PT2343052E

PT2343052E - Filtração hidrofílica durante o fabrico de adjuvantes de vacinas

Info

Publication number: PT2343052E
Application number: PT102520442T
Authority: PT
Inventors: Gottfried Kraus; Robert Eskes
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2009-12-03
Filing date: 2010-12-03
Publication date: 2013-08-28
Also published as: MX2012005598A; JP2013512890A; KR20150041812A; IL219627A0; SI2506832T1; KR101625623B1; EP2343052A1; CN102858322B; ES2461852T3; JP2015098499A; JP5754860B2; US20190201337A1; WO2011067669A2; US10213383B2; WO2011067669A3; ES2558056T3; EP2601933A1; EP2506832B1; HRP20130623T1; EP2343052B1

Description

DESCRIÇÃO

FILTRAÇÃO HIDROFÍLICA DURANTE O FABRICO DE ADJUVANTES DE

VACINAS

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção está no domínio da fabricação de adjuvantes de emulsão de óleo em água para vacinas por microfluidização.

ESTADO DA TÉCNICA 0 adjuvante de vacina conhecido como "MF59" [1-3] é uma emulsão óleo-em-água de submicron de esqualeno, polissorbato 80 (também conhecido como Tween 80) e trioleato de sorbitano (também conhecido como Span 85) . Pode também incluir iões de citrato, por exemplo 10 mM de tampão de citrato de sódio. A composição da emulsão, em volume, pode ser de cerca de 5% de esqualeno, cerca de 0,5% de Tween 80 e cerca de 0,5% de Span 85. O adjuvante e a sua produção são descritos em mais detalhes no Capítulo 10 da referência 4, capítulo 12 da referência 5 e no capitulo 19 da referência 6.

Como descrito na referência 7, o MF59 é fabricado em escala comercial por dispersão de Span 85 na fase de esqualeno e Tween 80 na fase aquosa, seguido por mistura de alta velocidade para formar uma emulsão grosseira. Esta emulsão grosseira é então passada através de um microfluidificador repetidamente para produzir uma emulsão possuindo um tamanho de gota de óleo uniforme. Conforme descrito nas referências 6 e 6a, a emulsão microfluidizada é então filtrada através de uma membrana de 0,22 ym para remover quaisquer gotas de óleo grandes, e o tamanho médio das 1 gotículas da emulsão resultante permanece inalterada durante pelo menos 3 anos a 4°C. 0 teor de esqualeno da emulsão final possa ser medido conforme descrito na referência 8. Vários documentos (por exemplo, as referências 9-12) descrevem que o MF59 pode ser fabricado por microfluidização seguido por esterilização por filtração através de um filtro de polissulfona a 0,22pm. As polissulfonas são polímeros que contêm grupos sulfona (SO2) na estrutura do polimero principal e os filtros de polissulfona são filtros hidrofóbicos bem conhecidos. É um objecto da invenção proporcionar novos e melhores métodos para a produção de emulsões de óleo em água microfluidizadas (por exemplo, MF59), em particular métodos específicos que são adequados para a utilização em escala comercial e que utilizam a filtração.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO A invenção proporciona um método para o fabrico de uma emulsão de óleo em água que compreende esqualeno, em que o método compreende as etapas de: (i) preparação de uma primeira emulsão tendo uma primeira dimensão média de goticulas de óleo, também conhecido como uma emulsão preliminar ou uma pré-emulsão; (ii) microfluidização da primeira emulsão para formar uma segunda emulsão tendo um segundo tamanho médio das goticulas de óleo de 500 nm ou menos, o que é menos do que a primeira dimensão média de goticulas de óleo, que é a filtração da segunda emulsão usando uma membrana de polietersulfona hidrofilica de camada dupla, com uma primeira camada possuindo um tamanho 2 de poro de ^ 0,3ym, e uma segunda camada tendo um tamanho de poro de <0,3 ym, proporcionando assim um adjuvante de vacina.

Opcionalmente, a primeira emulsão pode ser preparada utilizando um homogeneizador, tal como descrito abaixo.

Conforme descrito em mais detalhe abaixo, a primeira emulsão pode ter um tamanho médio de goticulas de óleo de 5000nm ou menos, por exemplo, um tamanho médio de entre 300 nm e 800nm. O número de goticulas de óleo na primeira emulsão com o tamanho de > 1,2 ym pode ser de 5 x 10i:L/ml ou menos, tal como descrito abaixo. Goticulas de óleo com um tamanho de >1,2 ym são desvantajosas uma vez que podem causar instabilidade da emulsão devido à aglomeração e coalescência das goticulas [14].

Após a formação, a primeira emulsão é, em seguida, submetida a pelo menos um passo de microfluidização, para formar a segunda emulsão que tem um tamanho médio reduzido de goticulas de óleo. Conforme descrito abaixo, o tamanho médio de goticula de óleo da segunda emulsão é de 500 nm ou menos. 0 número de goticulas de óleo na segunda emulsão possuindo um tamanho de >1,2 ym pode ser de 5 x 1010/ml ou menos, tal como descrito abaixo. Para atingir estas caracteristicas pode ser necessário passar os componentes da emulsão através do dispositivo de microfluidização uma pluralidade de vezes, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 vezes. A segunda emulsão é em seguida filtrada através de uma membrana hidrofílica como descrito na reivindicação 1, uma 3 membrana de polietersulfona hidrofilica, para dar uma emulsão de óleo-em-água que pode ser adequada para utilização como um adjuvante de vacina. 0 tamanho médio das goticulas de óleo da emulsão de óleo em água produzida após filtração pode ser de 220 nm ou menos, por exemplo, entre 135-175 nm, entre 145-165 nm, ou cerca de 155 nm. O número de goticulas de óleo possuindo um tamanho de >1,2 pm presentes na emulsão de óleo-em-água produzida após a filtração pode ser de 5 x 108/ ml ou menos, por exemplo, 5 x 107/ml ou menos, 5 x 106/ml ou menos, 2 x 106/ml ou menos, ou de 5 x 10‘5/ml ou menos. A emulsão de óleo em água final, formada após a filtração, pode ter pelo menos 102 vezes menos gotas de óleo possuindo um tamanho de >1,2 pm em comparação com a primeira emulsão, e de preferência pelo menos 103 vezes menos (por exemplo, 104 vezes menos).

Em algumas formas de realização, mais do que um ciclo de etapas (i) e (ii) é usado antes da etapa (iii). Da mesma forma, podem ser usadas várias repetições de etapas individuais (i) e (ii).

Também são descritos métodos para a preparação de adjuvantes de emulsão de óleo em água, sem utilização de microfluidização por exemplo, para métodos que se baseiam em técnicas alternativas, tais como a termorreversibilidade [40]. Nestas formas de realização, a invenção proporciona um método para o fabrico de uma emulsão de óleo em água que compreende esqualeno, em que o método compreende as etapas de: (i) preparação de uma emulsão de óleo em água tendo um tamanho médio de goticulas de óleo abaixo de 500 nm (por 4 exemplo, abaixo de 250 nm, inferior a 200 nm, inferior a 150 nm, inferior a 100 nm) ; e (ii) a filtração da emulsão através de uma membrana hidrofilica como descrito na reivindicação 1. Assim, estas concretizações tiram proveito da aptidão da membrana hidrofilica para a preparação de emulsões de adjuvantes de óleo em água contendo esqualeno, mas não exigem o uso de microfluidização prévia.

Em geral, os métodos da invenção são realizados entre 20-60°C e, de preferência a 40 ± 5°C. Embora o primeiro e segundo componentes da emulsão possam ser relativamente estáveis mesmo a altas temperaturas, a degradação térmica de alguns componentes pode ainda ocorrer e as temperaturas mais baixas são assim preferidas.

Componentes da emulsão O tamanho médio das gotas de óleo (isto é, o diâmetro médio em número de goticulas de óleo da emulsão) pode ser medido utilizando uma técnica de dispersão dinâmica da luz, como se descreve na referência 13. Um exemplo de uma máquina de medição da dispersão de luz dinâmica é a Nicomp 380 Submicron Particle Size Analyzer (da Particle Sizing Systems). O número de partículas com uma dimensão de >1,2 pm pode ser medido utilizando um contador de partículas, tais como o Accusizer™ 770 (da Particle Sizing Systems).

Os métodos da invenção são utilizados para o fabrico de emulsões de óleo em água. Estas emulsões incluem três 5 ingredientes essenciais: um óleo; um componente aquoso, e um agente tensioativo.

Uma vez que as emulsões são destinadas a uso farmacêutico, então, o óleo irá ser tipicamente biodegradável (metabolizável) e biocompativel. 0 óleo usado pode compreender esqualeno, um óleo de figado de tubarão, que é um terpenóide ramificado, insaturado (C30 H50, [ (CH3) 2C [=CHCH2CH2C (CH3) ] 2=CHCH2_] 2; 2, 6, 10,15,19, 23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno; CAS RN 7683-64-9). O esqualeno é particularmente preferido para utilização na presente invenção. O óleo da presente invenção pode compreender uma mistura (ou combinação) de óleos compreendendo, por exemplo, esqualeno e pelo menos um outro óleo.

Em vez da (ou em adição à) utilização de esqualeno uma emulsão pode compreender óleo (s), incluindo aqueles a partir de, por exemplo, um animal (tal como peixe) ou de uma fonte vegetal. Fontes de óleos vegetais incluem nozes, sementes e grãos. Os mais comummente disponíveis são o óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de coco e azeite, por exemplo, os óleos de nozes. O óleo de jojoba pode ser utilizado, por exemplo, o obtido a partir do feijão de jojoba. Os óleos de sementes incluem óleo de cártamo, óleo de semente de algodão, óleo de semente de girassol, óleo de semente de sésamo e semelhantes. No grupo de cereais, o óleo de milho é o mais facilmente disponível, mas o óleo de outros grãos de cereais tais como trigo, aveia, centeio, 6 arroz, teff, triticale e similares podem igualmente ser usados. 6-10 ésteres de ácidos gordos de carbono de glicerol e de 1,2-propanodiol, embora não ocorrem naturalmente em óleos de sementes, podem ser preparados por hidrólise, separação e estérificação dos materiais adequados a partir dos óleos de nozes e sementes. Gorduras e óleos do leite de mamíferos são metabolizáveis e por isso podem ser utilizados. Os procedimentos para separação, purificação, saponificação e outros meios necessários para obtenção de óleos puros de origem animal são bem conhecidos na técnica.

Muitos peixes contêm óleos metabolizáveis que podem ser facilmente recuperados. Por exemplo, o óleo de figado de bacalhau, óleos de figado de tubarão, e o óleo de baleia como espermacete exemplificam vários óleos de peixe que podem ser aqui usados. Uma série de óleos de cadeia ramificada são sintetizados bioquimicamente em unidades de isopreno de 5 carbonos e são geralmente referidos como terpenóides. O esqualano, o análogo saturado de esqualeno, também pode ser usado. Os óleos de peixe, incluindo esqualeno e esqualano, estão prontamente disponíveis a partir de fontes comerciais ou podem ser obtidos por métodos conhecidos na técnica.

Outros óleos úteis são os tocoferóis, particularmente em combinação com o esqualeno. Quando a fase oleosa de uma emulsão inclui um tocoferol, qualquer um dos tocoferóis a, β γ, δ, ε ou ξ podem ser usados, mas α-tocoferóis são preferidos. D-a-tocoferol e DL-a-tocoferol podem ser usados. Um preferido α-tocoferol é DL-a-tocoferol. O tocoferol pode assumir diversas formas, por exemplo, diferentes sais e/ou isómeros. Os sais incluem sais 7 orgânicos, tais como succinato, acetato, nicotinato, etc. Se um sal deste tocoferol é para ser usado, o sal preferido é o succinato. Uma combinação de óleo compreendendo esqualeno e um tocoferol (por exemplo, DL-a-tocoferol) pode ser usado. 0 componente aquoso pode ser água pura (por exemplo, w.f.i.) ou pode incluir outros componentes, por exemplo solutos. Por exemplo, pode incluir sais, por exemplo, para formar um tampão de sais de citrato ou de fosfato, tais como sais de sódio. Tampões tipicos incluem: um tampão fosfato, um tampão de Tris, um tampão de borato, um tampão de succinato, um tampão de histidina, ou um tampão de citrato. Os tampões estarão tipicamente incluídos na gama de 5-20mM. 0 agente tensioativo é de preferência biodegradável (metabolizável) e biocompatível. Os agentes ensioativos podem ser classificados por seu "HLB" (equilíbrio hidrófilo/lipófilo) , onde um HLB na gama de 1-10, geralmente significa que o agente tensioativo é mais solúvel em óleo do que em água, e os de HLB na gama de 10-20 são mais solúveis em água do que em óleo. As emulsões compreendem de preferência pelo menos um agente tensioativo que tem um HLB de pelo menos 10 por exemplo, pelo menos 15, ou, de preferência, pelo menos, 16. A invenção pode ser utilizada com agentes tensioativos incluindo: os agentes tensioativos de ésteres de polioxietileno sorbitano (vulgarmente referidos como os Tweens), especialmente o polisorbato 20 e o polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno 8 (PO) , e/ou óxido de butileno (BO) , vendidos sob o nome comercial DOWFAX™, tal como copolímeros de bloco lineares EO/PO; octoxinóis, que podem variar no número de repetição dos grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiilo), com octoxinol-9 (Triton X-100, ou t-octilfenoxipolietoxietanol) sendo de particular interesse; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolipideos tais como a fosfatidilcolina (lecitina); éteres gordos de polioxietileno derivados de álcoois lauril, cetil, estearil e oleil (conhecidos como tensioativos Brij), tais como éter de trietilenoglicol monolauril (Brij 30); éter de polioxietileno-9-laurilo; e ésteres de sorbitano (comummente conhecidos como os SPANs), tais como trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato de sorbitano. Os tensioativos preferidos para inclusão na emulsão são o polissorbato 80 (Tween 80; mono-oleato de polioxietileno sorbitano), Span 85 (trioleato de sorbitano), lecitina e Triton X-100.

Misturas de tensioativos podem ser incluidos na emulsão, por exemplo misturas de Tween 80/Span 85 ou misturas de Tween 80/Triton-X100. Uma combinação de um éster de polioxietileno sorbitano, tal como, o monooleato de polioxietileno sorbitano (Tween 80) e um octoxinol, tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100) é também adequado. Outra combinação útil compreende laureth 9 mais um éster de sorbitano de polioxietileno e/ou um octoxinol. Misturas úteis podem compreender um agente tensioativo com um valor de HLB na gama de 10-20 (por exemplo, Tween 80, com um HLB de 15,0) e um agente tensioativo com um valor de HLB na gama de 1-10 (por exemplo, Span 85, com um HLB de 1,8) . 9

Formação da primeira emulsão

Antes a etapa de microfluidização, os componentes da emulsão podem ser misturados para formar uma primeira emulsão.

Gotículas de óleo na primeira emulsão podem ter um tamanho médio de 5000 nm ou menos, por exemplo, de 4000 nm ou menos, 3000nm ou menos, 2000nm ou menos, 1200 nm ou menos, 1000 nm ou menos, por exemplo, um tamanho médio de entre 800 e 1200 nm, ou entre 300nm e 800nm.

Na primeira emulsão o número de gotículas de óleo com um tamanho de >1,2 ym pode ser de 5 x 1011/ml ou menos, por exemplo, 5 x 1010/ml ou menos, ou de 5 x 109/ml ou menos. A primeira emulsão é, em seguida, microfluidizada para formar uma segunda emulsão que tem um tamanho médio de gotículas de óleo menor do que a primeira emulsão e/ou menos gotas de óleo com tamanho de >1,2 ym. O tamanho médio das gotículas de óleo da primeira emulsão pode ser conseguido através da mistura de componentes da primeira emulsão num homogeneizador. Por exemplo, conforme mostrado na Figura 1, podem ser combinados num vaso de mistura (12) e, em seguida, os componentes combinados podem ser introduzidos (13) num homogeneizador mecânico, tal como um homogeneizador rotor-estator (1). 10

Os homogeneizadores podem operar de um modo vertical e/ou horizontal. Por conveniência num ambiente comercial, são preferidos os homogeneizadores em linha.

Os componentes são introduzidos num homogeneizador rotor-estator e conhecem um rotor de rotação rápida, contendo ranhuras ou furos. Os componentes são atirados por meio de força centrífuga para um tipo de bomba e passam através das ranhuras/furos. Em algumas concretizações, o homogeneizador inclui múltiplas combinações de rotores e estatores, por exemplo, um arranjo concêntrico de anéis em dentes de pente, como mostrado pelas características (3) e (4), (5) e (6) e (7) e (8) na Figura 1 e na Figura 2. Os rotores úteis em homogeneizadores de larga escala podem ter anéis em dentes de pente na extremidade de um rotor multi-laminado orientado horizontalmente (por exemplo, característica (9) na Figura 1) alinhados em estreita tolerância para corresponder aos dentes num revestimento estático. A primeira emulsão forma-se através de uma combinação de turbulência, cavitação e corte mecânico que ocorre dentro do intervalo entre o rotor e o estator. Os componentes são introduzidos proveitosamente numa direção paralela ao eixo do rotor.

Um parâmetro de desempenho importante nos homogeneizadores rotor-estator é a velocidade de ponta do rotor (velocidade periférica). Este parâmetro é uma função tanto da velocidade de rotação como do diâmetro do rotor. Uma velocidade de ponta de pelo menos 10 ms"1 é útil, e idealmente mais rápido, por exemplo, ú 20 ms-1, ^30 ms-1, ú 40 ms-1, etc. Uma velocidade de ponta de 40 ms’1' pode ser facilmente conseguida a 10000 rpm com um homogeneizador pequeno ou com velocidades de rotação mais baixas (por 11 exemplo 2000 rpm) com um homogeneizador maior. Os homogeneizadores de alto cisalhamento adequados estão disponíveis comercialmente.

Para o fabrico em escala comercial, o homogeneizador deve, idealmente, ter uma taxa de fluxo de pelo menos 300 L/h, por exemplo b 400 L/h, > 500 L/h, > 600 L/h, > 700 L/h, > 800 L/h, > 900 L/h, > 1000 L/h, > 2000 L/h, > 5000 L/h, ou até mesmo h 10000 L/h. Os homogeneizadores de alta capacidade adequados estão disponíveis comercialmente.

Um homogeneizador preferido proporciona uma taxa de corte compreendida entre 3xl05 e lxlO6 s”1, por exemplo, entre 3xl05 e 7xl05s_1, entre 4xl05 e 6xl05 s”1, por exemplo, cerca de 5x105 s”1.

Embora homogeneizadores rotor-estator gerem relativamente pouco calor durante a operação, o homogeneizador pode ser arrefecido durante o uso. Idealmente, a temperatura da primeira emulsão é mantida abaixo de 60°C durante a homogeneização, por exemplo, abaixo de 45°C.

Em algumas formas de realização os componentes da primeira emulsão podem ser homogeneizados várias vezes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 ou mais vezes) . Para evitar a necessidade de uma longa cadeia de recipientes e homogeneizadores os componentes da emulsão podem, em vez disso, circular (por exemplo, característica (11) na Figura 1). Em particular, a primeira emulsão pode ser formada através da circulação dos primeiros componentes de emulsão através de um homogeneizador por uma pluralidade 12 de vezes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100 vezes, etc.) No entanto, demasiados ciclos pode ser indesejável uma vez que pode produzir re-coalescência tal como descrito na referência 14. Assim, o tamanho das gotas de óleo pode ser monitorizada se a circulação homogeneizada for usada para verificar se o tamanho de goticula desejado é atingido e/ou a re-coalescência não está a ocorrer. A circulação através do homogeneizador é vantajosa, pois pode reduzir o tamanho médio das goticulas de óleo na primeira emulsão. A circulação é também vantajosa porque pode reduzir o número de gotas de óleo possuindo um tamanho de > 1,2 ym na primeira emulsão. Estas reduções no tamanho médio das goticulas e do número de gotas de >1,2 ym na primeira emulsão podem proporcionar vantagens no processo a jusante. Em particular, a circulação dos componentes da primeira emulsão através do homogeneizador pode levar a um processo de microfluidização melhorado que pode resultar, em seguida, num número reduzido de goticulas de óleo possuindo um tamanho de >1,2 ym, na segunda emulsão, ou seja, depois da microfluidização. Esta melhoria nos parâmetros da segunda emulsão pode proporcionar melhor desempenho da filtração. Um desempenho de filtração melhorado pode levar a menos perdas de conteúdo durante a filtração, por exemplo, perdas de esqualeno, Tween 80 e Span 85, quando a emulsão de óleo em água é MF59.

Dois tipos particulares de circulação são aqui referidos como o "tipo I" e o "Tipo II". A circulação do Tipo I é ilustrada na Figura 5, ao passo que a circulação do Tipo II é ilustrada na Figura 6. 13 A circulação dos componentes da primeira emulsão pode compreender uma circulação do tipo I pela transferência dos componentes da primeira emulsão entre um primeiro recipiente de pré-mistura e um homogeneizador. 0 primeiro recipiente de pré-mistura pode ser de 50 a 500 L de tamanho, por exemplo, 100 a 400 L, 100 a 300 L, de 200 a 300 L, 250 L e 280 L. 0 primeiro recipiente de pré-mistura pode ser fabricada a partir de aço inoxidável. A circulação do tipo I pode ser continuada durante 10 a 60 minutos, por exemplo 10 a 40 minutos ou 20 minutos. A circulação dos componentes da primeira emulsão podem compreender uma circulação do tipo II pela transferência dos componentes da primeira emulsão a partir de um primeiro recipiente de pré-mistura, através de um primeiro homogeneizador para um segundo recipiente de pré-mistura (opcionalmente tendo as mesmas propriedades que o primeiro recipiente de pré-mistura) e, em seguida, através de um segundo homogeneizador. 0 segundo homogeneizador será geralmente o mesma que o primeiro homogeneizador, mas em algumas modalidades o primeiro e segundo homogeneizadores são diferentes. Após a passagem dos componentes da primeira emulsão através do segundo homogeneizador, os componentes da primeira emulsão podem ser transferidos de volta para o primeiro recipiente de pré-mistura, por exemplo, se o processo de circulação do tipo II deva ser repetido. Assim, os componentes da emulsão podem viajar num percurso em oito entre o primeiro e segundo recipientes de pré-mistura através de um único homogeneizador (ver Figura 5) . A circulação do Tipo II pode ser efectuada de uma só vez ou por uma pluralidade de vezes, por exemplo, 2, 3, 4, 5 vezes, etc. 14 A circulação do tipo II é vantajosa, em comparação com a circulação do tipo I, porque pode ajudar a assegurar que todos os componentes da primeira emulsão passam através do homogeneizador. 0 esvaziamento do primeiro recipiente de pré-mistura quer dizer que o conteúdo completo da emulsão terá passado através do homogeneizador, para o segundo recipiente de pré-mistura. Do mesmo modo, o conteúdo do segundo recipiente de pré-mistura pode ser esvaziado, garantindo novamente que todos eles passam através do homogeneizador. Assim, o arranjo do tipo II pode convenientemente assegurar que todos os componentes da emulsão são homogeneizados, pelo menos, duas vezes, o que pode reduzir tanto o tamanho médio das goticulas de óleo como o número de gotas de óleo possuindo um tamanho de >1,2 ym na primeira emulsão. Uma circulação do tipo II ideal envolve assim o esvaziamento do primeiro recipiente de pré-mistura e a passagem de substancialmente todo o seu conteúdo através do homogeneizador para o segundo recipiente de pré-mistura, seguida pelo esvaziamento do segundo recipiente de pré-mistura e a passagem de substancialmente todo o seu conteúdo através do homogeneizador de volta para o primeiro recipiente de pré-mistura. Assim, todas as partículas passam através do homogeneizador, pelo menos, duas vezes, enquanto isto é difícil de conseguir com a circulação do tipo I.

Em algumas formas de realização é utilizada uma combinação de circulações do tipo I e tipo II, e esta combinação pode proporcionar uma primeira emulsão com boas características. Em particular, esta combinação pode reduzir grandemente o número de gotas de óleo possuindo um tamanho de >1,2 ym na primeira emulsão. Esta combinação pode incluir qualquer forma de circulação do tipo I e II, por exemplo, o tipo I, 15 seguido do tipo II, o tipo II seguido de tipo I, o tipo I seguido do tipo II, e seguido novamente pelo tipo I etc. Numa concretização, a combinação compreende 20 minutos de circulação do tipo I, seguido por uma única circulação do tipo II, isto é, a transferência dos componentes da primeira emulsão que circularam de um primeiro recipiente de pré-mistura, através de um primeiro homogeneizador para um segundo recipiente de pré-mistura, e depois através de um homogeneizador uma segunda vez. O primeiro e segundo recipientes de pré-mistura podem ser realizados sob um gás inerte, por exemplo azoto, por exemplo até 0,5 bar. Isto pode impedir que os componentes da emulsão oxidem, o que é particularmente vantajoso se um dos componentes da emulsão for esqualeno. Isto pode proporcionar um aumento da estabilidade da emulsão.

Como mencionado acima, a entrada inicial para o homogeneizador pode ser uma mistura não homogeneizada dos componentes da primeira emulsão. Esta mistura pode ser preparada por mistura dos componentes individuais da primeira emulsão individualmente, mas, em algumas formas de realização, vários componentes podem ser combinados antes desta mistura. Por exemplo, se a emulsão compreende um agente tensioativo com um HLB inferior a 10, em seguida, este agente tensioativo pode ser combinada com um óleo antes de se misturar. Do mesmo modo, se a emulsão compreende um agente tensioativo com um HLB superior a 10, então este agente tensioativo pode ser combinado com um componente aquoso, antes da mistura. Sais tampão podem ser combinados com um componente aquoso, antes da mistura, ou podem ser adicionados separadamente. 16

Os métodos da invenção podem ser utilizados em larga escala. Assim, um método pode envolver a preparação de uma primeira emulsão cujo volume seja superior a 1 litro por exemplo h 5 litros, hlO litros, h 20 litros, 50 litros h, h 100 litros, 250 litros h, etc.

Depois da sua formação, a primeira emulsão pode ser microfluidizada, ou pode ser armazenada para esperar a microfluidização.

Em algumas formas de realização, nomeadamente aquelas em que são usadas vários ciclos de etapas (i) e (ii), a entrada para o homogeneizador será a saida de um microfluidificador, tal que a primeira emulsão é microfluidizada e em seguida, novamente submetida a homogeneização.

Microfluidização

Após a sua formação a primeira emulsão é microfluidizada, a fim de reduzir o seu tamanho médio de goticulas de óleo e/ou para reduzir o número de gotas de óleo possuindo um tamanho de >1,2 ym.

Os instrumentos de microfluidização reduzem o tamanho médio das goticulas de óleo através do impulso dos fluxos dos componentes de entrada através dos canais geometricamente fixados a alta pressão e a alta velocidade. A pressão à entrada para a câmara de interação (também chamada de "primeira pressão") pode ser substancialmente constante (isto é, de ± 15%, por exemplo, ± 10%, ± 5% ± 2%) durante pelo menos 85% do tempo durante o qual os componentes são introduzidos no microfluidizador, por exemplo, pelo menos 17 87%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou 100% do tempo durante o qual a emulsão é introduzida no microfluidizador.

Numa concretização, a primeira pressão é de 1300 bar ± 15% (18 MPa ± 15%), isto é, entre 1100 bar e 1500 bar (entre 15 MPa e 21 MPa) durante 85% do tempo durante o qual a emulsão é introduzida no microfluidificador. Dois perfis de pressão adequados são mostrados na Figura 3. Na Figura 3A, a pressão é substancialmente constante pelo menos durante 85% do tempo, enquanto na Figura 3B a pressão permanece substancialmente constante continuamente.

Um aparelho de microfluidização tipicamente compreende pelo menos uma bomba de intensificador (de preferência duas bombas, que podem ser síncronas) e uma câmara de interação. A bomba de intensificador, que é idealmente electro-hidráulica dirigida, proporciona alta pressão (isto é, a primeira pressão) para forçar a emulsão para dentro e através da câmara de interação. A natureza síncrona das bombas intensificadoras pode ser utilizada para proporcionar uma pressão substancialmente constante da emulsão acima discutida, o que significa que as goticulas da emulsão são todas expostas a substancialmente o mesmo nível de forças de cisalhamento durante a microfluidização.

Uma vantagem da utilização de uma pressão substancialmente constante, é que ela pode reduzir falhas de fadiga no dispositivo de microfluidização, o que pode conduzir a uma vida mais longa do dispositivo. Uma vantagem adicional da utilização de uma pressão substancialmente constante é que os parâmetros da segunda emulsão podem ser melhorados. Em 18 particular, o número de gotículas de óleo possuindo um tamanho de >1,2 ym presente na segunda emulsão pode ser reduzido. Além disso, o tamanho médio das gotas de óleo da segunda emulsão pode ser reduzido quando é usada uma pressão substancialmente constante. A redução do tamanho médio das goticulas de óleo e do número de gotas de óleo possuindo um tamanho de >1,2 ym, na segunda emulsão podem proporcionar um desempenho melhorado da filtração. Um desempenho de filtração melhorado pode levar a menos perdas de conteúdo durante a filtração, por exemplo, perdas de esqualeno, Tween 80 e Span 85, quando a emulsão é MF59. A câmara de interação pode conter uma pluralidade, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc., de canais de geometria fixa, em que a emulsão passa. A emulsão entra na câmara de interação através de uma linha de entrada, que pode ter um diâmetro entre 200 a 250 ym. A emulsão dividida em correntes que entra na câmara de interação e, sob alta pressão, aceleram para uma velocidade elevada. À medida que passam através dos canais, as forças produzidas pela pressão elevada podem atuar para reduzir a dimensão das goticulas de óleo da emulsão e reduzir o número de gotas de óleo possuindo um tamanho de >1,2 ym. Estas forças podem incluir: forças de corte, por meio de deformação do fluxo de emulsão que ocorre do contacto com as paredes do canal; forças de impacto, através de colisões que ocorrem quando os fluxos de emulsão de alta velocidade colidem uns com os outros; e forças de cavitação, através da formação e do colapso das cavidades dentro do fluxo. A câmara de interação geralmente não inclui peças móveis. Pode incluir superfícies de canal de cerâmica (por exemplo alumina) ou diamante (por exemplo, diamante 19 policristalino). aço inoxidável.

Outras superfícies podem ser feitas de A geometria fixa da pluralidade de canais na câmara de interação pode ser de tipo "Y" ou de tipo "Z".

Numa geometria de tipo Y da câmara de interação um único fluxo de entrada de emulsão é dividido em primeira e segunda correntes de emulsão, que são em seguida recombinadas num único fluxo de saida de emulsão. Antes da recombinação, cada uma da primeira e segundas correntes de emulsão pode independentemente ser dividido numa primeira e segunda pluralidade (por exemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.), de sub-fluxos. Quando os fluxos de emulsão são recombinados, as primeiras e segundas correntes de emulsão (ou os seus sub-fluxos) fluem idealmente em direções substancialmente opostas (por exemplo, as primeira e segunda correntes de emulsão, ou as suas subcorrentes, fluem substancialmente no mesmo plano (± 20°) e a direção do fluxo da primeira corrente de emulsão é de 180 ± 20° diferente da direção do fluxo da segunda corrente de emulsão). As forças produzidas quando as correntes de emulsão são recombinadas podem atuar para reduzir a dimensão das goticulas de óleo da emulsão e reduzir o número de gotas de óleo possuindo um tamanho de >1,2 ym.

Em uma câmara de interação de geometria do tipo Z o fluxo de emulsão passa em torno de uma pluralidade (por exemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.), de cantos angulares substancialmente direitos (ou seja, 90 ± 20°). A Figura 4 ilustra uma câmara de interação com a geometria do tipo Z e dois cantos em ângulo reto na direção do fluxo. Durante a 20 sua passagem em torno dos cantos, uma corrente de emulsão de entrada pode ser dividida numa pluralidade (por exemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.), de subcorrentes e então recombinadas numa única saida fluxo de emulsão (por exemplo, conforme mostrado na Figura 4, com quatro sub-fluxos (32)). A separação e depois a recombinação (31) podem ocorrer em qualquer ponto entre a entrada e a saida. As forças geradas quando a emulsão contacta com as paredes do canal passando em torno dos cantos podem agir para reduzir o tamanho das gotas de óleo da emulsão e reduzir o número de gotas de óleo possuindo um tamanho de >1,2 pm. Um exemplo de uma câmara de interação de tipo Z é a câmara de interação E230Z de Microfluidics.

Numa concretização, o fluxo de emulsão passa em torno de dois cantos angulares substancialmente direitos. No momento em que o fluxo de entrada de emulsão passa em torno do primeiro canto em ângulo substancialmente recto, ele é dividido em cinco sub-fluxos. No momento em que os sub- fluxos passam em torno do segundo canto em ângulo substancialmente recto, eles são recombinados num único fluxo de saida de emulsão.

Na técnica anterior, tem sido habitual utilizar câmaras de interação de tipo Y para as emulsões de óleo em água, como as da presente invenção. Contudo, nós descobrimos que é vantajoso usar uma câmara de interação de geometria de canal de tipo Z para as emulsões de óleo em água, porque isso pode levar a uma maior redução no número de gotas de óleo possuindo um tamanho >1,2 pm presentes na segunda emulsão comparado a uma geometria da câmara de interação do tipo Y. A redução no número de gotas de óleo possuindo um tamanho > 1,2 pm, na segunda emulsão podem proporcionar um 21 desempenho melhorado da filtração. 0 desempenho de filtração melhorado pode levar a menos perdas de conteúdo durante a filtração, por exemplo, perdas de esqualeno, Tween 80 e Span 85, quando a emulsão é MF59.

Um aparelho de microfluidização preferido opera a uma pressão entre 170 bar e 2750 bar (cerca de 2500 psi a 40000 psi) por exemplo, cerca de 345 bar, cerca de 690 bar, cerca de 1380 bar, cerca de 2070 bar, etc.

Um aparelho de microfluidização preferido opera a uma velocidade de fluxo de até 20 L/min, por exemplo, até 14 L/min, até 7 L/min, até 3,5 L/min, etc.

Um aparelho de microfluidização preferido tem uma câmara de interação que proporciona uma taxa de corte superior a lxlO6 s_1, por exemplo á 2,5xl06 s_1, ú 5xl06 s 1, ú 107 s 1, etc.

Um aparelho de microfluidização pode incluir várias câmaras de interação que são usados em paralelo por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais, mas é mais útil incluir uma única câmara de interação. O dispositivo de microfluidização pode compreender um módulo de processamento auxiliar (APM), que compreende pelo menos um canal. O APM contribui para a redução do tamanho médio das goticulas de óleo na emulsão que passam através do dispositivo de microfluidização, embora a maior parte da redução ocorra na câmara de interação. Como mencionado 22 acima, os componentes da emulsão são introduzidos na câmara de interação através da bomba de intensificador, sob uma primeira pressão. Os componentes da emulsão geralmente saem do APM numa segunda pressão gue é mais baixa do gue a primeira pressão (por exemplo, pressão atmosférica). De um modo geral, entre 80 e 95% da diferença de pressão entre a primeira e a segunda pressão cai através da câmara de interação (por exemplo, a partir de Pi a P2 na Figura 4), e 5 a 20% da diferença de pressão entre a primeira e a segunda pressões cai através do módulo de processamento auxiliar, por exemplo, a câmara de interação pode fornecer cerca de 90% da queda de pressão, enquanto o APM pode fornecer cerca de 10% da queda de pressão. Se a pressão cai através da câmara de interação e a pressão cai através do módulo de processamento auxiliar não conta para o total da diferença de pressão entre a primeira e a segunda pressão, isto pode ser devido a uma queda de pressão finita entre os conectores entre a câmara de interação e o módulo de processamento auxiliar. O APM geralmente não inclui partes móveis. Pode incluir superfícies de canal em cerâmica (por exemplo alumina) ou diamante (por exemplo, diamante policristalino). Outras superfícies podem ser feitas de aço inoxidável. O APM é geralmente posicionado a jusante da câmara de interação e também pode ser posicionado sequencialmente para a câmara de interação. Na técnica anterior, os APM são geralmente posicionados a jusante das câmaras de interação que compreendem canais de tipo Y para suprimir a cavitação e, assim, aumentar o caudal na câmara do tipo Y em até 30%. Além disso, na técnica anterior os APM são geralmente posicionados a montante das câmaras de interação 23 que compreendem canais do tipo Z para reduzir a dimensão dos grandes aglomerados. Neste último caso, o APM só diminui o caudal nas câmaras do tipo Z até 3%. No entanto, verificou-se que o posicionamento dos APM a jusante de uma câmara de interação que compreende uma pluralidade de canais de tipo Z é vantajoso na presente invenção, porque pode levar a uma maior redução no tamanho médio das goticulas de óleo e uma maior redução no número de gotas de óleo possuindo um tamanho> 1,2 ym presente na segunda emulsão. Como discutido acima, a redução do número de gotas de óleo possuindo um tamanho> 1,2 ym, na segunda emulsão pode proporcionar um desempenho melhorado da filtração. 0 desempenho de filtração melhorado pode levar a menos perdas de conteúdo durante a filtração, por exemplo, perdas de esqualeno, Tween 80 e Span 85, quando a emulsão de óleo em água é MF59. Uma outra vantagem do presente posicionamento de uma câmara de interação de tipo Z e um APM a jusante é que ele pode levar a uma diminuição mais lenta da pressão após a câmara de interação. A queda de pressão mais lenta pode conduzir a um aumento da estabilidade do produto, porque há menos gás encerrado na emulsão.

Um APM contém pelo menos um canal de geometria fixa, em que a emulsão passa. O APM pode conter uma pluralidade, por exemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc., de canais de geometria fixa, em que a emulsão passa. O canal ou canais do APM podem ser lineares ou não lineares. Canais não lineares apropriados são de geometria de tipo "Z" ou geometria de tipo "Y", que são as mesmas que as descritas anteriormente para a câmara de interação. Numa concretização, o canal, ou canais, do APM são de geometria 24 de tipo Z. Uma pluralidade de canais de tipo Z divide a emulsão em correntes, uma vez entrada no APM.

Em contraste com as recomendações do fabricante, o uso de um APM que compreende uma pluralidade de canais de geometria fixa é vantajosa em relação a um APM de um único canal de geometria fixa, porque pode levar a uma maior redução no número de goticulas de óleo tendo um 1,2 ym presente na segunda emulsão. Como discutido acima, a redução do número de gotas de óleo possuindo um tamanho> 1,2 ym na segunda emulsão pode proporcionar um desempenho melhorado da filtração. 0 desempenho de filtração melhorado pode levar a menos as perdas de conteúdo durante a filtração, por exemplo, perdas de esqualeno, Tween 80 e Span 85, quando a emulsão de óleo em água é MF59.

Um aparelho de microfluidização gera calor durante a operação, o que pode aumentar a temperatura da emulsão até 15-20°C em relação à primeira emulsão. De forma vantajosa, portanto, a emulsão microfluidizada é arrefecida o mais rapidamente possível. A temperatura da segunda emulsão pode ser mantida abaixo de 60°C, por exemplo, abaixo de 45°C. Assim, a saída de uma câmara de interação e/ou uma saída de APM pode contribuir para um mecanismo de refrigeração, tal como um permutador de calor ou serpentina de arrefecimento. A distância entre a saída e o mecanismo de arrefecimento deve ser mantido tão curto quanto possível para reduzir o tempo global por redução dos atrasos de arrefecimento. Numa forma de realização, a distância entre a saída do microfluidizador e o mecanismo de refrigeração é de 20-30cm. Um mecanismo de refrigeração é particularmente útil quando uma emulsão é submetida a várias etapas de 25 microfluidização emulsão. para impedir o sobreaquecimento da 0 resultado da microfluidização é uma emulsão de óleo em água, a segunda emulsão, em que o tamanho médio das goticulas de óleo é de 500 nm ou menos. Este tamanho médio é particularmente útil, uma vez que facilita a esterilização da emulsão por filtração. Emulsões em que pelo menos 80% do número total de goticulas de óleo têm uma dimensão média de 500 nm ou menos, por exemplo, de 400 nm ou menos, menos de 300 nm, menos de 200 nm ou menos de 165 nm, são particularmente úteis. Além disso, o número de goticulas de óleo na segunda emulsão possuindo um tamanho> 1,2 ym é de 5 x 1010/mL ou menos, por exemplo, 5 x 109/ml ou menos, 5 x loVmL ou menos ou 2 x 108/ml ou menos. A entrada inicial para o microfluidização pode ser a primeira emulsão. Em algumas formas de realização, contudo, a emulsão microfluidizada é submetida a novamente à microfluidização, de tal modo que podem ocorrer vários ciclos de microfluidização. Em particular, a segunda emulsão pode ser formada através da circulação dos componentes da segunda emulsão através de um dispositivo de microfluidização uma pluralidade de vezes, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 vezes, etc. A segunda emulsão pode ser formada através da circulação dos componentes da segunda emulsão através de um dispositivo de microfluidização de 4 a 7 vezes. A circulação dos componentes da segunda de emulsão pode compreender uma transferência de circulação do tipo I dos componentes da segunda emulsão entre um primeiro recipiente 26 de emulsão (tendo, opcionalmente, as mesmas propriedades que o primeiro recipiente de pré-mistura) e o dispositivo de microfluidização. A circulação dos componentes da segunda de emulsão pode compreender uma circulação de transferência do tipo II dos componentes da segunda emulsão a partir de um primeiro recipiente de emulsão, através de um primeiro dispositivo de microfluidização para um segundo recipiente de emulsão (tendo, opcionalmente, as mesmas propriedades que o primeiro recipiente de pré-mistura) e, em seguida por meio de um segundo dispositivo de microfluidização. 0 segundo dispositivo de microfluidização pode ser o mesmo como o primeiro dispositivo de microfluidização. Alternativamente, o segundo dispositivo de microfluidização pode ser diferente do primeiro dispositivo de microfluidização. 0 primeiro recipiente de emulsão pode ser o mesmo que o primeiro recipiente de pré-mistura. Alternativamente, o primeiro reservatório de emulsão pode ser o mesmo que o segundo recipiente de pré-mistura. 0 segundo recipiente de emulsão pode ser o mesmo que o primeiro recipiente de pré-mistura. Em alternativa, o segundo recipiente emulsão pode ser o mesmo que o segundo recipiente de pré-mistura. 27 0 primeiro recipiente de emulsão pode ser o mesmo que o primeiro recipiente de pré-mistura e o segundo recipiente de emulsão pode ser o mesmo que o segundo recipiente de pré-mistura. Alternativamente, o primeiro reservatório de emulsão pode ser o mesmo que o segundo recipiente de pré-mistura e o segundo recipiente de emulsão pode ser o mesmo que o primeiro recipiente de pré-mistura.

Como alternativa, o primeiro e segundo recipientes de emulsão podem ser diferentes do primeiro e segundo recipientes de pré-mistura.

Após a passagem dos componentes da segunda emulsão através do segundo dispositivo de microfluidização, os componentes da segunda emulsão podem ser transferidos de volta para o primeiro recipiente de emulsão, por exemplo, se o processo de circulação do tipo II dever ser repetido. A circulação do tipo II, pode ser efectuada de uma só vez ou uma pluralidade de vezes, por exemplo, 2, 3, 4, 5 vezes, etc. A circulação do tipo II é vantajosa uma vez que assegura que todos os componentes da segunda emulsão terão passado através do dispositivo de microfluidização, pelo menos, duas vezes, o que reduz o tamanho médio das goticulas de óleo e o número de gotas de óleo possuindo um tamanho> 1,2 ym, na segunda emulsão.

Uma combinação da circulação tipo I e da circulação do tipo II, pode ser utilizada durante a microfluidização. Esta combinação pode incluir qualquer forma de circulação do tipo I e II, por exemplo, tipo I seguido do tipo II, tipo 28 II seguido de tipo I, tipo I seguido do tipo II, seguido do tipo I, novamente, etc. 0 primeiro e segundo recipientes de emulsão podems ser realizado sob um gás inerte, por exemplo, até 0,5 bar de azoto. Isto impede que os componentes da emulsão oxidem, o que é particularmente vantajoso se um dos componentes da emulsão for esqualeno. Isto leva a um aumento da estabilidade da emulsão.

Os métodos da invenção podem ser utilizados em larga escala. Assim, um método pode envolver microfluidização de um volume superior a 1 litro por exemplo, ^ 5 litros, á 10 litros, á 20 litros, ^ 50 litros, ^ 100 litros, > 250 litros, etc.

Filtração

Depois da microfluidização, a segunda emulsão é filtrada. Esta filtração remove quaisquer gotas de óleo grandes que sobreviveram aos procedimentos de homogeneização e microfluidização. Embora pequena, em termos de número, estas goticulas de óleo podem ser grandes em termos de volume, e podem atuar como locais de nucleação para a agregação, conduzindo à degradação da emulsão durante a armazenagem. Além disso, esta etapa de filtração pode conseguir a esterilização do filtro. A filtração por membrana, em particular, adequada para a esterilização do filtro depende das caracteristicas do fluido da segunda emulsão e do grau de filtração requerida. As caracteristicas dum filtro podem afetar sua aptidão para a filtração da emulsão microfluidizada. Por exemplo, as 29 suas características de tamanho e de superfície de poro podem ser importantes, particularmente quando da filtragem de uma emulsão à base de esqualeno. 0 tamanho dos poros das membranas utilizadas com a invenção deve permitir a passagem das gotículas desejadas, mantendo as gotículas indesejadas. Por exemplo, ele deve reter as gotas que têm um tamanho de ^1 ym permitindo ao mesmo tempo a passagem de gotículas de <200 nm. Um filtro de 0,2 ym ou 0,22ym é o ideal, e pode também conseguir a esterilização de filtro. A emulsão é pré-filtrado por exemplo através de um filtro de 0,45 ym. A pré-filtração e a filtração são realizadas numa etapa através da utilização de filtros de camada dupla conhecidos em que a primeira camada tem um tamanho de poro> 0.3ym, tal como entre 0,3-2 ym ou entre 0,3-1 ym, ou entre 0,4-0,8ym, ou entre 0,5-0,7ym. Um tamanho de poro de ^ 0,75ym na primeira camada é o preferido. Assim, a primeira camada pode ter um tamanho de poro de 0,6ym ou 0,45ym, por exemplo. A segunda camada tem um tamanho de poros <0.3ym, tal como entre 0,15-0,28ym ou entre 0,18-0.24ym, por exemplo, uma segunda camada com um tamanho de poro de 0,2 ym ou 0,22ym. Num exemplo, a primeira camada de membrana com poros maiores, proporciona um filtro de 0,45 ym, enquanto a segunda camada de membrana com poros menores fornece um filtro 0,22ym. A membrana de filtração e/ou a membrana pré-filtração pode ser assimétrica. Uma membrana assimétrica é aquela em que o tamanho do poro varia de um lado da membrana ao outro, por exemplo, na qual a dimensão dos poros é maior na face 30 de entrada do que na face de saída. Um dos lados da membrana assimétrica pode ser referido como a "superfície de poros grosseiros", enquanto o outro lado da membrana assimétrica pode ser referido como a "superfície de poros fina". Num filtro de camada dupla, uma ou (de preferência) de ambas as camadas podem ser assimétricas. A membrana de filtração pode ser porosa ou homogénea. Uma membrana homogénea é geralmente uma película densa variando de 10 a 200 ym. Uma membrana porosa apresenta uma estrutura porosa. Numa forma de realização, a membrana de filtração é porosa. Num filtro de camada dupla, ambas as camadas podem ser porosas, ambas as camadas podem ser homogéneas, ou pode haver uma porosa e uma homogénea. Um filtro de dupla camada preferido é aquele em que ambas as camadas são porosas.

Numa forma de realização, a segunda emulsão é pré-filtrada através de uma membrana porosa hidrofílica, assimétrica, e, em seguida, filtrada através de uma outra membrana porosa hidrofílica assimétrica com poros mais pequenos do que a membrana de pré-filtração. Isto pode utilizar um filtro de camada dupla. A membrana de filtro (s) pode ser autoclavada antes da utilização para assegurar que é estéril.

Um filtro ideal para utilização com a invenção tem uma superfície hidrofílica, em contraste com os ensinamentos das referências 9-12 que filtros hidrofóbicos (polissulfona) devem ser usados. Filtros com superfícies 31 hidrofílicas podem ser formados a partir de materiais hidrofílicos, ou por hidrofilização de materiais hidrofóbicos, e o filtro para utilização com a invenção é uma membrana de polietersulfona hidrofilica. Diversos métodos são conhecidos para transformar membranas hidrofóbicas PES em membranas hidrofílicas PES. Muitas vezes consegue-se através do revestimento da membrana com um polímero hidrofílico. Para proporcionar a fixação permanente de polímero hidrofílico à PES o revestimento de uma camada hidrofilica é normalmente submetido a uma reação por reticulação ou a enxertia. A referência 15 descreve um processo para modificar as propriedades de superfície de um polímero hidrofóbico que tem extremidades de cadeia funcionalizáveis, compreendendo o contacto do polímero com uma solução de uma porção ligante para formar uma ligação covalente, e depois contactar o polímero hidrofóbico feito reagir com uma solução de um agente de modificação. A referência 16 descreve um método de hidrofilização de membrana PES por revestimento direto da membrana, envolvendo um pré-humedecimento com álcool e, em seguida imersão numa solução aquosa contendo um monómero hidrofílico, um monómero polifuncional (reticulado) e um iniciador de polimerização. 0 monómero e agente de ligação reticulada são, em seguida, polimerizados através da polimerização térmica ou UV iniciada para formar um revestimento do polímero hidrofílico de ligação cruzada sobre a superfície da membrana. Da mesma forma, as referências 17 e 18 descrevem um revestimento de membrana PES por imersão numa solução aquosa de um polímero hidrofílico (óxido de polialquileno), e pelo menos um monómero polifuncional (reticulado), e, em seguida, polimerizar um monómero para proporcionar um revestimento hidrofílico não-extraível. A referência 19 descreve a hidrofilização da membrana PES por uma reação de enxerto em 32 que uma membrana PES é submetida a um tratamento de plasma de hélio a baixa temperatura seguido por enxerto do monómero hidrofilico N-vinil-2-pirrolidona (NVP) sobre a superfície da membrana. Outros processos são revelados nas referências 20 a 26.

Nos métodos que não dependem de revestimento, a PES pode ser dissolvida num solvente, misturado com um aditivo hidrofilico solúvel e, em seguida a solução combinada é utilizada para a fundição de uma membrana hidrofílica, por exemplo por precipitação ou por iniciação da co-polimerização. Tais métodos são descritos nas referências 27 a 33. Por exemplo, a referência 33 descreve um método de preparação de uma membrana de carga hidrofílica modificada que tem extraíveis de membrana baixos e permite uma recuperação rápida da resistividade de água ultrapura, tendo uma estrutura de rede de polímero reticulada interpenetrante formada fazendo uma solução de polímero de uma mistura de PES, PVP, polietilenoimina e éter diglicidílico alifático, formando uma fina película de solução, e precipitando a película como uma membrana. Um processo semelhante é descrito na referência 34.

Abordagens híbridas podem ser usadas, no qual os aditivos hidrofílicos estão presentes durante a formação da membrana e são também adicionados posteriormente como um revestimento, por exemplo ver a referência 35. A hidrofilização da membrana PES pode também ser conseguida por tratamento com plasma a baixa temperatura. A referência 36 descreve a modificação hidrofílica da membrana PES pelo tratamento com plasma CO2 de baixa temperatura. 33 A hidrofilização da membrana PES pode também ser conseguida por oxidação, tal como descrito na referência 37. Este método envolve o pré-humedecimento de uma membrana PES hidrofóbica num liquido com uma tensão superficial baixa, expondo a membrana PES molhada a uma solução aquosa de oxidante, e em seguida aquecida. A inversão de fase também pode ser usada, tal como descrito na referência 38.

Uma membrana hidrofilica de PES ideal pode ser obtida por tratamento de PES (hidrofóbico) com PVP (hidrofilico). 0 tratamento com PEG (hidrofilico) em vez de PVP foi encontrado para dar uma membrana PES hidrofilizada que é facilmente contaminada (particularmente quando se utiliza uma emulsão contendo esqualeno) e também desvantajosamente liberta formaldeido durante a autoclavagem. 0 filtro de dupla camada tem uma primeira membrana PES hidrofilica e uma segunda membrana PES hidrofilica.

Membranas hidrofilicas conhecidas incluem Bioassure (de Cuno); polietersulfona Everlux™; polietersulfona STyLUX™ (ambas de Meissner); membranas Millex GV Millex HP, Millipak 60, Millipak 200 e Durapore CVGL01TP3 (da Millipore); Membrana Fluorodyne™ EX FED, Supor™ EAV; Supor™ EBV, Supor™ EKV (todas da Pall); Sartopore™ (da Sartorius); membrana hidrofilica PES da Sterlitech; e membrana PES WFPES de Wolftechnik. 34

Durante a filtração, a emulsão pode ser mantida a uma temperatura de 40°C ou menos, por exemplo 30°C ou menos, para facilitar a filtração estéril com sucesso. Algumas emulsões não podem passar através de um filtro estéril, quando estão a uma temperatura superior a 40°C. É vantajoso realizar a etapa de filtração dentro de 24 horas, por exemplo, dentro de 18 horas, dentro de 12 horas, dentro de 6 horas, dentro de 2 horas, dentro de 30 minutos, para produzir a segunda emulsão, porque após este tempo, pode não ser possivel passar a segunda emulsão através do filtro estéril sem entupimento do filtro, tal como discutido na referência 39.

Os métodos da invenção podem ser utilizados em larga escala. Assim, um método pode envolver filtragem num volume superior a 1 litro por exemplo, A 5 litros, A 10 litros, A 20 litros, A 50 litros, ú 100 litros, ú 250 litros, etc. A emulsão final O resultado da microfluidização e filtração é uma emulsão de óleo em água em que o tamanho médio das gotas de óleo pode ser inferior a 220 nm, por exemplo, 155 ± 20 nm, 155 ± 10 nm e 155 ± 5 nm, e em que o número de gotas de óleo possuindo um tamanho> 1,2 ym pode ser de 5 x 108/mL ou menos, por exemplo, 5 x 107/ml ou menos, 5 x 106/ml ou menos, 2 x 106/ml ou menos, ou 5 x 105/ml ou menos. 35 0 tamanho médio de gotícula de óleo das emulsões aqui descritas (incluindo a primeira e segunda emulsões) não é geralmente inferior a 50 nm.

Os métodos da invenção podem ser utilizados em larga escala. Assim, um método pode envolver a preparação de uma emulsão final, com um volume superior a 1 litro por exemplo, > 5 litros, > 10 litros, > 20 litros, á 50 litros, á 100 litros, á 250 litros, etc.

Uma vez formada a emulsão de óleo em água pode ser transferido para garrafas de vidro estéreis. As garrafas de vidro podem ser de 5 L, 8 L ou 10 L. Alternativamente, a água-em-óleo pode ser transferida para um saco flexível, estéril (saco flex). O saco flexível pode ser de 50 L, 100 L ou 250 L. Além disso, o saco flexível pode ser equipado com um ou mais conectores estéreis para ligar o saco flexível ao sistema. 0 uso de um saco flexível com conectores estéreis é vantajosa em relação às garrafas de vidro, porque o saco flexível é maior do que a garrafa de vidro o que significa que pode não ser necessário mudar o saco flexível para armazenar toda a emulsão fabricado num único lote. Isto pode proporcionar um sistema fechado, estéril, para o fabrico da emulsão, que pode reduzir a possibilidade das impurezas estarem presentes na emulsão final. Isto pode ser particularmente importante se a emulsão final é usado para fins farmacêuticos, por exemplo, se a emulsão final é o adjuvante MF59.

As quantidades preferidas de óleo (% em volume) na emulsão final estão entre 2-20%, por exemplo cerca de 10%. Um conteúdo de esqualeno de cerca de 5% ou cerca de 10% é 36 particularmente útil. Um conteúdo de esqualeno (p/v) de entre 30-50mg/ml é útil, por exemplo entre 35-45mg/ml, 36-42mg/ml, 38-40mg/ml, etc.

As quantidades preferidas de agentes tensioativos (% em peso) na emulsão final, são: ésteres de polioxietileno de sorbitano (tal como Tween 80) : 0,02 a 2%, em particular cerca de 0,5% ou cerca de 1%; ésteres de sorbitano (tais como Span 85) 0,02-2%, em particular cerca de 0,5% ou cerca de 1%; octil ou nonilfenoxi polooxietanóis (como Triton X-100), 0,001 a 0,1%, especialmente 0,005-0,02%; éteres de polioxietileno (tal como laureth 9) 0,1 a 20%, de preferência de 0,1 a 10% e em particular 0,1 a 1% ou cerca de 0,5%. Um teor de polissorbato 80 (p/v) entre 4-6mg/ml é útil, por exemplo entre 4,1-5,3mg/ml. Um conteúdo de trioleato de sorbitano (p/v) entre 4-6mg/ml é útil, por exemplo entre 4,1-5,3mg/ml. O processo é particularmente útil para a preparação de qualquer uma das seguintes emulsões de óleo em água:

Uma emulsão compreendendo esqualeno, polissorbato 80 (Tween 80) e trioleato de sorbitano (Span 85) . A composição da emulsão, em volume pode ser de cerca de 5% de esqualeno, cerca de 0,5% de polissorbato 80 e cerca de 0,5% de trioleato de sorbitano. Em termos de peso, estes valores tornam-se 4,3% de esqualeno, 0,5% de polissorbato 80 e 0,48% de trioleato de sorbitano. Este adjuvante é conhecido como MF59. A emulsão MF59 inclui vantajosamente, iões de citrato, por exemplo, 10 mM de tampão de citrato de sódio. 37

As emulsões compreendendo esqualeno, um α-tocoferol (de preferência de DL-a-tocoferol), e polissorbato 80. Estas emulsões podem ter (em peso) de 2 a 10% de esqualeno, de 2 a 10% α-tocoferol e 0,3-3% de polissorbato 80, por exemplo, 4,3% de esqualeno, 4,7% a-tocoferol, 1,9% de polissorbato 80. A proporção de peso de esqualeno: tocoferol é de preferência < 1 (por exemplo, 0,90), pois isso proporciona uma emulsão mais estável. O esqualeno e polisorbato 80 podem estar presentes numa razão de volume de cerca de 5:2, ou numa proporção em peso de cerca de 11:5. Uma tal emulsão pode ser feita dissolvendo o polisorbato 80 em PBS para dar uma solução a 2%, seguida de mistura de 90 ml desta solução com uma mistura de (5 g de DL-a-tocoferol e 5 mL de esqualeno), em seguida, a mistura é microfluidizada. A emulsão resultante pode ter goticulas de óleo submicrométricas por exemplo, com um tamanho entre 100 e 250 nm, de preferência cerca de 180nm.

Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol, e um detergente de Triton (por exemplo, Triton X-100). A emulsão pode também incluir um monofosforil lípido A 3-O-desacilado ('3d-MPL'), embora as emulsões contendo 3d-MPL não sejam preferidas na presente invenção (e, por vezes, podem ser descartadas). A emulsão pode conter um tampão fosfato.

Uma emulsão compreendendo esqualeno, um polisorbato (por exemplo, polissorbato 80), com um detergente de Triton (por exemplo, Triton X-100) e um tocoferol (por exemplo um a-tocoferol succinato). A emulsão pode incluir os três componentes numa razão de massa de cerca de 75:11:10 (por exemplo, polissorbato 80 750pg/ml, 110pg/ml de Triton X-100 e 100pg/ml de α-tocoferol succinato), e as concentrações utilizadas devem incluir qualquer contribuição de estes componentes de antigénios. A emulsão também pode incluir 38 um 3d-MPL. A emulsão pode também incluir uma saponina, tal como QS21. A fase aquosa pode conter um tampão fosfato.

Uma emulsão compreendendo esqualeno, um solvente aquoso, um éter de alquilo polioxietileno de agente tensioativo não iónico hidrofílico (por exemplo, éter de polioxietileno (12) cetoestearilico) e um agente tensioativo não iónico hidrofóbico (por exemplo, um éster de sorbitano ou um éster manide, tais como monoleato de sorbitano ou 'Span 80'). A emulsão é, de preferência termo-reversivel e/ou tem, pelo menos, 90% das goticulas de óleo (por volume) com um tamanho inferior a 200 nm [40]. A emulsão pode também incluir um ou mais dos seguintes: alditol; um agente crioprotetor (por exemplo, um açúcar, tal como dodecilmaltoside e/ou sacarose) e/ou um alquilpoliglicosideo. Pode também incluir um agonista de TLR4, tal como um cuja estrutura química não inclui um anel de açúcar [41]. Essas emulsões podem ser liofilizadas.

As composições destas emulsões, expressas em termos percentuais acima, podem ser modificados, por diluição ou concentração (por exemplo, por um número inteiro, tal como 2 ou 3, ou por uma fracção, tal como 2/3 ou 3/4), em que as suas proporções permanecem as mesmas. Por exemplo, um MF59 concentrada 2 vezes teria cerca de 10% de esqualeno, cerca de 1% de polissorbato 80 e cerca de 1% de trioleato de sorbitano. As formas concentradas podem ser diluídas (por exemplo, com uma solução de antigénio) para dar uma concentração final da emulsão desejada.

As emulsões da invenção são armazenadas preferencialmente entre 2°C e 8°C. Elas não devem ser congeladas. Elas devem, idealmente, ser mantidas fora da luz direta. Em 39 particular, as emulsões contendo esqualeno e vacinas da invenção devem ser protegidas para evitar a quebra fotoquimica do esqualeno. Se as emulsões da invenção são, armazenadas, então, devem ser, de preferência, numa atmosfera inerte, por exemplo N2 ou árgon.

Vacinas

Embora seja possivel administrar adjuvantes de emulsão de óleo em água por si só aos pacientes (por exemplo, para proporcionar um efeito adjuvante para um antigénio que foi administrado separadamente ao paciente), é mais do que o habitual misturar o adjuvante com um antigénio previamente à administração, de modo a formar uma composição imunogénica, por exemplo uma vacina. A mistura da emulsão e do antigénio pode ter lugar extemporaneamente, no momento da utilização, ou pode ter lugar durante o fabrico da vacina, antes do enchimento. Os métodos da invenção podem ser aplicados em ambas as situações.

Assim, um método da invenção pode incluir uma etapa adicional de mistura do processo de emulsão com um componente antigénio. Como alternativa, pode incluir uma etapa adicional de embalar o adjuvante num kit como um componente do kit em conjunto com um componente de antigénio.

No geral, portanto, a invenção pode ser utilizada na preparação de vacinas mistas ou na preparação de kits, incluindo antigénios e adjuvante prontos para a mistura. Quando a mistura tem lugar durante o fabrico, então, os volumes de antigénio em bruto e emulsão que são misturados serão tipicamente superiores a 1 litro, por exemplo, h 5 40 litros, >10 litros, > 20 litros, >50 litros, > 100 litros, >250 litros, etc. Caso a mistura tenha lugar no ponto de uso, em seguida, os volumes que são misturados serão tipicamente menores do que 1 mililitro por exemplo d 0,6 ml, < 0,5 ml, ^0,4 ml, ^ 0,3 ml, d0,2 ml, etc. Em ambos os casos é usual que os volumes de emulsão e solução de antigénio a ser misturados sejam substancialmente iguais, ou seja, substancialmente 1:1 (por exemplo, entre 1,1:1 e 1:1,1, preferencialmente, entre 1,05:1 e 1:1,05 e, mais preferivelmente entre 1.025:1 e 1:1.025). Em algumas concretizações, no entanto, um excesso de emulsão ou um excesso de antigénio pode ser utilizado [42]. Se for utilizado um excesso de volume de um componente, o excesso será, geralmente, de pelo menos 1,5:1, por exemplo > 2:1, >2,5:1, > 3:1, > 4:1, > 5:1, etc.

Quando o antigénio e o adjuvante são apresentados como componentes separados dentro de um kit, estão fisicamente separadas um do outro dentro do kit, e esta separação pode ser conseguida de várias maneiras. Por exemplo, os componentes podem estar em recipientes separados, tais como frascos. Os conteúdos de dois frascos podem ser, em seguida, misturados quando necessário, por exemplo, removendo o conteúdo de um frasco e adicionando-o ao outro frasco, ou por remoção separadamente do conteúdo de ambos os frascos e a sua mistura num terceiro recipiente.

Numa outra disposição, um dos componentes do kit é uma seringa e o outro é um recipiente tal como um frasco. A seringa pode ser utilizada (por exemplo, com uma agulha) para inserir o seu conteúdo para dentro do frasco para a mistura, e a mistura pode então ser retirada para a seringa. Os conteúdos misturados da seringa podem, então, 41 ser administrados a um doente, tipicamente por meio de uma nova agulha estéril. A embalagem de um componente numa seringa elimina a necessidade de utilização de uma seringa separada para a administração ao paciente.

Numa outra disposição preferida, os dois componentes do kit são mantidos em conjunto, mas separados, na mesma seringa, por exemplo uma seringa de câmara dupla, tais como as descritas nas referências 43-50, etc. Quando a seringa é acionada (por exemplo, durante a administração a um paciente), então os conteúdos das duas câmaras são misturados . Este arranjo evita a necessidade de uma etapa de mistura em separado no momento da utilização. 0 conteúdo dos diferentes componentes do kit irá geralmente estar todos sob a forma liquida. Em algumas modalidades, um componente (tipicamente o componente antigénio em vez do componente emulsão) é na forma seca (por exemplo, numa forma liofilizada) , e o outro componente está na forma liquida. Os dois componentes podem ser misturados de modo a reativar o componente seco e proporcionar uma composição liquida para administração a um paciente. Um componente liofilizado irá tipicamente estar localizado dentro de um frasco, em vez de uma seringa. Os componentes secos podem incluir estabilizantes, tais como lactose, sacarose ou manitol, bem como as suas misturas, por exemplo, misturas de lactose/sacarose, misturas de sacarose/manitol, etc. Uma disposição possível utiliza uma emulsão de componente líquido numa seringa pré-cheia, e um componente antigénio liofilizado num frasco. 42

Se as vacinas contêm componentes para além da emulsão e antigénio, em seguida, estes outros componentes podem ser incluídos num destes dois componentes do kit, ou podem ser parte de um terceiro componente de kit.

Os recipientes adequados para vacinas mistas da invenção, ou para os componentes individuais do kit incluem frascos e seringas descartáveis. Estes recipientes devem ser estéreis.

Sempre que uma composição/componente está localizado num frasco, o frasco é de preferência feito de vidro ou de material plástico. 0 frasco é preferencialmente esterilizado antes da composição ser adicionada. Para evitar problemas com pacientes sensíveis ao látex, os frascos são preferencialmente selados com uma rolha livre de látex, e a ausência de látex em todo o material de embalagem é o preferido. Numa concretização, um tubo de ensaio tem uma rolha de borracha butílica. 0 frasco pode incluir uma dose única de vacina/componente, ou pode incluir mais de uma dose (um frasco de 'multidose') , por exemplo, 10 doses. Numa concretização, um frasco inclui 10 x 0,25 ml de doses de emulsão. Frascos preferidos são feitos de vidro incolor.

Um frasco pode ter uma tampa (por exemplo, um Luer lock) adaptada de tal forma que uma seringa pré-cheia pode ser inserida na tampa, o conteúdo da seringa pode ser expelido no frasco (por exemplo, para reconstituir o material liofilizado), e os conteúdos do frasco podem ser removidos de volta para a seringa. Após a remoção da seringa do frasco, uma agulha pode então ser ligada e a composição 43 pode ser administrada a um paciente. A tampa está de preferência localizados dentro de um selo ou cobertura, de tal modo que o selo ou cobertura tem que ser removido antes da tampa pode ser acedida.

Sempre que uma composição/componente é embalado dentro de uma seringa, a seringa não terá normalmente uma agulha unida a ela, embora uma agulha separada possa ser fornecida com a seringa para a montagem e utilização. São preferidas as agulhas de segurança. Agulhas de 1 polegada de calibre 23, agulhas de 1 polegada de calibre 25, agulhas de 5/*8 de polegada de calibre são tipicas. As seringas podem ser fornecidas com rótulos destacáveis em que o número de lote, estação da gripe e data de validade do conteúdo pode ser impresso, para facilitar a manutenção de registos. 0 êmbolo da seringa tem de preferência um batente para impedir que o êmbolo seja acidentalmente removido durante a aspiração. As seringas podem ter uma tampa e/ou êmbolo de borracha de látex. As seringas descartáveis contêm uma dose única de vacina. A seringa tem geralmente uma tampa na ponta para selar a ponta antes da fixação de uma agulha, e a tampa da ponta é de preferência feito de uma borracha de butilo. Se a seringa e agulha são embaladas separadamente a agulha está de preferência equipado com um retentor de borracha butilica. A emulsão pode ser diluida com um tampão antes de ser embalada num frasco ou seringa. Tampões típicos incluem: um tampão fosfato, um tampão de Tris, um tampão de borato, um tampão de succinato, um tampão de histidina ou um tampão de citrato. A diluição pode reduzir a concentração dos componentes do adjuvante, mantendo as suas proporções 44 relativas, por exemplo, para proporcionar um adjuvante de "meia-força" .

Os recipientes podem ser marcados para mostrar um volume de meia dose, por exemplo para facilitar a administração a crianças. Por exemplo, uma seringa que contém uma dose de 0,5 ml pode ter uma marca que mostra um volume de 0,25 ml.

Se for utilizado um recipiente de vidro (por exemplo, uma seringa ou um frasco), então é preferível utilizar um recipiente feito de um vidro de borossilicato em vez de um vidro de cal de soda. Vários antigénios podem ser utilizados com as emulsões de óleo em água: antigénios virais, tais como as proteínas virais de superfície; antigénios bacterianos, tais como proteínas e/ou antigénios sacarídeos; antigénios fúngicos; antigénios de parasitas; e antigénios tumorais. A invenção é particularmente útil para as vacinas contra o vírus da gripe, HIV, ancilóstomo, vírus da hepatite B, vírus do herpes simplex, raiva, vírus sincicial respiratório, citomegalovírus, Staphylococcus aureus, clamídia, coronavírus SARS, vírus da varicela zoster, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Mycobacterium tuberculose, Bacillus anthracis, vírus de Epstein Barr, vírus do papiloma humano, etc. Por exemplo:

Antígenos do vírus da gripe. Estes podem tomar a forma de um vírus vivo ou de um vírus inativado. Sempre que um vírus inativado é usado, a vacina pode compreender um irião inteiro, um virião fragmentado, ou antigénios de superfície purificados (incluindo hemaglutinina e, normalmente, também 45 incluindo a neuraminidase) . Os antigénios da gripe podem também ser apresentados sob a forma de virossomas. Os antigénios podem ter qualquer subtipo de hemaglutinina, selecionado a partir de Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hl 1, H12, Hl 3, H14, H15 e/ou H16. A vacina pode incluir o antigénio (s) de um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou mais) estirpes do virus de gripe, incluindo vírus da gripe A e/ou vírus da gripe B, por exemplo, uma vacina monovalente A/H5N1, A/H1N1 ou uma vacina trivalente A/H1N1 + A/H3N2 + B. 0 vírus da gripe pode ser de uma estirpe recombinante, e pode ter sido obtido por meio de técnicas de genética reversa [por exemplo, 51-55] . Assim, o vírus pode incluir um ou mais segmentos de ARN de um vírus A/PR/8/34 (tipicamente 6 segmentos de A/PR/8/34, com os segmentos HA e N sendo de uma estirpe de vacina, ou seja, uma 6:2 recombinante). Os vírus utilizados como a fonte dos antigénios podem ser produzidas quer em ovos (por exemplo, ovos de galinha embrionados) ou em cultura de células. Quando a cultura de células é utilizada, o substrato celular será tipicamente uma linha de células de mamíferos, tais como MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38, etc. Linhas de células de mamíferos preferidas para o cultivo dos vírus da gripe incluem: células MDCK [56-59], derivadas doe rim canino Madin Darby; células Vero [60-62], derivadas de rim de macaco verde Africano; ou células PER.C6 [63], derivada de retinoblastos embrionários humanos. Quando o vírus foi cultivado numa linha de células de mamífero, em seguida, a composição irá estar vantajosamente livre de proteínas do ovo (por exemplo, ovalbumina e ovomucóide) e do ADN do frango, reduzindo assim a alergenicidade. As doses unitárias de vacina são tipicamente normalizadas por referência ao conteúdo de hemaglutinina (HA), normalmente medido por SRID. As vacinas existentes contêm tipicamente cerca de 46 15μg de HA por estirpe, embora doses mais baixas possam ser usadas, em particular quando se usa um adjuvante. Doses fracionadas tais como is (isto é, 7,5yg de HA por estirpe), H e H foram utilizadas [64,65], assim como as doses mais elevadas (por exemplo de 3x ou 9x doses [66,67]). Assim, as vacinas podem incluir entre 0,1 e 150yg de HA por estirpe de gripe, preferencialmente, entre 0,1 e 50 yg por exemplo, 0,1-20 yg, 0,l-15yg, 0,1-10 yg, 0,l-7,5yg, 0,5-5 yg, etc. Doses especificas incluem, por exemplo, cerca de 15, cerca de 10, cerca de 7,5, cerca de 5, cerca de 3,8, cerca de 3,75, cerca de 1,9, cerca de 1,5, etc., por estirpe.

Virus da imunodeficiência humana, incluindo o HIV-1 e HIV-2. O antigénio será tipicamente um antigénio de envelope.

Antigenos de superficie do virus da hepatite B. Este antigénio é preferivelmente obtido por métodos de ADN recombinante, por exemplo, após a expressão numa levedura de Saccharomyces cerevisiae. Diferentemente do HBsAg nativo virai, o antigénio expresso de levedura recombinante é não-glicosilado. Ele pode estar na forma de partículas substancialmente esféricas (diâmetro médio de cerca de 20 nm) , incluindo uma matriz de lípido compreendendo fosfolipideos. Diferentemente das partículas de HBsAg nativo, as partículas expressas de levedura podem incluir fosfatidilinositol. 0 HBsAg pode ser de qualquer um dos subtipos aywl, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq e adrq+. caninos Ac-MTP-1 e/ou uma expressa

Ancilostoma, particularmente, como visto em (Ancylostoma caninum). Este antigénio pode ser recombinante (semelhante astacin, metaloprotease) hemoglobinase aspártica (Ac-APR-1), que pode ser 47 num sistema de baculovirus/células de insecto como uma proteína segregada [68,69].

Antigénios do virus Herpes simplex (HSV). Um antigénio HSV preferido para utilização com a invenção é a glicoproteina de membrana gD. É preferível utilizar gD uma estirpe de de HSV-2 (antigénio 'gD2'). A composição pode utilizar uma forma de gD em que a região de âncora na membrana do terminal C foi suprimida [70], por exemplo, uma gD truncada compreendendo os aminoácidos 1-306 da proteína natural com a adição de aparagine e glutamina na extremidade C-terminal. Esta forma da proteína inclui o peptídeo de sinal que é clivado para dar uma proteína madura de aminoácidos 283. A supressão da âncora permite que a proteína seja preparada na forma solúvel.

Antigénios do papilomavírus humano (HPV). Antigénios de HPV preferidos para utilização com a invenção são as proteínas da cápside Ll, que se podem montar para formar estruturas conhecidas como partículas semelhantes a vírus (VLPs) . As VLP podem ser produzidas pela expressão de Ll recombinante em células de levedura (por exemplo, em S. cerevisiae) ou em células de insectos (por exemplo, em células de Spodoptera, como S.frugiperda, ou em células de Drosophila) . Para as células de levedura, os vectores de plasmídeo podem transportar o gene Ll; para células de insectos, os vectores de baculovirus podem transportar o gene Ll. Mais preferencialmente, a composição inclui VLPs de Ll, tanto das estirpes HPV-16 como das HPV-18. Esta combinação bivalente tem demonstrado ser altamente eficaz [71]. Além das estirpes HPV-16 e HPV-18, também é possível incluir a VLPs de Ll das estirpes HPV-6 e HPV-11. O uso de estirpes de HPV oncogénico também é possível. Uma vacina pode incluir entre 20-60pg/ml (por exemplo, cerca de 40pg/ml) de Ll por estirpe de HPV. 48

Antígenos de antrax. 0 Antrax é causado por Bacillus anthracis. Antigénios de B.anthracis adequados incluem os componentes A (fator letal (LF) e factor de edema (EF)), ambos os quais podem partilhar um componente B comum conhecido como antigénio protetor (PA) . Os antigénios podem ser opcionalmente desintoxicados. Mais detalhes podem ser encontrados nas referências [72 a 74].

Antígenos de S. aureus. São conhecidas uma variedade de antigénios S.aureus. Antigénios adequados incluem sacarídeos capsulares (por exemplo, a partir de uma estirpe de tipo de 5 e/ou tipo 8) e proteínas (por exemplo, IsdB, HLA, etc.) Antigénios sacarídeos capsulares são idealmente conjugados com uma proteína transportadora.

Antígenos de S. pneumoniae. São conhecidas uma variedade de antigénios de S. pneumoniae. Antigénios adequados incluem sacarídeos capsulares (por exemplo, a partir de um ou mais dos serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e/ou 23F) e proteínas (por exemplo, pneumolisina, pneumolisina desintoxicada, poli-histidina da tríade da proteína D (PhtD), etc) . Antigénios sacarídeos capsulares são idealmente conjugados com uma proteína transportadora.

Antígenos de cancro. São conhecidas uma variedade de antigénios específicos de tumores. A invenção pode ser utilizada com antigénios que induzem uma resposta de imunoterapia contra o cancro do pulmão, melanoma, cancro da mama, cancro da próstata, etc.

Uma solução do antigénio será normalmente misturada com a emulsão, por exemplo numa relação de volume de 1:1. Esta mistura pode ser realizada por um fabricante da vacina, 49 antes do enchimento, ou pode ser realizada no ponto de uso, por um profissional de saúde.

As composições farmacêuticas

Composições feitas utilizando os métodos da invenção são farmaceuticamente aceitáveis. Elas podem incluir componentes em adição à emulsão e o antigénio facultativo. A composição pode incluir um conservante, tal como tiomersal ou 2-fenoxietanol. É preferido, no entanto, que a vacina deve estar substancialmente isenta de (ou seja, menos do que 5pg/ml) de material mercurial, por exemplo, livre de tiomersal [75,76]. Vacinas e componentes que não contenham mercúrio são mais preferidos. 0 pH da composição varia geralmente entre 5,0 e 8,1, e mais tipicamente entre 6,0 e 8,0, por exemplo entre 6,5 e 7,5. Um processo da invenção pode, portanto, incluir uma etapa de ajuste do pH da vacina antes da embalagem. A composição é de preferência estéril. A composição é de preferência não pirogénica por exemplo, contendo <1 EU (unidade de endotoxina, uma medida padrão) por dose, e de preferência <0,1 EU por dose. A composição é de preferência sem glúten. A composição pode incluir material para uma única imunização, ou pode incluir material para imunizações múltiplas (ou seja, um kit 'multidose'). A inclusão de um conservante é preferida em regime de multidose. 50

As vacinas são tipicamente administradas num volume de dosagem de cerca de 0,5 ml, apesar de uma meia dose (isto é, cerca de 0,25 ml) pode ser administrada a crianças.

Utilização em métodos de tratamento, e administração da vacina A invenção proporciona kits e composições preparadas utilizando os métodos da invenção. As composições preparadas de acordo com os métodos da invenção são adequadas para administração a pacientes humanos, e a invenção é utilizada num método para aumentar uma resposta imune num paciente, compreendendo a etapa de administração de uma tal composição ao paciente. A invenção também fornece esses kits e composições para utilização como medicamentos. A invenção também proporciona a utilização de: (i) uma preparação aquosa de um antigénio; e (ii) uma emulsão de óleo em água preparada de acordo com a invenção, no fabrico de um medicamento para aumentar uma resposta imune num paciente. A resposta imune levantada por estes métodos e utilizações incluirão geralmente uma resposta de anticorpos, de preferência uma resposta de anticorpos protetores.

As composições podem ser administradas de várias maneiras. A via mais preferida é a imunização por injeção intramuscular (por exemplo, no braço ou na perna), mas outras vias disponiveis incluem a injeção subcutânea, 51 intranasal [77-79], oral [80], intradérmica [81,82], transcutânea, transdérmica [83], etc.

As vacinas preparadas de acordo com a invenção podem ser utilizadas para tratar tanto crianças como adultos. O doente pode ter menos de 1 ano de idade, 1-5 anos, 5-15 anos, 15-55 anos, ou pelo menos 55 anos de idade. O paciente pode ser idoso (por exemplo, h 50 anos de idade, de preferência ^ 65 anos), jovem (por exemplo, ^ 5 anos), pacientes hospitalizados, trabalhadores da saúde, forças armadas, mulheres grávidas, doentes crónicos, imunodeficientes, e pessoas que viajem para o exterior. As vacinas não são adequadas apenas para estes grupos, no entanto, podem ser utilizadas mais geralmente numa população.

As vacinas da invenção podem ser administradas a pacientes substancialmente ao mesmo tempo que (por exemplo, durante a mesma consulta médica ou visita a um profissional de cuidados de saúde) outras vacinas.

Processos intermediários A invenção também proporciona um método para o fabrico de uma emulsão de óleo em água, compreendendo a microfluidização de uma primeira emulsão para formar uma segunda emulsão e, em seguida, filtração da segunda emulsão. A primeira emulsão apresenta as caracteristicas acima descritas. A invenção também proporciona um método para o fabrico de uma emulsão de óleo em água, compreendendo a filtração de uma segunda emulsão, isto é, uma emulsão microfluidizada. 52 A emulsão microfluidizada tem as características acima descritas. A invenção também proporciona um método para o fabrico de uma vacina, compreendendo a combinação de uma emulsão com um antigénio, em que a emulsão tem as caracteristicas acima descritas.

Concretizações específicas

Formas de realização específicas aqui descritas também incluem: - Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo em água que compreende esqualeno, que compreende as etapas de (i) formação de uma primeira emulsão tendo uma primeira dimensão média de goticulas de óleo; (ii) microfluidização da primeira emulsão para formar uma segunda emulsão que tem uma segundo tamanho médio de goticulas de óleo, que é menor do que a primeira dimensão média de goticulas de óleo; e (iii) filtração da segunda emulsão, utilizando uma membrana hidrofílica. - Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo em água, compreendendo as etapas de (i) formação de uma primeira emulsão tendo uma primeira dimensão média de goticulas de óleo de 5000 nm ou menos; (ii) microfluidização da primeira emulsão para formar uma segunda emulsão tendo um segundo tamanho médio das goticulas de óleo que é menor do que a primeira dimensão média de goticulas de óleo; e (iii) filtração da segunda emulsão, utilizando uma membrana hidrofílica. - Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo em água, compreendendo as etapas de (i) formação de uma primeira 53 emulsão tendo uma primeira dimensão média de goticulas de óleo; (ii) microfluidização da primeira emulsão para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho média de goticulas de óleo, que é menor do que a primeira dimensão média de goticulas de óleo; e (iii) filtração da segunda emulsão, utilizando uma membrana de polietersulfona hidrofilica. - Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo em água que compreende esqualeno, o método compreendendo a etapa de (i) formação de uma primeira emulsão tendo um primeiro tamanho médio de goticula de óleo utilizando um homogeneizador, em que a primeira emulsão é formada por fazer circular os componentes da primeira emulsão através de um homogeneizador uma pluralidade de vezes. - Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo em água que compreende esqualeno, o método compreendendo a etapa de (b) microfluidização de uma primeira emulsão tendo uma primeira dimensão média de goticulas de óleo, para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho médio de goticulas de óleo o qual é menor que o primeiro tamanho médio de goticula de óleo, em que a segunda emulsão é formada pela circulação dos componentes da segunda emulsão, transferindo os componentes da segunda emulsão a partir de um primeiro recipiente de emulsão, por meio de um primeiro dispositivo de microfluidização de um segundo recipiente de emulsão, e em seguida, através de um segundo dispositivo microfluidização, em que os primeiro e segundo dispositivos de microfluidização são os mesmos. - Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo em água, compreendendo: a passagem de uma primeira emulsão tendo um primeiro tamanho médio das goticulas de óleo através de um dispositivo de microfluidização, para formar uma segunda 54 emulsão que tem um segundo tamanho médio das gotículas de óleo que é menor que o primeiro tamanho médio das goticulas de óleo: em que o dispositivo de microfluidização compreende uma câmara de interação, que compreende uma pluralidade de canais de tipo Z e um módulo de processamento auxiliar compreendendo pelo menos um canal; em que o módulo de processamento auxiliar está posicionado a jusante da câmara de interação. - Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo em água, compreendendo a etapa de transmitir uma primeira emulsão tendo um primeiro tamanho médio das goticulas de óleo através de um dispositivo de microfluidização, para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho médio das goticulas de óleo que é menor que o primeiro tamanho médio das goticulas de óleo; em que o dispositivo de microfluidização compreende uma câmara de interação e um módulo de processamento auxiliar compreendendo uma pluralidade de canais. - Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo em água, compreendendo a etapa de transmitir uma primeira emulsão tendo um primeiro tamanho médio das goticulas de óleo através de um dispositivo de microfluidização, para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho médio das goticulas de óleo que é menor que o primeiro tamanho médio das goticulas de óleo, em que o dispositivo de microfluidização compreende uma câmara de interação e em que a pressão dos componentes da emulsão, na entrada para a câmara de interação é substancialmente constante pelo menos durante 85% do tempo durante o qual a emulsão é introduzida no microfluidizador. - Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo em água, compreendendo a etapa de formação de uma primeira emulsão 55 tendo uma primeira dimensão média de goticulas de óleo, em que a formação da primeira emulsão é levada a cabo sob um gás inerte, por exemplo azoto, por exemplo, a uma pressão de até 0,5 bar. - Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo em água, compreendendo a etapa de passagem de uma primeira emulsão tendo um primeiro tamanho médio das goticulas de óleo através de um dispositivo de microfluidização, para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho médio das goticulas de óleo que é menor do que o primeiro tamanho médio das goticulas de óleo, em que a formação da segunda emulsão é levada a cabo sob um gás inerte, por exemplo azoto, por exemplo, a uma pressão de até 0,5 bar. - Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo em água, compreendendo as etapas de (i) formação de uma primeira emulsão tendo uma primeira dimensão média de goticulas de óleo; (ii) microfluidização da primeira emulsão para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho média de goticulas de óleo, que é menor do que a primeira dimensão média de goticulas de óleo; (iii) filtração da segunda emulsão; (iv) transferência da emulsão de óleo em água para um saco flexivel estéril.

Geral O termo "que compreende" engloba "incluindo" bem como "consistindo" por exemplo, uma composição "que compreende" X pode consistir exclusivamente de X ou pode incluir algo adicional, por exemplo X + Y.

A palavra "substancialmente" não exclui "completamente" por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y 56 pode ser completamente livre de Y. Sempre que necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omissa da definição da invenção. 0 termo "cerca de" em relação a um valor numérico x é opcional e significa, por exemplo, x ± 10%. A menos que especificado em contrário, um processo que compreende uma etapa de mistura de dois ou mais componentes não requer nenhuma ordem especifica da mistura. Assim, os componentes podem ser misturados em qualquer ordem. Quando existem três componentes então dois componentes podem ser combinados um com o outro, e, em seguida, a combinação pode ser combinada com o terceiro componente, etc.

Onde materiais animais (e particularmente bovinos) são utilizados na cultura de células, eles devem ser obtidos de fontes que sejam livres de encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET), e em particular livres de encefalopatia espongiforme bovina (BSE). Em geral, prefere-se a cultura de células na ausência total de materiais derivados de animais.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra um exemplo específico de um homogeneizador que pode ser usado para formar uma primeira emulsão. A Figura 2 mostra o detalhe de um rotor e estator, que pode ser utilizado num tal homogeneizador. 57 A Figura 3 mostra dois perfis de pressão para um modo de intensificador de bomba síncrona. A Figura 4 mostra um canal da câmara de interação de tipo Z. A Figura 5 mostra uma circulação de tipo I, enquanto a Figura 6 mostra uma circulação de tipo II. Os recipientes são etiquetados como "C", enquanto o homogeneizador é rotulado como "H". A direção e a ordem dos movimentos de fluxo são mostradas. Na Figura 6, o homogeneizador tem duas setas de entrada e duas setas de saída, mas na realidade o homogeneizador tem um único canal de entrada e um único canal de saída. MODOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO Exemplo 1

Uma emulsão microfluidizada compreendendo esqualeno, polissorbato 80, trioleato de sorbitano e tampão de citrato de sódio foi preparado de acordo com a presente invenção. A emulsão foi microfluidizada até que tenha um tamanho de gota de óleo médio de 165 nm ou menos e um número de gotas de óleo possuindo um tamanho> 1,2 μΜ de 5 x 10 /ml ou menos. A emulsão foi filtrada através de um cartucho de filtro de grau de esterilização (filtro A) tendo um pré-filtro de membrana de polietersulfona hidrofílica assimétrica porosa tendo um tamanho de poro de 0,45 ym e uma membrana de filtro final hidrofílica de polietersulfona assimétrica porosa tendo um tamanho de poro de 0,2 ym. Durante a filtração, a emulsão foi mantida a uma temperatura de 40 ± 5 °C. 58 0 processo acima foi realizado por quatro experiências separadas e as caracteristicas das emulsões filtradas foram medidas e são apresentadas na Tabela 1.

Tabela 1

Parâmetros de teste Valor atual Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 Tamanho médio de gotícula de óleo 148 144 144 150 Número de goticulas de óleo tendo um tamanho >1,2 ym 0,08xl0b 0,08xl0b 0,12xl0b 0,20xl0b

Como mostrado na Tabela 1, o filtro A consistentemente reduziu o tamanho médio das goticulas de óleo na emulsão. Além disso, o filtro A consistentemente reduziu o número de goticulas de óleo tendo um 1,2 μΜ na emulsão de cerca de 103 vezes.

Exemplo 2 A mesma emulsão microfluidizada, como usada no exemplo 1, foi filtrada através de um cartucho de filtro de diferente grau de esterilização (filtro B) . 0 filtro B tinha uma membrana pré-filtro de hidrofilica de poliétersulfona assimétrica porosa e uma membrana hidrofilica de filtro final de polietersulfona assimétrica porosa tendo um tamanho de poro de 0,2 ym. Durante a filtração, a emulsão foi mantida a uma temperatura de 40 ± 5°C. Este processo foi realizado em quatro experiências separadas e as caracteristicas das emulsões filtradas foram medidas e são apresentadas na Tabela 2. 59

Tabela 2

Parâmetros de teste Valor medido Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 Tamanho médio de goticula de óleo 142 143 141 141 Número de goticulas de óleo tendo um tamanho >1,2 pm 0,23xlOb 0,15xlOb 0,20xl0b 0,23xlOb

Como mostrado na Tabela 2, o filtro B consistentemente reduziu o tamanho médio das goticulas de óleo na emulsão. Além disso, o filtro B consistentemente reduziu o número de goticulas de óleo tendo um 1,2 μΜ na emulsão de cerca de 103 vezes.

Dos exemplos 1 e 2, pode ser visto que o filtro B resulta num ligeiramente menor tamanho das gotas de óleo, mas um número ligeiramente maior de goticulas de óleo com um tamanho maior do que 1,2 μΜ. No entanto, ambos os filtros A e B apresentaram excelentes resultados.

Exemplo 3 A mesma emulsão microfluidizada, como usada para o exemplo 1, foi filtrada através de outro cartucho de filtro de diferente grau de esterilização (filtro C) . 0 filtro C tinha um pré-filtro de membrana de polietersulfona hidrofilica assimétrica porosa tendo um tamanho de poro de 0,45 pm e um final de filtro de membrana hidrófila de polietersulfona assimétrica porosa tendo um tamanho de poro de 0,2 pm. Durante a filtração, a emulsão foi mantida a uma temperatura de 40 ± 5°C. 60

Além disso, a mesma emulsão microfluidizada, como usada para o exemplo 1, foi filtrada através de outro cartucho de filtro de diferente grau de esterilização (filtro D). Filtro D tinha um pré-filtro de membrana de polietersulfona hidrofilica assimétrica porosa e um final de filtro de membrana hidrofilica de PVDF porosa. Durante a filtração, a emulsão foi mantida a uma temperatura de 40 + 5°C. 0 filtro C mostrou excelentes resultados de filtração proporcionando uma emulsão filtrada possuindo um tamanho médio de goticulas de óleo de 155 ± 20 nm e um certo número de gotas de óleo tendo um 1,2 μΜ de 5 x 106/ ml ou menos. Embora, o filtro D também forneça uma emulsão filtrada que satisfaça os critérios acima referidos, verificou-se que bloqueia mais rapidamente, necessitando, assim, a substituição do filtro de membrana D. Assim, todos os filtros de poliétersulfona eram superiores a este filtro de PVDF.

Exemplo 4

Dez diferentes membranas hidrofilicas, de vários fabricantes, foram testadas para a filtragem de uma emulsão microfluidizada compreendendo esqualeno, polissorbato 80, trioleato de sorbitano e tampão de citrato de sódio. Os filtros foram numerados de 1 a 10, como mostrado na Tabela 3 (Nota: O filtro 1 é o mesmo filtro que o filtro C no Exemplo 3 acima; filtro 2 é o filtro D; filtro 9 é o filtro A e o filtro 10 é o filtro B). O rendimento depois da filtração de 50 litros de emulsão foi medido para determinar se os filtros eram adequados para utilização em escala industrial. A % de emulsão de 61 entrada que foi recuperada após filtração, foi como se segue:

Tabela 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 % 50 16 8 8 8 13 4 82 88 89 A baixa % de recuperação indica que o filtro retém a emulsão, por exemplo por causa do bloqueio. É evidente que apenas os filtros 1, 8, 9 e 10 (isto é, os filtros A, B e C a partir de cima, além de um filtro adicional, que é semelhante ao filtro A, mas tem um tamanho de poro maior na primeira camada) originaram rendimentos de ^50 %, e que os rendimentos que são mais praticáveis para utilização numa escala industrial, são os filtros de 8-10. Os filtros 1, 8, 9 e 10 são todos de membranas de PES hidrofilicas de dupla camada, preparados por três fabricantes diferentes. As primeiras camadas nestas quatro membranas são de 0,45 ym ou 0,6ym e a segunda camada é de 0,2 ym. Os melhores resultados foram observados quando pelo menos uma das duas camadas era uma membrana assimétrica.

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Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método para a preparação de uma emulsão adjuvante de vacinas óleo em água contendo esqualeno, que compreende as etapas de: (i) formação de uma emulsão contendo esqualeno tendo um tamanho médio de goticulas de óleo de 500 nm ou menos, compreendendo as etapas de a. formação de uma primeira emulsão tendo uma primeira dimensão média de goticulas de óleo; b. microfluidização da primeira emulsão para formar uma segunda emulsão que tem uma segunda dimensão média de goticulas de óleo de 500 nm ou menos, o que é menos do que a primeira dimensão média de goticulas de óleo; e (ii) filtração da segunda emulsão, utilizando uma membrana hidrofilica de polietersulfona de dupla camada com uma primeira camada possuindo um tamanho de poro de > 0.3pm e uma segunda camada tendo um tamanho de poro de <0,3pm, proporcionando assim um adjuvante de vacina.
2. Método da reivindicação 1, em que a primeira dimensão média de goticulas de óleo é de 5000 nm ou menos.
3. Método da reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o número de gotas de óleo possuindo um tamanho de> 1,2 pm na primeira emulsão é de 5 x 1011/ml ou menos.
4. Método de qualquer das reivindicações 1-3, em que o número de gotas de óleo possuindo um tamanho de> 1,2 pm, na segunda emulsão é de 5 x 1010/ml ou menos. 1
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que 0 tamanho médio de goticula de óleo após a filtração seja inferior a 220 nm.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o número de gotas de óleo possuindo um tamanho de> 1,2 ym após a filtração é de 5 x 108/ml ou menos.
7 . Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que: (a) a primeira camada de membrana é assimétrica e/ou porosa; e/ou (b) a segunda camada de membrana é assimétrica e/ou porosa.
8. Método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a segunda camada de membrana, e, opcionalmente, a primeira camada de membrana, compreende (m) um material de suporte polimérico.
9. Método para preparar uma composição de vacina, compreendendo a preparação de uma emulsão de adjuvante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e combinar a emulsão de adjuvante com um antigénio.
10. Método para a preparação de um kit de vacina compreendendo a preparação de uma emulsão de adjuvante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e embalar a emulsão de adjuvante num kit como um componente do kit em conjunto com um componente de antigénio.
11. Método da reivindicação 10, em que os componentes do kit estão em frascos separados (por exemplo, em que os frascos são feitos de vidro de borosilicato). 2
12. Método de qualquer das reivindicações 9 a 11, em que a emulsão adjuvante é uma adjuvante a granel e o método compreende a extração de doses unitárias a partir do adjuvante a granel para embalagem como componentes do kit.
13. Método de qualquer uma das reivindicações 9 a 12, em que o antigénio é um antigénio do vírus da gripe, por exemplo, em que a combinação da emulsão e do antigénio constitui uma composição de vacina, e em que a composição de vacina inclui cerca 15yg, cerca de 10 yg, cerca de 7,5 yg, cerca de 5 yg, cerca de 3, 8 yg, cerca de 3,75 yg, cerca de 1,9 yg, ou cerca de 1,5 yg de hemaglutinina por estirpe do vírus da gripe. 3