ES2558056T3 - Filtración hidrófila durante la fabricación de adyuvantes para vacunas - Google Patents

Abstract

Un método para fabricar una composición farmacéuticamente aceptable que comprende una emulsión de aceite en agua, que comprende las etapas de: (i) preparar una emulsión de aceite en agua que tiene un tamaño medio de gotitas de aceite menor de 1 μm; (ii) prefiltrar la emulsión de aceite en agua usando una membrana de prefiltración de polietersulfona hidrófila; y (iii) filtrar la emulsión de aceite en agua prefiltrada obtenida en el paso (ii) usando una membrana de filtración de polietersulfona hidrófila.

Description

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Filtracion hidrofila durante la fabricacion de adyuvantes para vacunas

Descripcion

CAMPO TECNICO

La presente invencion se encuentra en el campo de la fabricacion de adyuvantes para vacunas en emulsion de aceite en agua, por ejemplo mediante microfluidificacion.

ANTECEDENTES DE LA TECNICA

El adyuvante para vacunas conocido como “MF59” [1-3] es una emulsion submicrometrica de aceite en agua de escualeno, polisorbato 80 (tambien conocido como Tween 80) y trioleato de sorbitan (tambien conocido como Span 85). Tambien puede incluir iones citrato, por ejemplo tampon de citrato de sodio 10 mM. La composicion de la emulsion en volumen puede ser escualeno aproximadamente al 5%, Tween 80 aproximadamente al 0,5% y Span 85 aproximadamente al 0,5%. El adyuvante y su produccion se describen con mas detalle en el capltulo 10 de la referencia 4, en el capltulo 12 de la referencia 5 y en el capltulo 19 de la referencia 6.

Como se describe en la referencia 7, MF59 se fabrica a escala comercial dispersando Span 85 en la fase de escualeno y Tween 80 en la fase acuosa, seguido de mezcla a alta velocidad para formar una emulsion grosera. A continuacion, se hace pasar varias veces esta emulsion grosera por un microfluidificador para producir una emulsion con un tamano de gotitas de aceite uniforme. Como se describe en la referencia 6, a continuacion se filtra la emulsion microfluidificada a traves de una membrana de 0,22 pm con el fin de eliminar cualquier gotita de aceite grande, y el tamano medio de las gotitas de la emulsion resultante permanece inalterada durante al menos 3 anos a 4°C. Puede medirse el contenido de escualeno de la emulsion final como se describe en la referencia 8.

En diversos documentos (por ejemplo, las referencias 9-12) se describe que MF59 puede fabricarse mediante microfluidificacion seguida de esterilizacion por filtracion a traves de un filtro de polisulfona de 0,22 pm. Las polisulfonas son pollmeros que contienen grupos sulfona (SO2) en la cadena principal del pollmero y los filtros de polisulfona son filtros hidrofobos bien conocidos.

Es un objeto de la invencion proporcionar metodos adicionales y mejorados para la produccion de emulsiones de aceite en agua microfluidificadas (tales como MF59), en concreto metodos que sean adecuados para su uso a escala comercial y que utilicen la filtracion.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

La invencion proporciona un metodo para la fabricacion de una emulsion de aceite en agua que comprende escualeno, en el que el metodo comprende las etapas de: (i) preparar una primera emulsion que tiene un primer tamano medio de gotitas de aceite, tambien conocida como emulsion preliminar o pre-emulsion; (ii) microfluidificar la primera emulsion para formar una segunda emulsion que tiene un segundo tamano medio de gotitas de aceite que es inferior al primer tamano medio de gotitas de aceite, y (iii) filtrar la segunda emulsion utilizando una membrana hidrofila.

La invencion tambien proporciona un metodo para fabricar una emulsion de aceite en agua que comprende las etapas de: (i) preparar una primera emulsion con un primer tamano medio de gotitas de aceite de 5.000 nm o menor, tambien conocida como emulsion preliminar o pre emulsion; (ii) microfluidificar la primera emulsion para formar una segunda emulsion con un segundo tamano medio de gotitas de aceite que es inferior al primer tamano medio de gotitas de aceite, y (iii) filtrar la segunda emulsion utilizando una membrana hidrofila.

La invencion tambien proporciona un metodo para la fabricacion de una emulsion de aceite en agua que comprende las etapas de: (i) preparar una primera emulsion que tiene un primer tamano medio de gotitas de aceite, tambien conocida como emulsion preliminar o preemulsion; (ii) microfluidificar la primera emulsion para formar una segunda emulsion que tiene un segundo tamano medio de gotitas de aceite que es inferior al primer tamano medio de gotitas de aceite, y (iii) filtrar la segunda emulsion utilizando una membrana de polietersulfona hidrofila.

Opcionalmente, puede prepararse la primera emulsion utilizando un homogeneizador como se describe mas adelante.

Como se describe con mas detalle mas adelante, la primera emulsion puede tener un tamano medio de gotitas de aceite de 5.000 nm o menor, por ejemplo, un tamano medio entre 300 nm y 800 nm. El numero de gotitas de aceite en la primera emulsion con un tamano > 1,2 pm puede ser 5 x 1011 /ml o menor, como se describe mas adelante. Las gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm resultan desventajosas, ya que pueden provocar inestabilidad de la emulsion debido a la aglomeracion y a la coalescencia de las gotitas [14].

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Despues de su formacion, a continuacion puede someterse la primera emulsion a al menos un pase de microfluidificacion para formar la segunda emulsion con un tamano medio de gotitas de aceite reducido. Como se describe mas adelante, el tamano medio de las gotitas de aceite de la segunda emulsion es 500 nm o menor. El numero de gotitas de aceite en la segunda emulsion con un tamano > 1,2 pm puede ser 5 x 1010 /ml o menor, como se describe mas adelante. Para conseguir estas caracterlsticas puede ser necesario hacer pasar los componentes de la emulsion por el dispositivo de microfluidificacion varias veces, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 veces.

La segunda emulsion se filtra a traves de una membrana asimetrica hidrofila, por ejemplo una membrana de polietersulfona hidrofila, para proporcionar una emulsion de aceite en agua que pueda ser adecuada para su uso como adyuvante para vacunas. El tamano medio de las gotitas de aceite de la emulsion de aceite en agua producida despues de la filtracion puede ser 220 nm o menor, por ejemplo entre 135 nm-175 nm, entre 145 nm-165 nm o aproximadamente 155 nm. El numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm presentes en la emulsion de aceite en agua producida despues de la filtracion puede ser 5 x 108 /ml o menor, por ejemplo 5 x 107 /ml o menor, 5 x 106 /ml o menor, 2 x 106 /ml o menor o 5 x 105 /ml o menor.

La emulsion final de aceite en agua formada despues de la filtracion puede tener al menos 102 veces menos gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm en comparacion con la primera emulsion, e idealmente al menos 103 veces menos (por ejemplo, 104 veces menos).

En algunas formas de realization, se utiliza mas de un ciclo de las etapas (i) y (ii) antes de la etapa (iii). Del mismo modo, pueden utilizarse multiples repeticiones de las etapas individuales (i) y (ii).

La invention tambien puede usarse para preparar adyuvantes de emulsiones de aceite en agua sin utilizar microfluidificacion, por ejemplo para metodos que se basan en tecnicas alternativas como termoreversibilidad [40]. En estas realizaciones la invencion proporcionan un metodo para la fabrication de una emulsion de aceite en agua que comprende escualeno, en el que el metodo comprende los pasos de: (i) preparation de una emulsion de aceite en agua que tiene un tamano medio de gotitas de aceite menor de 1pm (por ejemplo, menor de 500 nm, menor de 250 nm, menor de 200 nm, menor de 150 nm, menor de 100 nm); y (ii) filtrar la emulsion usando una membrana hidrofila. Por lo tanto estas realizaciones toman ventaja de la idoneidad de la membrana hidrofila para preparar adyuvantes de emulsiones de aceite en agua que contienen escualeno pero no requieren del uso de microfluidificacion de antemano.

Del mismo modo, la invencion proporciona el uso de una membrana hidrofila para preparar un adyuvante en emulsion de aceite en agua. Mas adelante se analizan otras caracterlsticas de la membrana y del adyuvante en emulsion.

En general, los metodos de la invencion se llevan a cabo entre 20°C-60°C, e idealmente a 40±5°C. Aunque los componentes de la emulsion primero y segundo pueden ser relativamente estables incluso a temperaturas mas elevadas, todavla puede producirse la degradation termica de algunos componentes, por lo que resultan preferentes temperaturas mas bajas.

Componentes de la emulsion

El tamano medio de las gotitas de aceite (es decir, el diametro medio en numero de las gotitas de aceite de la emulsion) puede medirse utilizando una tecnica de dispersion de luz dinamica, como se describe en la referencia 13. Un ejemplo de una maquina de medicion de dispersion de luz dinamica es el analizador de tamano de partlculas submicrometricas Nicomp 380 (de Particle Sizing Systems).

Puede medirse el numero de partlculas con un tamano > 1,2 pm utilizando un contador de partlculas tal como el Accusizer™ 770 (de Particle Sizing Systems).

Los metodos de la invencion se utilizan para fabricar emulsiones de aceite en agua. Estas emulsiones incluyen tres ingredientes basicos: un aceite, un componente acuoso y un tensioactivo.

Dado que las emulsiones estan destinadas al uso farmaceutico, el aceite sera por lo general biodegradable (metabolizable) y biocompatible.

El aceite utilizado puede comprender escualeno, un aceite de hlgado de tiburon que es un terpenoide insaturado ramificado (C30H50; [(CH3)2C[=CHCH2CH2C(CH3)]2=CHCH2-]2; 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22- tetracosahexaeno, CAS RN 7683-64-9). El escualeno resulta especialmente preferente para su uso en la presente invencion.

El aceite de la presente invencion puede comprender una mezcla (o combination) de aceites, por ejemplo, que comprenda escualeno y al menos un aceite adicional.

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En vez de (o ademas de) utilizar escualeno, una emulsion puede comprender otro(s) aceite(s), incluidos, por ejemplo, los de una fuente vegetal o animal (como el pescado). Las fuentes de aceites vegetales incluyen frutos secos, semillas y granos. Son ejemplos de aceites de frutos secos el aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite de coco y el aceite de oliva, los mas comunmente disponibles. Puede utilizarse el aceite de jojoba, por ejemplo, obtenido de la semilla de jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceite de cartamo, aceite de semilla de algodon, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de sesamo y similares. En el grupo de los granos, el aceite de malz es el de mas facil adquisicion, pero tambien puede utilizarse el aceite de otros granos de cereales tales como trigo, avena, centeno, arroz, tef, tritical y similares. Los esteres de acidos grasos de 6 a 10 carbonos de glicerol y 1,2-propanodiol, a pesar de no encontrarse de forma natural en los aceites de semillas, pueden prepararse mediante hidrolisis, separacion y esterificacion de los materiales apropiados a partir de aceites de frutos secos y semillas. Las grasas y aceites de la leche de los mamlferos son metabolizables y por tanto pueden utilizarse. Los procedimientos para la separacion, purificacion, saponificacion y otros medios necesarios para obtener aceites puros a partir de fuentes animales se conocen bien en la tecnica.

La mayorla de los peces contienen aceites metabolizables que pueden recuperarse facilmente. Por ejemplo, el aceite de hlgado de bacalao, los aceites de hlgado de tiburon y el aceite de ballena tal como el espermaceti, ejemplifican varios de los aceites de pescado que pueden utilizarse en el presente documento. Varios aceites de cadena ramificada se sintetizan bioqulmicamente en unidades de isopreno de 5 carbonos y se denominan generalmente terpenoides. Tambien puede utilizarse escualano, el analogo saturado del escualeno. Los aceites de pescado, incluidos el escualeno y el escualano, pueden adquirirse facilmente en fuentes comerciales o pueden obtenerse por metodos conocidos en la tecnica.

Otros aceites utiles son los tocoferoles, especialmente en combination con escualeno. Cuando la fase de aceite de una emulsion incluye un tocoferol, puede utilizarse cualquiera de los a, y P, 6, £ o ^ tocoferoles, pero resultan preferentes los a-tocoferoles. Pueden utilizarse el D-a-tocoferol y el DL-a-tocoferol. Un a-tocoferol preferente es el DL-a-tocoferol. El tocoferol puede adoptar varias formas, por ejemplo, diferentes sales y/o isomeros. Las sales incluyen sales organicas, tales como succinato, acetato, nicotinato, etc. Si va a utilizarse una sal de este tocoferol, la sal preferente es el succinato. Puede utilizarse una combinacion de aceites que comprenda escualeno y un tocoferol (por ejemplo, DL-a-tocoferol).

El componente acuoso puede ser agua pura (por ejemplo, agua para inyectables) o puede incluir otros componentes, por ejemplo solutos. Por ejemplo, puede incluir sales para formar un tampon, por ejemplo sales de fosfato o citrato, tales como sales de sodio. Los tampones tlpicos incluyen: un tampon de fosfato, un tampon Tris, un tampon de borato, un tampon de succinato, un tampon de histidina o un tampon de citrato. Los tampones estaran incluidos por lo general en el intervalo comprendido entre 5 mM-20 mM.

El tensioactivo es preferentemente biodegradable (metabolizable) y biocompatible. Los tensioactivos pueden clasificarse por su "EHL" (equilibrio hidrofilo/lipofilo), en el que un EHL en el intervalo comprendido entre 1 y 10 significa generalmente que el tensioactivo es mas soluble en aceite que en agua, y un eHl en el intervalo comprendido entre 10 y 20, mas soluble en agua que en aceite. Las emulsiones comprenden preferentemente al menos un tensioactivo con un EHL de al menos 10, por ejemplo al menos 15, o preferentemente al menos 16.

La invention puede utilizarse con tensioactivos que incluyen, pero no se limitan a: los tensioactivos de esteres de polioxietilensorbitan (comunmente conocidos como los Tween), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copollmeros de oxido de etileno (EO), oxido de propileno (PO) y/u oxido de butileno (BO), que se venden con el nombre comercial DOWFAX™, tales como copollmeros de bloque EO/PO lineales; octoxinoles, que pueden variar en el numero de grupos etoxi repetidos (oxi-1,2-etanodiilo), resultando de especial interes octoxinol-9 (Triton X-100, o t-octilfenoxipolietoxietanol); (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfollpidos tales como fosfatidilcolina (lecitina); eteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes de laurilo, cetilo, estearilo y oleilo (conocidos como tensioactivos Brij), tales como eter monolaurllico de trietilenglicol (Brij 30); eter de polioxietileno-9-laurilo; y esteres de sorbitan (comunmente conocidos como los SPAN), tales como trioleato de sorbitan (Span 85) y monolaurato de sorbitan. Los tensioactivos preferentes para incluir en la emulsion son polisorbato 80 (Tween 80; monooleato de polioxietilensorbitan), Span 85 (trioleato de sorbitan), lecitina y Triton X-100.

Pueden incluirse en la emulsion mezclas de tensioactivos, por ejemplo mezclas de Tween 80/Span 85 o mezclas de Tween 80/Triton-X100. Tambien resulta adecuada una combinacion de un ester de polioxietilensorbitan, tal como monooleato de polioxietilensorbitan (Tween 80) y un octoxinol tal como t-octilfenoxi-polietoxietanol (Triton X-100). Otra combinacion util comprende laureth-9 mas un ester de polioxietilensorbitan y/o un octoxinol. Las mezclas utiles pueden comprender un tensioactivo con un valor EHL en el intervalo comprendido entre 10 y 20 (por ejemplo, Tween 80, con un EHL de 15,0) y un tensioactivo con un valor EHL en el intervalo comprendido entre 1 y 10 (por ejemplo, Span 85, con un EHL de 1,8).

Formacion de la primera emulsion

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Antes de la etapa de microfluidificacion, pueden mezclarse los componentes de la emulsion para formar una primera emulsion.

Las gotitas de aceite en la primera emulsion tienen un tamano medio de 5.000 nm o menor, por ejemplo, 4.000 nm o menor, 3.000 nm o menor, 2.000 nm o menor, 1.200 nm o menor, 1.000 nm o menor, por ejemplo, un tamano medio entre 800 nm y 1.200 nm o entre 300 nm y 800 nm.

En la primera emulsion el numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm puede ser 5 x 1011 /ml o menor, por ejemplo, 5 x 1010 /ml o menor o 5 x 109 /ml o menor.

A continuation, se microfluidifica la primera emulsion para formar una segunda emulsion con un tamano medio de gotitas de aceite inferior al de la primera emulsion y/o menos gotitas de aceite con tamano >1,2 pm.

El tamano medio de las gotitas de aceite de la primera emulsion puede conseguirse mezclando los componentes de la primera emulsion en un homogeneizador. Por ejemplo, como se muestra en la figura 1, pueden combinarse en un recipiente de mezcla (12) y a continuacion, los componentes combinados pueden introducirse (13) en un homogeneizador mecanico, tal como un homogeneizador de rotor-estator (1).

Los homogeneizadores pueden funcionar de manera vertical y/u horizontal. Para mayor comodidad en un entorno comercial, resultan preferentes los homogeneizadores en llnea.

Los componentes se introducen en un homogeneizador de rotor-estator y se encuentran con un rotor en rapida rotation que contiene unas ranuras o agujeros. Los componentes son lanzados hacia afuera por centrifugation a modo de bomba y pasan por las ranuras/agujeros. En algunas formas de realization, el homogeneizador incluye multiples combinaciones de rotores y estatores, por ejemplo, un sistema concentrico de anillos con dientes de peine, como se muestra mediante los elementos (3) y (4); (5) y (6); y (7) y (8) de la figura 1 y de la figura 2. Los rotores en los homogeneizadores a gran escala utiles pueden tener anillos con dientes de peine en el borde de un impulsor de multiples palas orientadas horizontalmente (por ejemplo, el elemento (9) de la figura 1) alineados con poca tolerancia para hacer coincidir los dientes en un revestimiento estatico. La primera emulsion se forma por medio de una combination de turbulencia, cavitation y cizalladura mecanica que se producen dentro de la separation entre el rotor y el estator. Los componentes se introducen provechosamente en una direction paralela al eje del rotor.

Un parametro importante de rendimiento de los homogeneizadores de rotor-estator es la velocidad periferica del rotor. Este parametro esta en funcion de la velocidad de rotacion y del diametro del rotor. Es util una velocidad periferica de al menos 10 ms-1, y lo ideal es que sea mayor, por ejemplo > 20 ms-1, > 30 ms-1, > 40 ms-1, etc. Puede conseguirse facilmente una velocidad periferica de 40 ms-1 a 10.000 rpm con un homogeneizador pequeno, o a velocidades de rotacion inferiores (por ejemplo, 2.000 rpm) con un homogeneizador mas grande. Existen homogeneizadores de alta cizalla adecuados disponibles en el mercado.

Para la fabrication a escala comercial, lo ideal es que el homogeneizador tenga un caudal de al menos 300 l/h, por ejemplo > 400 l/h, > 500 l/h, > 600 l/h, > 700 l/h, > 800 l/h, > 900 l/h, > 1.000 l/h, > 2.000 l/h, > 5.000 l/h o incluso > 10.000 l/h. Existen homogeneizadores de alta capacidad adecuados disponibles en el mercado.

Un homogeneizador preferente proporciona una velocidad de cizalla de entre 3 x 105 s-1 y 1 x 106 s-1, por ejemplo, entre 3 x 105 s-1 y 7 x 105 s-1, entre 4 x 105 s-1 y 6 x 105 s-1, por ejemplo, aproximadamente 5 x 105 s-1.

Aunque los homogeneizadores de rotor-estator generan relativamente poco calor durante su funcionamiento, el homogeneizador puede enfriarse durante su uso. Lo ideal es mantener la temperatura de la primera emulsion por debajo de 60°C durante la homogeneizacion, por ejemplo, por debajo de 45°C.

En algunas formas de realizacion, los componentes de la primera emulsion pueden homogeneizarse multiples veces (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o mas veces). Para evitar la necesidad de una larga cadena de recipientes y homogeneizadores, los componentes de la emulsion pueden, en cambio, hacerse circular (por ejemplo, el elemento (11) de la figura 1). En concreto, la primera emulsion puede formarse haciendo circular los componentes de la primera emulsion varias veces a traves de un homogeneizador (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100 veces, etc.) Sin embargo, demasiados ciclos pueden resultar indeseables ya que pueden producir la re-coalescencia, como se describe en la referencia 14. Por lo tanto, puede controlarse el tamano de las gotitas de aceite si se utiliza la circulation en homogeneizador para comprobar que se alcanza un tamano de gotita deseado y/o que no se esta produciendo la re-coalescencia.

La circulacion a traves del homogeneizador resulta ventajosa porque puede reducir el tamano medio de las gotitas de aceite en la primera emulsion. La circulacion tambien resulta ventajosa porque puede reducir el numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm en la primera emulsion. Estas reducciones del tamano medio de gotita y del numero de gotitas de > 1,2 pm en la primera emulsion pueden proporcionar ventajas en el proceso o procesos aguas abajo. En concreto, la circulacion de los componentes de la primera emulsion a traves del homogeneizador

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puede conducir a un proceso de microfluidificacion mejorado que puede a continuacion dar como resultado un numero reducido de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm en la segunda emulsion, es decir, despues de la microfluidificacion. Esta mejora en los parametros de la segunda emulsion puede proporcionar un rendimiento de filtracion mejorado. El rendimiento de filtracion mejorado puede conducir a menores perdidas de contenido durante la filtracion, por ejemplo, perdidas de escualeno, Tween 80 y Span 85, cuando la emulsion de aceite en agua es MF59.

En el presente documento, dos tipos concretos de circulation se denominan "de tipo I" y "de tipo II". La circulation de tipo I se ilustra en la figura 5, mientras que la circulacion de tipo II se ilustra en la figura 6.

La circulacion de los componentes de la primera emulsion puede comprender una circulacion de tipo I de transferencia de los componentes de la primera emulsion entre un primer recipiente de premezcla y un homogeneizador. El primer recipiente de premezcla puede tener una capacidad de 50 l a 500 l, por ejemplo, de 100 l a 400 l, de 100 l a 300 l, de 200 l a 300 l, de 250 l o de 280 l. El primer recipiente de premezcla puede estar hecho de acero inoxidable. La circulacion de tipo I puede continuarse durante 10 a 60 minutos, por ejemplo, de 10 a 40 minutos o 20 minutos.

La circulacion de los componentes de la primera emulsion puede comprender una circulacion de tipo II de transferencia de los componentes de la primera emulsion desde un primer recipiente de premezcla, a traves de un primer homogeneizador, hasta un segundo recipiente de premezcla (que opcionalmente tiene las mismas propiedades que el primer recipiente de premezcla), y a continuacion a traves de un segundo homogeneizador. El segundo homogeneizador sera normalmente el mismo que el primer homogeneizador, pero en algunos sistemas los homogeneizadores primero y segundo son diferentes. Tras el paso de los componentes de la primera emulsion a traves del segundo homogeneizador, los componentes de la primera emulsion pueden transferirse de vuelta al primer recipiente de premezcla, por ejemplo, si va a repetirse el proceso de circulacion de tipo II. Por lo tanto, los componentes de la emulsion pueden desplazarse en un recorrido con forma de ocho entre los recipientes de premezcla primero y segundo mediante un unico homogeneizador (vease la figura 6). La circulacion de tipo II puede llevarse a cabo una sola vez o varias veces, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 veces, etc.

La circulacion de tipo II resulta ventajosa, en comparacion con la circulacion de tipo I, porque puede ayudar a asegurar que todos los componentes de la primera emulsion pasen a traves del homogeneizador. El vaciado del primer recipiente de premezcla significa que todo el contenido de emulsion ha pasado a traves del homogeneizador, al interior del segundo recipiente de premezcla. Del mismo modo, puede vaciarse el contenido del segundo recipiente de premezcla, lo que asegura de nuevo que todo el pase a traves del homogeneizador. Por lo tanto, el sistema de tipo II puede garantizar oportunamente que todos los componentes de la emulsion se homogeneizan al menos dos veces, lo que puede reducir tanto el tamano medio de las gotitas de aceite como el numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm en la primera emulsion. Una circulacion de tipo II ideal implica, por tanto, vaciar el primer recipiente de premezcla y hacer pasar sustancialmente todo su contenido a traves del homogeneizador al interior del segundo recipiente de premezcla, seguido de vaciar el segundo recipiente de premezcla y volver a hacer pasar sustancialmente todo su contenido a traves del homogeneizador de vuelta al primer recipiente de premezcla. Por lo tanto, todas las partlculas pasan a traves del homogeneizador al menos dos veces, mientras que esto resulta diflcil de conseguir con la circulacion de tipo I.

En algunas formas de realization, se utiliza una combination de las circulaciones de tipo I y de tipo II, y esta combinacion puede proporcionar una primera emulsion con buenas caracterlsticas. En concreto, esta combinacion puede reducir en gran medida el numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm en la primera emulsion. Esta combinacion puede comprender cualquier orden de circulacion de tipo I y II, por ejemplo, la tipo I seguida de la tipo II, la tipo II seguida de la tipo I, la tipo I seguida de la tipo II seguida de la tipo I de nuevo, etc. En una forma de realizacion, la combinacion comprende 20 minutos de circulacion de tipo I seguida de una unica circulacion de tipo II, es decir, transferir los componentes de la primera emulsion circulada desde un primer recipiente de premezcla, a traves de un primer homogeneizador, hasta un segundo recipiente de premezcla, y a continuacion a traves de un segundo homogeneizador una vez.

Los recipientes de premezcla primero y segundo pueden mantenerse en atmosfera de un gas inerte, por ejemplo, nitrogeno, por ejemplo, hasta 0,5 bar. Esto puede evitar la oxidation de los componentes de la emulsion, lo que resulta especialmente ventajoso si uno de los componentes de la emulsion es escualeno. Esto puede proporcionar un aumento de la estabilidad de la emulsion.

Como se ha mencionado anteriormente, el producto de entrada inicial para el homogeneizador puede ser una mezcla no homogeneizada de los componentes de la primera emulsion. Esta mezcla puede prepararse mezclando los componentes individuales de la primera emulsion de manera individual, pero, en algunas formas de realizacion, pueden combinarse multiples componentes antes de esta mezcla. Por ejemplo, si la emulsion incluye un tensioactivo con un EHL inferior a 10, puede combinarse este tensioactivo con un aceite antes de la mezcla. Del mismo modo, si la emulsion incluye un tensioactivo con un EHL superior a 10, puede combinarse este tensioactivo con un componente acuoso antes de la mezcla. Pueden combinarse sales tampon con un componente acuoso antes de la mezcla, o pueden anadirse por separado.

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Los metodos de la invencion pueden utilizarse a gran escala. Por lo tanto, un metodo puede implicar la preparacion de una primera emulsion cuyo volumen sea superior a 1 litro, por ejemplo > 5 litros, > 10 litros, > 20 litros, > 50 litros, > 100 litros, > 250 litros, etc.

Despues de su formacion, la primera emulsion puede microfluidificarse o puede almacenarse a la espera de la microfluidificacion.

En algunas formas de realizacion, en concreto aquellas en las que se utilizan multiples ciclos de las etapas (i) y (ii), el producto de entrada para el homogeneizador sera el producto de salida de un microfluidificador, de manera que la primera emulsion se microfluidifique y a continuation se someta de nuevo a homogeneizacion.

Microfluidificacion

Despues de su formacion, la primera emulsion se microfluidifica con el fin de reducir su tamano medio de gotitas de aceite y/o reducir el numero de gotitas de aceite con un tamano de > 1,2 pm.

Los instrumentos de microfluidificacion reducen el tamano medio de las gotitas de aceite impulsando las corrientes de los componentes de entrada a traves de canales fijados geometricamente a alta presion y alta velocidad. La presion en la entrada a la camara de interaction (tambien denominada "primera presion") puede ser sustancialmente constante (es decir, ±15%; por ejemplo, ±10%, ±5%, ±2%) durante al menos el 85% del tiempo durante el cual se alimentan los componentes al microfluidificador, por ejemplo, al menos el 87%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 99% o el 100% del tiempo durante el cual se alimenta la emulsion al microfluidificador.

En una forma de realizacion, la primera presion es de 1.300 bar ± 15% (18 kpsi ± 15%), es decir, entre 1.100 bar y 1.500 bar (entre 15 kpsi y 21 kpsi) durante el 85% del tiempo durante el cual se alimenta la emulsion al microfluidificador. En la figura 3 se muestran dos perfiles de presion adecuados. En la figura 3A la presion es sustancialmente constante durante al menos el 85% del tiempo, mientras que en la figura 3B la presion se mantiene sustancialmente constante de manera continua.

Un aparato de microfluidificacion comprende por lo general al menos una bomba intensificadora (preferentemente dos bombas, que pueden ser slncronas) y una camara de interaccion. La bomba intensificadora, que es idealmente electrohidraulica, proporciona una presion alta (es decir, la primera presion) para forzar una emulsion al interior y a traves de la camara de interaccion. Puede utilizarse la naturaleza slncrona de las bombas intensificadoras para proporcionar la presion sustancialmente constante de la emulsion analizada anteriormente, lo que significa que todas las gotitas de la emulsion quedan expuestas a sustancialmente el mismo nivel de fuerzas de cizalla durante la microfluidificacion.

Una ventaja de la utilization de una presion sustancialmente constante es que puede reducir los fallos por fatiga en el dispositivo de microfluidificacion, que puede conducir a una vida mas larga del dispositivo. Una ventaja adicional de la utilizacion de una presion sustancialmente constante es que pueden mejorarse los parametros de la segunda emulsion. En concreto, puede reducirse el numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm presentes en la segunda emulsion. Ademas, puede reducirse el tamano medio de las gotitas de aceite de la segunda emulsion cuando se utiliza una presion sustancialmente constante. La reduction del tamano medio de las gotitas de aceite y del numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm en la segunda emulsion puede proporcionar un rendimiento de filtration mejorado. El rendimiento de filtration mejorado puede conducir a menores perdidas de contenido durante la filtracion, por ejemplo, perdidas de escualeno, Tween 80 y Span 85 cuando la emulsion es MF59.

La camara de interaccion puede contener una pluralidad, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc., de canales de geometrla fija al interior de los cuales pasa la emulsion. La emulsion entra en la camara de interaccion a traves de una llnea de entrada que puede tener un diametro de entre 200 pm y 250 pm. La emulsion se divide en corrientes a medida que entra en la camara de interaccion y, a alta presion, se acelera a alta velocidad. A medida que pasa a traves de los canales, pueden actuar las fuerzas producidas por la alta presion para reducir el tamano de las gotitas de aceite de la emulsion y reducir el numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm. Estas fuerzas pueden incluir: fuerzas de cizalla, a traves de la deformation de la corriente de emulsion que se produce por el contacto con las paredes del canal; fuerzas de impacto, a traves de colisiones que se producen cuando las corrientes de emulsion a alta velocidad colisionan entre si; y fuerzas de cavitation, a traves de la formacion y el colapso de cavidades dentro de la corriente. La camara de interaccion no suele incluir piezas moviles. Puede incluir superficies de canal de ceramica (por ejemplo, alumina) o de diamante (por ejemplo, diamante policristalino). Otras superficies pueden estar hechas de acero inoxidable.

La geometrla fija de la pluralidad de canales en la camara de interaccion puede ser una geometrla de tipo "Y" o una geometrla de tipo "Z".

En una camara de interaccion con geometrla de tipo Y, una unica corriente de emulsion de entrada se divide en unas corrientes de emulsion primera y segunda, que a continuacion se recombinan en una unica corriente de emulsion de salida. Antes de la recombination, cada una de las corrientes de emulsion primera y segunda puede

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dividirse de forma independiente en una primera y segunda pluralidad (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) de sub-corrientes. Cuando se recombinan las corrientes de emulsion, las corrientes de emulsion primera y segunda (o sus sub-corrientes) estan fluyendo idealmente en direcciones sustancialmente opuestas (por ejemplo, las corrientes de emulsion primera y segunda, o sus sub-corrientes, estan fluyendo sustancialmente en el mismo plano (± 20°) y la direccion de flujo de la primera corriente de emulsion es diferente en 180 ± 20° de la direccion de flujo de la segunda corriente de emulsion). Las fuerzas que se producen cuando se recombinan las corrientes de emulsion pueden actuar para reducir el tamano de las gotitas de aceite de la emulsion y reducir el numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm.

En una camara de interaccion con geometrla de tipo Z, la corriente de emulsion pasa alrededor de una pluralidad (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) de codos en angulo sustancialmente recto (es decir, 90 ± 20°). La figura 4 ilustra una camara de interaccion con geometrla de tipo Z y dos codos en angulo recto en la direccion del flujo. Durante su paso alrededor de los codos, una corriente de emulsion de entrada puede dividirse en una pluralidad (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) de sub-corrientes y, a continuation, recombinarse en una unica corriente de emulsion de salida (por ejemplo, como se muestra en la figura 4, con cuatro sub-corrientes (32)). La division y a continuacion la recombination (31) pueden producirse en cualquier punto entre la entrada y la salida. Las fuerzas que se producen cuando la emulsion entra en contacto con las paredes del canal a medida que pasa alrededor de los codos pueden actuar para reducir el tamano de las gotitas de aceite de la emulsion y reducir el numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm. Un ejemplo de una camara de interaccion de tipo Z es la camara de interaccion E230Z de Microfluidics.

En una forma de realization, la corriente de emulsion pasa alrededor de dos codos en angulo sustancialmente recto. En el momento en el que la corriente de emulsion de entrada pasa alrededor del primer codo en angulo sustancialmente recto, esta se divide en cinco sub-corrientes. En el momento en el que las sub-corrientes pasan alrededor del segundo codo en angulo sustancialmente recto, estas se recombinan en una unica corriente de emulsion de salida.

En la tecnica anterior, ha sido habitual utilizar camaras de interaccion de tipo Y para emulsiones de aceite en agua como las de la presente invention. Sin embargo, los inventores han descubierto que resulta ventajoso utilizar una camara de interaccion con geometrla de canal de tipo Z para emulsiones de aceite en agua porque esto puede conducir a una mayor reduction del numero de gotitas de aceite con un tamano de > 1,2 pm presentes en la segunda emulsion, en comparacion con una camara de interaccion con geometrla de tipo Y. La reduccion del numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm en la segunda emulsion puede proporcionar un rendimiento de filtration mejorado. El rendimiento de filtration mejorado puede conducir a menores perdidas de contenido durante la filtration, por ejemplo, perdidas de escualeno, Tween 80 y Span 85 cuando la emulsion es MF59.

Un aparato de microfluidificacion preferente funciona a una presion entre 170 bar y 2.750 bar (aproximadamente de 2.500 psi a 40.000 psi), por ejemplo, aproximadamente a 345 bar, aproximadamente 690 bar, aproximadamente 1.380 bar, aproximadamente 2.070 bar, etc.

Un aparato de microfluidificacion preferente funciona a un caudal de hasta 20 l/minuto, por ejemplo hasta 14 l/minuto, hasta 7 l/minuto, hasta 3,5 l/minuto, etc.

Un aparato de microfluidificacion preferente tiene una camara de interaccion que proporciona una velocidad de cizalla superior a 1 x 106 s-1, por ejemplo > 2,5 x 106 s-1, > 5 x 106 s-1, > 107 s-1, etc.

Un aparato de microfluidificacion puede incluir multiples camaras de interaccion que se utilizan en paralelo, por ejemplo 2, 3, 4, 5 o mas, pero resulta mas util incluir una unica camara de interaccion.

El dispositivo de microfluidificacion puede comprender un modulo de procesamiento auxiliar (MPA) que comprende al menos un canal. El MPA contribuye a reducir el tamano medio de las gotitas de aceite en la emulsion que esta pasado por el dispositivo de microfluidificacion, aunque la mayor parte de la reduccion se produce en la camara de interaccion. Como se ha mencionado anteriormente, los componentes de la emulsion son introducidos en la camara de interaccion por la(s) bomba(s) intensificadora(s) a una primera presion. Los componentes de la emulsion salen generalmente del MPA a una segunda presion que es inferior a la primera presion (por ejemplo, la presion atmosferica). En general, entre el 80% y el 95% de la diferencia de presion entre las presiones primera y segunda va disminuyendo a traves de la camara de interaccion (por ejemplo, de P1 a P2 en la figura 4) y del 5% al 20% de la diferencia de presion entre las presiones primera y segunda va disminuyendo a traves del modulo de procesamiento auxiliar, por ejemplo, la camara de interaccion puede proporcionar aproximadamente el 90% de la perdida de carga mientras que el MPA puede proporcionar aproximadamente el 10% de la perdida de carga. Si la presion que ha disminuido a traves de la camara de interaccion y la presion que ha disminuido a traves del modulo de procesamiento auxiliar no explican el conjunto de la diferencia de presion entre las presiones primera y segunda, esto puede deberse a una perdida de carga finita a traves de los elementos de union entre la camara de interaccion y el modulo de procesamiento auxiliar.

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El MPA no suele incluir piezas moviles. Puede incluir superficies de canal de ceramica (por ejemplo, alumina) o de diamante (por ejemplo, diamante policristalino). Las demas superficies pueden estar hechas de acero inoxidable.

El MPA esta situado generalmente aguas abajo de la camara de interaccion y tambien puede estar situado secuencial a la camara de interaccion. En la tecnica anterior, los MPA estan situados generalmente aguas abajo de las camaras de interaccion que comprenden canales de tipo Y para suprimir la cavitacion y, por lo tanto, aumentar el caudal en la camara de tipo Y hasta en un 30%. Ademas, los MPA de la tecnica anterior estan situados generalmente aguas arriba de las camaras de interaccion que comprenden canales de tipo Z para reducir el tamano de aglomerados grandes. En este ultimo caso, el MPA solo disminuye el caudal en las camaras de tipo Z hasta en un 3%. Sin embargo, se ha descubierto que situar los MPA aguas abajo de una camara de interaccion que comprende una pluralidad de canales de tipo Z resulta ventajoso en la presente invencion porque puede conducir a una mayor reduccion del tamano medio de las gotitas de aceite y una mayor reduccion del numero de gotitas de aceite con un tamano de > 1,2 pm presentes en la segunda emulsion. Como se ha analizado anteriormente, la reduccion del numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm en la segunda emulsion puede proporcionar un rendimiento de filtracion mejorado. El rendimiento de filtracion mejorado puede conducir a menores perdidas de contenido durante la filtracion, por ejemplo, perdidas de escualeno, Tween 80 y Span 85, cuando la emulsion de aceite en agua es MF59. Una ventaja adicional de esta situacion de una camara de interaccion de tipo Z y un MPA aguas abajo es que puede conducir a una disminucion mas lenta de la presion despues de la camara de interaccion. La disminucion mas lenta de la presion puede conducir a un aumento de la estabilidad del producto, porque queda menos gas encerrado en la emulsion.

Un MPA contiene al menos un canal de geometrla fija al interior del cual pasa la emulsion. El MPA puede contener una pluralidad, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc., de canales de geometrla fija al interior de los cuales pasa la emulsion. El canal o canales del MPA pueden ser lineales o no lineales. Los canales no lineales adecuados son de geometrla de tipo "Z" o de geometrla de tipo "Y", que son los mismos que los descritos anteriormente para la camara de interaccion. En una forma de realizacion, el canal, o los canales, del MPA son de geometrla de tipo Z. Una pluralidad de canales de tipo Z divide la emulsion en corrientes a medida que esta entra al MPA.

A diferencia de las recomendaciones del fabricante, el uso de un MPA que comprende una pluralidad de canales de geometrla fija resulta ventajoso en comparacion con un MPA con un unico canal de geometrla fija, ya que esto puede conducir a una mayor reduccion del numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm presentes en la segunda emulsion. Como se ha analizado anteriormente, la reduccion del numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm en la segunda emulsion puede proporcionar un rendimiento de filtracion mejorado. El rendimiento de filtracion mejorado puede conducir a menores perdidas de contenido durante la filtracion, por ejemplo, perdidas de escualeno, Tween 80 y Span 85, cuando la emulsion de aceite en agua es MF59.

Un aparato de microfluidificacion genera calor durante su funcionamiento, lo que puede elevar la temperatura de una emulsion en 15°C-20°C con respecto a la primera emulsion. Ventajosamente, por lo tanto, la emulsion microfluidificada se enfrla tan pronto como sea posible. La temperatura de la segunda emulsion puede mantenerse por debajo de 60°C, por ejemplo, por debajo de 45°C. Por lo tanto, el producto de salida de una camara de interaccion y/o el producto de salida de un MPA pueden alimentarse a un mecanismo de enfriamiento, tal como un intercambiador de calor o serpentln de refrigeracion. La distancia entre la salida y el mecanismo de enfriamiento debe mantenerse lo mas corta posible para acortar el tiempo global, reduciendo los retardos del enfriamiento. En una forma de realizacion, la distancia entre la salida del microfluidificador y el mecanismo de enfriamiento es de entre 20 cm-30 cm. Un mecanismo de enfriamiento resulta especialmente util cuando se somete una emulsion a multiples etapas de microfluidificacion, para evitar el sobrecalentamiento de la emulsion.

El resultado de la microfluidificacion es una emulsion de aceite en agua, la segunda emulsion, en la que el tamano medio de las gotitas de aceite es 500 nm o menor. Este tamano medio resulta especialmente util ya que facilita la esterilizacion por filtracion de la emulsion. Resultan especialmente utiles las emulsiones en las que al menos el 80% en numero de las gotitas de aceite tienen un tamano medio de 500 nm o menor, por ejemplo, 400 nm o menor, 300 nm o menor, 200 nm o menor, o 165 nm o menor. Por otra parte, el numero de gotitas de aceite en la segunda emulsion con un tamano > 1,2 pm es 5 x 1010 /ml o menor, por ejemplo, 5 x 109 /ml o menor, 5 x 108 /ml o menor, o 2 x 108 /ml o menor.

El producto de entrada inicial para la microfluidificacion puede ser la primera emulsion. Sin embargo, en algunas formas de realizacion la emulsion microfluidificada se somete de nuevo a microfluidificacion, de manera que se producen multiples rondas de microfluidificacion. En concreto, la segunda emulsion puede formarse haciendo circular varias veces los componentes de la segunda emulsion a traves de un dispositivo de microfluidificacion, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces, etc. La segunda emulsion puede formarse haciendo circular, de 4 a 7 veces, los componentes de la segunda emulsion a traves de un dispositivo de microfluidificacion.

La circulacion de los componentes de la segunda emulsion puede comprender una circulacion de tipo I de transferencia de los componentes de la segunda emulsion entre un primer recipiente de emulsion (que

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opcionalmente tiene las mismas propiedades que el primer recipiente de premezcla) y el dispositivo de microfluidificacion.

La circulation de los componentes de la segunda emulsion puede comprender una circulation de tipo II de transferencia de los componentes de la segunda emulsion desde un primer recipiente de emulsion, a traves de un primer dispositivo de microfluidificacion, hasta un segundo recipiente de emulsion (que opcionalmente tiene las mismas propiedades que el primer recipiente de premezcla), y a continuation a traves de un segundo dispositivo de microfluidificacion.

El segundo dispositivo de microfluidificacion puede ser el mismo que el primer dispositivo de microfluidificacion. Como alternativa, el segundo dispositivo de microfluidificacion puede ser diferente del primer dispositivo de microfluidificacion.

El primer recipiente de emulsion puede ser el mismo que el primer recipiente de premezcla. Como alternativa, el primer recipiente de emulsion puede ser el mismo que el segundo recipiente de premezcla.

El segundo recipiente de emulsion puede ser el mismo que el primer recipiente de premezcla. Como alternativa, el segundo recipiente de emulsion puede ser el mismo que el segundo recipiente de premezcla.

El primer recipiente de emulsion puede ser el mismo que el primer recipiente de premezcla y el segundo recipiente de emulsion puede ser el mismo que el segundo recipiente de premezcla. Como alternativa, el primer recipiente de emulsion puede ser el mismo que el segundo recipiente de premezcla y el segundo recipiente de emulsion puede ser el mismo que el primer recipiente de premezcla.

Como alternativa, los recipientes de emulsion primero y segundo pueden ser diferentes de los recipientes de premezcla primero y segundo.

Despues del paso de los componentes de la segunda emulsion a traves del segundo dispositivo de microfluidificacion, los componentes de la segunda emulsion pueden transferirse de vuelta al primer recipiente de emulsion, por ejemplo, si va a repetirse el proceso de circulacion de tipo II. La circulacion de tipo II puede llevarse a cabo una sola vez o varias veces, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 veces, etc.

La circulacion de tipo II resulta ventajosa ya que asegura que todos los componentes de la segunda emulsion han pasado por el dispositivo de microfluidificacion al menos 2 veces, lo que reduce el tamano medio de las gotitas de aceite y el numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm en la segunda emulsion.

Durante la microfluidificacion puede utilizarse una combination de circulacion de tipo I y de circulacion de tipo II. Esta combinacion puede comprender cualquier orden de circulacion de tipo I y II, por ejemplo, la tipo I seguida de la tipo II, la tipo II seguida de la tipo I, la tipo I seguida de la tipo II seguida de la tipo I de nuevo, etc.

Los recipientes de emulsion primero y segundo pueden mantenerse en atmosfera de un gas inerte, por ejemplo, de hasta 0,5 bar de nitrogeno. Esto evita la oxidation de los componentes de la emulsion, que resulta especialmente ventajoso si uno de los componentes de la emulsion es escualeno. Esto conduce a un aumento de la estabilidad de la emulsion.

Los metodos de la invention pueden utilizarse a gran escala. Por lo tanto, un metodo puede implicar microfluidificar un volumen superior a 1 litro, por ejemplo > 5 litros, > 10 litros, > 20 litros, > 50 litros, > 100 litros, > 250 litros, etc.

Filtracion

Despues de la microfluidificacion, se filtra la segunda emulsion. Esta filtracion elimina cualquier gotita de aceite grande que haya superado los procedimientos de homogeneizacion y microfluidificacion. Aunque pequenas en terminos de numero, estas gotitas de aceite pueden ser grandes en terminos de volumen y pueden actuar como sitios de nucleacion para la agregacion, lo que conduce a la degradation de la emulsion durante el almacenamiento. Ademas, esta etapa de filtracion puede conseguir la esterilizacion por filtracion.

La membrana de filtracion concreta adecuada para la esterilizacion por filtracion depende de las caracterlsticas del llquido de la segunda emulsion y del grado de filtracion necesario. Las caracterlsticas de un filtro pueden influir en su idoneidad para la filtracion de la emulsion microfluidificada. Por ejemplo, sus caracterlsticas de tamano de poro y superficie pueden ser importantes, especialmente cuando se filtra una emulsion basada en escualeno.

El tamano de poro de las membranas utilizadas con la invencion debe permitir el paso de las gotitas deseadas al tiempo que retiene las gotitas no deseadas. Por ejemplo, debe retener las gotitas con un tamano

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La emulsion puede prefiltrarse, por ejemplo, a traves de un filtro de 0,45 pm. La prefiltracion y la filtracion pueden conseguirse en una etapa mediante el uso de filtros de doble capa conocidos que incluyen una primera capa de membrana con poros mas grandes y una segunda capa de membrana con poros mas pequenos. Los filtros de doble capa resultan especialmente utiles con la invention. Lo ideal es que la primera capa tenga un tamano de poro

> 0,3 pm, tal como entre 0,3 pm-2 pm o entre 0,3 pm-1 pm, o entre 0,4 pm-0,8 pm, o entre 0,5 pm-0,7 pm. Resulta preferente un tamano de poro de < 0,75 pm en la primera capa. Por lo tanto, la primera capa puede tener un tamano de poro de 0,6 pm o 0,45 pm, por ejemplo. Lo ideal es que la segunda capa tenga un tamano de poro inferior al 75% (e idealmente inferior a la mitad) del tamano de poro de la primera capa, tal como entre el 25%-70% o entre el 25%-49% del tamano de poro de la primera capa, por ejemplo entre el 30%-45%, tal como 1/3 o 4/9 del tamano de poro de la primera capa. Por lo tanto, la segunda capa puede tener un tamano de poro < 0,3 pm, tal como entre 0,15 pm-0,28 pm o entre 0,18 pm-0,24 pm, por ejemplo, una segunda capa con un tamano de poro de 0,2 pm o 0,22 pm. En un ejemplo, la primera capa de membrana con poros mas grandes proporciona un filtro de 0,45 pm, mientras que la segunda capa de membrana con poros mas pequenos proporciona un filtro de 0,22 pm.

La membrana de filtracion y/o la membrana de pre-filtracion pueden ser asimetricas. Una membrana asimetrica es una en la que el tamano de poro cambia de un lado de la membrana al otro, por ejemplo en la que el tamano de poro es mayor en la superficie de entrada que en la superficie de salida. Un lado de la membrana asimetrica puede denominarse "superficie de poros gruesos", mientras que el otro lado de la membrana asimetrica puede denominarse "superficie de poros finos". En un filtro de doble capa, una o (idealmente) ambas capas pueden ser asimetricas.

La membrana de filtracion puede ser porosa u homogenea. Una membrana homogenea es normalmente una pellcula densa de entre 10 pm y 200 pm. Una membrana porosa tiene una estructura porosa. En una forma de realization, la membrana de filtracion es porosa. En un filtro de doble capa, ambas capas pueden ser porosas, ambas capas pueden ser homogeneas, o puede haber una capa porosa y una homogenea. Un filtro de doble capa preferente es uno en el que ambas capas son porosas.

En una forma de realizacion, la segunda emulsion se prefiltra a traves de una membrana porosa hidrofila asimetrica y a continuation se filtra a traves de otra membrana porosa hidrofila asimetrica que tiene poros mas pequenos que la membrana de prefiltracion. Esta puede utilizar un filtro de doble capa.

La(s) membrana(s) de filtracion puede(n) esterilizarse en autoclave antes de su uso para garantizar su esterilidad.

Las membranas de filtracion estan hechas, por lo general, de materiales de soporte polimericos tales como PTFE (poli-tetra-fluoro-etileno), PES (polietersulfona), PVP (polivinilpirrolidona), PVDF (fluoruro de polivinilideno), nailon (poliamidas), PP (polipropileno), celulosas (incluidos esteres de celulosa), PEEK (polieteretercetona), nitrocelulosa, etc. (aunque la invencion evita preferentemente el uso de filtros a base de celulosa). Estos materiales de soporte tienen diferentes caracterlsticas, siendo algunos soportes intrlnsecamente hidrofobos (por ejemplo el PTFE) y siendo otros intrlnsecamente hidrofilos (por ejemplo los acetatos de celulosa). Sin embargo, estas caracterlsticas intrlnsecas pueden modificarse tratando la superficie de la membrana. Por ejemplo, se conoce la preparation de membranas hidrofilizadas o hidrofobizadas tratandolas con otros materiales (tales como otros pollmeros, grafito, silicona, etc.) para recubrir la superficie de la membrana, vease por ejemplo la section 2.1 de la referencia 15. En un filtro de doble capa las dos membranas pueden estar hechas de diferentes materiales o (idealmente) del mismo material.

Un filtro ideal para su uso con la invencion tiene una superficie hidrofila, a diferencia de las indicaciones de las referencias 9-12 de que deben utilizarse filtros hidrofobos (polisulfona). Los filtros con superficies hidrofilas pueden formarse a partir de materiales hidrofilos, o por hidrofilizacion de materiales hidrofobos, y un filtro preferente para su uso con la invencion es una membrana de polietersulfona hidrofila. Se conocen varios metodos diferentes para transformar las membranas de PES hidrofobas en membranas de PES hidrofilas. A menudo, esto se consigue recubriendo la membrana con un pollmero hidrofilo. Para proporcionar una fijacion permanente del pollmero hidrofilo al PES, normalmente se somete una capa de recubrimiento hidrofila a una reaction de reticulation o a injerto. En la referencia 15 se describe un proceso para modificar las propiedades superficiales de un pollmero hidrofobo que tiene extremos de cadena funcionalizables, que comprende poner en contacto el pollmero con una solution de un resto conector para formar un enlace covalente, y a continuacion poner en contacto el pollmero hidrofobo reaccionado con una solucion de un agente de modification. En la referencia 16 se describe un metodo de hidrofilizacion de membrana de PES mediante recubrimiento directo de la membrana, que implica la humectacion previa con alcohol y a continuacion la inmersion en una solucion acuosa que contiene un monomero hidrofilo, un monomero polifuncional (agente reticulante) y un iniciador de la polimerizacion. A continuacion, se polimerizan el monomero y el agente reticulante mediante polimerizacion iniciada termicamente o por UV para formar un recubrimiento de pollmero hidrofilo reticulado sobre la superficie de la membrana. Del mismo modo, en las referencias 17 y 18 se describe un recubrimiento de membrana de PES sumergiendola en una solucion acuosa de

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pollmero hidrofilo (oxido de polialquileno) y al menos un monomero polifuncional (agente reticulante) y, a continuacion, polimerizando un monomero para proporcionar un recubrimiento hidrofilo no extralble. En la referencia 19 se describe la hidrofilizacion de la membrana de PES mediante una reaccion de injerto en la que se somete una membrana de PES a tratamiento con plasma de helio a baja temperatura seguido de injerto del monomero hidrofilo N-vinil-2-pirrolidona (NVP) sobre la superficie de la membrana. En las referencias 20 a 26 se describen otros de tales procesos.

En los metodos que no dependen del recubrimiento, la PES puede disolverse en un disolvente, mezclarse con un aditivo hidrofilo soluble, y a continuacion la solucion mezclada se utiliza para colar una membrana hidrofila, por ejemplo por precipitacion o iniciando la copolimerizacion. Tales metodos se describen en las referencias 27 a 33. Por ejemplo, en la referencia 33 se describe un metodo de preparacion de una membrana con carga modificada hidrofila que tiene niveles bajos de extralbles de la membrana y permite la rapida recuperacion de la resistividad del agua ultrapura, que tiene una estructura de red polimerica interpenetrante reticulada que se forma preparando una solucion polimerica de una mezcla de PES, PVP, polietilenimina y eter de diglicidilo alifatico, formando una pellcula delgada de la solucion y haciendo precipitar la pellcula en forma de membrana. En la referencia 34 se describe un proceso similar.

Pueden utilizarse enfoques hlbridos, en los que se encuentren presentes aditivos hidrofilos durante la formacion de la membrana y tambien se anaden mas tarde como un recubrimiento, por ejemplo, vease la referencia 35.

La hidrofilizacion de la membrana de PES tambien puede conseguirse por tratamiento con plasmas a baja temperatura. En la referencia 36 se describe la modificacion hidrofila de una membrana de PES por tratamiento con plasma de CO2 a baja temperatura.

La hidrofilizacion de la membrana de PES tambien puede conseguirse por oxidacion, como se describe en la referencia 37. Este metodo implica la humectacion previa de una membrana de PES hidrofoba en un llquido de baja tension superficial, la exposicion de la membrana de PES humeda a una solucion acuosa de oxidante y, a continuacion, el calentamiento.

Tambien puede utilizarse la inversion de fases, como se describe en la referencia 38.

Puede obtenerse una membrana de PES hidrofila ideal por tratamiento de PES (hidrofobo) con PVP (hidrofilo). Se ha descubierto que el tratamiento con PEG (hidrofilo) en lugar de PVP proporciona una membrana de PES hidrofilizada que se obstruye facilmente (especialmente cuando se utiliza una emulsion que contiene escualeno) y tambien libera desventajosamente formaldehldo durante la esterilizacion en autoclave.

Un filtro de doble capa preferente tiene una primera membrana de PES hidrofila y una segunda membrana de PES hidrofila. No resultan preferentes las formas de realizacion (y a veces pueden excluirse) en las que la filtracion es en primer lugar a traves de un filtro de acetato de celulosa de doble capa y a continuacion a traves de un segundo filtro de acetato de celulosa de doble capa, en el que el tamano de poro mas pequeno del primer filtro es mayor que el tamano de poro mas grande del segundo filtro, y en el que el segundo filtro de doble capa consigue la esterilizacion por filtracion.

Las membranas hidrofilas conocidas incluyen Bioassure (de Cuno); polietersulfona EverLUX™; polietersulfona STyLUX™ (ambas de Meissner); las membranas Millex Gv, Millex HP, Millipak 60, Millipak 200 y Durapore CVGL01TP3 (de Millipore); Fluorodyne™ EX FED Membrane, Supor™ EAV; Supor™ EBV, Supor™ EKV (todas de Pall); Sartopore™ (de Sartorius); la membrana de PES hidrofila de Sterlitech; y la membrana de PES WFPES de Wolftechnik.

Durante la filtracion, la emulsion puede mantenerse a una temperatura de 40°C o menor, por ejemplo, 30°C o menor, para facilitar el exito de la filtracion esteril. Algunas emulsiones pueden no pasar a traves de un filtro esteril cuando estan a una temperatura superior a 40°C.

Resulta ventajoso llevar a cabo la etapa de filtracion en las 24 horas siguientes, por ejemplo las 18 horas siguientes, las 12 horas siguientes, las 6 horas siguientes, las 2 horas siguientes, los 30 minutos siguientes a la produccion de la segunda emulsion, porque despues de este tiempo puede que no sea posible hacer pasar la segunda emulsion a traves del filtro esteril sin obstruir el filtro, como se analiza en la referencia 39.

Los metodos de la invencion pueden utilizarse a gran escala. Por lo tanto, un metodo puede implicar filtrar un volumen superior a 1 litro, por ejemplo > 5 litros, > 10 litros, > 20 litros, > 50 litros, > 100 litros, > 250 litros, etc.

La emulsion final

El resultado de la microfluidificacion y la filtracion es una emulsion de aceite en agua en la que el tamano medio de las gotitas de aceite puede ser inferior a 220 nm, por ejemplo, 155 ± 20 nm, 155 ± 10 nm o 155 ± 5 nm, y

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en la que el numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 |jm puede ser 5 x 108 /ml o menor, por ejemplo 5 x 107 /ml o menor, 5 x 10° /ml o menor, 2 x 106 /ml o menor, o 5 x 105 /ml o menor.

El tamano medio de las gotitas de aceite de las emulsiones descritas en el presente documento (incluidas las emulsiones primera y segunda) generalmente no es inferior a 50 nm.

Los metodos de la invencion pueden utilizarse a gran escala. Por lo tanto, un metodo puede implicar la preparacion de una emulsion final con un volumen superior a 1 litro, por ejemplo > 5 litros, > 10 litros, > 20 litros, > 50 litros, > 100 litros, > 250 litros, etc.

Una vez que se ha formado la emulsion de aceite en agua, puede transferirse a botellas de vidrio esteriles. Las botellas de vidrio pueden tener una capacidad de 5 l, 8 l o 10 l. Como alternativa, el aceite en agua puede transferirse a una bolsa flexible esteril (bolsa flexible). La bolsa flexible puede tener una capacidad de 50 l, 100 l o 250 l. Ademas, la bolsa flexible puede estar equipada con uno o mas elementos de union esteriles para conectar la bolsa flexible al sistema. El uso de una bolsa flexible con unos elementos de union esteriles resulta ventajoso en comparacion con las botellas de vidrio porque la bolsa flexible es mayor que las botellas de vidrio, lo que significa que puede no ser necesario cambiar la bolsa flexible para almacenar toda la emulsion fabricada en un unico lote. Esto puede proporcionar un sistema cerrado esteril para la fabrication de la emulsion que puede reducir la probabilidad de presencia de impurezas en la emulsion final. Esto puede ser especialmente importante si la emulsion final se utiliza para fines farmaceuticos, por ejemplo, si la emulsion final es el adyuvante MF59.

Las cantidades preferentes de aceite (% en volumen) en la emulsion final son de entre el 2%-20%, por ejemplo aproximadamente el 10%. Resulta especialmente util un contenido de escualeno de aproximadamente el 5% o aproximadamente el 10%. Resulta util un contenido de escualeno (p/v) de entre 30-50 mg/ml, por ejemplo entre 35-45 mg/ml, 36-42 mg/ml, 38-40 mg/ml, etc.

Las cantidades preferentes de tensioactivos (% en peso) en la emulsion final son: esteres de polioxietilensorbitan (tales como Tween 80): del 0,02% al 2%, en concreto aproximadamente un 0,5% o aproximadamente un 1%; esteres de sorbitan (tal como Span 85) del 0,02% al 2%, en concreto aproximadamente un 0,5% o aproximadamente un 1%; octilfenoxi o nonilfenoxi polioxietanoles (tal como Triton X-100) del 0,001% al 0,1%, en concreto del 0,005% al 0,02%; eteres de polioxietileno (tal como laureth-9) del 0,1% al 20%, preferentemente del 0,1% al 10% y en concreto del 0,1% al 1% o aproximadamente un 0,5%. Resulta util un contenido de polisorbato 80 (p/v) de entre 4-6 mg/ml, por ejemplo entre 4,1-5,3 mg/ml. Resulta util un contenido de trioleato de sorbitan (p/v) de entre 4-6 mg/ml, por ejemplo entre 4,1-5,3 mg/ml.

El proceso resulta especialmente util para preparar cualquiera de las siguientes emulsiones de aceite en

agua:

• Una emulsion que comprende escualeno, polisorbato 80 (Tween 80) y trioleato de sorbitan (Span 85). La composition de la emulsion en volumen puede ser escualeno aproximadamente al 5%, polisorbato 80 aproximadamente al 0,5% y trioleato de sorbitan aproximadamente al 0,5%. En terminos de peso, estas cantidades se convierten en escualeno al 4,3%, polisorbato 80 al 0,5% y trioleato de sorbitan al 0,48%. Este adyuvante se conoce como “MF59”. La emulsion de MF59 incluye ventajosamente iones citrato, por ejemplo tampon de citrato de sodio 10 mM.

• Emulsiones que comprenden escualeno, un a-tocoferol (idealmente DL-a-tocoferol) y polisorbato 80. Estas emulsiones pueden tener (en peso) escualeno del 2% al 10%, a-tocoferol del 2% al 10% y polisorbato 80 del 0,3% al 3%, por ejemplo, escualeno al 4,3%, a-tocoferol al 4,7%, polisorbato 80 al 1,9%. La relation en peso de escualeno: tocoferol es preferentemente < 1 (por ejemplo, 0,90) ya que esto proporciona una emulsion mas estable. El escualeno y el polisorbato 80 pueden estar presentes en una relacion en volumen de aproximadamente 5:2, o en una relacion en peso de aproximadamente 11:5. Puede prepararse una de tales emulsiones disolviendo polisorbato 80 en PBS para proporcionar una solution al 2%, a continuation mezclando 90 ml de esta solucion con una mezcla de (5 g de DL-a-tocoferol y 5 ml de escualeno) y a continuacion microfluidificando la mezcla. La emulsion resultante puede tener gotitas de aceite submicrometricas, por ejemplo, con un tamano entre 100 nm y 250 nm, preferentemente de aproximadamente 180 nm.

• Una emulsion de escualeno, un tocoferol y un detergente Triton (por ejemplo Triton X-100). La emulsion tambien puede incluir un llpido A monofosforil 3-O-desacilado (“3d-MPL”), aunque las emulsiones que contienen 3d-MPL no resultan preferentes en la presente invencion (y a veces podrlan excluirse). La emulsion puede contener un tampon de fosfato.

• Una emulsion que comprende escualeno, un polisorbato (por ejemplo, polisorbato 80), un detergente Triton (por ejemplo Triton X-100) y un tocoferol (por ejemplo, un succinato de a-tocoferol). La emulsion puede incluir estos tres componentes en una relacion de masa de aproximadamente 75:11:10 (por ejemplo, 750 jg/ml de polisorbato 80, 110 jg/ml de Triton X-100 y 100 jg/ml de succinato de a-tocoferol), y estas

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concentraciones deberlan incluir cualquier contribution de estos componentes proveniente de los antlgenos. La emulsion tambien puede incluir un 3d-MPL. La emulsion tambien puede incluir una saponina, tal como QS21. La fase acuosa puede contener un tampon de fosfato.

• Una emulsion que comprende escualeno, un disolvente acuoso, un tensioactivo no ionico hidrofilo de alquil eter de polioxietileno (por ejemplo, polioxietileno (12) cetoestearil eter) y un tensioactivo no ionico hidrofobo (por ejemplo, un ester de sorbitan o ester de manida, tal como monooleato de sorbitan o "Span 80"). La emulsion es preferentemente termorreversible y/o tiene al menos un 90% de gotitas de aceite (en volumen) con un tamano inferior a 200 nm [40]. La emulsion tambien puede incluir uno o mas de: alditol, un agente crioprotector (por ejemplo, un azucar, tal como dodecilmaltosido y/o sacarosa) y/o un alquilpoliglicosido. Tambien puede incluir un agonista de TLR4, tal como uno cuya estructura qulmica no incluya un anillo de azucar [41]. Tales emulsiones pueden estar liofilizadas.

Las composiciones de estas emulsiones, expresadas anteriormente en terminos porcentuales, pueden modificarse por dilution o concentration (por ejemplo, por un numero entero, tal como 2 o 3 o por una fraction, tal como 2/3 o 3/4), en las que sus relaciones se mantengan igual. Por ejemplo, un MF59 concentrado 2 veces tendrla escualeno aproximadamente al 10%, polisorbato 80 aproximadamente al 1% y trioleato de sorbitan aproximadamente al 1%. Las formas concentradas pueden diluirse (por ejemplo, con una solution de antlgeno) para proporcionar una concentracion final deseada de la emulsion.

Lo ideal es almacenar las emulsiones de la invention entre 2°C y 8°C. No deben congelarse. Lo ideal es mantenerlas alejadas de la luz directa. En concreto, las vacunas y emulsiones de la invencion que contienen escualeno deben protegerse para evitar la degradation fotoqulmica del escualeno. Si las emulsiones de la invencion se almacenan, resulta preferente hacerlo en una atmosfera inerte, por ejemplo, N2 o argon.

Vacunas

Aunque es posible administrar a los pacientes adyuvantes en emulsion de aceite en agua en solitario (por ejemplo, para proporcionar un efecto adyuvante para un antlgeno que se ha administrado al paciente por separado), es mas habitual mezclar el adyuvante con un antlgeno antes de la administration, para formar una composition inmunogenica, por ejemplo una vacuna. La mezcla de la emulsion y el antlgeno puede tener lugar de manera extemporanea, en el momento del uso, o puede tener lugar durante la fabrication de la vacuna, antes del llenado. Los metodos de la invencion pueden aplicarse en ambas situaciones.

Por lo tanto, un metodo de la invencion puede incluir una etapa de proceso adicional de mezcla de la emulsion con un componente antlgeno. Como alternativa, puede incluir una etapa adicional de envasado del adyuvante en un kit como componente de kit junto con un componente antlgeno.

Por lo tanto, en terminos generales, la invencion puede utilizarse cuando se preparan vacunas mixtas o cuando se preparan kits que incluyen un antlgeno y un adyuvante listos para mezclarse. Cuando la mezcla tiene lugar durante la fabricacion, los volumenes de emulsion y antlgeno a granel que se mezclan seran por lo general superiores a 1 litro, por ejemplo > 5 litros, > 10 litros, > 20 litros, > 50 litros, > 100 litros, > 250 litros, etc. Cuando la mezcla tiene lugar en el punto de uso, los volumenes que se mezclan seran por lo general inferiores a 1 mililitro, por ejemplo < 0,6 ml, < 0,5 ml, < 0,4 ml, < 0,3 ml, < 0,2 ml, etc. En ambos casos, es habitual mezclar volumenes sustancialmente iguales de emulsion y solucion de antlgeno, es decir, sustancialmente 1:1 (por ejemplo, entre 1,1:1 y 1:1,1, preferentemente entre 1,05:1 y 1:1,05, y mas preferentemente entre 1,025:1 y 1:1,025). Sin embargo, en algunas formas de realization puede utilizarse un exceso de emulsion o un exceso de antlgeno [42]. Cuando se utiliza un exceso de volumen de un componente, el exceso sera generalmente de al menos 1,5:1, por ejemplo > 2:1, > 2,5:1, > 3:1, > 4:1, > 5:1, etc.

Cuando el antlgeno y el adyuvante se presentan como componentes separados dentro de un kit, se encuentran flsicamente separados entre si dentro del kit, y esta separation puede conseguirse de varias maneras. Por ejemplo, los componentes pueden estar en recipientes separados, tales como viales. El contenido de dos viales puede mezclarse cuando sea necesario, por ejemplo, sacando el contenido de un vial y anadiendolo al otro vial, o sacando por separado el contenido de ambos viales y mezclandolo en un tercer recipiente.

En otro sistema, uno de los componentes de kit esta en una jeringa y el otro esta en un recipiente tal como un vial. La jeringa puede utilizarse (por ejemplo, con una aguja) para insertar su contenido en el vial para la mezcla, y a continuation puede sacarse la mezcla a la jeringa. A continuation, puede administrarse a un paciente el contenido mezclado de la jeringa, por lo general mediante una nueva aguja esteril. El envasado de un componente en una jeringa elimina la necesidad de utilizar una jeringa distinta para la administracion al paciente.

En otro sistema preferente, los dos componentes de kit se mantienen juntos pero por separado en la misma jeringa, por ejemplo una jeringa de doble camara, tales como las descritas en las referencias 43-50, etc. Cuando se acciona la jeringa (por ejemplo, durante la administracion a un paciente), se mezcla el contenido de las dos camaras. Este sistema evita la necesidad de una etapa de mezcla separada en el momento del uso.

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El contenido de los diversos componentes de kit se encontrara generalmente en forma llquida. En algunos sistemas, un componente (por lo general el componente antlgeno mas que el componente de emulsion) se encuentra en forma seca (por ejemplo, en forma liofilizada), encontrandose el otro componente en forma llquida. Los dos componentes pueden mezclarse con el fin de reactivar el componente seco y proporcionar una composicion llquida para la administration a un paciente. Un componente liofilizado estara por lo general dentro de un vial en vez de una jeringa. Los componentes secos pueden incluir estabilizadores tales como lactosa, sacarosa o manitol, as! como mezclas de los mismos, por ejemplo, mezclas de lactosa/sacarosa, mezclas de sacarosa/manitol, etc. Un sistema posible utiliza un componente de emulsion llquido en una jeringa precargada y un componente antlgeno liofilizado en un vial.

Si las vacunas contienen otros componentes ademas de la emulsion y el antlgeno, estos componentes adicionales pueden incluirse en uno de estos dos componentes de kit, o pueden ser parte de un tercer componente de kit.

Los recipientes adecuados para las vacunas mixtas de la invention, o para los componentes individuales del kit, incluyen viales y jeringas desechables. Estos recipientes deben ser esteriles.

Cuando una composicion/componente se encuentra en un vial, el vial esta hecho preferentemente de material de plastico o vidrio. El vial se esteriliza preferentemente antes de anadir al mismo la composicion. Para evitar problemas con los pacientes con sensibilidad al latex, los viales se sellan preferentemente con un tapon libre de latex, y resulta preferente la ausencia de latex en todos los materiales de envasado. En una forma de realization, un vial tiene un tapon de goma de butilo. El vial puede incluir una dosis unica de vacuna/componente, o puede incluir mas de una dosis (un vial "multidosis"), por ejemplo 10 dosis. En una forma de realizacion, un vial incluye 10 dosis de la emulsion de 0,25 ml cada una. Los viales preferentes son de vidrio incoloro.

Un vial puede tener una tapa (por ejemplo, un cierre Luer) adaptada de manera que pueda insertarse en la tapa una jeringa precargada, pueda expulsarse el contenido de la jeringa en el vial (por ejemplo, para reconstituir el material liofilizado en el mismo) y pueda devolverse el contenido del vial a la jeringa. Despues de retirar la jeringa del vial, puede fijarse una aguja y puede administrarse la composicion a un paciente. La tapa esta situada preferentemente dentro de un sello o cubierta, de manera que deba retirarse el sello o cubierta antes de acceder a la tapa.

Cuando una composicion/componente esta envasado en una jeringa, normalmente la jeringa no tendra fijada una aguja, aunque puede suministrarse una aguja separada con la jeringa para su montaje y uso. Resultan preferentes las agujas de seguridad. Son tlpicas las agujas de calibre 23 de 1 pulgada, de calibre 25 de 1 pulgada y de calibre 25 de 5/8 de pulgada. Las jeringas pueden estar provistas de etiquetas despegables en las que pueden imprimirse el numero de lote, la temporada de gripe y la fecha de caducidad del contenido, para facilitar el mantenimiento de los registros. El embolo de la jeringa tiene preferentemente un tapon que evita que el embolo sea extraldo accidentalmente durante la aspiration. Las jeringas pueden tener un embolo y/o tapa de goma latex. Las jeringas desechables contienen una dosis unica de vacuna. La jeringa tendra generalmente un protector para sellar el cono antes de fijar una aguja, y el protector esta hecho preferentemente de un caucho de butilo. Si la jeringa y la aguja se envasan por separado, la aguja va equipada preferentemente con un capuchon de caucho de butilo.

La emulsion puede diluirse con un tampon antes de envasarse en un vial o en una jeringa. Los tampones tlpicos incluyen: un tampon de fosfato, un tampon Tris, un tampon de borato, un tampon de succinato, un tampon de histidina o un tampon de citrato. La dilution puede reducir la concentration de los componentes del adyuvante al tiempo que conserva sus proporciones relativas, por ejemplo para proporcionar un adyuvante “la mitad de concentrado".

Los recipientes pueden estar marcados para mostrar el volumen de la mitad de una dosis, por ejemplo para facilitar su administracion a ninos. Por ejemplo, una jeringa que contiene una dosis de 0,5 ml puede tener una marca que muestre un volumen de 0,25 ml.

Cuando se utiliza un recipiente de vidrio (por ejemplo, una jeringa o un vial), resulta preferente utilizar un recipiente hecho de un vidrio de borosilicato en vez de hecho de un vidrio sodico-calcico.

Pueden utilizarse diversos antlgenos con las emulsiones de aceite en agua, incluidos pero no limitados a: antlgenos virales, tales como protelnas virales de superficie; antlgenos bacterianos tales como antlgenos sacaridos y/o proteicos, antlgenos fungicos, antlgenos de parasitos y antlgenos tumorales. La invencion resulta especialmente util para vacunas contra el virus de la gripe, el VIH, el anquilostoma, el virus de la hepatitis B, el virus del herpes simple, la rabia, el virus respiratorio sincicial, el citomegalovirus, Staphylococcus aureus, clamidia, coronavirus del SARs, el virus de la varicela zoster, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, el virus de Epstein-Barr, el virus del papiloma humano, etc. Por ejemplo:

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• Antiaenos del virus de la gripe. Pueden adoptar la forma de virus vivo o de virus inactivado. Cuando se utiliza un virus inactivado, la vacuna puede comprender el virion completo, el virion fraccionado o antlgenos de superficie purificados (incluida la hemaglutinina y, normalmente, incluida tambien la neuraminidasa). Los antlgenos de la gripe tambien pueden presentarse en forma de virosomas. Los antlgenos pueden tener cualquier subtipo de hemaglutinina, seleccionado de entre H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y/o H16. La vacuna puede incluir antlgeno(s) de una o mas cepas (por ejemplo 1, 2, 3, 4 o mas) del virus de la gripe, incluidos el virus de la gripe A y/o el virus de la gripe B, por ejemplo, una vacuna monovalente A/H5N1 o A/H1N1 o una vacuna trivalente A/H1N1 + A/H3N2 + B. El virus de la gripe puede ser una cepa reordenante y puede haberse obtenido mediante tecnicas de genetica inversa [por ejemplo, 51-55]. Por lo tanto, el virus puede incluir uno o mas segmentos de ARN de un virus A/PR/8/34 (por lo general 6 segmentos de A/PR/8/34, siendo los segmentos HA y N de una cepa vacunal, es decir, un reordenante 6:2). Los virus utilizados como fuente de antlgenos pueden cultivarse en huevos (por ejemplo, huevos embrionados de gallina) o en cultivo celular. Cuando se utiliza el cultivo celular, el sustrato celular sera por lo general una llnea celular de mamlfero, tal como MDCK; CHO; 293T; BHK, Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38; etc. Las llneas celulares de mamlfero preferentes para cultivar virus de la gripe incluyen: celulas MDCK [56-59], derivadas de rinon canino Madin Darby; celulas Vero [60-62], derivadas de rinon de mono verde africano; o celulas PER.C6 [63], derivadas de retinoblastos embrionarios humanos. Cuando el virus se ha cultivado en una llnea celular de mamlfero, la composicion estara ventajosamente libre de protelnas de huevo (por ejemplo, ovoalbumina y ovomucoide) y de ADN de pollo, lo que reduce su potencial alergenico. Las dosis unitarias de la vacuna estan por lo general estandarizadas por referencia al contenido de hemaglutinina (HA), por lo general medido mediante SRID. Las vacunas existentes contienen por lo general aproximadamente 15 pg de HA por cepa, aunque pueden utilizarse dosis menores, especialmente cuando se utiliza un adyuvante. Se han utilizado dosis fraccionarias tales como ^ (es decir, 7,5 pg de HA por cepa), % y V [64,65], al igual que dosis mayores (por ejemplo, dosis 3x o 9x [66,67]). Por lo tanto, las vacunas pueden incluir entre 0,1 pg y 150 pg de HA por cepa de gripe, preferentemente entre 0,1 pg y 50 pg, por ejemplo 0,1 pg-20 pg, 0,1 pg-15 pg, 0,1 pg-10 pg, 0,1 pg-7,5 pg, 0,5 pg-5 pg, etc. Las dosis concretas incluyen, por ejemplo, aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 7,5, aproximadamente 5, aproximadamente 3,8, aproximadamente 3,75, aproximadamente 1,9, aproximadamente 1,5, etc. por cepa.

• Virus de la inmunodeficiencia humana, incluidos el VIH-1 y el VIH-2. El antlgeno sera por lo general un antlgeno de la envoltura.

• Antlgenos de superficie del virus de la Hepatitis B. Este antlgeno se obtiene preferentemente por metodos de ADN recombinante, por ejemplo, despues de la expresion en una levadura Saccharomyces cerevisiae. A diferencia del HBsAg viral nativo, el antlgeno recombinante expresado en levadura no esta glicosilado. Puede estar en forma de partlculas sustancialmente esfericas (diametro medio de aproximadamente 20 nm), que incluyen una matriz lipldica que comprende fosfollpidos. A diferencia de las partlculas nativas de HBsAg, las partlculas expresadas en levadura pueden incluir fosfatidilinositol. El HBsAg puede ser de cualquiera de los subtipos ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq- y adrq+.

• Anquilostoma, especialmente como se observa en caninos (Ancylostoma caninum). Este antlgeno puede ser Ac-MTP-1 recombinante (metaloproteasa similar a astacina) y/o una hemoglobinasa aspartica (Ac-APR-1), que puede expresarse en un sistema de baculovirus/celula de insecto como protelna secretada [68,69].

• Antlgenos del virus del herpes simple (VHS). Un antlgeno del VHS preferente para su uso con la invencion es la glicoprotelna de membrana gD. Resulta preferente utilizar gD de una cepa de VHS-2 (antlgeno “gD2”). La composicion puede utilizar una forma de gD en la que se ha suprimido la region de anclaje a la membrana del extremo C-terminal [70], por ejemplo, una gD truncada que comprende los aminoacidos 1-306 de la protelna natural con la adicion de asparagina y glutamina en el extremo C-terminal. Esta forma de la protelna incluye el peptido senal que se escinde para producir una protelna madura de 283 aminoacidos. La delecion del anclaje permite preparar la protelna en forma soluble.

• Antlgenos del virus del papiloma humano (VPH). Los antlgenos del VPH preferentes para su uso con la invencion son protelnas de la capside L1, que pueden ensamblarse para formar estructuras conocidas como partlculas pseudovirales (VLP). Las vLp pueden producirse por expresion recombinante de L1 en celulas de levadura (por ejemplo, en S. cerevisiae) o en celulas de insecto (por ejemplo, en celulas de Spodoptera, tal como S. frugiperda, o en celulas de Drosophila). Para las celulas de levadura, los vectores plasmldicos pueden portar el(los) gen(es) de L1; para las celulas de insectos, los vectores baculovirales pueden portar el(los) gen(es) de L1. Mas preferentemente, la composicion incluye VLP de L1 de cepas VPH-16 y VPH-18. Esta combinacion bivalente ha demostrado ser muy eficaz [71]. Ademas de las cepas VPH-16 y VPH-18, tambien es posible incluir VLP de L1 de cepas VPH-6 y VpH-11. Tambien es posible utilizar cepas oncogenicas de VPH. Una vacuna puede incluir entre 20 pg/ml y 60 pg/ml (por ejemplo, aproximadamente 40 pg/ml) de L1 por cepa de VPH.

• Antlgenos del antrax. El antrax es causado por Bacillus anthracis. Los antlgenos adecuados de B. anthracis incluyen componentes A (factor letal (LF) y factor de edema (EF)), pudiendo compartir ambos un componente B comun conocido como antlgeno protector (PA). Los antlgenos pueden estar opcionalmente destoxificados. Pueden encontrarse detalles adicionales en las referencias [72 a 74].

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• Antiaenos de S. aureus. Se conocen diversos antlgenos de S. aureus. Los antlgenos adecuados incluyen sacaridos capsulares (por ejemplo, de una cepa tipo 5 y/o tipo 8) y protelnas (por ejemplo, IsdB, Hla, etc.). Lo ideal es conjugar los antlgenos sacaridos capsulares con una protelna transportadora.

• Antlgenos de S. pneumoniae. Se conocen diversos antlgenos de S. pneumoniae. Los antlgenos adecuados incluyen sacaridos capsulares (por ejemplo, de uno o mas de los serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y/o 23F) y protelnas (por ejemplo neumolisina, neumolisina destoxificada, protelna D de la trlada de polihistidina (PhtD), etc.). Lo ideal es conjugar los antlgenos sacaridos capsulares con una protelna transportadora.

• Antlgenos del cancer. Se conoce diversos antlgenos especlficos de tumor. La invencion puede utilizarse con antlgenos que inducen una respuesta inmunoterapeutica contra el cancer de pulmon, el melanoma, el cancer de mama, el cancer de prostata, etc.

Normalmente se mezclara una solucion del antlgeno con la emulsion, por ejemplo, en una relacion en volumen 1:1. Esta mezcla puede ser realizada por un fabricante de la vacuna, antes de su llenado, o puede ser realizada en el punto de uso por el personal sanitario.

Composiciones farmaceuticas

Las composiciones preparadas utilizando los metodos de la invencion son farmaceuticamente aceptables. Pueden incluir otros componentes ademas de la emulsion y el antlgeno opcional.

La composicion puede incluir un conservante tal como tiomersal o 2-fenoxietanol. Sin embargo, resulta preferente que la vacuna este sustancialmente libre de material mercurial (es decir, menos de 5 pg/ml) por ejemplo, libre de tiomersal [75,76]. Resultan mas preferentes las vacunas y los componentes que no contienen mercurio.

El pH de una composicion estara generalmente entre 5,0 y 8,1, y mas generalmente entre 6,0 y 8,0, por ejemplo entre 6,5 y 7,5. Por lo tanto, un proceso de la invencion puede incluir una etapa de ajuste del pH de la vacuna antes de su envasado.

La composicion es preferentemente esteril. La composicion es preferentemente apirogena, conteniendo por ejemplo < 1 UE (unidad de endotoxina, una medida estandar) por dosis y, preferentemente, < 0,1 UE por dosis. La composicion esta preferentemente libre de gluten.

La composicion puede incluir material para una unica vacunacion o puede incluir material para vacunaciones multiples (es decir, un kit "multidosis"). En los sistemas multidosis resulta preferente incluir un conservante.

Las vacunas se administran por lo general en un volumen de dosis de aproximadamente 0,5 ml, aunque puede administrarse a los ninos la mitad de una dosis (es decir, aproximadamente 0,25 ml).

Metodos de tratamiento, y administracion de la vacuna

La invencion proporciona kits y composiciones preparadas utilizando los metodos de la invencion. Las composiciones preparadas segun los metodos de la invencion resultan adecuadas para la administracion a pacientes humanos, y la invencion proporciona un metodo para provocar una respuesta inmunitaria en un paciente, que comprende la etapa de administrar una composicion de este tipo al paciente.

La invencion tambien proporciona estos kits y composiciones para su uso como medicamentos.

La invencion tambien 'proporciona el uso de: (i) una preparacion acuosa de un antlgeno, y (ii) una emulsion de aceite en agua preparada segun la invencion, en la fabricacion de un medicamento para provocar una respuesta inmunitaria en un paciente.

La respuesta inmunitaria provocada mediante estos metodos y usos incluira generalmente una respuesta de anticuerpos, preferentemente una respuesta de anticuerpos protectora.

Las composiciones pueden administrarse de diversas maneras. La via de inmunizacion mas preferente es por inyeccion intramuscular (por ejemplo, en el brazo o en la pierna), pero otras vlas disponibles incluyen la inyeccion subcutanea, intranasal [77-79], oral [80], intradermica [81,82], transcutanea, transdermica [83], etc.

Las vacunas preparadas segun la invencion pueden utilizarse para tratar tanto a ninos como a adultos. El paciente puede tener menos de 1 ano de edad, de 1 a 5 anos, de 5 a 15 anos, de 15 a 55 anos, o al menos 55 anos de edad. El paciente puede ser de edad avanzada (por ejemplo, > 50 anos de edad, preferentemente > 65 anos), joven (por ejemplo, < 5 anos de edad), pacientes hospitalizados, personal sanitario, personal militar y de las fuerzas armadas, mujeres embarazadas, pacientes cronicos, pacientes inmunodeprimidos y personas que viajan al

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extranjero. Sin embargo, las vacunas no resultan adecuadas unicamente para estos grupos y pueden utilizarse de manera mas general en una poblacion.

Las vacunas de la invencion pueden administrarse a los pacientes sustancialmente al mismo tiempo que otras vacunas (por ejemplo, durante la misma consulta medica o visita a un profesional sanitario).

Procesos intermedios

La invencion tambien proporciona un metodo para fabricar una emulsion de aceite en agua, que comprende microfluidificar una primera emulsion para formar una segunda emulsion y, a continuation, filtrar la segunda emulsion. La primera emulsion tiene las caracterlsticas que se han descrito anteriormente.

La invencion tambien proporciona un metodo para fabricar una emulsion de aceite en agua, que comprende filtrar una segunda emulsion, es decir, una emulsion microfluidificada. La emulsion microfluidificada tiene las caracterlsticas que se han descrito anteriormente.

La invencion tambien proporciona un metodo para fabricar una vacuna, que comprende combinar una emulsion con un antlgeno, en el que la emulsion tiene las caracterlsticas que se han descrito anteriormente.

Formas de realizacion especificas

Las formas de realizacion especificas de la presente invencion incluyen:

• Un metodo para fabricar una emulsion de aceite en agua que comprende escualeno, que comprende las etapas de: (i) formar una primera emulsion que tiene un primer tamano medio de gotitas de aceite; (ii) microfluidificar la primera emulsion para formar una segunda emulsion que tiene un segundo tamano medio de gotitas de aceite que es inferior al primer tamano medio de gotitas de aceite, y (iii) filtrar la segunda emulsion utilizando una membrana hidrofila.

• Un metodo para fabricar una emulsion de aceite en agua, que comprende las etapas de: (i) formar una primera emulsion que tiene un primer tamano medio de gotitas de aceite de 5000 nm o menor; (ii) microfluidificar la primera emulsion para formar una segunda emulsion que tiene un segundo tamano medio de gotitas de aceite que es inferior al primer tamano medio de gotitas de aceite, y (iii) filtrar la segunda emulsion utilizando una membrana hidrofila.

• Un metodo para fabricar una emulsion de aceite en agua, que comprende las etapas de: (i) formar una primera emulsion que tiene un primer tamano medio de gotitas de aceite; (ii) microfluidificar la primera emulsion para formar una segunda emulsion que tiene un segundo tamano medio de gotitas de aceite que es inferior al primer tamano medio de gotitas de aceite, y (iii) filtrar la segunda emulsion utilizando una membrana de polietersulfona hidrofila.

• Un metodo para fabricar una emulsion de aceite en agua que comprende escualeno, el metodo comprende las etapas de (b) microfluidificar la primera emulsion que tiene un primer tamano medio de gotitas de aceite para formar una segunda emulsion que tiene un segundo tamano medio de gotitas de aceite que es inferior al primer tamano medio de gotitas de aceite, en el que la segunda emulsion se forma circulando los componentes de la segunda emulsion transfiriendo los componentes de la segunda emulsion de un primer recipiente de la emulsion, a traves de un primer dispositivo de microfluidificacion a un segundo recipiente de la emulsion, y despues a traves de un segundo dispositivo de microfluidificacion, en el que el primer y el segundo dispositivos de microfluidificacion son el mismo.

• Un metodo para fabricar una emulsion de aceite en agua que comprende: pasar una primera emulsion que tiene un primer tamano medio de gotitas de aceite a traves de un dispositivo de microfluidificacion para formar una segunda emulsion que tiene un segundo tamano medio de gotitas de aceite que es menor que el primer tamano medio de gotitas de aceite; en el que el dispositivo de microfluidificacion comprende una camara de interaction que comprende una pluralidad de canales de tipo Z y un modulo de procesamiento auxiliar que comprende al menos un canal; en el que el modulo de procesamiento auxiliar esta posicionado corriente abajo de la camara de interaccion.

• Un metodo para fabricar una emulsion de aceite en agua que comprende la etapa de pasar una primera emulsion que tiene un primer tamano medio de gotitas de aceite a traves de un dispositivo de microfluidificacion para formar una segunda emulsion que tiene un segundo tamano medio de gotitas de aceite que es menor que el primer tamano medio de gotitas de aceite; en el que el dispositivo de microfluidificacion comprende una camara de interaccion y un modulo de procesamiento auxiliar que comprende una pluralidad de canales.

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• Un metodo para fabricar una emulsion de aceite en agua que comprende la etapa de pasar una primera

emulsion que tiene un primer tamano medio de gotitas de aceite a traves de un dispositivo de

microfluidificacion para formar una segunda emulsion que tiene un segundo tamano medio de gotitas de aceite que es menor que el primer tamano medio de gotitas de aceite; en el que el dispositivo de microfluidificacion comprende una camara de interaccion y en el que la presion de los componentes de la emulsion en la entrada a la camara de interaccion es sustancialmente constante durante al menos el 85% del tiempo durante el que la emulsion se introduce en el microfluidificador.

• Un metodo para fabricar una emulsion de aceite en agua, que comprende la etapa de formar una primera emulsion que tiene un primer tamano medio de gotitas de aceite, en el que la formacion de la primera emulsion se lleva a cabo bajo un gas inerte, por ejemplo nitrogeno, por ejemplo a una presion de hasta 0,5 bar.

• Un metodo para fabricar una emulsion de aceite en agua que comprende la etapa de pasar una primera

emulsion que tiene un primer tamano medio de gotitas de aceite a traves de un dispositivo de

microfluidificacion para formar una segunda emulsion que tiene un segundo tamano medio de gotitas de aceite que es menor que el primer tamano medio de gotitas de aceite, en el que la formacion de la segunda emulsion se lleva a cabo bajo un gas inerte, por ejemplo nitrogeno, por ejemplo a una presion de hasta 0,5 bar.

• Un metodo para fabricar una emulsion de aceite en agua, que comprende las etapas de (i) formar una primera emulsion que tiene un primer tamano medio de gotitas de aceite; (ii) microfluidificar la primera emulsion para formar una segunda emulsion que tiene un segundo tamano medio de gotitas de aceite que es menor que el primer tamano medio de gotitas de aceite; (iii) filtrar la segunda emulsion; (iv) transferir la emulsion de aceite en agua a una bolsa flexible esteril

General

La expresion "que comprende" abarca "incluido/a/os/as" y “que incluye/n”, as! como "que consiste", por ejemplo, una composicion "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X + Y.

El termino "sustancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composicion que esta "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, puede omitirse el termino "sustancialmente" de la definicion de la invencion.

El termino "aproximadamente" con relacion a un valor numerico x es opcional y significa, por ejemplo, x ±10%.

A menos que se indique especlficamente, un proceso que comprende una etapa de mezcla de dos o mas componentes no requiere ningun orden especlfico de mezcla. Por lo tanto, los componentes pueden mezclarse en cualquier orden. Cuando haya tres componentes, pueden combinarse dos componentes entre si y, a continuacion, puede combinarse la combinacion con el tercer componente, etc.

Cuando en el cultivo de celulas se utilicen materiales animales (especialmente bovinos), estos deben obtenerse de fuentes que esten libres de encefalopatlas espongiformes transmisibles (EET), y, en concreto, libres de la encefalopatla espongiforme bovina (EEB). En general, resulta preferente cultivar las celulas en ausencia total de materiales derivados de animales.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra un ejemplo especlfico de un homogeneizador que puede utilizarse para formar una primera emulsion.

La figura 2 muestra un detalle de un rotor y estator que puede utilizarse en un homogeneizador de este tipo.

La figura 3 muestra dos perfiles de presion para un modo slncrono de la bomba intensificadora.

La figura 4 muestra una camara de interaccion con canales de tipo Z.

La figura 5 muestra una circulacion de tipo I, mientras que la figura 6 muestra una circulacion de tipo II. Los recipientes estan etiquetados como "C", mientras que un homogeneizador esta etiquetado como "H". Se muestran la direccion y el orden de los movimientos del llquido. En la figura 6 el homogeneizador tiene dos flechas de entrada y dos flechas de salida, pero en realidad el homogeneizador tiene un unico canal de entrada y un unico canal de salida.

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MODOS DE LLEVAR A CABO LA INVENCION Ejemplo 1

Se prepare una emulsion microfluidificada que comprendla escualeno, polisorbato 80, trioleato de sorbitan y tampon de citrato de sodio, segun la presente invencion. Se microfluidifico la emulsion hasta que tuvo un tamano medio de gotitas de aceite de 165 nm o menor y un numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm de 5 x 108 /ml o menor.

Se filtro la emulsion a traves de cartucho filtrante esterilizante (filtro A) con una membrana de prefiltracion de polietersulfona porosa asimetrica hidrofila con un tamano de poro de 0,45 pm y una membrana de filtracion final de polietersulfona porosa asimetrica hidrofila con un tamano de poro de 0,2 pm. Durante la filtracion, se mantuvo la emulsion a una temperatura de 40 ± 5°C.

El proceso anterior se llevo a cabo durante cuatro ciclos independientes y se midieron las caracterlsticas de las emulsiones filtradas, que se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1

Parametro de ensayo

Valor Real

Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Ciclo 4

Tamano medio de las gotitas de aceite

148 144 144 150

Numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm

0,08 x 106 0,08 x 106 0,12 x 106 0,20 x 106

Como se muestra en la Tabla 1, el filtro A redujo sistematicamente el tamano medio de las gotitas de aceite en la emulsion. Ademas, el filtro A redujo sistematicamente el numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm en la emulsion aproximadamente 103 veces.

Ejemplo 2

Se filtro la misma emulsion microfluidificada tal como se utiliza para el ejemplo 1 a traves de un cartucho filtrante esterilizante diferente (filtro B). El filtro B tenia una membrana de prefiltracion de polietersulfona porosa asimetrica hidrofila y una membrana de filtracion final de polietersulfona porosa asimetrica hidrofila con un tamano de poro de 0,2 pm. Durante la filtracion, se mantuvo la emulsion a una temperatura de 40 ± 5°C. Este proceso se llevo a cabo durante cuatro ciclos independientes y se midieron las caracterlsticas de las emulsiones filtradas, que se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2

Parametro de ensayo

Valor Medido

Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Ciclo 4

Tamano medio de las gotitas de aceite

142 143 141 141

Numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm

0,23 x 106 0,15 x 106 0,20 x 106 0,23 x 106

Como se muestra en la Tabla 2, el filtro B redujo sistematicamente el tamano medio de las gotitas de aceite en la emulsion. Ademas, el filtro B redujo sistematicamente el numero de gotitas de aceite un tamano > 1,2 pm en la emulsion aproximadamente 103 veces.

A partir de los ejemplos 1 y 2, puede observarse que el filtro B da como resultado un tamano de gotitas de aceite ligeramente menor, pero un numero ligeramente mayor de gotitas de aceite con un tamano superior a 1,2 pm. Sin embargo, ambos filtros A y B presentaron excelentes resultados.

Ejemplo 3

Se filtro la misma emulsion microfluidificada tal como se utiliza para el ejemplo 1 a traves de otro cartucho filtrante esterilizante diferente (filtro de C). El filtro C tenia una membrana de prefiltracion de polietersulfona porosa asimetrica hidrofila con un tamano de poro de 0,45 pm y una membrana de filtracion final de polietersulfona porosa asimetrica hidrofila con un tamano de poro de 0,2 pm. Durante la filtracion, se mantuvo la emulsion a una temperatura de 40 ± 5°C.

Ademas, se filtro la misma emulsion microfluidificada tal como se utiliza para el ejemplo 1 a traves de otro cartucho filtrante esterilizante diferente (filtro D). El filtro D tenia una membrana de prefiltracion de polietersulfona porosa asimetrica hidrofila y una membrana de filtracion final de PVDF porosa hidrofila. Durante la filtracion, se mantuvo la emulsion a una temperatura de 40 + 5°C.

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El filtro C presento excelentes resultados de filtracion, proporcionando una emulsion filtrada con un tamano medio de gotitas de aceite de 155 ± 20 nm y un numero de gotitas de aceite con un tamano > 1,2 pm de 5 x 106 /ml o menor. Aunque el filtro D tambien proporciono una emulsion filtrada que satisfacla los criterios anteriormente indicados, resulto que se obstrula con mayor rapidez, siendo necesario as! sustituir la membrana del filtro D. Por lo tanto, todos los filtros de polietersulfona resultaron superiores a este filtro de PVDF.

Ejemplo 4

Se ensayaron diez membranas hidrofilas diferentes, de diversos fabricantes, para filtrar una emulsion microfluidificada que comprendla escualeno, polisorbato 80, trioleato de sorbitan y tampon de citrato de sodio. Los filtros se numeraron del 1 al 10 como se muestra en la Tabla 3 (NB: el filtro 1 es el mismo que el filtro C del Ejemplo 3 anterior; el filtro 2 es el filtro D; el filtro 9 es el filtro A; y el filtro 10 es el filtro B).

Se midio el rendimiento de la emulsion despues de filtrar 50 litros de emulsion para determinar si los filtros eran adecuados para su uso a escala industrial. El % de emulsion de entrada que se recupero despues de la filtracion fue como sigue:

Tabla 3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

%

50 16 8 8 8 13 4 82 88 89

Un % de recuperacion bajo indica que el filtro retiene la emulsion, por ejemplo debido a la obstruccion. Queda claro que solo los filtros 1, 8, 9 y 10 (es decir, los filtros A, B y C anteriores, ademas de un filtro adicional que es similar al filtro A pero tiene un tamano de poro mayor en la primera capa) proporcionaron rendimientos de > 50%, y que los rendimientos mas factibles para el uso a escala industrial son los filtros 8-10. Los filtros 1, 8, 9 y 10 son membranas de PES hidrofilas de doble capa, preparadas por tres fabricantes diferentes. Las primeras capas en estas cuatro membranas son de 0,45 pm o de 0,6 pm y la segunda capa es de 0,2 pm. Los mejores resultados se observaron cuando al menos una de las dos capas era una membrana asimetrica.

Se entendera que la invencion se ha descrito a modo de ejemplo solamente y que pueden realizarse modificaciones mientras permanezcan dentro del alcance y el esplritu de la invencion.

REFERENCIAS

[1] WO90/14837.

[2] Podda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203.

[3] Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680.

[4] Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X).

[5] Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (volumen 42 de la serie Methods in Molecular Medicine). ISBN: 1-59259-083-7. Ed. O'Hagan.

[6] New Generation Vaccines (eds. Levine et al.). 3a edicion, 2004. ISBN 0-8247-4071-8.

[7] O'Hagan (2007) Expert Rev Vaccines 6(5):699-710.

[8] EP-B-2029170

[9] Baudner et al. (2009) Pharm Res. 26(6):1477-85.

[10] Dupuis et al. (1999) Vaccine 18:434-9.

[11] Dupuis et al. (2001) Eur J Immunol 31:2910-8.

[12] Burke et al. (1994) J Infect Dis 170:1110-9.

[13] Light Scattering from Polymer Solutions and Nanoparticle Dispersions (W. Schartl), 2007. ISBN: 978-3-540-71950-2.

[14] Jafari et al (2008) Food Hydrocolloids 22:1191-1202

[15] WO90/04609.

[16] US-4.618.533

[17] US-6.193.077

[18] US-6.495.050

[19] Chen et al. (1999) Journal of Applied Polymer Science, 72:1699-1711.

[20] US-4.413.074

[21] US-4.432.875

[22] US-4.340.482

[23] US-4.473.474

[24] US-4.473.475

[25] US-4.673.504

[26] EP-A-0221046

[27] US-4.943.374

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[28] US-6.071.406

[29] US-4.705.753

[30] US-5.178.765

[31] US-6.495.043

[32] US-6.039.872

[33] US-5.277.812

[34] US-5.531.893

[35] US-4.964.990

[36] Wavhal & Fisher (2002) Journal of Polymer Science Part B: Polymer Physics 40:2473-88.

[37] WO2006/044463.

[38] Espinoza-Gomez et al. (2003) Revista de la Sociedad Qulmica de Mexico 47:53-57.

[39] Lidgate et al (1992) Pharmaceutical Research 9(7):860-863.

[40] US-2007/0014805.

[41] W02007/080308.

[42] W02007/052155.

[43] WO2005/089837.

[44] US 6.692.468.

[45] WO00/07647.

[46] W099/17820.

[47] US 5.971.953.

[48] US 4.060.082.

[49] EP-A-0520618.

[50] W098/01174.

[51] Hoffmann et al. (2002) Vaccine 20:3165-3170.

[52] Subbarao et al. (2003) Virology 305:192-200.

[53] Liu et al. (2003) Virology 314:580-590.

[54] Ozaki et al. (2004) J. Virol. 78:1851-1857.

[55] Webby et al. (2004) Lancet 363:1099-1103.

[56] W097/37000.

[57] Brands et al. (1999) Dev Biol Stand 98:93-100.

[58] Halperin et al. (2002) Vaccine 20:1240-7.

[59] Tree et al. (2001) Vaccine 19:3444-50.

[60] Kistner et al. (1998) Vaccine 16:960-8.

[61] Kistner et al. (1999) Dev Biol Stand 98:101-110.

[62] Bruhl et al. (2000) Vaccine 19:1149-58.

[63] Pau et al. (2001) Vaccine 19:2716-21.

[64] W001/22992.

[65] Hehme et al. (2004) Virus Res. 103(1-2):163-71.

[66] Treanor et al. (1996) J Infect Dis 173:1467-70.

[67] Keitel et al. (1996) Clin Diagn Lab Immunol 3:507-10.

[68] Williamson et al. (2006) Infection and Immunity 74: 961-7.

[69] Loukas et al. (2005) PLoS Med 2(10): e295.

[70] EP-A-0139417.

[71] Harper et al. (2004) Lancet 364(9447):1757-65.

[72] J Toxicol Clin Toxicol (2001) 39:85-100.

[73] Demicheli et al. (1998) Vaccine 16:880-884.

[74] Stepanov et al. (1996) J Biotechnol 44:155-160.

[75] Banzhoff (2000) Immunology Letters 71:91-96.

[76] W002/097072.

[77] Greenbaum et al. (2004) Vaccine 22:2566-77.

[78] Zurbriggen et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:295-304.

[79] Piascik (2003) J Am Pharm Assoc (Wash DC). 43:728-30.

[80] Mann et al. (2004) Vaccine 22:2425-9.

[81] Halperin et al. (1979) Am J Public Health 69:1247-50.

[82] Herbert et al (1979) J Infect Dis 140:234-8.

[83] Chen et al. (2003) Vaccine 21:2830-6.

Claims (19)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

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   Reivindicaciones

   1. Un metodo para fabricar una composicion farmaceuticamente aceptable que comprende una emulsion de aceite en agua, que comprende las etapas de:

   (i) preparar una emulsion de aceite en agua que tiene un tamano medio de gotitas de aceite menor de 1 pm;

   (ii) prefiltrar la emulsion de aceite en agua usando una membrana de prefiltracion de polietersulfona hidrofila; y

   (iii) filtrar la emulsion de aceite en agua prefiltrada obtenida en el paso (ii) usando una membrana de filtracion de polietersulfona hidrofila
2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el tamano medio de gotitas de aceite de la emulsion preparada en la etapa (i) es 5000 nm o menor.
3. 3. El metodo segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el numero de gotitas de aceite que tienen un tamano de >1,2 pm en la emulsion antes de las etapas (ii) y (iii) es 5 x 1011/ml o menor.
4. 4. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el numero de gotitas de aceite que tienen un tamano de >1,2 pm en la emulsion despues de las etapas (ii) y (iii) es 5 x 108/ml o menor.
5. 5. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, en el que la membrana de prefiltracion es asimetrica y/o porosa.
6. 6. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la membrana de filtracion es asimetrica y/o porosa.
7. 7. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, en el que la membrana de prefiltracion usada en la etapa (ii) tiene un tamano de poro de 0,2 pm.
8. 8. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, en el que la membrana de filtracion usada en la etapa (iii) tiene un tamano de poro de 0,2 pm.
9. 9. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la membrana de prefiltracion usada en la etapa (ii) tiene un tamano de poro de 0,22 pm.
10. 10. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o 9, en el que la membrana de filtracion usada en la etapa (iii) tiene un tamano de poro de 0,22 pm.
11. 11. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la membrana de filtracion, y opcionalmente la membrana de prefiltracion, comprende un material de soporte polimerico.
12. 12. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la emulsion tiene un volumen mayor de 20 litros.
13. 13. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la emulsion de aceite en agua es una emulsion de aceite en agua que contiene escualeno.
14. 14. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la composicion farmaceuticamente aceptable es esteril.
15. 15. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la composicion farmaceuticamente aceptable es una composicion que promueve una respuesta inmune en un paciente.
16. 16. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la composicion farmaceuticamente aceptable comprende ademas un antlgeno.
17. 17. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la emulsion de aceite en agua es un adyuvante.
18. 18. Un metodo para preparar una composicion de vacuna, que comprende preparar un adyuvante en emulsion segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores y combinar el adyuvante en emulsion con un antlgeno.
19. 19. Un metodo para preparar un kit de vacuna que comprende preparar un adyuvante en emulsion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y envasar el adyuvante en emulsion en un kit como un componente del kit junto con un componente antlgeno.