Além disso, a presença ou ausência de fucose no componente oligossacárido de uma IgG pode melhorar a ligação e a ADCC. Ver, p. ex., Shields et ai. (2002) J. Biol. Chem. 277(30):26733-26740. Uma IgG sem um hidrato de carbono fucosilado ligado a Asn297 exibiu ligação ao recetor normal para o recetor FcyRI. Em contraste, a ligação ao recetor FcyRIIIA foi melhorada 50 vezes e acompanhada de maior ADCC, especialmente a concentrações de anticorpo mais baixas.
Shinkawa et al. demonstraram que um anticorpo para o recetor de IL-5 humano produzido num hibridoma de rato apresentou uma ADCC mais de 50% maior em comparação com o anticorpo produzido em células de ovário de hamster chinês (CHO) (Shinkawa et al. (2003) J. Biol. Chem. 278(5) :3466-73) . O perfil da composição de monossacáridos e oligossacáridos mostrou que a imunoglobulina produzida pelo hibridoma de rato tinha um teor de fucose menor que a proteína produzida pelas CHO. Os autores concluíram que a falta de fucosilação de uma IgGl tem um papel crítico no aumento da atividade de ADCC.
Uma abordagem diferente foi tomada por Umana et al. que mudou o padrão de glicosilação de chCE7, um anticorpo IgGl quimérico anti-neuroblastoma. (1999) Nat. Biotechnol. 17(2):176-180). Utilizando tetraciclina, regularam a atividade de uma enzima glicosiltransferase (GnTIII), que bisseta oligossacáridos que foram implicados em atividade de ADCC. A atividade de ADCC do anticorpo parental foi ligeiramente acima do nível de fundo. A medição da atividade de ADCC do chCE7 produzido a diferentes níveis de tetraciclina mostrou um intervalo ótimo de expressão de
GnTIII para máxima atividade de ADCC in vitro de chCE7. Esta atividade correlacionou-se com o nivel de oligossacárido do complexo bissetado associado à região constante. Variantes recém-otimizadas exibiram substancial atividade de ADCC. De forma semelhante, Wright e Morrison produziram anticorpos numa linha de células CHO deficiente em glicosilação e mostraram que os anticorpos produzidos nesta linha celular eram incapazes de citólise mediada pelo complemento. (1994) J. Exp. Med. 180:1087-1096. Assim, como alterações conhecidas que afetam a função efetora incluem modificações no padrão de glicosilação ou uma mudança no número de resíduos glicosilados, a presente divulgação refere-se a um anticorpo anti-C5a em que a glicosilação é alterada para aumentar ou diminuir a ou as funções efetoras incluindo ADCC e CDC. Glicosilação alterada inclui uma diminuição ou um aumento do número de resíduos glicosilados bem como uma mudança no padrão ou localização dos resíduos glicosilados.
Existem ainda outras abordagens para alteração da função efetora de anticorpos. Por exemplo, as células produtoras de anticorpos podem ser hipermutagénicas, gerando assim anticorpos com resíduos polipeptídicos alterados de forma aleatória ao longo de uma molécula de anticorpo inteira. Ver, p. ex., publicação PCT no. WO 05/011735. Células hospedeiras hipermutagénicas incluem células deficientes na reparação de emparelhamentos incorretos do ADN. Os anticorpos produzidos deste modo podem ser menos antigénicos e/ou ter propriedades farmacocinéticas benéficas. Além disso, estes anticorpos podem ser selecionados para propriedades tais como função ou funções efetoras aumentadas ou diminuída. Detalhes adicionais de técnicas de biologia molecular úteis para a preparação de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito são expostos abaixo.
Expressão e Purificação de Anticorpos Recombinantes
Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigénio destes aqui descritos podem ser produzidos utilizando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica de biologia molecular e química de proteínas. Por exemplo, um ácido nucleico codificando um ou ambos os polipéptidos das cadeias pesada e leve de um anticorpo pode ser inserido num vetor de expressão que contenha sequências reguladoras da transcrição e da tradução, que incluem, p. ex., sequências promotoras, local de ligação ao ribossoma, sequências de início e terminação da transcrição, sequências de início e terminação da tradução, sinais terminadores da transcrição, sinais de poliadenilação e sequências estimuladoras ou ativadoras. As sequências reguladoras incluem um promotor e sequências de início e terminação da transcrição. Além disso, o vetor de expressão pode incluir mais de um sistema de replicação de modo a que seja mantido em dois organismos diferentes, por exemplo em células de mamífero ou de inseto para expressão e num hospedeiro procariótico para clonagem e amplificação. Vários possíveis sistemas vetores estão disponíveis para a expressão de polipéptidos de cadeia pesada e cadeia leve clonados a partir de ácidos nucleicos em células de mamífero. Uma classe de vetores baseia-se na integração das sequências génicas desejadas no genoma da célula hospedeira. Células que integraram de forma estável o ADN podem ser selecionadas através da introdução simultânea de genes de resistência a fármacos tais como gpt de E. coli (Mulligan e Berg (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072) ou Tn5 neo (Southern e Berg (1982) Mol. Appl. Genet. 1:327). 0 gene marcador selecionável pode estar ligado às sequências génicas do ADN a expressar, ou introduzido na mesma célula através de cotransfeção (Wigler et al. (1979) Cell 16:77) . Uma segunda classe de vetores utiliza elementos de ADN que conferem capacidades de replicação autónoma a um plasmídeo extracromossómico. Estes vetores podem ser derivados de vírus animais, tais como o vírus do papiloma bovino (Sarver et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:7147), citomegalovírus, vírus de polioma (Deans et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1292), ou vírus SV40 (Lusky e Botchan (1982) Nature 293:79) .
Os vetores de expressão podem ser introduzidos em células de modo adequado para subsequente expressão do ácido nucleico. O método de introdução é grandemente ditado pelo tipo de célula alvo, discutido abaixo. Métodos exemplares incluem precipitação em CaP04, fusão de lipossomas, lipossomas catiónicos, eletroporação, infeção virai, transfeção mediada por dextrano, transfeção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, e microinjeção direta. Células hospedeiras apropriadas para a expressão de anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigénio destes incluem células de levedura, bactérias, de inseto, vegetais, e de mamífero. De particular interesse são bactérias tais como E. coli, fungos tais como Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris, células de inseto tais como SF9, linhas celulares de mamífero (p. ex., linhas celulares humanas), bem como linhas celulares primárias.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo ou fragmento deste pode ser expresso em, e purificado a partir de, animais transgénicos (p. ex., mamíferos transgénicos). Por exemplo, um anticorpo pode ser produzido em mamíferos transgénicos não humanos (p. ex., roedores) e isolado a partir do leite tal como descrito, p. ex., em Houdebine (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13 ( 6) :625-629; van Kuik-
Romeijn et al. (2000) Transgenic Res. 9(2):155-159; e Pollock et al. (1999) J. Immunol. Methods 231(1-2):147-157.
Os anticorpos e fragmentos destes podem ser produzidos a partir das células através da cultura de uma célula hospedeira transformada com o vetor de expressão contendo ácido nucleico codificando os anticorpos ou fragmentos, sob condições, e durante uma quantidade de tempo suficiente para permitir a expressão das proteínas. Tais condições para expressão proteica variarão com a escolha do vetor de expressão e da célula hospedeira, serão fáceis de determinar por um perito na técnica através de experimentação de rotina. Por exemplo, os anticorpos expressos em E. coli podem ser redobrados a partir de corpos de inclusão (ver, p. ex., Hou et al. (1998) Cytokine 10:319-30). Sistemas de expressão bacterianos e métodos para a sua utilização são bem conhecidos na área (ver "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley & Sons, e "Molecular Cloning A Laboratory Manual" 3a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)) . A escolha dos codões, vetores de expressão adequados e células hospedeiras adequadas variará dependendo de vários fatores, e pode ser facilmente otimizada conforme for necessário. Um anticorpo (ou fragmento deste) aqui descrito pode ser expresso em células de mamífero ou noutros sistemas de expressão, incluindo mas não limitados a leveduras, baculovírus, e sistema de expressão in vitro (ver, p. ex.,
Kaszubska et al. (2000) Protein Expression and Purification 18:213-220).
Após expressão, os anticorpos e fragmentos destes podem ser isolados. O termo "purificado" ou "isolado" tal como aplicado a qualquer uma das proteínas (anticorpos ou fragmentos) aqui descritos refere-se a um polipéptido que foi separado ou purificado a partir de componentes (p. ex., proteínas ou outras moléculas biológicas de ocorrência natural ou orgânicas) que o acompanham naturalmente, p. ex., outras proteínas, lípidos, e ácido nucleico num procariota expressando as proteínas. Tipicamente, um polipéptido está purificado quando constituí pelo menos 60 (p. ex., pelo menos 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, ou 99) %, em peso, da proteína total numa amostra.
Um anticorpo ou fragmento deste pode ser isolado ou purificado numa variedade de maneiras conhecidas dos peritos na técnica dependendo de quais os outros componentes presentes na amostra. Métodos de purificação padrão incluem técnicas eletroforéticas, moleculares, imunológicas e cromatográficas, incluindo cromatografia de permuta iónica, hidrófoba, de afinidade, e HPLC de fase inversa. Por exemplo, um anticorpo pode ser purificado utilizando uma coluna padrão anti-anticorpo (p. ex., uma coluna de proteína A ou proteína G) . Técnicas de ultrafiltração e diafiltração, em conjunto com concentração proteica, são também úteis. Ver, p. ex., Scopes (1994) "Protein Purification, 3a edição", Springer-Verlag, New York City, New York. O grau de purificação necessário variará dependendo da utilização desejada. Nalguns casos, não será necessária qualquer purificação do anticorpo expresso ou de fragmentos deste. Métodos para determinação do rendimento ou da pureza de um anticorpo purificado ou fragmento deste são conhecidos na técnica e incluem, p. ex., ensaio de Bradford, espectroscopia de UV, ensaio de proteínas de Biureto, ensaio de proteínas de Lowry, ensaio de proteínas de negro de amido, cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), espectrometria de massa (MS), e métodos eletroforéticos em gel (p. ex., utilizando uma coloração de proteínas tal como azul de Coomassie ou coloração de prata coloidal).
Nalguns aspetos da divulgação, a endotoxina pode ser removida dos anticorpos ou fragmentos. Os métodos para a remoção de endotoxinas de uma amostra de proteínas são conhecidos na técnica e exemplificados nos exemplos de trabalho. Por exemplo, a endotoxina pode ser removida da amostra de proteínas utilizando uma variedade de reagentes comercialmente disponíveis incluindo, sem limitação, os Estojos de Remoção de Endotoxinas ProteoSpin™ (Norgen Biotek Corporation), Detoxi-Gel Endotoxin Removal Gel (Thermo Scientific; Pierce Protein Research Products), Estojo de Remoção de Endotoxinas MiraCLEAN® (Mirus), ou membrana Acrodisc™ -Mustang® E (Pall Corporation).
Os métodos para deteção e/ou medição da quantidade de endotoxina presente numa amostra (tanto antes como após a purificação) são conhecidos na técnica e estão disponíveis estojos comerciais. Por exemplo, a concentração de endotoxina numa amostra de proteínas pode ser determinada utilizando o estojo QCL-1000 Chromogenic (BioWhittaker), os estojos baseados em lisado de amebócito de limulus (LAL) tais como o estojo Pyrotell®, Pyrotell®-T, Pyrochrome®,
Chromo-LAL, e estojos CSE disponíveis em the Associates of
Cape Cod Incorporated.
Embora de maneira alguma pretendendo ser limitante, os métodos exemplificativos para gerar os anticorpos aqui descritos são expostos nos Exemplos de trabalho.
Modificação dos Anticorpos ou Fragmentos de Ligação ao Antigénio Destes
Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigénio destes podem ser modificados após a sua expressão e purificação. As modificações podem ser modificações covalentes ou não covalentes. Tais modificações podem ser introduzidas nos anticorpos ou fragmentos, p. ex., fazendo reagir os resíduos de aminoácidos alvo do polipéptido com um agente de derivação orgânico que seja capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou resíduos terminais. Os locais adequados para modificação podem ser escolhidos utilizando qualquer um de uma variedade de critérios, incluindo, p. ex., análise estrutural ou análise da sequência de aminoácidos dos anticorpos ou fragmentos.
Nalguns aspetos da divulgação, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigénio destes podem ser conjugados com uma porção heteróloga. A porção heteróloga pode ser, p. ex., um polipéptido heterólogo, um agente terapêutico (p. ex., uma toxina ou um fármaco), ou um marcador detetável tal como, mas não limitado a, um marcador radioativo, um marcador enzimático, um marcador fluorescente, um marcador de metal pesado, um marcador luminescente, ou uma etiqueta de afinidade tal como biotina ou estreptavidina. Polipéptidos heterólogos adequados incluem, p. ex., uma etiqueta antigénica (p. ex., FLAG (DYKDDDDK (SEQ ID NO:50)), polihistidina (6-His; HHHHHH (SEQ ID NO:81), hemaglutinina (HA; YPYDVPDYA (SEQ ID-NO:82), glutationa-S-transferase (GST), ou proteína de ligação à maltose (MBP)) para utilização na purificação dos anticorpos ou fragmentos. Polipéptidos heterólogos incluem também polipéptidos (p. ex., enzimas) que são úteis como marcadores de diagnóstico ou detetáveis, por exemplo, luciferase, uma proteína fluorescente (p. ex., proteína fluorescente verde (GFP)), ou cloranfenicol-acetil-transferase (CAT). Marcadores radioativos adequados incluem, p. ex., 32P, 33P, 14C, 125I, i3i i, 1311, 35S, e 3H. Marcadores fluorescentes adequados incluem, sem limitação, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), proteína fluorescente verde (GFP), DyLight™ 488, ficoeritrina (PE), iodeto de propídio (PI), PerCP, PE-Alexa Fluor® 700, Cy5, aloficocianina, e Cy7. Marcadores luminescentes incluem, p. ex., qualquer um de uma variedade de quelatos de lantanido luminescentes (p. ex., európio ou térbio). Por exemplo, quelatos de európio adequados incluem o quelato de európio de ácido dietileno-triamina-pentaacético (DTPA) ou ácido tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA). Marcadores enzimáticos incluem, p. ex., fosfatase alcalina, CAT, luciferase, e peroxidase de rábano.
Duas proteínas (p. ex., um anticorpo e uma porção heteróloga) podem ser reticuladas utilizando qualquer um de vários agentes de reticulação química conhecidos. Exemplos de tais agentes de reticulação são os que ligam dois resíduos de aminoácidos através de uma ligação que inclui uma ligação dissulfureto "dificultada". Nestas ligações, uma ligação dissulfureto dentro da unidade de ligação cruzada está protegida (dificultando os grupos em ambos os lados da ligação dissulfureto) de redução pela ação, por exemplo, de glutationa reduzida ou da enzima dissulfureto-redutase. Um reagente adequado, 4-sucinimidiloxicarbonil-a-metil-a (2-piridilditio)tolueno (SMPT), forma uma tal ligação entre duas proteínas utilizando uma lisina terminal numa das proteínas e uma cisteína terminal na outra. Reagentes heterobifuncionais que reticulam através de uma porção de acoplamento diferente em cada uma das proteínas podem também ser usados. Outros agentes de reticulação úteis incluem, sem limitação, reagentes que ligam dois grupos amino (p. ex., N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisucinimida), dois grupos sulfidrilo (p. ex., 1,4-bis-maleimidobutano), um grupo amino e um grupo sulfidrilo (p. ex., éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxissucinimida), um grupo amino e um grupo carboxilo (p. ex., 4-[p-azidossalicilamido]butilamina), e um grupo amino e um grupo guanidina que está presente na cadeia lateral da arginina (p. ex., monoidrato de p-azidofenil-glioxal).
Nalguns aspetos da divulgação, um marcador radioativo pode ser conjugado diretamente com o esqueleto de aminoácidos do anticorpo. Alternativamente, o marcador radioativo pode ser incluído como parte de uma molécula maior (p. ex., 125I em Meta : [ 125I ] iodof enil-N-hidroxissuccinimida ( [ 125I ] mIPNHS) que se liga a grupos amino livres para formar derivados meta-iodofenilo (mlP) de proteínas relevantes (ver, p. ex., Rogers et ai., (1997) J. Nucl. Med. 38:1221-1229) ou quelato (p. ex., para DOTA ou DTPA) que por sua vez se liga ao esqueleto da proteína. Métodos de conjugação de marcadores radioativos ou moléculas maiores/quelatos contendo-os aos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigénio aqui descritos são conhecidos na técnica. Tais métodos envolvem a incubação das proteínas com o marcador radioativo sob condições (p. ex., pH, concentração de sal, e/ou temperatura) que facilitem a ligação do marcador radioativo ou quelato à proteína (ver, p. ex., Patente U.S. No. 6,001,329).
Os métodos para conjugação de um marcador fluorescente (por vezes referido como um "f luoróforo") com uma proteína (p. ex., um anticorpo) são conhecidos na técnica da química de proteínas. Por exemplo, fluoróforos podem ser conjugados com grupos amino livres (p. ex., de lisinas) ou grupos sulfidrilo (p. ex., cisteínas) de proteínas utilizando porções éster de succinimidilo (NHS) ou éster de tetrafluorofenilo (TFP) ligadas aos fluoróforos. Nalguns aspetos da divulgação, os fluoróforos podem ser conjugados com uma porção agente de reticulação heterobifuncional tal como sulfo-SMCC. Os métodos de conjugação adequados envolvem a incubação de uma proteína de anticorpo, ou fragmento desta, com o fluoróforo sob condições que facilitem a ligação do fluoróforo à proteína. Ver, p. ex., Welch e Redvanly (2003) "Handbook of Radiopharmaceuticals: Radiochemistry and Applications", John Wiley e Sons (ISBN 0471495603).
Nalguns aspetos da divulgação, os anticorpos ou fragmentos podem ser modificados, p. ex., com uma porção que melhore a estabilização e/ou retenção dos anticorpos em circulação, p. ex., no sangue, soro, ou outros tecidos. Por exemplo, o anticorpo ou fragmento pode ser PEGuilado tal como descrito, p. ex., em Lee et al. (1999) Bioconjug. Chem. 10(6): 973-8; Kinstler et al. (2002) Advanced Drug Deliveries Reviews 54:477-485; e Roberts et al. (2002)
Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476 ou HESilados (Fresenius Kabi, Alemanha; ver, p. ex., Pavisic et al. (2010) Int. J. Pharm. 387(1-2):110-119). A porção de estabilização pode melhorar a estabilidade, ou retenção, do anticorpo (ou fragmento) em pelo menos 1,5 (p. ex., pelo menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, ou 50 ou mais) vezes.
Nalguns aspetos da divulgação, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigénio destes aqui descritos podem ser glicosilados. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito pode ser submetido a tratamento enzimático ou químico, ou produzido a partir de uma célula, de modo a que o anticorpo ou fragmento tenha glicosilação reduzida ou ausente. Os métodos para produção de anticorpos com glicosilação reduzida são conhecidos na técnica e descritos, p. ex., na patente U.S. no. 6, 933, 368; Wright et al. (1991) EMBO J. 10 (10) : 2717-2723; e Co et al. (1993) Mol. Immunol. 30:1361.
Composições Farmacêuticas
Composições contendo um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito pode ser formuladas como uma composição farmacêutica, p. ex., para administração a um sujeito para o tratamento ou a prevenção de um distúrbio associado ao complemento. As composições farmacêuticas incluirão geralmente um transportador farmaceuticamente aceitável. Tal como aqui utilizado, um "transportador farmaceuticamente aceitável" refere-se a, e inclui, qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores da absorção, e semelhantes, que sejam fisiologicamente compatíveis. As composições podem incluir um sal farmaceuticamente aceitável, p. ex., um sal de adição ácida ou um sal de adição básica (ver, p. ex., Berge et al., (1977) J. Pharm. Sei. 66: 1-19).
As composições podem ser formuladas de acordo com métodos padrão. A formulação farmacêutica é uma técnica bem estabelecida, e é mais descrita, p. ex., em Gennam (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20a Edição, Lippincott, Williams & Wilkins (ISBN: 0683306472); Ansel et al. (1999) "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", 7a Edição, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (ISBN: 0683305727); e Kibbe (2000) "Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association", 3a Edição (ISBN: 091733096X). Nalguns aspetos da divulgação, uma composição pode ser formulada, por exemplo, como uma solução tamponada a concentrações adequadas e adequada para armazenamento a 2-8°C (p. ex., 4°C) . Nalguns aspetos da divulgação, a composição pode ser formulada para armazenamento a uma temperatura abaixo de 0°C (p. ex., -20°C ou -80°C). Nalguns aspetos da divulgação, a composição pode ser formulada para armazenamento durante até 2 anos (p. ex., um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, sete meses, oito meses, nove meses, 10 meses, 11 meses, 1 ano, 1½ anos, ou 2 anos) a 2-8°C (p. ex., 4°C) . Assim, nalguns aspetos da divulgação, as composições aqui descritas são estáveis em armazenamento durante pelo menos 1 ano a 2-8°C (p. ex., 4°C).
As composições farmacêuticas podem estar numa variedade de formas. Estas formas incluem, p. ex., formas de dosagem líquidas, semissólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (p. ex., soluções injetáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas e supositórios. A forma preferida depende, em parte, do modo de administração e aplicação terapêutica pretendidos. Por exemplo, composições contendo um anticorpo ou fragmento deste pretendido para distribuição sistémica ou local, podem estar na forma de soluções injetáveis ou infusíveis. Por conseguinte, as composições podem ser formuladas para administração através de um modo parentérico (p. ex., injeção intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, ou intramuscular). "Administração parentérica", "administrado por via parentérica", e outras frases gramaticamente equivalentes, tal como aqui utilizadas, referem-se a modelos de administração além da administração entérica e tópica, usualmente através de injeção, e incluem, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intranasal, intraocular, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intra-espinal, epidural, intracerebral, intracraniana, intracarotídea e intra-esternal.
As composições podem ser formuladas como uma solução, microemulsão, dispersões, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para armazenamento estável a concentração elevada. Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas através da incorporação de um anticorpo (ou um fragmento do anticorpo) aqui descrito na quantidade necessária num solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguida de esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas através de incorporação de um anticorpo ou de um fragmento deste aqui descrito num veiculo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários dos enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, métodos de preparação incluem secagem em vácuo e secagem por congelação que produzem um pó de um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antigénio deste, aqui descrito mais qualquer ingrediente adicional desejado (ver abaixo) de uma solução deste previamente esterilizada por filtração. A fluidez correta de uma solução pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e através da utilização de tensioativos. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição um reagente que atrase a absorção, por exemplo, sais de monoestearato, e gelatina.
Os anticorpos anti-C5a, ou fragmentos de ligação ao antigénio destes, aqui descritos podem também ser formulados em composições de imunolipossomas. Lipossomas contendo o anticorpo podem ser preparados através de métodos conhecidos na técnica tais como, p. ex., os métodos descritos em Epstein et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:3688; Hwang et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4030; e Patentes U.S. Nos. 4,485,045 e 4,544,545. Lipossomas com tempo de circulação aumentado são divulgados, p. ex., na Patente U.S. No. 5,013,556.
Em certos aspetos da divulgação, um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio deste pode ser preparado com um transportador que protegerá o composto contra a libertação rápida, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes e sistemas de distribuição microencapsulados. Polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, podem ser utilizados, tais como acetato de etileno-vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são conhecidos na técnica. Ver, p. ex., J.R. Robinson (1978) "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", Marcel Dekker, Inc., New York.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio aqui descrito pode ser formulado numa composição adequada para administração intrapulmonar (p. ex., para administração através de nebulizador; ver abaixo) a um mamífero tal como um humano. Métodos para preparação de tais composições são bem conhecidos na técnica e descritos, p. ex., na publicação de pedido de patente U.S. no. 20080202513; patentes U.S. nos. 7,112,341 e 6, 019, 968; e publicação de pedido PCT nos. WO 00/061178 e WO 06/122257, cujas divulgações de cada uma são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Formulações de inaladores de pó seco e sistemas adequados para administração das formulações estão descritos, p. ex., na publicação de pedido de patente U.S. no. 20070235029, Publicação PCT No. WO 00/69887; e patente U.S. no. 5,997,848.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito pode ser formulado numa composição adequada para distribuição ao olho. Nalguns aspetos da divulgação, um ou mais dos anticorpos anti-C5a (ou fragmentos de ligação ao antigénio destes) aqui descritos podem ser administrados localmente, por exemplo, por meio de aplicação tópica ou injeção intra-vítrea. Por exemplo, nalgumas formas de realização, os anticorpos anti-C5a podem ser formulados para administração por meio de gotas nos olhos. A preparação terapêutica para tratamento do olho pode conter um ou mais dos anticorpos anti-C5a numa concentração de cerca de 0,01 a cerca de 1% em peso, de preferência de cerca de 0,05 a cerca de 0,5% numa solução, suspensão ou unguento farmaceuticamente aceitável. A preparação estará de preferência na forma de uma solução aquosa estéril contendo, p. ex., ingredientes adicionais tais como, mas não limitados a, conservantes, tampões, agentes de tonicidade, antioxidantes e estabilizadores, agentes molhantes não iónicos ou agentes clarificantes, e agentes de aumento da viscosidade.
Conservantes adequados para uso em tal solução incluem cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio, clorobutanol, timerosal e semelhantes. Tampões adequados incluem, p. ex., ácido bórico, bicarbonato de sódio e de potássio, boratos de sódio e de potássio, carbonato de sódio e de potássio, acetato de sódio, e bifosfato de sódio, em quantidades suficientes para manter o pH entre cerca de pH 6 e pH 8, e de preferência, entre cerca de pH 7 e pH 7,5. Agentes de tonicidade adequados são dextrano 40, dextrano 70, dextrose, glicerina, cloreto de potássio, propilenoglicol, e cloreto de sódio.
Antioxidantes e estabilizadores adequados incluem bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio, tiossulfito de sódio e tioureia. Agentes molhantes e clarificantes adequados incluem polissorbato 80, polissorbato 20, poloxâmero 282 e tiloxapol. Agentes de aumento da viscosidade adequados incluem dextrano 40, dextrano 70, gelatina, glicerina, hidroxietilcelulose, hidroximetilpropilcelulose, lanolina, metilcelulose, petrolato, polietilenoglicol, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona e carboximetilcelulose. A preparação pode ser administrada topicamente no olho do sujeito a necessitar de tratamento (p. ex., um sujeito afligido com DMRI) através de métodos convencionais, p. ex., na forma de gotas ou através de banho do olho numa solução terapêutica, contendo um ou mais anticorpos anti-C5a.
Além disso, foi desenvolvida uma variedade de dispositivos para introdução de fármacos na cavidade vítrea do olho. Por exemplo, a publicação de pedido de patente U.S. no. 20020026176 descreve um tampão contendo um produto farmacêutico que pode ser inserido através da esclerótica de modo a projetar-se para dentro da cavidade vítrea para distribuir o agente farmacêutico na cavidade vítrea. Noutro exemplo, a patente U.S. no. 5,443,505 descreve um dispositivo implantável para introdução num espaço supracoroidal ou numa região avascular para libertação sustida de fármaco para o interior do olho. As patentes U.S. nos. 5,773,019 e 6,001,386 divulgam cada uma um dispositivo de libertação de fármacos implantável que se anexa à superfície escleral de um olho. O dispositivo compreende um núcleo interno contendo uma quantidade eficaz de um agente de reduzida solubilidade coberto por um polímero não bioerodível que é permeável ao agente de baixa solubilidade. Durante o funcionamento, o agente de baixa solubilidade atravessa a cobertura de polímero bioerodível para libertação sustida para fora do dispositivo. Métodos adicionais e dispositivos (p. ex., um penso transescleral e distribuição através de lentes de contacto) para distribuição de um agente terapêutico ao olho são descritos, p. ex., em Ambati e Adamis (2002) Prog. Retin. Eye Res. 21(2): 145-151; Ranta e Urtti (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58 (11) : 1164-1181; Barocas e Balachandran (2008) Expert. Opin. Drug Delivery 5(1): 1-10(10); Gulsen e Chauhan (2004) Invest. Opthalmol. Vis. Sei. 45:2342-2347; Kim et al. (2007) Ophthalmic. Res. 39:244-254; e publicação PCT no. WO 04/073551. Ácidos nucleicos codificando um anticorpo (ou um fragmento de ligação ao antigénio deste) podem ser incorporados numa construção génica a utilizar como parte de um protocolo de terapia genética para distribuir ácidos nucleicos que podem ser utilizados para expressar e produzir agentes dentro de células (ver abaixo). Construções de expressão de tais componentes podem ser administradas em qualquer transportador terapeuticamente eficaz, p. ex., qualquer formulação ou composição capaz de distribuir eficazmente o gene componente a células in vivo. Abordagens incluem inserção do gene sujeito em vetores virais incluindo retrovirus recombinantes, adenovirus, virus adeno-associados, lentivirus, e virus herpes simplex-1 (VHS-1), ou plasmideos bacterianos ou eucarióticos recombinantes. Os vetores virais podem transfetar células diretamente; ADN plasmidico pode ser distribuído com a ajuda de, por exemplo, lipossomas catiónicos (lipofectina) ou derivados (p. ex., conjugados com anticorpo), conjugados de polilisina, gramicidina S, envelopes virais artificiais ou outros desses transportadores intracelulares, bem como injeção direta da construção génica ou precipitação de CaPCh (ver, p. ex., W004/060407) realizado in vivo. (Ver também, "Abordagens Ex vivo", abaixo). Exemplos de
retrovirus adequados incluem pLJ, pZIP, pWE e pEM que são conhecidos dos peritos na técnica (ver, p. ex., Eglitis et al. (1985) Science 230:1395-1398; Danos e Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:64 60-64 64; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8 9:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10892-10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150:4104- 4115; Patentes U.S. Nos. 4,868,116 e 4,980,286; Publicações PCT Nos. WO89/07136, WO89/02468, WO89/05345, e WO92/07573) . Outro sistema virai de distribuição de genes utiliza vetores derivados de adenovirus (ver, p. ex., Berkner et al., (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252: 431-434; e Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155). Vetores adenovirais adequados derivados da estirpe de adenovirus Ad tipo 5 dl324 ou outras estirpes de adenovirus (p. ex., Ad2, Ad3, Ad7, etc.) são conhecidos dos peritos na técnica. Ainda outro sistema de vetor virai útil para distribuição do gene sujeito é o vírus adeno-associado (AAV) . Ver, p. ex., Flotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; e McLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62 :1963-1973.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antigénio deste, aqui descrito pode ser formulado com um ou mais agentes ativos adicionais úteis para tratamento ou prevenção de um distúrbio associado ao complemento num sujeito. Agentes adicionais para tratamento de um distúrbio associado ao complemento num sujeito variarão dependendo do distúrbio particular a tratar, mas podem incluir, sem limitação, um anti-hipertensivo (p. ex., um inibidor da enzima conversora da angiotensina), um anticoagulante, um corticosteroide (p. ex., prednisona), ou um agente imunossupressor (p. ex. , vincristina ou ciclosporina A). Exemplos de anticoagulantes incluem, p. ex., varfarina (Coumadin), heparina, fenindiona, fondaparinux, idraparinux, e inibidores da trombina (p. ex., argatroban, lepirudina, bivalirudina, ou dabigatrano). Um anticorpo ou fragmento deste aqui descrito pode também ser formulado com um agente fibrinolitico (p. ex., ancrod, ácido ε-aminocapróico, antiplasmina-ai, prostaciclina, e desfibrótido) para o tratamento de um distúrbio mediado pelo complemento. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo pode ser formulado com um agente de redução de lipidos tal como um inibidor da hidroximetilglutaril-CoA-redutase. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo pode ser formulado com, ou para utilização com, um agente anti-CD20 tal como rituximab (Rituxan™; Biogen Idee, Cambridge, MA). Nalguns aspetos da divulgação, p. ex., para o tratamento de AR, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste pode ser formulado com um ou ambos de infliximab (Remicade®; Ceptocor, Inc.) e metotrexato (Rheumatrex®, Trexall®) . Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito pode ser formulado com um fármaco anti-inflamatório não esteroide (FAINE). Muitos FAINE diferentes estão disponíveis, alguns sem receita incluindo ibuprofeno (Advil®, Motrin®, Nuprin®) e naproxeno (Alleve®) e muitos outros estão disponíveis com prescrição incluindo meloxicam (Mobic®) , etodolac (Lodine®) , nabumetona (Relafen®) , sulindac (Clinoril®) , tolementina (Tolectin®) , salicilato de magnésio de colina (Trilasate®) , diclofenac (Cataflam®, Voltaren®, Arthrotec®) , Diflusinal (Dolobid®) , indometacina (Indocin®), Cetoprofeno (Orudis®, Oruvail®) , oxaprozina (Daypro®) , e piroxicam (Feldene®) . Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo ou um fragmento deste pode ser formulado para utilização com um anti-hipertensivo, um agente anticonvulsivo (p. ex., sulfato de magnésio), ou um agente antitrombótico. Anti-hipertensivos incluem, p. ex., labetalol, hidralazina, nifedipina, antagonistas do canal de cálcio, nitroglicerina ou nitroprussiato de sódio. Ver, p. ex., Mihu et ai., (2007) J. Gasrointestin. Liver Dis. 16(4):419-424. Agentes antitrombóticos incluem, p. ex., heparina, antitrombina, prostaciclina, ou dose baixa de aspirina.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste pode ser formulado para administração a um sujeito juntamente com terapia intravenosa de globulina gama (IVIG), plasmaferese ou troca de plasma. Nalguns aspetos da presente divulgação, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste pode ser formulado para utilização antes, durante, ou após, um transplante renal.
Quando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste é para ser utilizado em combinação com um segundo agente ativo, os agentes podem ser formulados separadamente ou em conjunto. Por exemplo, as respetivas composições farmacêuticas podem ser misturadas, p. ex., imediatamente antes da administração, e administradas em conjunto ou podem ser administradas separadamente, p. ex., ao mesmo tempo ou em momentos diferentes (ver abaixo).
Tal como descrito acima, uma composição pode ser formulada de modo a que inclua uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito. Nalguns aspetos da divulgação, uma composição pode ser formulada para incluir uma quantidade subterapêutica do anticorpo (ou fragmento) e uma quantidade subterapêutica de um ou mais agentes ativos adicionais de modo a que os componentes no total sejam terapeuticamente eficazes para tratamento ou prevenção de um distúrbio associado ao complemento. Os métodos para determinação de uma dose terapeuticamente eficaz de um agente tal como um anticorpo terapêutico são conhecidos na técnica e aqui descritos.
Aplicações
Os anticorpos, fragmentos de ligação ao antigénio destes, conjugados, e composições de qualquer um dos anteriores podem ser usados em várias aplicações de diagnóstico e terapêuticas. Por exemplo, anticorpos anti-C5a marcados de forma detetável (p. ex., anticorpos anti-C5a humana ou anticorpos anti-C5a de ratinho) podem ser utilizados em ensaios para detetar a presença ou quantidade de C5a presente numa amostra biológica. A determinação da quantidade de C5a numa amostra, p. ex., uma amostra de sangue de um paciente, pode ser útil para avaliar o nivel de ativação do complemento na amostra. Métodos adequados para utilização dos anticorpos em ensaios de diagnóstico são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, ELISA, aplicações de transferência de energia de ressonância de fluorescência, Western blot, e técnicas dot blot. Ver, p. ex., Sambrook et al., supra e Ausubel et al., supra.
Nalguns aspetos da divulgação, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antigénio aqui descritos podem ser utilizados como controlos positivos em ensaios desenhados para identificar novos compostos adicionais para tratamento de distúrbios mediados pelo complemento. Por exemplo, um anticorpo anti-C5a que inibe a atividade de C5a pode ser utilizado como controlo positivo num ensaio para identificar compostos adicionais (p. ex., moléculas pequenas, aptâmeros, ou anticorpos) que inibam C5a ou a sinalização do recetor de C5a dependente de C5a.
Nalguns aspetos da divulgação, os anticorpos anti-C5a reativos de forma cruzada ou fragmentos de ligação ao antigénio destes (p. ex., reativo de forma cruzada com C5a humana e, p. ex., C5a de macaco cinomolgo) aqui descritos podem ser utilizados para testes pré-clínicos em mamíferos não humanos, p. ex., estudos farmacocinéticos ou farmacodinâmicos em primatas não humanos. Por conseguinte, um investigador que deseje avaliar a eficácia de um anticorpo anti-C5a no tratamento de um distúrbio associado ao complemento de interesse (p. ex., AR ou sepsia) pode utilizar um anticorpo anti-C5a reativo de forma cruzada aqui descrito num modelo apropriado de primata não humano da doença. Se o investigador, por exemplo, estabelecer a eficácia do anticorpo no modelo de primata não humano, estes resultados podem proporcionar apoio suficiente à prova de conceito para aprovação regulamentar para utilização do anticorpo no tratamento de humanos. Alternativamente, ou em adição, um investigador pode administrar o anticorpo reativo de forma cruzada a um primata não humano para estudar, p. ex., a eliminação do anticorpo e/ou as propriedades farmacodinâmicas. Com base em tais estudos utilizando o anticorpo reativo de forma cruzada, o investigador pode aproximar melhor a dose necessária para tratar doenças humanas.
Nalguns aspetos da divulgação, os anticorpos anti-5a de ratinho ou fragmentos de ligação ao antigénio destes aqui descritos, bem como anticorpos que reagem de forma cruzada com C5a humana e de ratinho, podem ser utilizados como substituto do anticorpo em modelos de ratinho de doenças humanas. Isto pode ser especialmente útil quando um humanizado anticorpo anti-C5a humana não reage de forma cruzada com C5a de ratinho e/ou é provável que cause uma resposta de anticorpos anti-humano num ratinho ao qual o anticorpo humanizado é administrado. Por conseguinte, um investigador que deseje estudar o efeito de um anticorpo anti-C5a no tratamento de uma doença (p. ex., lesão de isquemia-reperfusão) pode utilizar um anticorpo anti-C5a de ratinho aqui descrito num modelo de ratinho da doença apropriado. Se o investigador puder estabelecer a eficácia no modelo de ratinho de doença utilizando o anticorpo anti-5a de ratinho, os resultados podem estabelecer a prova de conceito para utilização de um anticorpo anti-C5a humana em tratamento da doença em humanos. Os exemplos de trabalho divulgam um estudo exemplar utilizando um anticorpo anti-5a de ratinho substituto num modelo de ratinho de AR estabelecendo a prova de conceito para a utilização de um anticorpo anti-C5a humana para tratar AR no homem.
Os anticorpos anti-C5a aqui descritos podem também ser utilizados em métodos para purificação de C5a a partir de uma amostra (p. ex., uma amostra biológica). Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a pode ser imobilizado num suporte de fase sólida utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Uma amostra contendo o antigénio a purificar, neste caso C5a, é colocada em contacto com o anticorpo no suporte sólido sob condições e durante um tempo suficiente para permitir que o antigénio se ligue ao anticorpo. 0 suporte sólido é então lavado uma ou mais vezes com um tampão adequado para remover o material não ligado. 0 suporte sólido pode então ser colocado em contato com um segundo tampão que resulta na libertação do antigénio a partir do anticorpo. 0 antigénio libertado é então colhido e caracterizado (p. ex., quanto à pureza e atividade) utilizando métodos bem conhecidos na técnica.
Os anticorpos anti-C5a e fragmentos de ligação ao antigénio destes aqui descritos podem também ser utilizados em métodos terapêuticos tal como detalhado abaixo. Métodos para Tratamento
As composições acima descritas são úteis, inter alia, em métodos para tratamento ou prevenção de uma variedade de distúrbios associados ao complemento num sujeito. As composições podem ser administradas a um sujeito, p. ex., um sujeito humano, utilizando uma variedade de métodos que dependem, em parte, da via de administração. A via pode ser, p. ex., injeção ou infusão intravenosa (IV), injeção subcutânea (SC), injeção intraperitoneal (IP), ou injeção intramuscular (IM). A administração pode ser alcançada, p. ex., através de infusão ou injeção local, ou por meio de um implante. 0 implante pode ser de um material poroso, não poroso, ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como membranas sialásticas, ou fibras. 0 implante pode ser configurado para libertação sustida ou periódica da composição ao sujeito. Ver, p. ex., a Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 20080241223; as Patentes U.S. Nos. 5,501,856; 4,863,457; e 3,710,795; EP488401; e EP 430539. A composição pode ser distribuída ao sujeito por meio de um dispositivo implantável com base, p. ex., em sistemas difusíveis, erodíveis, ou de convecção, p. ex., bombas osmóticas, implantes biodegradáveis, sistemas de eletrodifusão, sistemas de eletro-osmose, bombas de pressão de vapor, bombas eletrolíticas, bombas efervescentes, bombas piezoelétricas, sistemas à base de erosão, ou sistemas eletromecânicos.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste é terapeuticamente distribuído a um sujeito por meio de administração local. Tal como aqui utilizado, "administração local" ou "distribuição local", refere-se a distribuição que não se baseia no transporte da composição ou do agente para o seu tecido ou local alvo pretendido através do sistema vascular. Por exemplo, a composição pode ser distribuída através de injeção ou implantação da composição ou do agente ou através de injeção ou implantação de um dispositivo contendo a composição ou o agente. Após a administração local na proximidade de um tecido ou local alvo, a composição ou o agente, ou um ou mais componentes destes, pode difundir-se para o tecido ou local alvo pretendido.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste pode ser administrado localmente a uma junção (p. ex., uma articulação). Por exemplo, em formas de realização em que o distúrbio associado ao complemento é artrite, o inibidor do complemento pode ser administrado diretamente a uma articulação (p. ex., num espaço articular) ou na proximidade de uma articulação. Exemplos de junções intra-articulares às quais um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste pode ser localmente administrado incluem, p. ex., a anca, o joelho, o cotovelo, o pulso, a esternoclavicular, a temperomandibular, a carpal, a tarsal, o tornozelo, e qualquer outra articulação sujeita a condições artríticas. Um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste pode também ser administrado a uma bursa tal como, p. ex., acromial, bicipitorradial, cubitorradial, deltoide, infrapatelar, isquiática, e qualquer outra bursa conhecida na técnica da medicina.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste pode ser localmente administrado ao olho. Tal como aqui utilizado, o termo "olho" refere-se a qualquer um e a todos os tecidos anatómicos e estruturas associados a um olho. 0 olho tem uma parede composta de três camadas distintas: a esclerótica externa, a camada coroideia do meio e a retina interna. A câmara por trás da lente é cheia com um fluido gelatinoso referido como o humor vítreo. Na parte de trás do olho está a retina, a qual deteta a luz. A córnea é um tecido opticamente transparente, que transmite imagens para à parte posterior do olho. A córnea inclui uma via para a permeação de fármacos no olho. Outras estruturas teciduais anatómicas associadas ao olho incluem o sistema de drenagem lacrimal, que inclui um sistema secretor, um sistema de distribuição e um sistema excretor. 0 sistema secretor compreende secretores que são estimulados através do piscar e da carga de temperatura devido à evaporação das lágrimas e secretores reflexos que têm um fornecimento nervoso parassimpático eferente e segregam lágrimas em resposta a estimulação física ou emocional. 0 sistema de distribuição inclui as pálpebras e o menisco das lágrimas em torno das bordas das pálpebras de um olho aberto, que espalha as lágrimas sobre a superfície ocular através do piscar, reduzindo assim o desenvolvimento de áreas secas.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste é administrado à câmara posterior do olho. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste é administrado por via intravítrea. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste é administrado trans-escleralmente.
Nalguns aspetos da divulgação, p. ex., em aspetos para tratamento ou prevenção de um distúrbio pulmonar associado ao complemento tal como DPOC ou asma, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito pode também ser administrado a um sujeito por meio do pulmão. A distribuição pulmonar do fármaco pode ser alcançada através de inalação, e a administração através de inalação aqui pode ser oral e/ou nasal. Exemplos de dispositivos farmacêuticos para distribuição pulmonar incluem inaladores de doses calibradas, inaladores de pó seco (DPI), e nebulizadores. Por exemplo, um anticorpo anti-C5a ou um fragmento de ligação ao antigénio deste pode ser administrado aos pulmões de um sujeito por meio de um inalador de pó seco. Estes inaladores são dispositivos sem propulsores que distribuem formulações de pó seco dispersíveis e estáveis aos pulmões. Os inaladores de pó seco são bem conhecidos na técnica da medicina e incluem, sem limitação: o TurboHaler® (AstraZeneca; Londres, Inglaterra) o inalador AIR® (Alkermes®; Cambridge, Massachusetts); Rotahaler® (GlaxoSmithKline; London, Inglaterra); e Eclipse™ (Sanofi-Aventis; Paris, França). Ver também, p. ex., Publicações PCT Nos. WO 04/026380, WO 04/024156, e WO 01/78693. Os dispositivos DPI têm sido utilizados para administração pulmonar de polipéptidos tais como insulina e hormona de crescimento. Nalgum aspeto da divulgação, um anticorpo anti-C5a ou um fragmento de ligação ao antigénio deste pode ser administrado intrapulmonarmente por meio de um inalador de dose calibrada. Estes inaladores baseiam-se num propulsor para distribuir uma dose discreta de um composto aos pulmões. Exemplos de compostos administrados por inaladores de doses calibradas incluem, p. ex., Astovent® (Boehringer-Ingelheim; Ridgefield, Connecticut) e Flovent® (GlaxoSmithKline). Ver também, p. ex., Patentes U.S. Nos. 6,170,717; 5,447,150; e 6,095,141.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste pode ser administrado aos pulmões de um sujeito por meio de um nebulizador. Os nebulizadores usam ar comprimido para distribuir um composto como um aerossol ou névoa liquefeito. Um nebulizador pode ser, p. ex., um nebulizador de jato (p. ex., nebulizadores de jato de ar ou liquido) ou um nebulizador ultrassónico. Dispositivos adicionais e métodos de administração intrapulmonar são expostos, p. ex., nas Publicações de Pedido de Patente U.S. Nos. 20050271660 e 20090110679.
Nalguns aspetos da divulgação, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigénio destes aqui proporcionados estão presentes na forma de dosagem unitária, que pode ser particularmente adequada para autoadministração. Um produto formulado da presente divulgação pode ser incluído dentro de um recipiente, tipicamente, por exemplo, um frasco, cartucho, seringa preenchida ou caneta descartável. Um doseador, tal como o dispositivo doseador descrito na Patente U.S. No. 6,302,855, pode também ser utilizado, por exemplo, com um sistema de injeção da presente divulgação.
Um sistema de injeção da presente divulgação pode empregar uma caneta de distribuição tal como descrito na Patente U.S. No. 5,308,341. Os dispositivos de caneta, mais vulgarmente utilizados para autodistribuição de insulina a pacientes com diabetes, são bem conhecidos na técnica. Tais dispositivos podem compreender pelo menos uma agulha de injeção (p. ex., uma agulha de calibre 31 de cerca de 5 a 8 mm de comprimento), são tipicamente preenchidos com uma ou mais doses unitárias terapêuticas de uma solução terapêutica, e são úteis para distribuir rapidamente a solução a um sujeito com o mínimo de dor possível.
Uma caneta de distribuição de medicação inclui um suporte de frasco no qual pode ser recebido um frasco de insulina ou de outra medicação. O suporte do frasco é geralmente um elemento alongado de estrutura tubular com extremidades proximal e distal. A extremidade distai do suporte do frasco inclui meios de montagem para engatar uma cânula de agulha de extremidade dupla. A extremidade proximal inclui também meios de montagem para engatar um corpo de caneta que inclui um aparelho condutor e de ajuste da dose. Um frasco contendo medicação descartável (p. ex., uma solução de alta concentração de um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste) para utilização com o suporte de frasco da técnica anterior inclui uma extremidade distai possuindo um septo elastomérico perfurável que pode ser perfurado por uma extremidade de uma cânula de agulha de duas extremidades. A extremidade proximal deste frasco inclui uma tampa disposta de forma deslizante no engate estanque do fluido com a parede cilíndrica do frasco. Esta caneta de distribuição de medicações é utilizada inserindo o frasco da medicação no suporte do frasco. 0 corpo da caneta é então ligado à extremidade proximal do suporte do frasco. 0 corpo da caneta inclui um aparelho de ajuste da dose para designar uma dose de medicação a distribuir pela caneta e um aparelho condutor para pressionar a tampa do frasco de modo distai até uma distância correspondente à dose selecionada. 0 utilizador da caneta monta uma cânula de agulha de dupla extremidade na extremidade distal do suporte do frasco de modo a que o ponto proximal da cânula de agulha perfure o septo do frasco. 0 paciente seleciona então uma dose e opera a caneta para pressionar a tampa distalmente para distribuir a dose selecionada. 0 aparelho seletor de dose regressa a zero após injeção da dose selecionada. 0 paciente remove então e descarta a cânula de agulha, e mantém a caneta de distribuição de medicação numa localização conveniente para a próxima administração necessária da medicação. A medicação no frasco ficará esgotada após várias administrações da medicação. 0 paciente separa então o suporte do frasco do corpo da caneta. 0 frasco vazio pode então ser removido e descartado. Um novo frasco pode ser inserido no suporte do frasco, e o suporte do frasco e o corpo da caneta podem ser novamente montados e usados tal como explicado acima. Por conseguinte, uma caneta para distribuição de medicação tem geralmente um mecanismo condutor para dosagem precisa e facilidade de utilização.
Um mecanismo de dosagem, tal como um botão rotativo permite ao utilizador ajustar com precisão a quantidade de medicamento que será injetada pela caneta a partir de um frasco de medicação pré-embalado. Para injetar a dose de medicação, o utilizador insere a agulha debaixo da pele e prime o botão uma vez até ao ponto em que ele comprime. A caneta pode ser um dispositivo totalmente mecânico ou pode ser combinada com circuitos eletrónicos para definir e/ou indicar com precisão a dosagem da medicação que é injetada no utilizador. Ver Patente U.S. No. 6,192,891.
Nalguns aspetos da divulgação, a agulha do dispositivo de caneta é descartável e os estojos incluem uma ou mais agulhas de substituição descartáveis. Dispositivos de caneta adequados para distribuição de qualquer um dos anticorpos presentemente apresentados ou fragmentos de ligação ao antigénio destes são também descritos, p. ex., nas patentes U.S. nos. 6,277,099; 6,200,296; e 6,146,361.
Um dispositivo de caneta baseado em microagulha é descrito, p. ex., na patente U.S. no. 7,556,615.
Ver também o dispositivo Precision Pen Injector (PPI), Molly™, fabricado por Scandinavian Health Ltd. A presente divulgação apresenta também formulações de libertação controlada ou libertação prolongada adequadas para administração crónica e/ou autoadministração de uma medicação tal como um anticorpo anti-C5a ou um fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito. As várias formulações podem ser administradas a um paciente a necessitar de tratamento com a medicação como um bolo ou através de infusão contínua ao longo de um período de tempo.
Nalguns aspetos da divulgação, uma elevada concentração de anticorpo anti-C5a (ou fragmento de ligação ao antigénio deste) aqui descrita é formulada para administração de libertação sustida, libertação prolongada, libertação temporizada, libertação controlada, ou libertação contínua. Nalguns aspetos da presente divulgação, formulações de depósito são usadas para administrar o anticorpo ao sujeito a necessitar deste. Neste método, o anticorpo é formulado com um ou mais transportadores proporcionando uma libertação gradual de agente ativo ao longo de um período de várias horas ou dias. Tais formulações são frequentemente baseadas numa matriz de degradação que se dispersa gradualmente no corpo para libertar o agente ativo.
Nalguns aspetos da divulgação, um fragmento de ligação a C5a (p. ex., um anticorpo de cadeia simples, um diacorpo, ou um fragmento Fab') de um anticorpo anti-C5a aqui descrito é administrado por meio de administração intrapulmonar a um sujeito a necessitar deste. Por exemplo, uma forma de anticorpo de cadeia simples de qualquer um dos anticorpos anti-C5a aqui descritos pode ser distribuída por meio de um nebulizador ou um inalador a um sujeito (p. ex., um humano) afligido com um distúrbio pulmonar associado ao complemento, tal como asma ou DPOC.
Uma dose adequada de um anticorpo ou fragmento deste aqui descrito, cuja dose é capaz de tratar ou prevenir um distúrbio associado ao complemento num sujeito, pode depender de uma variedade de fatores, incluindo, p. ex., a idade, o sexo, e o peso de um sujeito a tratar e do composto inibidor particular utilizado. Por exemplo, pode ser necessária uma dose diferente de um anticorpo anti-C5a inteiro para tratar um sujeito com AR, em comparação com a dose de um fragmento de anticorpo Fab' que se ligue a C5a necessária para tratar o mesmo sujeito. Outros fatores que afetam a dose administrada ao sujeito incluem, p. ex., o tipo ou a gravidade do distúrbio mediado pelo complemento. Por exemplo, um sujeito com AR pode requerer a administração de uma dosagem diferente de um anticorpo anti-C5a que um sujeito com DMRI. Outros fatores podem incluir, p. ex., outros distúrbios médicos que afetem simultaneamente ou anteriormente o sujeito, a saúde geral do sujeito, a predisposição genética do sujeito, a dieta, o tempo de administração, a taxa de excreção, a combinação de fármacos, e quaisquer outros agentes terapêuticos adicionais que sejam administrados ao sujeito. Deve também entender-se que uma dosagem e um regime de tratamento específicos para qualquer sujeito particular dependerão também do julgamento do médico assistente (p. ex., médico ou enfermeiro).
Um anticorpo aqui descrito pode ser administrado, como dose fixa, ou numa dose de miligrama por quilograma (mg/kg) . Nalguns aspetos da divulgação, a dose pode também ser escolhida para reduzir ou evitar a produção de anticorpos ou outras respostas imunitárias do hospedeiro contra um ou mais dos anticorpos ativos na composição. Embora não se pretenda de forma alguma que sejam limitantes, dosagens exemplares de um anticorpo, tal como um anticorpo anti-C5a incluem, p. ex., 1-1000 mg/kg, 1-100 yg/kg, 0,5-50 yg/kg, 0,1-100 yg/kg, 0,5-25 yg/kg, 1-20 yg/kg, e 1-10 yg/kg, 1-100 mg/kg, 0,5-50 mg/kg, 0,1-100 mg/kg, 0,5-25 mg/kg, 1-20 mg/kg, 0,100 mg/kg a 1 mg/kg, e 1-10 mg/kg. Dosagens exemplares de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito incluem, sem limitação, 0,1 yg/kg, 0,5 yg/kg, 1,0 yg/kg, 2,0 yg/kg, 4 yg/kg, e 8 yg/kg, 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4 mg/kg, 8 mg/kg, e 20 mg/kg.
Uma composição farmacêutica pode incluir uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito. Tais quantidades eficazes podem ser facilmente determinadas por um vulgar perito na técnica com base, em parte, no efeito do anticorpo administrado, ou no efeito combinatório do anticorpo e um ou mais agentes ativos adicionais, se for utilizado mais de um agente. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento deste aqui descrito pode também variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, a idade, o sexo, e o peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo (e um ou mais agentes ativos adicionais) para desencadear uma resposta desejada no indivíduo, p. ex., melhoria de pelo menos um parâmetro da condição, p. ex., melhoria de pelo menos um sintoma do distúrbio mediado pelo complemento. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-C5a pode inibir (diminuir a gravidade ou eliminar a ocorrência de) e/ou prevenir um determinado distúrbio, e/ou qualquer um dos sintomas do distúrbio particular conhecido na técnica ou aqui descrito. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais da composição são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.
Doses humanas adequadas de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos destes aqui descritos podem ser adicionalmente avaliadas, p. ex., em estudos de Fase I de aumento da dose. Ver, p. ex., van Gurp et al., (2008) Am. J. Transplantation 8(8):1711-1718; Hanouska et al. (2007) Clin. Cancer Res. 13(2, parte 1):523-531; e Hetherington et al. (2006) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50(10):3499-3500. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "dose terapeuticamente eficaz" ou termos semelhantes aqui utilizados destinam-se a significar uma quantidade de um agente (p. ex., um anticorpo anti-C5a ou um fragmento de ligação ao antigénio deste) que desencadeará a resposta biológica ou médica desejada (p. ex., uma melhoria num ou mais sintomas de um distúrbio associado ao complemento). Nalguns aspetos da divulgação, uma composição aqui descrita contém uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antigénio deste, que se ligue especificamente a um neo-epitopo presente em C5a. Em aspetos da divulgação, a composição contém qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigénio destes aqui descritos e um ou mais (p. ex. , dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, ou 11 ou mais) agentes terapêuticos adicionais de modo a que a composição como um todo seja terapeuticamente eficaz. Por exemplo, uma composição pode conter um anticorpo anti-C5a aqui descrito e um agente imunossupressor, em que o anticorpo e o agente estão cada um a uma concentração que quando combinados sejam terapeuticamente eficazes para tratamento ou prevenção de um distúrbio associado ao complemento (p. ex., um distúrbio inflamatório associado ao complemento tal como DPOC, asma, sepsia, ou AR) num sujeito. A toxicidade e eficácia terapêutica de tais composições podem ser determinadas através de procedimentos farmacêuticos conhecidos em culturas celulares ou animais experimentais (p. ex., modelos animais de qualquer um dos distúrbios mediados pelo complemento aqui descritos). A utilização de um anticorpo anti-C5a num modelo animal de AR é exemplificada nos exemplos de trabalho. Estes procedimentos podem ser utilizados, p. ex., para determinação da LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de doses entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expresso como a razão LD50/ED50. É preferido um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste que exiba um elevado índice terapêutico. Embora possam ser utilizadas composições que exibam efeitos secundários tóxicos, deve ser tomado cuidado para desenhar um sistema de distribuição que direcione tais compostos para o local de tecido afetado e para minimizar potenciais danos em células normais e, deste modo, reduzir os efeitos secundários.
Os dados obtidos a partir de ensaios em culturas celulares e estudos animais podem ser utilizados na formulação de um intervalo de dosagem para utilização em humanos. A dosagem de tais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigénio destes reside geralmente dentro de um intervalo de concentrações em circulação dos anticorpos ou fragmentos que inclua a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro deste intervalo dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. Para um anticorpo anti-C5a aqui descrito, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura celular. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para alcançar um intervalo de concentração em circulação no plasma que inclua a IC50 (i.e., a concentração do anticorpo à qual se alcança uma inibição semimáxima dos sintomas) tal como determinado em cultura celular. Tal informação pode ser utilizada para determinar com maior precisão as doses úteis em humanos. Os niveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, através de cromatografia liquida de alta resolução. Nalguns aspetos da divulgação, p. ex., quando é desejada administração local (p. ex., no olho ou numa articulação), podem ser utilizadas culturas celulares ou modelos animais para determinar uma dose necessária para atingir uma concentração terapeuticamente eficaz no local.
Nalguns aspetos da divulgação, os métodos podem ser realizados em conjunto com outras terapias para distúrbios associados ao complemento. Por exemplo, a composição pode ser administrada a um sujeito ao mesmo tempo, antes, ou após, plasmaferese, terapia IVIG, ou troca de plasma. Ver, p. ex., Appel et ai., (2005) J. Am. Soc. Nephrol. 16:1392-1404. Nalguns aspetos da divulgação, a composição pode ser administrada a um sujeito ao mesmo tempo, antes, ou após, um transplante renal.
Um "sujeito", tal como aqui utilizado, pode ser qualquer mamífero. Por exemplo, um sujeito pode ser um humano, um primata não humano (p. ex., macaco, babuíno, ou chimpanzé), um cavalo, uma vaca, um porco, uma ovelha, uma cabra, um cão, um gato, um coelho, uma cobaia, um gerbilo, um hamster, um rato, ou um ratinho. Nalgumas formas de realização, o sujeito é uma criança (p. ex., um bebé humano).
Tal como aqui utilizado, um sujeito "a necessitar de prevenção", "a necessitar de tratamento", ou "a necessitar destes", refere-se a um, que pela avaliação de um médico assistente indicado (p. ex., um médico, um enfermeiro, ou um praticante de enfermagem no caso de humanos; um veterinário no caso de mamíferos não humanos) , beneficiará razoavelmente de um dado tratamento (tal como tratamento com uma composição compreendendo um anticorpo anti-C5a). 0 termo "prevenção" é reconhecido na técnica e, quando utilizado em relação a uma condição, é bem compreendido na técnica, e inclui a administração de uma composição que reduz a frequência, ou atrasa o aparecimento, de sintomas de uma condição médica num sujeito em relação a um sujeito que não recebe a composição. Assim, a prevenção de um distúrbio associado ao complemento tal como asma inclui, por exemplo, redução da extensão ou frequência de tosse, pieira, ou dor no peito numa população de pacientes que recebem um tratamento profilático em relação a uma população de controlo não tratada, e/ou atraso da ocorrência de tosse ou pieira numa população tratada contra uma população de controlo não tratada, p. ex., numa quantidade estatisticamente e/ou clinicamente significativa.
Tal como descrito acima, os anticorpos e fragmentos biologicamente ativos destes aqui descritos podem ser utilizados para tratar uma variedade de distúrbios associados ao complemento tais como, mas não limitados a: artrite reumatoide (AR); nefrite de lúpus; lesão de isquemia-reperfusão; síndroma hemolítica urémica atípica (SHUa); síndroma hemolítica urémica típica ou infeciosa (SHUt); doença de depósito denso (DDD); hemoglobinúria paroxística noturna (HPN); esclerose múltipla (EM) ; degeneração macular (p. ex., degeneração macular relacionada com a idade (DMRI)); hemólise, elevação das enzimas hepáticas e síndroma de plaquetas baixas (HELLP); sepsia; dermatomiosite; retinopatia diabética; púrpura trombocitopénica trombótica (PTT); perda fetal espontânea; vasculite imunitária de Pauci; epidermólise bolhosa; perda fetal recorrente; esclerose múltipla (EM); e lesão cerebral traumática. Ver, p. ex., Holers (2008) Immunological Reviews 223:300-316 e Holers e Thurman (2004) Molecular Immunology 41:147-152. Nalguns aspetos da divulgação, o distúrbio mediado pelo complemento é um distúrbio vascular mediado pelo complemento tal como, mas não limitado a, um distúrbio cardiovascular, miocardite, um distúrbio vascular cerebral, um distúrbio vascular periférico (p. ex., músculo-esquelético), um distúrbio renovascular, um distúrbio vascular mesentérico/entérico, revascularização para transplantes e/ou replantes, vasculite, nefrite de púrpura de Henoch-Schõnlein, vasculite associada a lúpus eritematoso sistémico, vasculite associada a artrite reumatoide, vasculite do complexo imunitário, doença de Takayasu, síndroma de permeabilidade capilar, cardiomiopatia dilatada, angiopatia diabética, aneurisma da aorta torácica-abdominal, doença de Kawasaki (arterite), embolia gasosa venosa (EGV), e reestenose após colocação de stent, ateretomia rotacional, e angioplastia coronária transluminal percutânea (ACTP). (Ver, p. ex., publicação de pedido de patente U.S. no. 20070172483) . Nalgumas formas de realização, o distúrbio associado ao complemento é miastenia grave, doença de aglutinina a frio (DAF), hemoglobinúria paroxística a frio (HPF), dermatomiosite, esclerodermia, anemia hemolitica autoimune a quente, doença de Graves, tiroidite de Hashimoto, diabetes tipo I, psoriase, pênfigo, anemia hemolitica autoimune (AHAI), púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), síndroma de Goodpasture, síndroma antifosfolipídica (SAF), doença de Degos, e SAF catastrófica (SAFC).
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito, sozinho ou em combinação com um segundo agente anti-inflamatório, pode ser utilizado para tratar um distúrbio inflamatório tal como, mas não se limitando a, AR (acima), doença inflamatória do intestino, sepsia (acima), choque séptico, lesão pulmonar aguda, coagulação intravascular disseminada (CID), ou doença de Crohn. Nalguns aspetos da divulgação, o segundo agente anti-inflamatório pode ser um selecionado a partir de um grupo que consiste em FAINE, corticosteroides, metotrexato, hidroxicloroquina, agentes anti-TNF tais como etanercept e infliximab, um agente que esgota células B tal como rituximab, um antagonista de interleucina-1, ou um agente bloqueador coestimulador de células T tal como abatacept.
Nalguns aspetos da divulgação, o distúrbio associado ao complemento é um distúrbio neurológico associado ao complemento tal como, mas não limitado a, esclerose lateral amiotrófica (ELA), lesão cerebral, doença de Alzheimer, e neuropatia desmielinizante inflamatória crónica.
Distúrbios associados ao complemento incluem também distúrbios pulmonares associados ao complemento tais como, mas não limitado a, asma, bronquite, doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), uma doença pulmonar intersticial, deficiência em anti-tripsina a-1, enfisema, bronquiectasia, bronquiolite obliterante, alveolite, sarcoidose, fibrose pulmonar e distúrbios vasculares do colagénio.
No caso de distúrbios hemolíticos associados ao complemento tais como HPN, DAF, e HPF, um médico apreciará que o fragmento C5b de C5 (por meio do complexo terminal do complemento) contribui significativamente para a patogénese destes distúrbios. Ver, p. ex., Kaplan (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3(7) : 1017-23; Hill (2005) Clin. Adv. Hematol. Oncol. 3(11) :849-50; e Rother et al. (2007) Nature Biotechnology 25(11):1256-1488. Por conseguinte, um médico pode decidir administrar um ou mais dos anticorpos anti-C5a aqui descritos em conjunto com uma ou mais terapias adicionais para o distúrbio hemolitico, tal como um inibidor do complemento que impeça a formação do complexo terminal do complemento C5b-9. Nalguns aspetos dos métodos aqui descritos, o distúrbio associado ao complemento não é um distúrbio hemolitico associado ao complemento. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a ou um fragmento de ligação ao antigénio deste é administrado a um sujeito para tratar, prevenir, ou melhorar pelo menos um sintoma de uma resposta inflamatória associada ao complemento (p. ex., a resposta inflamatória associada ao complemento de um distúrbio associado ao complemento) num sujeito. Por exemplo, um anticorpo anti-C5a aqui descrito pode ser utilizado para tratar, prevenir e/ou melhorar um ou mais sintomas associados a uma resposta inflamatória associada ao complemento, tal como doença de rejeição de enxerto/enxerto-versus-hospedeiro (DEVH), lesões de reperfusão (p. ex., após bypass cardiopulmonar ou um transplante de tecido), e danos em tecidos após outras formas de lesões traumáticas tais como uma queimadura (p. ex., uma queimadura grave), contusão, lesão da coluna vertebral ou queimaduras de gelo. Ver, p. ex., Park et al., (1999) Anesth. Analg. 99(l):42-48; Tofukuji et al. (1998) J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 116 ( 6) : 1060-1068; Schmid et al. (1997) Shock 8(2):119-124,- e Bless et al. (1999) Am. J. Physiol. 276 (1) :L57-L63.
Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a ou um fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito pode ser administrado a um sujeito como uma monoterapia. Alternativamente, tal como descrito acima, o anticorpo ou fragmento deste pode ser administrado a um sujeito como uma terapia de combinação com outro tratamento, p. ex., outro tratamento para um distúrbio associado ao complemento ou uma resposta inflamatória associada ao complemento. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir a administração ao sujeito (p. ex., um paciente humano) de um ou mais agentes adicionais (p. ex., fármacos anticoagulantes, anti-hipertensivos ou anti-inflamatórios (p. ex., esteroides)) que proporcionem um benefício terapêutico a um sujeito que tenha, ou esteja em risco de desenvolver, sepsia. Noutro exemplo, a terapia de combinação pode incluir a administração ao sujeito de um ou mais agentes adicionais (p. ex., um anticorpo anti-IgE, um anticorpo anti-IL-4, um anticorpo anti-IL-5, ou um anti-histamínico) que proporcione benefício terapêutico a um sujeito que tenha, ou esteja em risco de desenvolver, ou seja suspeito de ter um distúrbio pulmonar associado ao complemento tal como DPOC ou asma. Nalguns aspetos da divulgação, um anticorpo anti-C5a e um ou mais agentes ativos adicionais são administrados ao mesmo tempo. Noutros aspetos da divulgação, o anticorpo anti-C5a é administrado primeiro no tempo e o um ou mais agentes ativos adicionais são administrados posteriormente. Nalguns aspetos da divulgação, um ou mais agentes ativos adicionais são administrados primeiro e o anticorpo anti-C5a é administrado posteriormente.
Um anticorpo anti-C5a ou um fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito pode substituir ou aumentar uma terapia administrada anteriormente ou simultaneamente. Por exemplo, após tratamento com um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste, a administração de um ou mais agentes ativos adicionais, pode cessar ou diminuir, p. ex., ser administrada a níveis baixos. Nalguns aspetos da divulgação, a administração da terapia anterior pode ser mantida. Nalguns aspetos da divulgação, uma terapia anterior será mantida até que o nível do anticorpo anti-C5a alcance um nível suficiente para proporcionar um efeito terapêutico. As duas terapias podem ser administradas em combinação. A monitorização de um sujeito (p. ex., um paciente humano) quanto a uma melhoria num distúrbio associado ao complemento (p. ex., sepsia, queimadura grave, AR, nefrite de lúpus, síndroma de Goodpasture, ou asma), tal como aqui definido, significa a avaliação do sujeito quanto a uma mudança num parâmetro da doença, p. ex., uma melhoria num ou mais sintomas de um dado distúrbio. Os sintomas de distúrbios associados ao complemento são bem conhecidos na técnica médica. Nalguns aspetos da divulgação, a avaliação é realizada pelo menos uma (1) hora, p. ex., pelo menos 2, 4, 6, 8, 12, 24, ou 48 horas, ou pelo menos 1 dia, 2 dias, 4 dias, 10 dias, 13 dias, 20 dias ou mais, ou pelo menos 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 10 semanas, 13 semanas, 20 semanas ou mais, após uma administração. O sujeito pode ser avaliado num ou mais dos seguintes períodos: antes de iniciar o tratamento; durante o tratamento; ou após um ou mais elementos do tratamento terem sido administrados. A avaliação pode incluir a avaliação da necessidade de mais tratamento, p. ex., a avaliação de se uma dosagem, frequência de administração, ou duração do tratamento deve ser alterada. Pode também incluir a avaliação da necessidade de adicionar ou deixar cair uma modalidade terapêutica selecionada, p. ex., adição ou queda de qualquer um dos tratamentos para um distúrbio associado ao complemento aqui descrito.
Estojos Terapêuticos e de Diagnóstico A divulgação apresenta também estojos terapêuticos e de diagnóstico contendo, entre outras coisas, um ou mais dos anticorpos anti-C5a, e/ou fragmentos de ligação ao antigénio destes, aqui descritos. Os estojos terapêuticos podem conter, p. ex., um meio adequado para distribuição do anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio a um sujeito. Nalguns aspetos da divulgação, o meio é adequado para distribuição subcutânea do anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste ao sujeito. O meio pode ser, p. ex., uma seringa ou uma bomba osmótica. Isto é, um estojo terapêutico aqui descrito pode conter uma seringa preenchida com um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste (p. ex., um dispositivo de caneta contendo o anticorpo ou fragmento) aqui descrito ou o estojo pode conter uma bomba (p. ex., uma bomba osmótica) e uma ou mais cassetes descartáveis configuradas para utilização com a bomba, as cassetes preenchidas com um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito (p. ex., preenchidas com uma solução aquosa contendo o anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste). Noutro exemplo, o estojo pode conter um dispositivo de distribuição trans-escleral ou implantável (p. ex., um tampão) que é preenchido com (ou contém de outra forma) uma solução contendo um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste aqui descrito.
Nalguns aspetos da divulgação, o meio para distribuição de um anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste é um dispositivo de caneta para distribuição de fármacos.
Nalguns aspetos da divulgação, o meio é adequado para distribuição intrapulmonar do anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste a um sujeito, p. ex., para utilização em tratamento ou prevenção de um distúrbio pulmonar associado ao complemento tal como, mas não limitado a, DPOC ou asma. Por conseguinte, um meio pode ser, p. ex., um inalador oral ou nasal (ver acima) . 0 inalador pode ser, p. ex., um inalador de dose medida (MDI), inalador de pó seco (DPI), ou um nebulizador. Um tal estojo pode também, opcionalmente, incluir instruções para administração (p. ex., autoadministração) do anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste a um sujeito.
Os estojos terapêuticos podem incluir, p. ex., um ou mais agentes ativos adicionais para tratamento ou prevenção de um distúrbio associado ao complemento e/ou melhoria de um sintoma deste. Por exemplo, estojos terapêuticos desenhados para utilização em tratamento ou prevenção de um distúrbio pulmonar associado ao complemento podem incluir um ou mais agentes ativos adicionais incluindo, mas não limitados a, outro anticorpo terapêutico (p. ex., um anticorpo anti-IgE, um anticorpo anti-IL-4, ou um anticorpo anti-IL-5), um inibidor de molécula pequena anti-IgE (p. ex., montelucaste de sódio), um simpatomimético (p. ex., albuterol), um antibiótico (p. ex., tobramicina), uma desoxirribonuclease (p. ex., Pulmozyme), um fármaco anticolinérgico (p. ex., brometo de ipratrópio), um corticosteroide (p. ex., dexametasona) , um agonista dos β-adrenorrecetores, um inibidor de leucotrienos (p. ex., zileuton), um inibidor da 5-lipoxigenase, um inibidor da fosfodiesterase (PDE), um antagonista de CD23, um antagonista de IL-13, um inibidor da libertação de citocinas, um antagonista do recetor Hl da histamina, uma anti-histamina, um agente anti-inflamatório (p. ex., cromoglicato de sódio ou qualquer outro agente anti-inflamatório conhecido na técnica ou aqui descrito), ou um inibidor da libertação de histamina.
Nalguns aspetos da divulgação, o meio pode ser adequado para administração intraocular de um anticorpo anti-C5a, ou um fragmento de ligação ao antigénio deste, aqui descrito a um sujeito a necessitar deste, p. ex., um sujeito afligido com DMRI ou qualquer outro distúrbio ocular associado ao complemento. 0 meio pode ser, p. ex., uma seringa, um penso trans-escleral, ou mesmo uma lente de contacto contendo o anticorpo ou fragmento. 0 meio pode, nalguns aspetos da divulgação, ser um conta-gotas ocular, em que o anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste é formulado para tal administração. Tais estojos terapêuticos podem também incluir, p. ex., um ou mais agentes terapêuticos adicionais para utilização em tratamento de um distúrbio associado ao complemento do olho. Os agentes terapêuticos podem ser, p. ex., bevacizumab ou o fragmento Fab de bevacizumab, ranibizimab, ambos vendidos por Roche Pharmaceuticals, Inc., ou pegaptanib de sódio (Mucogen®; Pfizer, Inc.). Um tal estojo pode também, opcionalmente, incluir instruções para administração do anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste a um sujeito.
Nalguns aspetos das divulgações, o meio pode ser adequado para administração intra-articular de um anticorpo anti-C5a, ou fragmento de ligação ao antigénio deste, aqui descrito a um sujeito a necessitar deste, p. ex., um sujeito afligido com AR. 0 meio pode ser, p. ex., uma seringa ou uma seringa de corpo duplo. Ver, p. ex., as Patentes U.S. Nos. 6,065,645 e 6,698,622. Uma seringa de corpo duplo é útil para administração a uma articulação de duas composições diferentes com apenas uma injeção. Podem ser incorporadas duas seringas separadas para utilização na administração da terapêutica ao mesmo tempo que se tira fluido do joelho para análise (batendo levemente) de um modo empurrar-puxar. Agentes terapêuticos adicionais que podem ser administrados com os anticorpos anti-C5a ou fragmentos em conjunto com a seringa de corpo duplo, ou que podem de outro modo ser geralmente incluídos nos estojos terapêuticos aqui descritos, incluem, p. ex., FAINE, corticosteroides, metotrexato, hidroxicloroquina, agentes anti-TNF, tais como etanercept e infliximab, um agente de empobrecimento em células B, tal como rituximab, um antagonista de interleucina-1, ou um agente de bloqueio co-estimulador de células T, tal como abatacept. Um tal estojo pode também, opcionalmente, incluir instruções para administração do anticorpo anti-C5a ou fragmento de ligação ao antigénio deste a um sujeito. Será apreciado que a divulgação engloba estojos compreendendo um ou mais dos anticorpos anti-C5 aqui descritos e um ou mais agentes anti-inflamatórios selecionados a partir do grupo que consiste em FAINE, corticosteroides, metotrexato, hidroxicloroquina, agentes anti-TNF tais como etanercept e infliximab, um agente de empobrecimento em células B tal como rituximab, um antagonista de interleucina-1, ou um agente de bloqueio co-estimulador de células T, tal como abatacept. Os anticorpos e agentes podem ser, p. ex., formulados separadamente ou em conjunto. Os estojos podem ser utilizados para tratar uma condição inflamatória, tal como AR, doença de Crohn, doença inflamatória do intestino, ou qualquer outro distúrbio inflamatório conhecido na técnica ou aqui citado. São também apresentados estojos de diagnóstico contendo os anticorpos anti-C5a ou fragmentos de ligação ao antigénio destes aqui descritos. Por exemplo, os estojos podem conter uma forma marcada de forma detetável de um anticorpo anti-C5a (p. ex., um anticorpo anti-C5a ou um anticorpo anti-5a de ratinho) aqui descrito para utilização em deteção ou quantificação da quantidade de C5a numa amostra biológica. Nalguns aspetos da divulgação, os estojos podem conter proteína C5a isolada (p. ex., uma ou ambas de proteína C5a humana e de ratinho) e/ou uma amostra de controlo compreendendo uma ou ambas de proteína C5a humana e de ratinho. Nalguns aspetos da divulgação, o estojo contém uma placa multipoços revestida com um primeiro anticorpo anti-C5a possuindo uma primeira especificidade. 0 estojo contém também um segundo anticorpo anti-C5a (p. ex., um segundo anticorpo anti-C5 marcado de forma detetável) possuindo uma segunda especificidade. Um tal estojo é concebido para ser utilizado na captura, com o primeiro anticorpo ligado à placa, proteína C5a (p. ex., proteína C5a humana) numa amostra (p. ex., uma amostra biológica) em contacto com a placa e em seguida deteção da proteína C5a capturada usando o segundo anticorpo. Nalguns aspetos da divulgação, os estojos de diagnóstico incluem tanto um anticorpo anti-5a de ratinho como um anticorpo anti-C5a humana aqui descritos. Nalguns aspetos da divulgação, os estojos de diagnóstico incluem um anticorpo anti-C5a que se liga tanto a C5a de ratinho como a C5a humana.
Os seguintes exemplos destinam-se a ilustrar, não limitar, a invenção.
Exemplos
Exemplo 1. Métodos de imunização
Os anticorpos anti-C5a presentemente descritos são formas humanizadas de anticorpos de murídeo geradas sob o seguinte protocolo de imunização. As imunizações para criar anticorpos contra C5a humana desarginada foram realizadas em quatro ratinhos incluindo dois ratinhos da estirpe DBA/2J e dois ratinhos da estirpe A/J. Estas estirpes foram selecionadas porque transportam o alelo Hc°, que as torna deficientes em C5 endógena. Todas as imunizações foram repetidas a intervalos de 14 dias durante um total de três imunizações. Todos os animais receberam uma imunização subcutânea de reforço de aproximadamente 50 yg de C5a purificada em 200 yL de emulsão adjuvante aproximadamente 14 dias após a última imunização e 5 a 7 dias antes da colheita. A titulação de soro de ratinhos imunizados, utilizando um ensaio ELISA, mostrou que os ratinhos exibiram uma forte resposta de anticorpos contra o imunogénio C5a humana desarginada.
Exemplo 2: Determinação da especificidade dos anticorpos de ratinho para C5a humana
Um subconjunto de cinco Fab de ratinho anti-C5a humana que eram representativos de Fab seletivos para neoepitopos foi convertido em anticorpos IgG2a de ratinho inteiros designados como - 5an048ME, 5anl0lME, 5anl78ME, 5anl79ME, e 5anl80ME. Estes anticorpos foram avaliados quando à especificidade utilizando Interferometria de Biocamadas num Octet (ForteBio Inc.). (As sequências de aminoácidos dos conjuntos de CDR de cadeia leve e de cadeia pesada de cada anticorpo, tal como definido por Rabat, são expostas na Tabela 3.) Resumidamente, C5a humana, C5a humana desarg, C5 humana inteira, ou os parálogos da C5a humana, C3a humana e C4a humana, foram conjugados com biotina a uma estequiometria de <1 (biotina):1 (anticorpo) ao longo dos grupos amina e imobilizados numa ponta de estreptavidina. As pontas carregadas foram então expostas a uma solução contendo 20 nM de anticorpo IgG anti-C5a. Cada um dos anticorpos ligou-se a C5a e C5a desarginada. Nenhum dos anticorpos IgG anti-C5a se ligou a C3a ou a C4a. No entanto, 5anl78ME e 5anl79ME ligaram-se cada um a C5 humana inteira. Uma pequena quantidade de ligação foi observada entre 5an048ME e a C5 humana inteira. No entanto, a ligação de 5an048ME a C5 foi muito menor que a ligação observada a C5a.
Estes resultados confirmaram que os anticorpos de ratinho anti-C5a humana - 5an048ME, 5anl0lME, e 5anl80ME - se ligavam a um neoepitopo em C5a que estava oculto na C5 nativa, inteira ou gerada após a clivagem de C5 nos fragmentos C5a e C5b. Os resultados indicaram também que os três anticorpos eram seletivos para a C5a humana em comparação com os parálogos C3a ou C4a.
Uma série de ensaios em sanduíche foi realizada por Octet no subconjunto selecionado de anticorpos IgG2a de ratinho anti-C5a humana para determinar o grau de sobreposição de epitopos de C5a para cada um dos cincos anticorpos IgG2a representativos. Resumidamente, um primeiro anticorpo foi biotinilado e imobilizado numa ponta revestida com estreptavidina na plataforma Octet. Em seguida, C5a humana foi capturada a partir de uma solução 20 nM no anticorpo imobilizado. A ponta transportando o complexo anticorpo-C5a foi então exposta a uma solução contendo 20 nM de um segundo anticorpo IgG anti-C5a não marcado. O desencadeamento de um perfil de associação adicional no sensograma indicaria que os dois anticorpos se ligaram a C5a simultaneamente num complexo ternário e que os epitopos que se ligam aos dois anticorpos não estavam sobrepostos. A incapacidade de obter um segundo perfil de associação após adição do segundo anticorpo indicaria que os dois anticorpos se ligavam a C5a de uma forma competitiva, ou seja, o epitopo em C5a ao qual o segundo anticorpo se ligou estava obstruído após a ligação do primeiro anticorpo. Em contraste com a ligação não competitiva, a ligação competitiva não indica necessariamente que o primeiro e segundo anticorpos reconheceram o mesmo epitopo, nem mesmo epitopos sobrepostos, na C5a humana. Usando esta abordagem os locais de ligação dos cinco anticorpos anti-C5a representativos foram atribuídos a 4 epitopos distintos na C5a humana (Fig. 1) . Os anticorpos 5an048ME, 5anl80ME, e 5anl0lME competiram uns com os outros. Enquanto 5an048 e 5anl80 também competiram com o 5anl79ME não seletivo para neoepitopos, 5anl0lME não, o que indicou que 5an048ME e 5anl80ME reconhecem um neoepitopo que é diferente do epitopo reconhecido por 5anl0lME. Além disso, enquanto o anticorpo 5anl78ME não seletivo para neoepitopos competiu com o 5anl79ME não seletivo para neoepitopos, apenas o último competiu com 5anl80ME e 5an048ME, mostrando que 5anl79ME e 5anl78ME se ligam a epitopos diferentes que são acessíveis tanto em C5 como em C5a. Os resultados indicam também que algumas combinações dos anticorpos podem ser utilizados em ensaios baseados em sanduíche para detetar e/ou quantificar a quantidade de C5a numa amostra.
Exemplo 3. Humanização de anticorpos de ratinho anti-C5a humana selecionados
As regiões variáveis de dois anticorpos de ratinho anti-C5a humana relacionados - 5anl0lME e 5anl85ME - foram selecionados para humanização como anticorpos IgG inteiros. A humanização de regiões variáveis de cadeia leve e pesada foi baseada na identificação de regiões estruturais individuais de anticorpos humanos (com uma preferência dada ao genes v da linha germinativa) com um elevado grau de identidade de sequência com o anticorpo parental original de murídeo. Os métodos para a identificação de regiões estruturais candidatas adequadas são descritos na patente U.S. no. 7,393, 648 para Rother e Wu. As definições de estrutura (FW) e regiões determinantes de complementaridade (CDR) foram realizadas de acordo com métodos descritos por Rabat, Chothia e IMGT® (Sistema Internacional de Informação ImmunoGenetics; França). Resumidamente, as consultas da base de dados foram realizadas de forma independente para ambas as regiões variáveis de cadeia leve e pesada com uma variedade de fragmentos de anticorpo incluindo: a região variável intata de murídeo de FWl a FW4, as regiões variáveis intatas de murídeo excluindo as CDR e todos os possíveis fragmentos de regiões variáveis de murídeo incluindo uma, duas ou três estruturas com ou sem as suas CDR flanqueadoras. As estruturas humanas foram selecionadas a partir deste banco candidato com base na sua identidade de sequência qlobal com os anticorpos originais de murídeo e fragmentos destes. Métodos de biologia molecular de rotina foram empregues para montar pequenas bibliotecas combinatórias, de menos de 103 membros, em que cada conjunto de CDR de murídeo era flanqueado por todas as combinações possíveis de estruturas humanas selecionadas. Estes anticorpos humanizados foram expressos como Fab solúveis e avaliados quanto à ligação a C5a desarginada utilizando ELISA. Os Fab que se ligaram a C5a foram então sujeitos a análise da sequência de ADN. A partir destes ligadores, um subconjunto de seis Fab humanizados foi reformatado como IgG inteiras (IgG2 humana ou IgG2/G4 humana). Mais humanização foi efetuada em dois anticorpos (BNJ371 e BNJ381) através da substituição de resíduos de murídeo na CDR2 da cadeia leve pelos seus aminoácidos correspondentes da linha germinativa humana. As sequências de aminoácidos dos anticorpos anti-C5a humanizados - BNJ364, BNJ367, BNJ371, BNJ378, BNJ366, BNJ369, BNJ381, e BNJ383 - são expostas na Tabela 2 acima.
Exemplo 4. Determinação da afinidade dos anticorpos anti-C5a humana humanizados para C5a
Os anticorpos humanizados foram sujeitos a análise BIAcore para quantificar as suas respetivas afinidades para C5a humana. Ver, p. ex., Karlsson e Larsson (2004) Methods Mol. Biol. 248:389-415. Resumidamente, cada um dos anticorpos humanizados foi rastreado com 3-4 concentrações de C5a humana (antigénio) utilizando uma técnica de captura. Os anticorpos foram capturados através de um Anti-Fc (humano) diretamente imobilizado num chip sensor CM5 com várias concentrações no intervalo de 0,6 nM a 5,9 nM de C5a humana passadas sobre a superfície do chip sensor. A superfície foi regenerada com HC1 20 mM, P20 a 0,02% após cada ciclo para remover o anticorpo e o antigénio ligados. Os dados foram avaliados utilizando suporte lógico BIAevaluation de Biacore utilizando um Modelo de Ajuste de Langmuir 1:1 (Rmax:Global Fit; RI:Local Fit) . A informação da cinética tal como (ka: constante de Velocidade de Associação), (kd:
Constante da Velocidade de Dissociação) e Kd (Constante de Dissociação em Equilíbrio) foi obtida a partir do ajuste. Os resultados das análises são apresentados na Tabela 4. Estas experiências foram para fins de pesquisa com um número mínimo de concentrações de analito (3 a 4) com 1 duplicado. Portanto, os valores aproximados da cinética são relatados na Tabela 4.
Todos os anticorpos humanizados ligaram-se especificamente a C5a humana com uma kD de menos de 1,2 0 nanomolar. Todos os anticorpos com a exceção de BNJ371 ligaram-se a C5a humana com uma Kd de menos de 1 nanomolar. Três dos anticorpos, BNJ369, BNJ381, e BNJ383 ligaram-se a C5a humana com uma Kd de menos de 100 picomolar.
Exemplo 5. Os anticorpos anti-C5a inibem a sinalização mediada por C5a in vitro
Foi utilizado um ensaio in vitro de ativação de neutrófilos para avaliar a atividade dos anticorpos humanizados. O ensaio é geralmente descrito, p. ex., em Paczkowski et al. (1999) Br. J. Pharmacol. 128(7):1461-1466, e serve para quantificar a quantidade de mieloperoxidase (MPO) produzida por neutrófilos como medida de ativação de neutrófilos.
Resumidamente, células polimorfonucleares, a maioria das quais sendo neutrófilos, foram isoladas usando centrifugação de densidade (meio de separação mono-Poly número de catálogo: 91698049; MP Biochemicals; Solon, Ohio) de sangue completo de um dador saudável. As células foram lavadas uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e os glóbulos vermelhos (RBC) removidos da população celular através de lise numa solução hipotónica (tampão de Use ACK número de catálogo 10-548E; Lonza) . Após mais duas lavagens com PBS, as células livres de glóbulos vermelhos foram ressuspensas a uma concentração de 4χ106 células/mL em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS; Mediatech, número de catálogo: 21-023-CV), que foi suplementada com cálcio e magnésio e suplementada ainda com gelatina a 0,1% (Sigma Aldrich; St. Louis, Missouri) [daqui em diante tampão de ensaio].
Citocalasina B (Sigma Aldrich) foi adicionada à suspensão celular numa quantidade suficiente para atingir uma concentração de 10 μg/mL. A suspensão foi então incubada durante 10 minutos a 37°C. Foram adicionados 100 pL de células aos poços de placas de 96 poços de fundo em U. Os poços da placa foram agrupados em vários conjuntos diferentes. Cada um dos vários conjuntos diferentes de poços continha um anticorpo anti-C5a: cada poço do conjunto 1 continha um anticorpo humanizado que se liga a C5 nativa, não clivada, mas não se liga a C5a livre; cada poço do conjunto 2 continha o anticorpo anti-C5a humanizado BNJ367; cada poço do conjunto 3 continha o anticorpo anti-C5a humanizado BNJ369; cada poço do conjunto 4 continha o anticorpo anti-C5a humanizado BNJ371; cada poço do conjunto 5 continha o anticorpo anti-C5a humanizado BNJ378; cada poço do conjunto 6 continha o anticorpo anti-C5a humanizado BNJ381; e cada poço do conjunto 7 continha o anticorpo anti-C5a humanizado BNJ383. Nenhum dos poços de um oitavo conjunto de poços continha anticorpo. Um intervalo de concentrações de anticorpo foi avaliado em cada conjunto de poços, o intervalo incluindo 0,08 nM, 0,4 nM, 2 nM, e 10 nM de anticorpo. C5a (obtida em Complement Technologies, Inc.) foi avaliada a uma concentração de 2 nM. Uma concentração de trabalho de 10x de 20 nM foi preparada no tampão de ensaio acima mencionado e foram adicionados 20 pL a cada poço. Após a adição de C5a aos poços, a placa foi incubada durante 10 minutos a 37 °C. Após a incubação, 60 pL de PBS foram adicionados a cada poço da placa. As placas foram sujeitas a centrifugação a 1200 rpm (aproximadamente 335 xg) durante 10 minutos à temperatura ambiente. Foram transferidos 100 pL do sobrenadante de cada poço para o poço correspondente de uma segunda placa. Foram adicionados 25 pL de substrato (Sigma Aldrich número de catálogo T0440) a cada poço da segunda placa e a reação de peroxidase foi deixada revelar durante aproximadamente dois a cinco minutos. A reação foi terminada através da adição de 25 yL de HC1 1 N. A DO a 450 nM foi registada.
Tal como mostrado na Fig. 2, todos os anticorpos anti-C5a humanizados inibiram a ativação de neutrófilos in vitro. Estes resultados indicam que os anticorpos anti-C5a humanizados aqui descritos são potentes inibidores da sinalização mediada por C5a in vitro e apoiam a conclusão dos inventores de que os anticorpos são úteis para tratamento de uma variedade de distúrbios associados ao complemento (p. ex., distúrbios inflamatórios associados ao complemento) em humanos.
Exemplo 6. Caracterização de um anticorpo de ratinho substituto anti-5a de ratinho
Uma série de ensaios em sanduíche foi realizada num anticorpo IgG selecionado de ratinho anti-C5a de ratinho -5anl95ME - para determinar a especificidade do anticorpo para C5a. Resumidamente, os poços de uma placa de ensaio foram revestidos com o anticorpo 5anl95ME. A placa foi lavada cuidadosamente para remover o anticorpo não ligado. Em seguida, os poços contendo 5anl95ME foram colocados em contato com C5a de ratinho durante um tempo e sob condições suficientes para permitir que o antigénio se ligasse ao anticorpo. A proteína não ligada foi removida com lavagem. Após o passo de lavagem, os poços foram ainda colocados em contacto com uma solução contendo um segundo anticorpo anti-C5a biotinilado. Os poços foram novamente lavados para remover qualquer segundo anticorpo não ligado. A quantidade de ligação do segundo anticorpo ao poço foi quantificada utilizando peroxidase de rábano (HRP) conjugada com estreptavidina. A quantidade de ligação do segundo anticorpo era uma função da ligação de C5a a 5anl95ME.
Numa experiência paralela, um conjunto de poços revestidos com 5anl95ME foi incubado com proteína C5 de ratinho inteira, em vez de C5a. Após um passo de lavagem, os poços foram colocados em contato com uma solução contendo um segundo anticorpo: um anticorpo biotinilado anti-C5 de ratinho. A quantidade de ligação do segundo anticorpo, em função da quantidade de C5 ligada a 5anl95ME, foi quantificada utilizando a construção de HRP conjugada com estreptavidina. A ausência de ligação do segundo anticorpo indica que 5anl95ME não se liga a C5 de ratinho inteira.
Embora 5anl95ME se ligasse a C5a de um modo dependente da dose, não foi detectada ligação entre o anticorpo e a C5 de ratinho inteira utilizando este ensaio. Estes resultados indicam que 5anl95ME se liga a um neo-epitopo presente em C5a. A afinidade de ligação relativa de 5anl95ME para C5a de ratinho foi ainda quantificada utilizando BIAcore. A cinética de 5anl95ME foi medida utilizando uma técnica de captura. 0 anticorpo foi capturado através de um anti-Fc (ratinho) diretamente imobilizado num chip sensor CM5 com várias concentrações entre, e inclusive, 0,4 nM e 25 nM de C5a de ratinho passadas sobre a superfície do chip sensor. Foram também corridos duplicados de cada concentração. A superfície do chip foi regenerada com glicina-HCl 10 mM pH 1,7 após cada ciclo para remover o anticorpo ligado e o antigénio. Os dados foram avaliados utilizando suporte lógico Biacore BIAevaluation utilizando um Modelo de Ajuste de Langmuir 1:1 (Rmax:Global Fit; RI:Local Fit) . A informação da cinética tal como ka (constante da Velocidade de Associação), kd (constante da Velocidade de Dissociação) e Kd (constante de Dissociação em Equilíbrio) foi obtida a partir do ajuste. Os resultados das análises cinéticas são mostrados na Tabela 5.
Estes resultados indicam que o anticorpo de ratinho anti-C5a de ratinho é não só específico para C5a, em comparação com a C5 de ratinho inteira, como também que o anticorpo se liga com elevada afinidade a C5a de ratinho.
Exemplo 7. Utilização do anticorpo anti~C5a de ratinho substituto 5anl95ME num modelo animal de AR 0 anticorpo anti-C5a de ratinho 5anl95ME foi avaliado num modelo de ratinho de artrite induzida por colagénio. Ratinhos DBA/lLacJ machos (9 a 12 semanas de idade) foram imunizados através de injeção intradérmica na base da cauda com 300 yg de colagénio bovino tipo II emulsionado com volumes iguais de adjuvante completo de Freund. O procedimento foi repetido duas semanas após a primeira imunização. Os ratinhos foram inspecionados diariamente para identificar a inflamação inicial numa articulação de joelho. Uma vez identificada a inflamação inicial, foi administrado aos ratinhos por via intraperitoneal três vezes/semana o anticorpo anti-C5a de ratinho 5anl95ME (40 mg/kg) ou um anticorpo de controlo (40 mg/kg). A espessura da articulação inicialmente inflamada (em mm) foi medida diariamente até ao dia 12.
Tal como mostrado na Fig. 3, 5anl95ME reduziu a espessura da articulação do joelho em comparação com o anticorpo de controlo. 5anl95ME pareceu proporcionar o beneficio de manter uma espessura da articulação do joelho inferior a 4,5 mm.
Além de avaliar a capacidade do anticorpo 5anl95ME para reduzir o inchaço da articulação do joelho inicialmente inflamada, foi também avaliada a capacidade do anticorpo anti-C5a 5anl95ME para impedir a migração da inflamação para novas articulações. 0 número de articulações recém-recrutadas foi medido diariamente do dia 1 ao dia 12. Os resultados da experiência são expostos na Tabela 6.
Tal como mostrado na Tabela 6, os ratinhos tratados com 5anl95ME tiveram menos articulações recém-inflamadas em comparação com os animais tratados com Ac de controlo pelo dia 12. Os ratinhos tratados com 5anl95ME tinham também, em média, acentuadamente menos articulações recém-inflamadas. A artrite nos ratinhos foi também monitorizada e definida utilizando uma pontuação clinica/indice de artrite. Cada membro foi graduado diariamente de acordo com um sistema de pontuação estabelecido (0, articulação normal; 1, eritema e inchaço visível leve/moderado; 2, eritema e inchaço grave afetando uma pata ou articulação inteira; 3, pata deformada ou articulação com anquilose), com uma pontuação máxima de vinte e quatro por animal. Ver, p. ex. , Wang et ai. (2000) J. Immunol. 164:4340-4347. Tal como mostrado na Fig. 4, os ratinhos tratados com o anticorpo anti-5a de ratinho 5anl95ME exibiram uma redução acentuada da pontuação clínica (pontuação média de menos de 1), em comparação com os ratinhos tratados com o anticorpo de controlo (pontuação média acima de 6), ao longo do curso do estudo.
Em resumo, estes resultados indicam que o anti-C5a de ratinho substituto é eficaz em tratamento de AR - tanto numa articulação inicial como na migração da inflamação para articulações secundárias - no modelo de ratinho da doença. Os resultados sugerem também fortemente que um anticorpo anti-C5a humana terapêutico, tal como qualquer um dos anticorpos anti-C5a humanizados aqui descritos, é útil para tratamento de humanos com AR.
Exemplo 8. Utilização de um anticorpo anti-C5a para tratar artrite reumatoide
Um paciente humano é identificado por um médico assistente como tendo artrite reumatoide numa única articulação articulada. Ao paciente é administrado pouco depois por via intra-articular ou intraperitoneal uma composição contendo um anticorpo anti-C5a humanizado aqui descrito numa quantidade suficiente para reduzir a sinalização de C5a mediada por C5aRl localmente dentro do espaço da articulação. 0 paciente e o médico assistente observam uma melhoria substancial em pelo menos dois sintomas de artrite reumatoide após o tratamento. 0 paciente recebe "doses de manutenção" administradas por via intravenosa do anticorpo a cada mês para prevenir a recorrência dos sintomas, para evitar a progressão da AR numa única articulação, ou para evitar a migração dos sintomas de AR para uma segunda articulação.
Exemplo 9. Utilização de um anticorpo anti~C5a para tratamento de sepsia
Um paciente humano é identificado por um médico assistente como tendo sepsia. Ao paciente é administrada pouco depois uma composição contendo um anticorpo anti-C5a humanizado aqui descrito a uma dose de cerca 600 a 900 mg por via de infusão intravenosa. O paciente e o médico assistente observam uma melhoria substancial em pelo menos dois sintomas conhecidos de sepsia durante o tratamento. O paciente recebe "doses de manutenção" administradas por via intravenosa do anticorpo a cada duas semanas até o paciente deixar o hospital.
Exemplo 10. Utilização de um anticorpo anti-C5a para tratar distúrbios_inflamatórios_pulmonares_associados_ao complemento
Um paciente humano é identificado por um médico assistente como tendo uma forma grave de DPOC. Uma vez a cada duas semanas durante quatro semanas é administrada ao paciente uma composição contendo um anticorpo anti-C5a humanizado a uma dose de aproximadamente 600 mg a 900 mg através de infusão intravenosa. O paciente e médico assistente observam uma melhoria substancial em pelo menos dois sintomas conhecidos de DPOC durante o tratamento inicial. Por exemplo, o paciente a receber o anticorpo anti-C5a tem uma frequência e/ou gravidade das exacerbações relacionadas com DPOC reduzidas. O paciente continua a receber "doses de manutenção" administradas por via intravenosa do anticorpo a cada duas semanas para manter a frequência e/ou gravidade das exacerbações relacionadas com a DPOC reduzidas.
Um paciente humano é identificado por um médico assistente como tendo uma forma grave de asma. Ao paciente é prescrito um anticorpo anti-C5a humanizado terapêutico a administrar por meio de um inalador. Durante o próximo ataque de broncospasmos, o paciente autoadministra o anticorpo anti-C5a numa quantidade suficiente para reduzir a resposta inflamatória mediada por C5a nos pulmões do paciente. O paciente continua a usar o inalador conforme necessário para prevenir ou diminuir a gravidade dos ataques de asma.
Exemplo 11. Anticorpos anti-C5a adicionais identificados a partir dos ratinhos imunizados Vários anticorpos adicionais foram obtidos a partir dos ratinhos imunizados (ver Exemplo 1) e ainda identificados através de ELISA como capazes de se ligar a C5a humana. Os anticorpos adicionais incluem 15 conjuntos únicos de CDR de cadeia leve (expostos na Tabela 7) e 14 conjuntos únicos de CDR de cadeia pesada (tal como expostos na Tabela 8).
Os emparelhamentos de Vl e Vh dando origem aos anticorpos 5anl77ME, 5an054ME, 5anllOME, 5anl88ME, 5anl85ME, e 5anl07ME são evidentes a partir das Tabelas 7 e 8. Emparelhamentos exemplares adicionais de regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve e/ou conjuntos de CDR são expostos na Tabela 9 abaixo.
Exemplo 12. Anticorpos anti-C5a humana humanizados adicionais Várias regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpos anti-C5a humanizados adicionais foram geradas, todas as quais quando emparelhadas com uma região variável de cadeia leve comum (a cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 16) se ligaram a C5a humana com uma Kd de menos de 1 nM, tal como determinado através de análise Biacore (ver acima para metodologia) . Todos estes anticorpos humanizados adicionais ligaram-se especif icamente a C5a humana, mas não se ligaram a C5 humana nativa, totalmente dobrada, C4a, ou C3a tal como determinado através de análise Octet (ver acima para metodologia). Os anticorpos humanizados adicionais continham: (i) uma região estrutural 1 da região variável de cadeia pesada contendo uma das seguintes sequências de aminoácidos: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO:68)
ou QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO:69); (ii) uma região estrutural 2 da região variável de cadeia pesada contendo uma das seguintes sequências de aminoácidos: WVRQAPGQGLEWMG (SEQ ID NO:70) ou WVRQASGKGLEWVG (SEQ ID NO:71); (iii) uma região estrutural 3 da região variável de cadeia pesada contendo uma das seguintes sequências de aminoácidos: RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID
NO:72); RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO:73); ou RVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCAR (SEQ ID NO:74); e uma região estrutural 4 da região variável de cadeia pesada contendo a seguinte sequência de aminoácidos: WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:75). Regiões variáveis de cadeia pesada humanizadas adicionais exemplares compreendendo um ou mais dos conjuntos de estruturas humanizadas adicionais descritos nesta seção são expostos na Fig. 5.
Exemplo 13. Utilização de um anticorpo anti-C5a humana num modelo de ratinho de neutropenia
Um modelo de murídeo de neutropenia de C5a foi utilizado para avaliar a eficácia de um anticorpo anti-C5 humana livre in vivo. Para induzir neutropenia, C5a humana nativa, purificada (hC5a) foi administrada por meio de injeção intravenosa na veia caudal em ratinhos Balb/c. 0 número de neutrófilos em circulação foi avaliado até cinco minutos após administração de hC5a.
Verificou-se consistentemente que a administração de 300 yg/kg de hC5a induz ativação de neutrófilos, medida através do ensaio de libertação de mieloperoxidase (MPO) (ver Exemplo 5 para utilização com soro em comparação com sobrenadante de cultura celular, supra) e neutropenia (uma redução no número de neutrófilos em circulação). Além disso, os níveis plasmáticos de hC5a e de anticorpo anti-C5a humana BNJ383 (quando administrados aos ratinhos, infra) foram também medidos para estabelecer a resposta farmacodinâmica (ver abaixo).
As contagens de neutrófilos no sangue periférico foram examinadas antes do confronto com hC5a ou veículo de controlo. Em comparação com ratinhos de controlo tratados de forma simulada (1,37 ± 0,09 χ 106/mL), as contagens de neutrófilos em ratinhos tratados com anticorpo anti-C5 humana livre (1,32 ± 0,13 χ 106 por mL a 24 mg/kg; P >0,05) ou mAb de controlo do isotipo (1,31 ± 0,10 χ 106 por mL a 24 mg/kg; P >0,05) permaneceram as mesmas. Estes resultados indicaram que o anticorpo sozinho não induziu alterações nas contagens de neutrófilos em circulação.
Para avaliar a eficácia de um anticorpo anti-C5a para inibir neutropenia induzida por hC5a em ratinhos, foram administradas dosagens diferentes (24 mg/kg, 12 mg/kg, 6 mg/kg, e 3 mg/kg) do anticorpo anti-C5a humana BNJ383 a ratinhos Balb/c 24 horas antes da injeção de hC5a. A administração do anticorpo anti-C5a 24 horas antes de hC5a permitiu que as propriedades farmacodinâmicas do anticorpo fossem estudadas durante a fase β de eliminação de anticorpos dos ratinhos.
Tal como mostrado na Fig. 6, as contagens de neutrófilos após o tratamento são expressas como uma percentagem do "limiar" (onde a contagem no tempo 0 é igual a 100%) . Em ratinhos de controlo tratados de forma simulada, as contagens de neutrófilos foram de 79,02 ± 5,71%, 67,42 ± 3,23% e 59,54 ± 2,11% do limiar a 1, 3 e 5 minutos após a administração de hC5a, respetivamente. Os ratinhos tratados com anticorpo de controlo do isotipo demonstraram uma redução significativa (P <0,01) na contagem de neutrófilos a 6,76 ± 0,81% a 1 minuto, 6,68 ± 0,81% a 3 minutos, e 8,29 ± 0,79% a 5 minutos após injeção intravenosa de hC5a. O anticorpo anti-C5a apresentou um efeito dependente da dose na neutropenia induzida por hC5a. À dose mais elevada, 24 mg/kg, o anticorpo anti-C5a bloqueou completamente a neutropenia. As contagens de neutrófilos foram de 70,35 ± 8,64% a 1 minuto, 63,35 ± 6,08% a 3 minutos, e 59, 65 ± 6,51% a 5 minutos, o que foi comparável com os níveis de neutrófilos nos animais de controlo tratados de forma simulada nos mesmos instantes. As doses mais baixas de 12 mg/kg ou 6 mg/kg do anticorpo anti-C5a também inibiram significativamente o esgotamento de neutrófilos (12 mg/kg: 42,61 ± 5,12% a 1 minuto, 45,33 ± 8,29% a 3 minutos, e 41,02 ± 7,08% a 5 minutos, P <0,01; 6 mg/kg: 18,00 ± 3,8 a 1 minuto, 26,20 ± 4,44% a 3 minutos, e 28,03 ± 4,51 % a 5 minutos, P <0,05) após administração de hC5a, em comparação com o grupo do anticorpo de controlo do isotipo (6,76 ± 0,81% a 1 minuto, 6,68 ± 0,81% a 3 minutos, e 8,29 ± 0,79% a 5 minutos). O anticorpo de controlo do isotipo é um anticorpo que se liga ao antigénio protetor de antraz 63 e contém uma região Fc humana de isotipo IgG2/4. A administração da dose mais baixa do anticorpo anti-C5a (3 mg/kg) não reduziu significativamente a neutropenia (6,28 ± 0,88% a 1 minuto, 6,71 ± 2,14% a 3 minutos, e 8,75 ± 2,98% a 5 minutos, P >0,05). Ver Fig. 6. O anticorpo anti-C5a humana inibe a libertação de MPO induzida por hC5a in vivo
Tal como discutido acima, a C5a humana ativa os neutrófilos através da ligação ao recetor de C5a de ratinho reativo de forma cruzada. A libertação de miloperoxidase (MPO) é uma consequência da ativação de neutrófilos através da ligação de C5a a C5aR. Ver Darren et al. , (2004) Mol. Pharm. 65(4):868-879. A injeção intravenosa de C5a humana recombinante no ratinho pode reduzir a neutropenia e ativar os neutrófilos em circulação. A capacidade de um anticorpo anti-C5a humana livre para inibir a libertação de MPO devido à ativação de neutrófilos in vivo foi avaliada utilizando o anticorpo anti-C5a para se ligar a hC5a livre e impedir a ligação ao C5aR de murideo.
Uma experiência in vivo (em que a C5a humana foi administrada a ratinhos) foi realizada tal como é descrito acima. O nivel de MPO plasmática no tempo 0 foi de 79,25 ± 22,88 ng/mL no grupo de controlo tratado de forma simulada. Cinco minutos após a injeção intravenosa de tampão veiculo, os níveis de MPO estavam significativamente alterados (77,46 ± 21,21 ng/mL, P >0,05). Antes da injeção intravenosa de hC5a, os níveis de MPO nos animais tratados com anticorpo de controlo do isotipo (75,17 ± 14,66 ng/mL) ou anticorpo anti-C5a (87,57 ± 14,86 ng/mL) eram comparáveis com os níveis observados nos animais de controlo tratados de forma simulada. Após a injeção intravenosa de hC5a, os níveis de MPO em todas as doses de C5a estavam elevados e permaneceram a níveis significativamente mais elevados aos 5 minutos (Fig. 7).
Quando comparados com os animais tratados com anticorpo de controlo do isotipo (221,00 ± 51,02 ng/mL), os animais tratados com anticorpo anti-hC5a mostraram redução dependente da dose dos níveis de MPO (114,83 ± 23,26 ng/mL, P <0,05, na coorte de 24 mg/kg; 104,80 ± 29,83 ng/mL, P <0,05, na coorte de 12 mg/kg; e 126,90 ± 36,40 ng/mL, P=0,08, na coorte de 6 mg/kg). Os níveis de MPO dos animais tratados com dose baixa (3 mg/kg) de anticorpo anti-C5a (176,55 ± 23,05 ng/mL) não foram significativamente diferentes daqueles dos animais tratados com anticorpo de controlo de isotipo (p >0,05).
Um anticorpo anti-C5a reduz os niveis de hC5a em circulação em ratinhos
Tal como observado acima, C5a é um potente péptido inflamatório com várias funções biológicas. Estes estudos acima demonstraram que a C5a humana reage de forma cruzada com C5aR de murídeo em neutrófilos uma vez que a injeção intravenosa de C5a humana recombinante pode induzir neutropenia. Embora esta divulgação não esteja de modo algum limitada por qualquer teoria ou mecanismo de ação particular, o anticorpo anti-C5a pode estar a inibir neutropenia induzida por C5a humana através da formação de complexos com hC5a e impedindo a hC5a de se ligar ao C5aR de murideo expresso na superfície celular. Os níveis de hC5a foram medidos no plasma de ratinhos antes e 1, 3, e 5 minutos após a administração intravenosa de hC5a para confirmar que os efeitos do anticorpo anti-hC5a in vivo eram devidos à sua inibição dependente de ligação de hC5a.
Foi realizada uma experiência tal como é descrito acima utilizando o modelo de neutropenia induzida por hC5a de ratinho. hC5a não foi detetada no plasma em nenhum grupo de ratinhos antes da administração de hC5a no tempo 0, usando um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA). O nível de hC5a no plasma, no entanto, aumentou para um pico a 1 minuto (7783,50 ± 327,73 ng/mL), em seguida reduziu para 4788,38 ± 260,51 ng/mL a 3 minutos, e em seguida para 3855,75 ± 298,99 ng/mL a 5 minutos após injeção intravenosa de hC5a (no ratinho tratado com mAb de controlo do isotipo). Em comparação com os ratinhos tratados com anticorpo de controlo, o nível de hC5a em ratinhos tratados com 24 mg/kg do anticorpo anti-C5a apresentaram um declínio de 43, 30, e 23 vezes a 1 minuto (178,4 ± 14,14 ng/mL), 3 minutos (158,4 ± 10,43 ng/mL), e 5 minutos (167,2 ± 15,61 ng/mL), respetivamente. Os níveis de hC5a no plasma das coortes de 12 mg/kg e 6 mg/kg foram 235,00 ± 22,33 e 609,20 ± 78,75 ng/mL a 1 minuto, 210,80 ± 19,59 e 527,60 ± 52,25 ng/mL a 3 minutos, 192,20 ± 7,40 e 505,00 ± 45,96 ng/mL a 5 minutos, respetivamente. Os ratinhos tratados com anti-C5a apresentaram níveis de hC5a significativamente reduzidos de um modo dependente da dose durante neutropenia após injeção intravenosa de hC5a (P <0,001). Embora os ratinhos recebendo a dose mais baixa de anticorpo anti-C5a (3 mg/kg) não tivessem sido poupados de neutropenia induzida por hC5a, os ratinhos tiveram contudo uma redução significativa da hC5a plasmática (3130,40 ± 433,58 ng/mL a 1 minuto; 1932,00 ± 268,92 ng/mL a 3 minutos; 1593,00 ± 169,68 ng/mL a 5 minutos) em comparação com os níveis plasmáticos de hC5a verificados nos ratinhos tratados com anticorpo de controlo do isotipo (P <0,05) . Ver Fig. 8. Estes dados indicaram que a administração de anticorpo anti-C5a a ratinhos diminuiu significativamente a concentração de hC5a livre no plasma, resultando numa neutropenia induzida por hC5a muito melhorada.
Em conjunto, estes resultados apresentados nesta seção indicaram que um anticorpo anti-C5a humana aqui descrito pode inibir o efeito biológico da C5a humana em condições de doença in vivo e proporcionam fortes evidências de que os anticorpos (e fragmentos de ligação de antigénio destes) são úteis para, entre outras coisas, tratar ou prevenir distúrbios associados ao complemento, tais como qualquer um dos aqui citados.
Exemplo 14. O anticorpo anti-C5a humana reage de forma cruzada com C5a de primatas não humanos Vários anticorpos anti-hC5a humanizados foram testados quanto à sua capacidade para reagir de forma cruzada com C5a de uma ou mais espécies de mamíferos não humanos. Tal como observado acima, os benefícios de um tal anticorpo anti-C5a são numerosos, p. ex., a capacidade de um investigador ou médico assistente modela a eficácia de um anticorpo anti-C5a terapêutico num modelo de doença não humano antes da administração do anticorpo a humanos. Os testes em mamíferos não humanos podem também permitir a determinação ou aproximação da dosagem apropriada de um anticorpo anti-C5a necessária para eficácia em humanos.
Resumidamente, BNJ369, BNJ366, BNJ364, e BNJ383 (descritos acima) foram avaliados para determinar se poderiam co-imunoprecipitar a proteína C5a no soro ativado de vários primatas não humanos, incluindo babuíno, macaco rhesus, e macaco cinomolgo. 0 soro foi ativado através da adição de zimosan. Após incubação de um dia para o outro de cada anticorpo com soro ativado, os anticorpos foram separados da fase de solução utilizando contas de agarose conjugadas com proteína A. As contas foram lavadas cuidadosamente e depois fervidas em tampão de amostra de eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) contendo β-mercaptoetanol. As amostras fervidas foram então sujeitas a SDS-PAGE. A C5a de primata não humano foi detetada através de western blot utilizando o anticorpo anti-neoepitopo de C5a comercialmente disponível #2942 (Abeam, Cambridge, MA). Cada um dos anticorpos testados foi capaz de imunoprecipitar C5a (ou C5a desarg) de babuíno, macaco rhesus, e macaco cinomolgo indicando que o anticorpo é reativo de forma cruzada com C5a destas espécies bem como com C5a humana. A determinação dos parâmetros da afinidade de ligação à C5a de macaco cinomolgo foi determinada tal como é descrito acima. Resumidamente, o anticorpo BNJ383 foi pesquisado contra 3-4 concentrações de C5a recombinante de macaco cinomolgo (antigénio) utilizando uma técnica de captura tal como é descrito acima. 0 anticorpo foi capturado através de um Anti-Fc (humano) diretamente imobilizado num chip sensor CM5 com várias concentrações no intervalo de 0,6 nM a 5,9 nM de C5a de cinomolgo passada sobre a superfície do chip sensor. A superfície foi regenerada com HC1 20 mM, tensioativo P20 a 0,02% (Biacore) após cada ciclo para remover o anticorpo e o antigénio ligados. Os dados foram avaliados utilizando suporte lógico BIAevaluation de Biacore utilizando um Modelo de Ajuste de Langmuir 1:1 (Rmax:Global Fit; RI:Local Fit). Estas experiências foram para fins de pesquisa com um número mínimo de concentrações de analito (3 a 4) com 1 duplicado. A Kd aproximada do anticorpo para a C5a de macaco cinomolgo é de 3,3 nM. Ver Tabela 10.
Tabela 10. Determinação da Afinidade para proteínas C5a Não
Humanas
O anticorpo BNJ383 foi também pesquisado contra 3-4 concentrações de C5a de ratinho recombinante (antigénio) utilizando uma técnica de captura tal como é descrito acima para determinar a sua afinidade para a proteína de ratinho. O anticorpo foi capturado, tal como descrito acima, através de um anti-Fc (humano) diretamente imobilizado num chip sensor CM5 com várias concentrações no intervalo de 0,6 nM a 5,9 nM de C5a de ratinho passada sobre a superfície do chip sensor. A superfície foi regenerada com HC1 20 mM, P20 a 0,02% após cada ciclo para remover o anticorpo e o antigénio ligados. Os dados foram avaliados utilizando suporte lógico BIAevaluation de Biacore usando um Modelo de
Ajuste de Langmuir 1:1 (Rmax:Global Fit; RI:Local Fit).
Os resultados acima indicaram que vários dos anticorpos anti-hC5a humanizados aqui descritos são reativos de forma cruzada com C5a de várias espécies de primatas não humanos incluindo macaco cinomolgo, macaco rhesus, e babuíno. 0 anticorpo BNJ383; p. ex., também reage de forma cruzada com C5a de ratinho. Além disso, os resultados descritos nesta secção indicam que um anticorpo anti-C5a humana, tal como BNJ383, é útil não só em aplicações clínicas para tratamento de distúrbios associados ao complemento, como também numa variedade de aplicações pré-clínicas em mamíferos não humanos, que são necessárias, ou de suporte, para aprovação do uso clínico em humanos.
Exemplo 15. Competição pela ligação a C5a
Foi realizada uma experiência para avaliar a ligação de um anticorpo anti-C5a aqui descrito, BNJ383, na presença de antigénios potencialmente competitivos. Resumidamente, BNJ383 (250 pM) marcado com ruténio foi incubado durante duas horas à temperatura ambiente com C5a biotinilada 1 nM, juntamente com várias concentrações (p. ex., 400, 133, 44,4, 14,8, 4,9, 1,6, e 0,5 nM) de um dos seguintes: (a) proteína C5a humana desarg em solução salina tamponada com fosfato, (b) plasma humano, (c) plasma de macaco cinomolgo, (d) plasma de Balb/C (ratinho), ou (e) plasma de DBA/2J (ratinho). Em relação aos componentes do plasma (b), (c), (d) , e (e) , a concentração refere-se à concentração final aproximada do antigénio C5 na mistura de incubação.
Após o período de incubação, as amostras foram colocadas em contato com os respetivos poços individuais de uma placa de ensaio revestida com estreptavidina sob condições que permitiram a ligação de C5a biotinilada à estreptavidina nos poços da placa. Os poços foram lavados cuidadosamente para remover o material não ligado. A quantidade de ligação de BNJ383 a C5a na presença de competidor foi determinada através de deteção da quantidade de sinal produzido a partir do marcador detetável de ruténio. Os resultados são mostrados na Fig. 9.
Embora a C5a humana desarg fosse um competidor eficaz, praticamente não foi observada qualquer competição na presença de soro de ratinho (17% de redução no sinal detetável observado aproximadamente a uma razão de 400:1 de C5 derivada de plasma de ratinho Balb/C para C5a humana biotinilada e 25% de redução no sinal detetável observado a aproximadamente uma razão de 400:1 de C5 derivada do plasma de DBA2/J para C5a humana biotinilada). Não foi observada qualquer mudança no nível de ligação de BNJ383 a C5a humana biotinilada a até aproximadamente uma razão de 15:1 de C5 derivada de plasma humano ou de macaco cinomolgo para C5a humana biotinilada.
Tal como observado acima, embora a divulgação não esteja de modo algum limitada a qualquer teoria ou mecanismo de ação particular, os inventores colocam a hipótese de o anticorpo anti-C5a poder ligar-se a uma subpopulação de C5 processada, não clivada (p. ex., C5 plasmática) constituindo menos de 10% da população total de C5 inteira numa amostra (p. ex., uma amostra de plasma), subpopulação que é no todo ou em parte desnaturada de modo a que um neoepitopo de C5a de outro modo oculto, ao qual o anticorpo anti-C5a ou fragmento se liga, fique exposto. Assim, acredita-se que o anticorpo não se liga a uma C5 totalmente funcional e/ou a uma espécie de C5 totalmente funcional e assim não se liga verdadeiramente a C5 nativa, não clivada. 0 plasma humano é um competidor pelo menos aproximadamente 30 a 100 vezes mais fraco pela ligação a C5a biotinilada que a C5a humana desarg.
Apesar destas considerações, estes resultados indicam ainda que os anticorpos anti-C5a humana aqui descritos, tais como BNJ383, ligam-se de preferência a C5a humana livre mesmo na presença de um excesso de até aproximadamente 20 vezes de não clivada, mas não necessariamente à proteína C5 humana derivada do plasma inteiramente nativa.
Exemplo 16. Efeito do anticorpo anti-C5a na atividade da VA e da VC in vitro
Foi realizada uma experiência para avaliar o efeito de um anticorpo anti-C5a aqui descrito (BNJ383) na atividade da via alternativa (VA) do complemento in vitro utilizando soro normal humano reunido (PNHS). A experiência utilizou o Estojo do Complemento da Via Alternativa Wieslab® (Wieslab® COMPL AP330, Euro-Diagnostica, Suécia) e o protocolo associado foi seguido apenas com otimização de rotina dentro da competência de um vulgar perito na técnica. Resumidamente, alíquotas do PNHS foram incubadas em poços de uma placa revestida com lipopolissacárido durante uma hora (a 37°C) juntamente com várias concentrações (0,778, 0,389, 0, 194, 0, 097, 0, 049, 0,024, 0,012, 0, 006, 0, 003, e 0,002 μΜ) de um anticorpo anti-hC5 ou de um anticorpo anti-hC5a (BNJ383). O anticorpo anti-C5 inibe a clivagem de C5 humana nos fragmentos C5a e C5b; Como controlo negativo, vários poços foram incubados com PNHS sob as mesmas condições, mas na ausência de anticorpo anti-hC5 ou anticorpo anti-hC5a.
Após a incubação, os poços foram lavados cuidadosamente com tampão de lavagem lx fornecido com o estojo. 0 nivel de ativação da via alternativa do complemento foi medido através da absorvância a 405 nm, após o contacto de cada poço com um conjugado de enzima fornecido pelo estojo (um anticorpo anti-C5b-9 conjugado com fosfatase alcalina) e substrato fluorogénico (que é operado pela enzima) e incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente. Os resultados são mostrados na Fig. 10.
Embora o anticorpo anti-C5 tivesse inibido a atividade da via alternativa do complemento completamente a concentrações superiores a 0,1 μΜ, o anticorpo anti-hC5a não inibiu significativamente a atividade do complemento, mesmo na maior concentração testada.
Foi realizada uma experiência para avaliar o efeito de um anticorpo anti-C5a aqui descrito (BNJ383) na atividade da via clássica (VC) do complemento in vitro utilizando PNHS. A experiência utilizou o Estojo da Via Clássica do Complemento Wieslab® (Wieslab® COMPL CP310, Euro-Diagnostica, Suécia) e o protocolo associado foi seguido apenas com otimização de rotina bem dentro da competência de um vulgar perito na técnica. Resumidamente, alíquotas do PNHS foram incubadas em poços de uma placa revestida com anticorpo IgM humano durante uma hora (a 37°C) juntamente com várias concentrações (7,2, 3,6, 1,8, 0,9, 0,45, 0,2, 0,1, 0,05, 0,02, ou 0,01 μΜ) de um anticorpo anti-hC5 ou um anticorpo anti-hC5a (BNJ383). O anticorpo anti-C5 inibe a clivagem de C5 humana nos fragmentos C5a e C5b. Como controlo, vários poços foram incubados com PNHS sob as mesmas condições, mas na ausência de anticorpo anti-hC5 ou anticorpo anti-hC5a.
Após a incubação, os poços foram lavados cuidadosamente com tampão de lavagem 1χ fornecido com o estojo. 0 nível de ativação da via alternativa do complemento foi medido através da absorvância a 405 nm, após o contato de cada poço com um conjugado de enzima fornecido com o estojo (um anticorpo anti-C5b-9 conjugado com fosfatase alcalina) e substrato fluorogénico (que é operado pela enzima) e incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente. Os resultados são mostrados na Fig. 11.
Embora o anticorpo anti-C5 tivesse inibido a atividade do complemento pela via clássica completamente a concentrações superiores a 0,1 μΜ, o anticorpo anti-hC5a não inibiu de forma significativa a atividade do complemento, mesmo na concentração mais elevada testada.
Em conjunto, estes resultados indicam que, in vitro, ο anticorpo anti-hC5a, BNJ383, não afetou significativamente a geração de C5b-9 (ativação terminal do complemento) conduzida quer pela via clássica do complemento quer pela alternativa, dando assim mais provas de que os anticorpos anti-hC5a aqui descritos se dirigem especificamente ao braço de anafilatoxina da C5a livre de ativação do complemento.
Exemplo 17. O anticorpo anti-C5a mantém um local de ligação ao antigénio não ocupado disponível para ligar-se a C5a mesmo na presença de um excesso molar de hC5 0 anticorpo anti-C5a BNJ383 (exposto acima) foi incubado a 4°C durante 84 horas na presença de um excesso molar de C5 humana (hC5) de 2,1 vezes para permitir a formação do complexo de anticorpo de C5 completo. Foi realizada uma experiência paralela utilizando um anticorpo que se liga a C5 humana a uma estequiometria de 2:1 (daqui em diante o anticorpo anti-C5). Os complexos anticorpo:C5 foram separados numa coluna de exclusão de tamanho TSK™ G4000 SW (Tosoh, Tóquio) utilizando um sistema de HPLC Waters™ 2690/5 com um detetor de duplo comprimento de onda Waters™ W2487 para determinar a ocupação dos locais de ligação. Os picos foram monitorizados a um comprimento de onda de 214 nm. A fase móvel para a análise de HPLC continha a seguinte composição de tampão: NaH2P04 3, 9 mM, Na2HP04 6, 1 mM, um NaCl 150 mM, um pH 7,0. O caudal foi de 1,0 mL por minuto e o tempo de corrida foi de 20 minutos. Os dados foram adquiridos e analisados com suporte lógico de cromatografia Waters Empower™ 2.
Tal como representado na Fig. 12, BNJ383 sozinho (Fig. 12A) e hC5 sozinho (Fig. 12B) separam-se cada um como um pico único centrado em torno dos 10,2 minutos e >95% dos complexos anticorpo anti-C5a:hC5 separam-se como um pico único centrado em torno dos 9,2 minutos (Figura 12C) . Em contraste, os complexos de hC5 e o anticorpo anti-C5 separam-se em dois picos centrados nos 8,6 min (39%) e 9,2 min (61%) (Fig. 12D) . Assim, mesmo num excesso molar de hC5, 95,2% do BNJ383 tem um braço Fab livre que pode ser capaz de se ligar à C5a humana.
Estas amostras foram ainda examinadas para determinar se o anticorpo BNJ383 mantinha a capacidade para se ligar a C5a na presença de concentrações saturantes de C5. O anticorpo livre ou complexos anticorpo:C5 foram titulados de 500 a 0,5 ng/mL numa placa revestida com estreptavidina na qual foi imobilizada hC5a conjugada com biotina. O anticorpo capturado foi detetado com um anticorpo anti-Fc humano conjugado com peroxidase de rábano. Os resultados representados na Fig. 13 demonstram que o BNJ383 mesmo complexado com hC5 é capaz de se ligar a C5a e que a concentração de anticorpo disponível para se ligar a C5a não diminuiu de forma detetável na presença de C5 saturante. Assim, os resultados aqui descritos indicam que 0 anticorpo, mesmo na presença de um excesso molar de C5 não clivada, mantém a capacidade para se ligar a C5a livre com elevada afinidade e mantém deste modo, mesmo nesse excesso molar, a capacidade para inibir a atividade pró-inflamatória de C5a.
Exemplos 18. BNJ383 é um potente antagonista de C5a mas é um antagonista incompleto/parcial da formação do complexo terminal do complemento in vivo
Foi administrada de forma intravenosa a macacos cinomolgos uma dose única do anticorpo BNJ383 anti-C5a a 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg 250 mg/kg ou 400 mg/kg. Amostras de plasma foram colhidas a partir dos macacos a instantes variando de 1 dia a 30 dias após a administração do anticorpo. Os níveis de C5a/C5a desarg no plasma foram determinados através de um ensaio de eletroquimioluminescência (ECL) no qual uma C5a livre/C5a desarg foi capturada numa placa de microtitulação revestida com um anticorpo específico para um neoepitopo em C5a/C5a desarg e detetou-se com um anticorpo de C5a não competitivo conjugado com uma porção ECL contendo rutenato e leu-se num leitor de placas SECTOR 2400™ (MesoScale Discovery). As concentrações de anticorpo em circulação foram determinadas através de um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) em que o anticorpo livre (BNJ383) foi capturado numa placa de microtitulação revestida com C5a humana desarg e detetou-se com um anticorpo de ratinho anti-humano conjugado com peroxidase de rábano (HRP).
Tal como mostrado na Fig. 14, tal como os resultados descritos no Exemplo 13, concentrações de BNJ383 em circulação tão baixas como 10 yg/mL esgotam os niveis plasmáticos de C5/C5a desarg para abaixo dos limites detetáveis em macacos cinomolgos. Estes resultados mostram também que o anticorpo, mesmo na presença de um excesso molar de C5 não clivada, mantém a capacidade para se ligar a C5a livre com elevada afinidade e mantém assim, mesmo nesse excesso molar, a capacidade para inibir a atividade pró-inflamatória de C5a.
Para determinar se BNJ383 tinha um efeito na atividade hemolitica de soro de macaco, o anticorpo foi avaliado num ensaio in vitro de hemólise de glóbulos vermelhos. O ensaio de hemólise de glóbulos vermelhos é geralmente descrito em detalhe, p. ex., em Rinder et al. (1995) J. Clin. Invest. 96:1564-1572. Resumidamente, amostras de soro obtidas de macacos aos quais foi administrado BNJ383 (tal como descrito acima) foram adicionadas a múltiplos poços de uma placa de ensaio de 96 poços de modo a que a concentração do soro em cada poço fosse de aproximadamente 10%. As amostras de soro, em virtude dos instantes em que foram obtidas, continham várias concentrações do anticorpo BNJ383. A atividade hemolitica do soro dos macacos que não receberam BNJ383 serviu como controlo negativo e como nivel de atividade hemolitica no limiar.
Eritrócitos de galinha (Lampire Biological Laboratories, Pipervilie, PA) foram lavados e ressuspensos em tampão a uma concentração final de 5><107 células/mL. Os eritrócitos foram sensibilizados para lise através de incubação das células com uma composição de anticorpos policlonais anti-glóbulos vermelhos de galinha. Os eritrócitos sensibilizados foram adicionados aos poços da placa de 96 poços e a placa foi incubada a 37 °C durante 30 minutos. A libertação de hemoglobina foi medida através de absorvância aparente a 415 nm, utilizando um leitor de microplacas.
Tal com mostrado na Fig. 15A, mesmo concentrações elevadas de BNJ383 não inibiram substancialmente a hemólise de eritrócitos sob estas condições experimentais de ensaio hemolitico ex vivo. O anticorpo BNJ383 foi também avaliado para determinar se tinha efeito na ativação do complemento de soro de macaco usando um ensaio de CH50eq ex vivo. O ensaio de CH50eq é um método para medição da atividade do complemento clássico total no soro. Este teste é um ensaio imunossorvente ligado a enzima, que utiliza gamaglobulinas humanas e anticorpos monoclonais de ratinho como o ativador da via clássica do complemento e captura o complexo terminal do complemento (TCC) gerado num poço de microtitulação revestido com um anticorpo especifico de neoepitopo de TCC. O TCC capturado é detetado com um anticorpo de cabra anti-TCC conjugado com peroxidase de rábano. O ensaio de CH50eq proporciona uma medida direta da formação do complexo terminal do complemento (TCC).
Tal como mostrado na Fig. 15B, concentrações elevadas de BNJ383 presente no soro macaco foram capazes de inibir substancialmente a formação de TCC sob estas condições ex vivo. Estes resultados indicam que o anticorpo BNJ383 não só é capaz de se ligar e sequestrar C5a livre, como também é capaz de, em função da concentração, inibir parcialmente ou substancialmente a formação de TCC.
Foi também realizada uma experiência ex vivo para avaliar o efeito de BNJ383 na atividade da via clássica (VC) do complemento utilizando as amostras de soro de macaco tal como descrito acima. A experiência utilizou o Estojo da Via Clássica do Complemento Wieslab® (Wieslab® COMPL CP310, Euro-Diagnostica, Suécia) e o protocolo associado foi seguido apenas com otimização de rotina bem dentro da competência de um vulgar perito na técnica. Resumidamente, alíquotas do soro de macaco foram incubadas em poços de uma placa revestida com anticorpo IgM humano durante uma hora. Como controlo, vários poços foram incubados sob as mesmas condições com soro de macacos aos quais não foi administrado o anticorpo BNJ383.
Após a incubação, os poços foram lavados cuidadosamente com tampão de lavagem lx fornecido com o estojo. 0 nível de ativação da via alternativa do complemento foi medido através da absorvância a 405 nm, após o contacto de cada poço com um conjugado de enzima fornecido pelo estojo (um anticorpo anti-C5b-9 conjugado com fosfatase alcalina) e substrato fluorogénico (que é operado pela enzima) e incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente. Os resultados são mostrados na Fig. 15C. 0 anticorpo anti-hC5a inibiu significativamente, embora não completamente, a atividade do complemento de um modo dependente da dose. Em conjunto, os resultados aqui descritos indicam que BNJ383 não é apenas um potente antagonista de C5a, mas é também um antagonista incompleto/parcial da formação do complexo terminal do complemento in vivo. Assim, o anticorpo e os anticorpos que partilham as suas propriedades são úteis para tratamento de uma variedade de distúrbios associados ao complemento em que a inflamação mediada por C5a é o contribuinte principal para os efeitos patológicos prejudiciais e TCC pode desempenhar um papel menos importante, ou mesmo benéfico na patologia.
Embora a presente divulgação tenha sido descrita com referência às formas de realização especificas desta, os peritos na técnica devem entender que podem ser feitas várias mudanças e que podem ser substituídos equivalentes. Além disso, podem ser feitas muitas modificações para adaptar uma situação, um material, uma composição de matéria, um processo, um passo ou passos do processo particulares.
Lisboa, 11 de novembro de 2015

Claims (5)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste que se liga a um polipéptido C5a livre, em que o C5a livre é um polipéptido humano (hC5a) possuindo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID N0:1, e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste se liga ao polipéptido hC5a livre in vitro com uma Kd que é inferior a 1,25><10“9 M medida através de ressonância de plasmão de superfície (SPR) na presença de um excesso molar de C5 humana nativa, não clivada e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreende: I. (a) um polipéptido de cadeia leve compreendendo: (i) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:21; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:22; ou (ii) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 38; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:2 2; e (b) um polipéptido de cadeia pesada compreendendo: (i) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:29; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:30; ou (ii) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:46; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:4 7; II. (a) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 37 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:27; (b) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 36 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:33; (c) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 19 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:27; (d) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 17 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:25; (e) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 42 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:21; (f) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 40 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:33; (g) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 17 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:33; (h) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 19 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:45; (i) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 17 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:44; (j) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 17 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:49; (k) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 37 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:45; ou (l) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 36 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:49; ou III. (a) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 42 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:45; (b) um polipéptido de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 40 e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:49; ou
  2. 2. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreende: (a) um polipéptido de cadeia leve compreendendo: (i) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 21; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:22; e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo: (i) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 29; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:30.
  3. 3. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreende: (a) um polipéptido de cadeia leve compreendendo: (i) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 21; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:22; e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo: uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 46; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO :47.
  4. 4. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreende: (a) um polipéptido de cadeia leve compreendendo: (i) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 38; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:22; e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo: (i) uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 29; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:30.
  5. 5. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigénio deste de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste compreende: (a) um polipéptido de cadeia leve compreendendo: (i) uma CDRl de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 38; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:22; e um polipéptido de cadeia pesada compreendendo: uma CDRl de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO: 46; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em SEQ ID NO:47. Lisboa, 11 de novembro de 2015
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