PT2227483T - Formas solúveis da glicoproteína f de vírus hendra e nipah e suas utilizações - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"FORMAS SOLÚVEIS DA GLICOPROTEÍNA F DE VÍRUS HENDRA E NIPAH E SUAS UTILIZAÇÕES"

ÁREA DA INVENÇÃO A presente invenção está relacionada com formas solúveis da gi icoproteina F de virus Hendra e Nipah, com composições compreendendo formas solúveis da glicoproteína F de vírus Hendra e Nipah, com anticorpos reativos contra as formas solúveis da glicoproteína F de vírus Hendra e Nipah, e com métodos relacionados com os mesmos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 vírus Nipah (NiV) e o vírus Hendra (HeV) são vírus zoonóticos emergentes recentes que atualmente compõem seu próprio género, Henipaviruses, dentro da família Paramyxoviridae. Os paramixovírus são vírus encapsulados de ARN de sentido negativo e englobam uma variedade de patogénicos humanos e animais, incluindo o vírus do sarampo, vírus da papeira, vírus Sendai, vírus da doença de Newcastle, vírus da peste bovina, vírus da cinomose canina, vírus da parainfluenza humana, vírus sincicial respiratório e vírus símio 5 (revisto em Lamb e Parks (2007) Fields Virology, eds. Knippe & Howley, Lippincott, Williams&Wilkins, pp. 1449-1496). O tropismo em espécies amplas dos Henipavírus e a capacidade de causar doença fatal em animais e seres humanos distinguem HeV e NiV de todos os outros paramixovírus conhecidos (revisto em Eaton (2001) Microbes Infect 3:277-278). HeV e NiV são ambos considerados como patogénicos de Nível de Segurança

Biológica 4 (BSL-4), e estão no programa de investigação da NIAID Biodefense como patogénicos zoonóticos emergentes de categoria C de prioridade que podem potencialmente ser usados como agentes para bioterrorismo. 0 Henipavírus pode ser facilmente amplificado em animais domésticos hospedeiros e pode adicionalmente causar doença em animais grandes. Os Henipavírus podem ser transmitidos aos seres humanos por aerossóis onde a doença se pode manifestar como doença respiratória grave e encefalite febril. A transmissão entre seres humanos é também possível. 0 Henipavírus pode ser crescer facilmente em cultura de células ou ovos de galinha embrionados, podendo ser produzidos em títulos elevados sem concentração (~108 TCID50/mL), e pode ser altamente infecioso (Crameri et al. (2002) J. Virol. Methods 99:41-51; Field et al. (2001) Microbes Infect. 3:307-314; Hooper et al. (2001) Microbes Infect. 3:315-322).

Os principais reservatórios para NiV e HeV parecem ser várias espécies de morcegos frugívoros pteroides, comuns no Sudeste da Ásia e do Pacífico, e como tal a maior parte dos surtos virais observados até à data foram nessas áreas (2006 Eaton et al. (2006) Nat. Rev. Microbiol. 4:23-35). O HeV apareceu pela primeira vez na Austrália em 1994 em dois episódios não relacionados, mas semelhantes no período temporal, de doença grave respiratória em cavalos, em que um total de três transmissões para seres humanos foram observadas, o que resultou em duas mortes. O HeV ressurgiu através infeções equídeas fatais na Austrália em 1999, 2004, e 2006 (Field et al. (2000) Aust. Vet. J. 78:279-280; Anónimo (2004) Int. Soc. For Infect. Dis. 20041214.337; Murray (2006) World Org. for Animal Health Vol. 19- No. 26). O NiV surgiu entre 1997 e 1998 em um surto de encefalite entre os criadores de suínos na Malásia e Singapura; originando 265 relatórios de infeção humana, 105 dos quais foram fatais (Chua (2003) J. Clin. Virol. 26:265— 275). O NiV ressurgiu recentemente no Bangladesh. Dois surtos de NiV ocorreram em 2004, e ainda outro em janeiro de 2005 (Communicable Disease Weekly Report (2005) Vol. 15, No. 16). Várias observações importantes nos surtos mais recentes foram feitas, incluindo maior incidência de síndrome da angústia respiratória aguda, transmissão interpessoal, e taxas de letalidade significativamente maiores (que se aproxima de 75%) (Health and Science Bulletin (2004) 2:5-11; Hsu et al. (2004) Emerg. Infect. Dis. 10:2082-2087) .

Fisiologicamente, os paramixovírus possuem duas glicoproteínas principais ancoradas às membranas no envelope da partícula virai que são necessárias para a infeção de uma célula hospedeira recetiva. As duas glicoproteínas desempenham funções diferentes mas complementares. Uma glicoproteína atua para atingir ligação física com o hospedeiro, enquanto a outra glicoproteína atua para obter a fusão efetiva com o hospedeiro. Normalmente, sem a ação concertada de ambas, o hospedeiro pode não ser infetado. A glicoproteína de ligação é uma proteína de membrana de tipo II onde o terminal amino (N-) é orientado para o citoplasma e o terminal carboxi (C-) está no outro lado da membrana plasmática e no material extracelular. A glicoproteína de ligação pode ser uma proteína hemaglutinina-neuraminidase (HN), uma proteína hemaglutinina (H), ou uma glicoproteína (G) (que não possui atividade de hemaglutinação e neuraminidase) dependendo do vírus em particular (revisto em Lamb & Parques (2007) Fields Virology, eds. Knippe & Howley, Lippincott Williams & Wilkins, pp. 1449-1496). Tradicionalmente, as proteínas HN, F, e G são os principais antigénios para os quais são dirigidos todos os virtuais anticorpos neutralizantes. NiV e HeV expressam ambos glicoproteínas G. Estudos anteriores sobre as glicoproteínas G do NiV e HeV produziram

subunidade de vacinas e reagentes de diagnóstico eficaz. A função primária glicoproteína de ligação do paramixovírus é atrair os recetores apropriados nas superfícies das células hospedeiras, que para a maioria dos paramixovírus bem caracterizados, são frações de ácido siálico. As glicoproteínas de HeV e NiV, no entanto, utilizam os recetores de proteína da célula hospedeira ephrinB2 e/ou ephrinB3 (Bishop et al. (2007) J. Virol. 81:5893-5901; Bonaparte et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102:10652-10657; Negrete et al. (2006) PLoS Pathog 2:e7). A glicoproteína de fusão (F) do paramixovírus medeia a fusão da membrana independente do pH entre a célula do vírus e do seu hospedeiro, o que resulta na entrega do nucleocapsídeo. As glicoproteínas do paramixovírus F são glicoproteínas de classe 1 do invólucro, triméricas fusogénicas, com terminal N da proteína localizado no domínio extracelular. Uma característica importante das glicoproteínas F do paramixovírus é a presença de duas regiões de repetição de sete elementos e um péptido de fusão hidrofóbico. HeV e NiV infetam através de um processo de fusão de membrana independente do pH na célula hospedeira através da ação concertada das glicoproteínas de ligação e de fusão. Em quase todos os casos, ambas as glicoproteínas são necessárias para a fusão eficiente à membrana (Bossart & Broder (2007) Viral Entry into Host Cells, eds. Pohlmann & Simmons, Landes Bioscience).

Após a ativação do mecanismo de fusão, as glicoproteinas F sofrem alterações conformacionais que irão facilitar a inserção do péptido de fusão nas membranas alvo. As alterações conformacionais reúnem as duas regiões de repetição de sete elementos para a formação de uma estrutura de seis hélices em feixe (também chamado um trimero-de-forquilha) . Estas alterações conformacionais ocorrem durante ou imediatamente após a fusão da membrana celular com virus (revisto em Lamb et al. (2006) Virology 344:30-37). Vários detalhes moleculares das alterações conformacionais substanciais da glicoproteína F foram revelados nas resoluções estruturais recentes de ambas as conformações de pós-fusão e pré-fusão da glicoproteína F (Yin et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102:9288-9293; Yin et al. (2006) Nature 439:38-44). A técnica anterior inclui W02005028673, divulgando inter alia, uma glicoproteína F do vírus Nipah e uma glicoproteína F do vírus Hendra. A investigação em Henipavírus é de extrema importância pelo menos por duas razões principais: para obter conhecimento sobre a fisiologia destes vírus e desenvolver estratégias para tratar, para detetar e impedir o seu surto futuro. Atualmente, terapêuticas e metodologias de diagnóstico para indivíduos infetados com NiV ou HeV são limitadas. Dada a novidade e a ameaça colocada por estes vírus, existe uma necessidade de meios melhorados para o tratamento e/ou prevenção de uma infeção por NiV ou HeV, bem como um meio para detetar com precisão a infeção. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é a seguinte: 1. Um polipéptido isolado compreendendo uma forma antigénica solúvel de uma glicoproteína F do Virus Hendra, em que o polipéptido compreende os aminoácidos 1 a 488 da SEQ ID N0:2, ou uma forma antigénica solúvel de uma glicoproteína F do Vírus Nipah, em que o polipéptido compreende os aminoácidos 1 a 488 da SEQ ID NO: 4 . 2. 0 polipéptido isolado do item 1, em que o polipéptido é fundido com um segundo polipéptido. 3. 0 polipéptido isolado do item 2, em que o segundo polipéptido compreende um polipéptido selecionado do grupo que consiste em: um epítopo péptido S, um local de clivagem do Fator Xa, e um domínio de trimerização. 4. 0 polipéptido isolado do item 3, em que o domínio de trimerização é a SEQ ID NO:10. 5. Uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido de qualquer um dos itens 1 a 4. 6. Uma composição farmacêutica compreendendo o polipéptido de qualquer um dos itens 1 a 4 e um veículo farmaceuticamente aceitável. 7. Um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga especificamente ao polipéptido de qualquer um dos itens 1 a 4. 8. Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo do item 7 e um veículo farmaceuticamente aceitável. 9. Um kit de diagnóstico para detetar uma infeção de Henipavírus num sujeito compreendendo o polipéptido de qualquer um dos itens 1 a 4, ou o anticorpo do item 7. 10. Um método de detetar um Henipavírus numa amostra biológica compreendendo o contato da amostra biológica com i) o anticorpo do item 7 e detetar a ligação do anticorpo, em que a ligação do anticorpo é indicativa da presença do Henipavírus na biológica amostra, ou ii) o polipéptido de qualquer um dos itens 1 a 4, e detetar a ligação do polipéptido, em que a ligação do polipéptido é indicativa da presença do Henipavírus na amostra biológica. 11. Um polipéptido isolado de qualquer um dos itens 1 a 4 para uso como um medicamento. 12. Um polipéptido isolado de qualquer um dos itens 1 a 4 para uso na prevenção de infeção por um Henipavírus. 13. Um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga especificamente ao polipéptido de qualquer um dos itens 1 a 4 para uso como um medicamento. 14. Um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga especificamente a esse polipéptido de qualquer um dos itens 1 a 4 para uso no tratamento ou prevenção da infeção por um Henipavirus.

Outros aspetos da divulgação feita e vantagens da invenção são apresentadas em parte na descrição, que se segue, e em parte, pode ser evidente desta descrição, ou podem ser aprendidas a partir da prática da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 mostra a análise por cromatografia de exclusão de tamanho da glicoproteina F solúvel (sF) de HeV. Foram analisados 300 pg da glicoproteina sF de HeV numa coluna de filtração em gel Superdex™ 200 10/300 calibrada. Foram recolhidas frações de 400 pL. O volume de eluição de cada pico foi utilizado para determinar a massa molecular aproximada como representado a partir da curva calibrada. Vo indica o volume vazio.

Figura 2 mostra a análise por cromatografia de exclusão de tamanho da glicoproteina sF de NiV gerada após clivagem da Fosfolipase D de uma sequência GPI no terminal carboxi. A Figura 2A mostra 300 pg da glicoproteina sF-GPI de NiV analisados numa coluna de filtração em gel de Superdex™ 200 10/300 calibrada.

Foram recolhidas frações de 400 pL. O volume de eluição de cada pico foi utilizado para determinar a massa molecular aproximada como representado a partir da curva calibrada. Vo indica o volume vazio. A Figura 2B mostra 5 pL de cada fração após análise por eletroforese em gel de poliacrilamida Blue Native (BN-PAGE) seguida por Western blot. A deteção imune foi efetuada utilizando uma peroxidase de rábano (HRP) conjugada com anticorpo anti péptido S.

Figura 3 mostra a análise por cromatografia de exclusão de tamanho da glicoproteina sF de HeV com um motivo peptidico GCN no terminal carboxi. A Figura 3A mostra 4 mg da glicoproteina sF-GCN de HeV analisadas numa coluna de filtração em gel de Superdex™ 200 10/300 calibrada. Foram recolhidas frações de 400 pL. O volume de eluição de cada pico foi utilizado para determinar a massa molecular aproximada como representado a partir da curva calibrada. Vo indica o volume vazio. A Figura 3B mostra 5 pL de cada fração analisados por BN-PAGE seguida por Western blot. A deteção foi efetuada utilizando uma peroxidase de rábano (HRP) conjugada com anticorpo anti péptido S.

Figura 4 mostra a análise por cromatografia de exclusão de tamanho da glicoproteina sF de NiV com um motivo peptidico GCN no terminal carboxi. A Figura 4A mostra 3 mg da glicoproteina sF-GCN de NiV analisadas numa coluna de filtração em gel de Superdex™ 200 10/300 calibrada. Foram recolhidas frações de 400 pL. O volume de eluição de cada pico foi utilizado para determinar a massa molecular aproximada como representado a partir da curva calibrada. Vo indica o volume vazio. A Figura 4B mostra 2 pL de cada fração analisados por BN-PAGE seguida por Western blot. A deteção foi efetuada utilizando uma peroxidase de rábano (HRP) conjugada com anticorpo anti péptido S.

Figuras 5A-5B mostram BN PAGE da glicoproteína sF. Na linha 1, foi carregada glicoproteína sF-GCN de HeV. Na linha 2, foi carregada glicoproteína sF-GCN de NiV. Na linha 3, foi carregada glicoproteína sF de HeV. Na linha 4, foi carregada glicoproteína sF-GPI de NiV. A Figura 5A mostra um Western blot de aproximadamente 2 yg de proteína carregada por linha. A deteção imune foi feita usando HRP conjugada com anticorpo anti-péptido S. A Figura 5B mostra a coloração com Azul de Coomassie de cerca de 5 yg de proteína carregados por linha.

Figuras 6A-6C mostram titulação ELISA de soro de ratinhos imunizados com diferentes proteínas sF, tal como indicado na Tabela 1. As placas foram revestidas com 50 ng da sF GCN de HeV (Figura 6A) ou NiV (Figura 6B) por poço seguido de bloqueio em BSA a 5%, PBS, Tween 20 a 0,05%. Diluição em série de duas vezes foi realizada começando em 1/2000 de cada soro de ratinho; mAb D54 contra GCN do envelope de HIV-1, anticorpo anti-péptido S, e anticorpo policlonal de Coelho anti Fl de HeV. HRP conjugada com anti-IgG de ratinho foi utilizada como anticorpo secundário. Cada titulação do soro foi feita em duplicado e os valores médios de OD foram representados graficamente contra a diluição do soro em valores de log. GCN do envelope de HIV-1 (Figura 6C) foi utilizado para monitorizar o título de anticorpo gerado contra a cauda GCN.

Figura 7 mostra a imunoprecipitação da F de comprimento total de HeV ou NiV por soro de diferentes ratinhos. As células HeLa USA foram infetadas com vírus vaccinia recombinante expressando F de comprimento total de HeV ou NiV com MOI de 10 durante 24 horas. As células foram lisadas e limpas por centrifugação. Os lisados foram então divididos igualmente em 7 porções. Cada fração de lisado celular foi então adicionada com 1 yL de soro de diferentes ratinhos imunizados com diferentes sF como indicado na Tabela 1. A mistura foi rodada a 4 °C durante a noite, seguido por precipitação com esferas de proteína-G a temperatura ambiente durante 1 h. Em seguida, o complexo ligado foi lavado 3 vezes e subsequentemente fervido em 50 yL de tampão de carregamento de amostra de SDS-PAGE em condição redutora. Foram então analisados 25 yL das amostras fervidas em SDS-PAGE seguido de western blot. A glicoproteína F precipitada foi detetada utilizando anticorpo policlonal de coelho anti Fl de HeV. (-ve indica combinado de soro pré-imunização).

Figura 8 mostra a neutralização de soro da luciferase repórter de vírus pseudotipado com F e G de NiV. As partículas F e G de pseudovirus NiV com o gene repórter da luciferase NL43 foram pré-incubadas com o soro de ratinho em diluição de 1/200, 1/400, e 1/800 (esquerda para a direita) à temperatura ambiente durante is h. Em seguida, as células 293T foram infetadas com a mistura durante 48 horas. Em seguida, as células foram lisadas e a atividade da luciferase foi medida. Cada infeção foi realizada em triplicado, (-ve indica combinado de soro pré-imunização).

Figura 9 mostra dados representativos do equilíbrio de sedimentação (6000 rpm) de sF GCN de HeV (1,5 mg/mL) em PBS com tampão Triton X-100 a 0,01% a 4 °C. Os dados são representados graficamente como absorvância versus o raio do eixo de rotação. Os dados enquadram-se com os de um complexo trimérico. O desvio nos dados do ajuste linear para um modelo trimérico é representado no gráfico (em cima).

DESCRIÇÃO DETALHADA O vírus Hendra (HeV) e o vírus Nipah (NiV) são membros estreitamente relacionados do género Henipavirus da família Paramyxoviridae. Esses vírus infetam células por um evento de fusão de membrana independente do pH mediado pelas suas glicoproteínas de ligação (G) e de fusão (F) do envelope (Envs). Esta invenção proporciona formas solúveis específicas da glicoproteína F de HeV e NiV e aspetos relacionados, tal como estabelecido nas reivindicações. A invenção proporciona formas solúveis da glicoproteína F de HeV e NiV que retêm características da glicoproteína F nativa. A fisiologia nativa da sequência de aminoácidos da glicoproteína F impede a proteína de ser solúvel em soluções aquosas. A presente invenção proporciona formas solúveis das glicoproteínas F de HeV e NiV compreendendo toda ou parte do domínio extracelular da glicoproteína F de um HeV ou NiV. As formas solúveis da glicoproteína F podem ser produzidas por exclusão de todos ou parte dos domínios de cauda transmembranar e citoplasmática da glicoproteína F. A título de exemplo, uma glicoproteína F solúvel pode compreender a região extracelular total de uma glicoproteína F de HeV ou NiV. Além disso, a título de exemplo, uma glicoproteína F solúvel pode compreender a totalidade ou parte da região extracelular e parte do domínio transmembranar de uma glicoproteína F de HeV ou NiV. Ainda a título de exemplo, várias versões de uma glicoproteína F solúvel (sF) foram construídas principalmente através da remoção da cauda citoplasmática e/ou domínio transmembranar que liga a proteína. Sem estas regiões, a glicoproteína F resultante expressa é solúvel.

As glicoproteínas sF da invenção são estruturalmente similares à glicoproteína F virai nativa. A titulo de exemplo, as glicoproteínas sF da invenção podem ser reconhecidas por anticorpos policlonais dirigidos a HeV e/ou NiV. A título de exemplo, as glicoproteínas sF da invenção podem organizar-se na forma oligomérica ou formas (tal como um trímero), comparáveis à glicoproteína F nativa de NiV e HeV.

As glicoproteínas sF da presente invenção são adequadas, por exemplo, para o desenvolvimento de vacinas e para agirem como um antigénio para gerar anticorpos antivirais quando utilizadas como uma vacina ou no isolamento de anticorpos monoclonais recombinantes. As glicoproteínas sF são adequadas para gerar anticorpos capazes de reconhecer a glicoproteína F nativa. As glicoproteínas sF da presente invenção que se organizam em formas oligoméricas, tal como trímeros, podem ser para utilização posterior, tal como, por exemplo, para cristalização e determinação estrutural para fornecer informação adicional contribuindo na pesquisa antiviral baseada na estrutura. As formas oligoméricas da glicoproteína sF da presente invenção podem também gerar ainda anticorpos capazes de reconhecer a glicoproteína F nativa e suas formas oligoméricas nativas. Exemplos de uma metodologia que pode ser usada incluem, mas não estão limitados, aos ensaios descritos aqui nos Exemplos.

Tal como aqui utilizado, as formas singulares "um/uma" ou "o/a" incluem referências no plural salvo indicação em contrário. Por exemplo, "uma" glicoproteina F inclui uma ou mais glicoproteinas F.

Tal como aqui utilizado, "glicoproteina F solúvel" ou "forma solúvel da glicoproteina F" ou "glicoproteina sF" relaciona-se com uma sequência de aminoácidos correspondendo a um fragmento ou porção da glicoproteina F nativa que contém o domínio extracelular ou uma sua porção. A glicoproteina sF é estruturalmente semelhante à glicoproteina F virai nativa. A título de exemplo, a remoção de um domínio transmembranar aumenta a solubilidade.

Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo" significa uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento de uma molécula de imunoglobulina que possui a capacidade de se ligar especificamente a um antigénio particular. Os anticorpos são bem conhecidos dos peritos na ciência da imunologia. Como aqui utilizado, o termo "anticorpo" significa não só moléculas de anticorpo de comprimento total mas também fragmentos de moléculas de anticorpo que retêm a capacidade de ligação a antigénio. Tais fragmentos são bem conhecidos na técnica atual e são empregues regularmente, in vitro e in vivo. Em particular, tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo" significa não só moléculas de imunoglobulina de comprimento total mas também os fragmentos ativos de ligação a antigénio tal como os fragmentos ativos bem conhecidos F(ab')2, Fab, Fv e Fd.

Como aqui utilizados, os termos "Doença do Virus Hendra" e "Doença do Virus Nipah " referem-se a doenças causadas, direta ou indiretamente, pela infeção com o virus Hendra ou Nipah. 0 grande tropismo das espécies e a capacidade de causar doença fatal em animais e seres humanos distinguiu o virus Hendra (HeV) e virus Nipah (NiV) de todos os outros paramixovirus conhecidos (Eaton (2001) Microbes. Infect. 3:277-278). Estes virus podem ser amplificados e causar doença em animais de grande porte e pode ser transmitida aos seres humanos onde a infeção se manifesta como uma doença respiratória grave e/ou encefalite febril.

Tal como aqui utilizado no que diz respeito a proteínas e a polipéptidos, o termo "recombinante" pode incluir proteínas e/ou polipéptidos e/ou péptidos que são produzidos ou derivados por manipulação genética, por exemplo por tradução numa célula de ácido nucleico não nativo ou construção por meios ou mecanismos artificiais.

Tal como aqui utilizado no que diz respeito a polipéptidos e proteínas, o termo "isolado" pode incluir um polipéptido ou ácido nucleico que, pela mão do homem, existe para além do seu ambiente nativo e não é, portanto, um produto da natureza. Por exemplo, um polipéptido isolado pode existir numa forma purificada ou pode existir num ambiente não nativo tal como, por exemplo, uma célula hospedeira recombinante.

Tal como aqui utilizado, o termo "análogo" pode incluir qualquer polipéptido com uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica a um polipéptido, ou péptido, da invenção, na qual um ou mais resíduos tenham sido substituídos de forma conservativa com um resíduo funcionalmente semelhante, e ainda que exibe aspetos funcionais substancialmente idênticos aos polipéptidos como aqui descritos. Exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo não polar (hidrofóbico) por um outro (por exemplo, isoleucina, valina, leucina ou metionina), substituição de um resíduo polar (hidrofílico) por um outro (por exemplo, entre arginina e lisina, entre glutamina e asparagina, entre glicina e serina), substituição de um resíduo básico por um outro (por exemplo, lisina, arginina ou histidina), ou substituição de um resíduo ácido por um outro (por exemplo, ácido aspártico ou ácido glutâmico).

Como aqui utilizado, um "homólogo" pode incluir qualquer polipéptido com uma estrutura terciária substancialmente idêntica à de um polipéptido da invenção que também apresenta as propriedades funcionais dos polipéptidos como aqui descrito.

Como aqui utilizado, "domínio de trimerização" refere-se a um motivo estrutural que contribui para polimerização de proteínas expressas. Os domínios de trimerização podem auxiliar as proteínas solúveis na configuração como se estivessem ligadas à membrana. Os domínios de trimerização, por exemplo, podem utilizar motivos em espiral enrolada para polimerizar. Um exemplo de um domínio de trimerização é observado no fecho de leucina de base. Os fechos de leucina de base tipicamente correlacionam-se com uma espiral enrolada de α-hélices, no qual o posicionamento de leucina, ou outros aminoácidos hidrofóbicos, nas hélices interagem para formar um núcleo hidrofóbico. Um exemplo de um fecho de leucina de base é GCN4.

Tal como aqui utilizado, "tratamento" pode incluir qualquer tipo de intervenção utilizada numa tentativa para alterar o curso natural do indivíduo ou célula. 0 tratamento pode incluir, mas não está limitado a, administração de por exemplo, uma composição farmacêutica, isolada ou em combinação com outras modalidades de tratamento geralmente conhecido na técnica. 0 "tratamento" pode ser realizado profilaticamente, ou posterior à iniciação de um evento patológico.

Tal como aqui utilizado, "veículo farmaceuticamente aceitável" pode incluir quaisquer materiais que, quando combinados com um ingrediente ativo, permite ao ingrediente reter a atividade biológica e não é reativo com o sistema imune do sujeito. Exemplos podem incluir, mas não estão limitados a, veículo farmacêuticos padrão, tais como uma solução salina fosfato tamponada (PBS), água, emulsões, e vários tipos de agentes molhantes.

Tal como aqui utilizado, "fusão" pode estar relacionado com ácidos nucleicos e polipéptidos que compreendem sequências que não são naturalmente encontradas associadas entre si na ordem ou contexto em que estas são colocadas de acordo com a presente invenção. Um ácido nucleico ou polipéptido de fusão não compreende necessariamente a sequência natural do ácido nucleico ou polipéptido na sua totalidade. As proteínas de fusão têm os dois ou mais segmentos unidos entre si através de ligações peptídicas normais. Os ácidos nucleicos de fusão têm os dois ou mais segmentos unidos entre si através de ligações fosfodiéster normais.

Tal como aqui utilizado, "sujeito" pode incluir o recetor do tratamento a ser praticado de acordo com a invenção. 0 sujeito pode ser qualquer animal, incluindo um vertebrado. 0 sujeito poderá na maior parte dos casos, preferencialmente ser um humano, mas pode também ser animal doméstico, animais de laboratório (incluindo, mas não limitados a roedores tais como um rato ou ratinho) ou animal de estimação.

Tal como aqui utilizado, "clivagem" pode estar relacionado com separação de uma sequência de aminoácidos ou nucleótidos. A titulo de exemplo, a clivagem pode ocorrer com o uso de enzimas, tais como tripsina e quimiotripsina. A titulo de exemplo adicional, as sequências de nucleótidos podem ser clivadas com a utilização de endonucleases de restrição.

Os virus Nipah e Hendra exigem uma ação combinada das glicoproteinas de ligação e fusão para infetar a célula hospedeira e inserir o nucleocapsideo. A presente invenção proporciona uma forma da glicoproteina F solúvel do virus Nipah e Hendra. Por exemplo, a ausência das regiões citoplasmáticas e transmembranares do terminal carboxilo da glicoproteina F permitem a solubilização da proteína. Como um exemplo adicional, a utilização dos primeiros 488 aminoácidos do NiV e HeV (uma perda de 58 aminoácidos em ambos), produz uma versão solúvel da glicoproteina F que retém características da proteína nativa. A presente invenção inclui polipéptidos tal como definido na reivindicação 1.

Formas solúveis da glicoproteina f de Niv e Hev A presente invenção proporciona formas solúveis da glicoproteina F de NiV e HeV de estirpes diferentes. A presente invenção proporciona formas solúveis da glicoproteína F compreendendo uma sequência de aminoácidos com homologia significativa com as sequências de aminoácidos do domínio extracelular das glicoproteínas F nativas do vírus Nipah e Hendra, isto é, as formas solúveis da glicoproteína F têm pelo menos 90% de identidade com a glicoproteína F solúvel nativa de NiV ou HeV da SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:2. Numa forma de realização, o polipéptido compreende a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4. As glicoproteínas sF podem incluir inserções, substituições e/ou deleções de aminoácidos que tenham um mínimo ou nenhum efeito sobre a atividade, função ou forma do polipéptido. Exemplos de tais substituições incluem a substituição de um resíduo não-polar por outro, a substituição de um resíduo polar por outro, a substituição de um resíduo básico por um outro, ou a substituição de um resíduo ácido por outro. As glicoproteínas sF podem ainda incluir inserções, substituições e/ou deleções de aminoácidos em uma comparação com a sequência de aminoácidos do domínio extracelular da glicoproteína F nativa NiV ou HeV que produzem um efeito mínimo sobre a atividade, função e/ou estrutura dos polipéptidos. Os peritos na técnica irão reconhecer que aminoácidos não naturais podem também ser utilizados. Os aminoácidos não naturais incluem, por exemplo, beta-alanina (beta-Ala), ou outros omega-aminoácidos, tais como 3-amino propiónico, 2,3-diamino propiónico (2,3-diaP), 4-amino butírico e assim por diante, ácido alfa-aminoisobutírico (Aib), sarcosina (Sab), ornitina (Orn), citrulina (Cit), t-butilalanina (t-BuA), t-butilglicina (t-BuG), N-metilisoleucina (N-Melle), fenilglicina (Phg), e ciclohexilalanina (Cha), norleucina (Nle), ácido cisteico (Cya), 2-naftilalanina (2-Nal); ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico (Tie); beta-2-tienilalanina (Thi); e sulfóxido de metionina (MSO). A glicoproteína sF da presente invenção pode ser preparada através de quaisquer técnicas conhecidas. Por exemplo, os polipéptidos podem ser expressos por meio de manipulação genética. A titulo de exemplo, a tradução do ADN recombinante. Os polipéptidos podem também ser preparados sinteticamente. A titulo de exemplo, o polipéptido pode ser sintetizado utilizando a técnica de síntese em fase sólida inicialmente descrita por Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154), que é aqui incorporada por referência. Outras técnicas de síntese de polipéptidos podem ser encontradas, por exemplo, Kent et al. (1985), em Synthetic Peptides in Biology and Medicine, eds. Alitalo et al., Elsevier Science Publishers, 295-358. A glicoproteína sF da presente invenção pode ser isolada ou obtida em forma substancialmente pura. Substancialmente pura significa que as proteínas e/ou polipéptidos e/ou péptidos são essencialmente livres de outras substâncias com que podem ser encontrados na natureza ou em sistemas in vivo de uma forma prática e adequados para a utilização pretendida. Em particular, as glicoproteínas sF são suficientemente puras e são suficientemente livres de outros constituintes biológicos das suas células hospedeiras de modo a serem úteis na, por exemplo, geração de anticorpos, sequenciação ou produção de preparações farmacêuticas. Através de técnicas bem conhecidas na técnica, polipéptidos substancialmente puros podem ser produzidos de acordo com as sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos aqui divulgadas. Porque um polipéptido substancialmente purificado da invenção pode ser misturado com um veículo farmaceuticamente aceitável numa preparação farmacêutica, o polipéptido pode compreender apenas uma percentagem em peso da preparação. 0 polipéptido é contudo substancialmente puro uma vez que foi substancialmente separado das substâncias com as quais pode estar associado em sistemas vivos.

Polipéptido de fusão compreendendo glicoproteina F solúvel A presente invenção proporciona polipéptidos de fusão adicionalmente isolados das glicoproteinas sF da invenção com polipéptidos adicionais. Os polipéptidos adicionais podem ser fragmentos de um polipéptido maior. Uma, duas, três, quatro, ou mais polipéptidos podem ser fundidos com a glicoproteina sF. Os polipéptidos adicionais podem ser na direção do terminal amino da glicoproteina sF. Os polipéptidos adicionais podem ser fundidos na direção do terminal carboxilo d a glicoproteina sF. Os polipéptidos adicionais podem flanquear a glicoproteina sF.

Os polipéptidos adicionais podem auxiliar na estabilização, estrutura e/ou purificação da glicoproteina sF. Os polipéptidos adicionais podem auxiliar a glicoproteina sF para formar oligómeros, tal como um trimero. Os oligómeros podem auxiliar glicoproteinas sF a ficarem na configuração mais semelhante à glicoproteina F nativa. A titulo de exemplo, um domínio de trimerização fundido a glicoproteina sF pode estabilizar o polipéptido e podem aumentar ainda mais a polimerização do polipéptido.

Os polipéptidos adicionais podem incluir um epítopo. Os polipéptidos adicionais podem incluir um marcador de afinidade. A título de exemplo, a fusão de um polipéptido compreendendo um epítopo e/ou um marcador de afinidade da glicoproteina sF pode auxiliar a purificação e/ou a identificação do polipéptido. A titulo de exemplo, o segmento de polipéptido pode ser um marcador His, um marcador myc, um marcador péptido S, um marcador MBP (proteína de ligação à maltose), um marcador GST (glutationa S-transferase), um marcador FLAG, um marcador tioredoxina, um marcador GFP (proteína fluorescente verde), um marcador BCCP (proteína transportadora de biotina carboxilo), um marcador calmodulina, um marcador Strep, um marcador do epítopo HSV, um marcador do epítopo V5, e um marcador CBP. 0 uso de marcadores de epítopos e afinidade é conhecido dos peritos na técnica.

Os polipéptidos adicionais podem proporcionar uma proteína de fusão compreendendo locais para clivagem do polipéptido. Como um exemplo, um polipéptido pode ser clivado por hidrólise da ligação peptídica. A clivagem pode ser realizada por uma enzima. A clivagem pode ocorrer na célula. A clivagem pode ocorrer através de manipulação artificial e/ou a introdução artificial de uma enzima de clivagem. A título de exemplo, enzimas de clivagem podem incluir pepsina, tripsina, quimiotripsina e/ou Fator Xa. Os polipéptidos adicionais podem proporcionar um domínio de âncora na membrana. 0 domínio de âncora na membrana pode ser um local de clivagem. Por exemplo, Fosfolipase D irá clivar o domínio de âncora na membrana da SEQ ID NO:8. Além disso, a clivagem permite facilidade no isolamento da glicoproteína sF dos polipéptidos. A clivagem também pode permitir o isolamento da glicoproteína sF fundida a polipéptidos de outros polipéptidos. A título de exemplo, um local de clivagem Fator Xa pode permitir o isolamento da glicoproteína sF fundida a um domínio de trimerização de um marcador péptido S. A presente invenção proporciona as glicoproteínas sF da invenção fundidas com um domínio de trimerização, um domínio de clivagem Fator Xa ou um marcador péptido S. 0 domínio de trimerização permite a associação da glicoproteína sF como um oligómero. 0 marcador péptido S permite a purificação através da utilização de anticorpos anti-péptido S. 0 domínio de clivagem Fator Xa permite a separação da glicoproteína sF fundida com o domínio de trimerização do marcador péptido S.

Os polipéptidos de fusão podem ainda possuir modificações estruturais adicionais que não são partilhadas com o mesmo péptido organicamente sintetizados, tais como adenilação, carboxilação, glicosilação, hidroxilação, metilação, fosforilação ou miristilação. Estas modificações estruturais podem ser ainda selecionadas ou preferidas pela escolha apropriada do sistema de expressão recombinante. Por outro lado, os polipéptidos de fusão podem ter a sua sequência aumentada pelos princípios e prática da síntese orgânica.

Ácidos nucleicos que codificam formas solúveis da glicoproteína F A presente invenção proporciona moléculas de ácidos nucleicos codificando uma sequência de aminoácidos das formas solúveis das glicoproteínas F de NiV ou HeV da invenção. Os ácidos nucleicos podem incluir formas em cadeia simples ou duplas de desoxirribonucleótidos ou ribonucleótidos ou seus polímeros. A presente invenção também proporciona um vetor compreendendo tais ácidos nucleicos. Um vetor pode ser qualquer um de um número de ácidos nucleicos, em que pode ser inserida uma sequência desejada por restrição e ligação para transporte entre diferentes ambientes genéticos ou para expressão numa célula hospedeira. Tipicamente os vetores são compostos por ADN, embora os vetores de ARN estejam também disponíveis. Os vetores incluem, mas não estão limitados a plasmídeos e fagemídeos. Um vetor de clonagem é um que é capaz de se replicar numa célula hospedeira, e que é caracterizado adicionalmente por um ou mais locais de restrição de endonucleases nos quais o vetor pode ser cortado de um modo determinável e no qual uma sequência de ADN desejada pode ser ligada de tal modo que o novo vetor recombinante mantém a sua capacidade de replicação na célula hospedeira. No caso dos plasmídeos, a replicação da sequência desejada pode ocorrer muitas vezes à medida que o plasmídeo aumenta em número de cópias na bactéria hospedeira ou apenas uma única vez por hospedeiro antes do hospedeiro se reproduzir por mitose. No caso de fagos, a replicação pode ocorrer ativamente durante uma fase lítica ou passivamente durante uma fase lisogénica.

Os vetores podem conter ainda uma sequência de promotor. Um promotor pode incluir uma sequência de ácido nucleico não traduzida normalmente localizada a montante da região codificante que contém o local para iniciar a transcrição do ácido nucleico. A região do promotor pode também incluir outros elementos que atuam como reguladores da expressão do gene. Em formas de realização adicionais da invenção, o vetor de expressão contém uma região adicional para auxiliar na seleção de células que têm o vetor de expressão incorporado. A sequência do promotor está ligada muitas vezes (inclusive) no seu terminal 3' pelo local de iniciação da transcrição e prolonga-se a montante (direção 5' ) para incluir o número mínimo de base ou elementos necessários para iniciar a transcrição a niveis detetáveis acima do nivel base. Dentro da sequência do promotor será encontrado um local de iniciação da transcrição, assim como domínios de ligação à proteína responsáveis pela ligação da polimerase de ARN. Os promotores eucarióticos irão, muitas vezes, mas não sempre, conter caixas "TATA" e caixas "CAT".

Os vetores podem ainda conter uma ou mais sequências marcador apropriadas para utilização na identificação e seleção de células que tenham sido transformadas ou transfectadas com o vetor. Os marcadores incluem, por exemplo, genes que codificam proteínas que aumentam ou diminuem qualquer resistência ou sensibilidade a antibióticos ou outros compostos, genes que codificam enzimas cujas atividades são detetáveis por ensaios padrão conhecidos na técnica (por exemplo, galactosidase ou fosfatase alcalina), e genes que visivelmente afetam o fenótipo de células, hospedeiros, colónias ou placas transformadas ou transfectadas. Os vetores preferidos são aqueles capazes de replicação autónoma e expressão dos produtos dos genes estruturais presentes nos segmentos de ADN aos quais estão operacionalmente ligados.

Um vetor de expressão é um em que a sequência desejada do ácido nucleico pode ser inserida por restrição e ligação de tal modo que é operacionalmente ligada a sequências reguladoras e pode ser expressa como um transcrito de ARN. A expressão está relacionada com a transcrição e/ou tradução de um gene endógeno, transgene ou região codificante numa célula.

Uma sequência codificante e sequências reguladoras estão operacionalmente unidas quando estão ligadas covalentemente de tal forma que colocam a expressão ou transcrição da sequência codificante sob a influência ou controlo das sequências requladoras. Se for desejado que as sequências codificantes sejam traduzidas numa proteína funcional, duas sequências de ADN são referidas como sendo operacionalmente ligadas se a indução de um promotor nas sequências reguladoras 5' resulta na transcrição da sequência codificante e se a natureza da ligação entre as duas sequências de ADN não (1) resultar na introdução de uma mutação por deslocamento, (2) interferir com a capacidade da região do promotor para dirigir a transcrição das sequências codificantes, ou (3) interferir com a capacidade do transcrito de ARN correspondente de ser traduzido em proteína. Assim, uma região do promotor estaria operacionalmente ligada a uma sequência codificante se a região do promotor fosse capaz de realizar a transcrição dessa sequência de ADN de tal modo que o transcrito resultante possa ser traduzido na proteína ou polipéptido desej ado. A presente divulgação inclui a transformação e/ou a transfecção de ácidos nucleicos que codificam a glicoproteína sF. A transformação é a introdução de ácido nucleico exógeno ou heterólogo para o interior de uma célula procariótica. A transfecção é a introdução de ácido nucleico exógeno ou heterólogo para o interior de uma célula eucariótica. 0 ácido nucleico da transformação ou transfecção pode ou não ser integrado (ligado covalentemente) no ADN cromossómico que constitui o genoma da célula. Em procariotas, por exemplo; a transformação de ácidos nucleicos pode ser mantida num elemento epissomal tal como um plasmídeo ou vetor viral. No que diz respeito às células eucarióticas, uma célula transfectada de forma estável é aquela em que o ácido nucleico da transfecção tornou-se parte integrante dum cromossoma de modo a ser herdado pelas células filhas através da replicação do cromossoma. Esta estabilidade é demonstrada pela capacidade da célula eucariótica para estabelecer linhas celulares ou clones constituídos por uma população de células filhas contendo o ácido nucleico transfectado. A cultura de células de eucariotas superiores pode ser utilizada para expressar as proteínas da presente invenção, seja de células de vertebrados ou de invertebrados, incluindo insetos, e os procedimentos de propagação das mesmas são conhecidos (ver, por exemplo, Kruse et al. (1973) Tissue Culture, Academic Press) .

As células hospedeiras adequadas para expressar os polipéptidos da presente invenção em eucariotas superiores incluem: 293 (células de rim embrionário humano) (ATCC GRL-1573); 293F (Invitrogen, Carlsbad CA); 293T e a derivada 293T/17 (293tsAl609neo e a derivada ATCC CRL-11268) (células de rim embrionário humano transformadas pelo antigénio T de SV40); COS-7 (linha CVI de rim de macaco transformada por SV40) (ATCC CRL1651); BHK (células de rim de hamster bebé) (ATCC CRL10); CHO (células de ovário de hamster chinês); células de Sertoli de ratinho; CVI (células de rim de macaco) (ATCC CCL70); VER076 (células de rim de macaco verde Africano) (ATCC CRL1587); HeLa (células de carcinoma cervical humano) (ATCC CCL2); MDCK (células de rim canino) (ATCC CCL34); BRL3A (células de fígado de rato) (ATCC CRL1442); W138 (células de pulmão humano) (ATCC CCL75); HepG2 (células de fígado humano) (HB8065); e MMT 060652 (células de tumor mamário de ratinho) (ATCC CCL51) . A presente invenção proporciona moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas de fusão compreendendo as glicoproteínas sF da invenção e polipéptidos adicionais. Os vetores úteis para a construção de sistemas de expressão eucarióticos para a produção de polipéptidos compreendendo ácidos nucleicos que codificam a proteína de fusão ligada operacionalmente a uma sequência de ativação da transcrição adequada, tal como um promotor e/ou operador. Outras características típicas podem incluir locais de ligação ao ribossoma adequados, codões de terminação, potenciadores, terminadores, ou elementos de replicação. Estas características adicionais podem ser inseridas no vetor no sítio ou sítios adequados por técnicas convencionais de excisão, tais como digestão com endonucleases de restrição e ligação.

As moléculas de ácido nucleico podem codificar uma proteína de fusão compreendendo ácidos nucleicos fundidos com um ácido nucleico que codifica uma glicoproteína sF. 0 ácido nucleico fundido pode codificar polipéptidos que podem auxiliar na purificação e/ou imunogenicidade e/ou estabilidade, sem deslocamento do quadro de leitura do codão da glicoproteína sF. 0 ácido nucleico fundido pode codificar para um polipéptido para auxiliar a purificação da glicoproteína sF. 0 ácido nucleico fundido pode codificar um epítopo e/ou um marcador de afinidade. Exemplos de polipéptidos que ajudam a purificação incluem, mas não estão limitados a um marcador His, um marcador Myc, um marcador péptido S, um marcador MBP, um marcador GST, um marcador FLAG, um marcador tioredoxina, um marcador GFP, um marcador BCCP, um marcador calmodulina, um marcador Strep, um marcador do epítopo HSV, um marcador do epítopo V5, e um marcador CBP. 0 ácido nucleico fundido pode codificar um polipéptido que se correlaciona com um local direcionado para, ou propenso a, clivagem. 0 ácido nucleico fundido pode codificar polipéptidos que são locais de clivagem enzimática. A clivagem enzimática pode auxiliar a isolar a glicoproteina sF, bem como outros segmentos de polipéptidos fundidos, a partir de outros polipéptidos. A titulo de exemplo, um ácido nucleico intermediário que codifica para um local de clivagem enzimática posicionado entre ácidos nucleicos que codificam para a glicoproteina sF e um epítopo péptido S irá permitir a separação posterior da glicoproteina sF expressa e do péptido S. 0 ácido nucleico fundido pode codificar em parte os aminoácidos que são um local de clivagem pelo Fator Xa. 0 ácido nucleico fundido pode codificar aminoácidos que estão ancorados à membrana ancorada e um local de clivagem. A titulo de exemplo, a SEQ ID NO:8 vai ancorar o polipéptido de fusão à membrana plasmática e é um local para a clivagem da Fosfolipase D. 0 ácido nucleico fundido pode codificar em parte um polipéptido que ajuda a estabilidade e função da glicoproteina F solúvel. 0 ácido nucleico fundido pode codificar polipéptidos que ajudam na formação de oligómeros da glicoproteina F solúvel. 0 ácido nucleico fundido pode codificar um domínio de trimerização. Um motivo de fecho de leucina de base é um exemplo de um domínio de trimerização. Ainda a título de exemplo, o motivo de fecho de leucina de base é um segmento polipeptídico GCN4.

Os vários ácidos nucleicos podem ser fundidos com o ácido nucleico que codifica a glicoproteina sF. Os ácidos nucleicos fundidos podem codificar para polipéptidos que ajudam a purificação e/ou clivagem enzimática e/ou estabilidade. Os ácidos nucleicos fundidos podem não alongar significativamente o polipéptido. Os ácidos nucleicos fundidos podem codificar para menos de sessenta aminoácidos extra para a glicoproteína sF. 0 ácido nucleico fundido pode vir após o ácido nucleico que codifica a glicoproteína sF. Os ácidos nucleicos fundidos podem flanquear o ácido nucleico que codifica a glicoproteína sF. 0 ácido nucleico fundido pode anteceder o ácido nucleico que codifica a glicoproteína sF. Os ácidos nucleicos fundidos podem flanquear o ácido nucleico que codifica a glicoproteína sF. 0 ácido nucleico fundido que codifica para uma sequência de aminoácidos propensa a clivagem enzimática pode ser colocado entre o ácido nucleico que codifica para a região da glicoproteína sF e outro ácido nucleico fundido que codifica para um polipéptido para auxiliar a purificação. A molécula de ácido nucleico pode ser disposta de modo que um domínio de clivagem vai separar um polipéptido para auxiliar a purificação da glicoproteína sF fundida com um domínio de trimerização.

Anticorpos que ligam formas solúveis da glicoproteína F

Outro aspeto da invenção é dirigido a anticorpos. Os anticorpos da presente invenção são aqueles específicos para a glicoproteína F de HeV ou específicos para a glicoproteína F de NiV. Fazem parte da divulgação os anticorpos que têm reatividade cruzada com a glicoproteína F de HeV e a glicoproteína F de NiV e anticorpos neutralizantes. Os anticorpos da invenção podem ser caracterizados utilizando métodos bem conhecidos na técnica.

Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etc.), anticorpos quiméricos, anticorpos biespecificos, anticorpos heteroconjugados, cadeia simples (ScFv), mutantes dos mesmos, proteínas de fusão compreendendo uma porção do anticorpo, anticorpos humanizados, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um local de reconhecimento do antigénio da especificidade requerida, incluindo variantes de glicosilação de anticorpos, variantes de sequências de aminoácidos de anticorpos, e anticorpos modificados covalentemente. Os anticorpos preferidos são derivados de murino, rato, humano, primata, ou qualquer outra origem (incluindo anticorpos quiméricos e humanizados).

Os anticorpos podem ser anticorpos policlonais ou monoclonais. Métodos de preparação de anticorpos monoclonais e policlonais são bem conhecidos na técnica.

Os anticorpos podem ser humanizados por métodos conhecidos na técnica. Um anticorpo humanizado é uma molécula de imunoglobulina que contém uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Os anticorpos totalmente humanos podem ser obtidos utilizando ratinhos comercialmente disponíveis que foram manipulados para expressar proteínas específicas de imunoglobulina humana. Os anticorpos podem ser quiméricos. Um anticorpo quimérico é um anticorpo que combina características de dois anticorpos diferentes. Métodos de preparação de anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. A sequência de nucleótidos que codifica anticorpo pode ser obtida e depois clonada num vetor para a expressão ou propagação. Os anticorpos podem ser produzidos de forma recombinante e expressos usando métodos conhecidos na técnica. A titulo de exemplo, a glicoproteína sF pode ser utilizada como um antigénio para efeitos de isolamento de anticorpos recombinantes por estas técnicas. Os anticorpos podem ser produzidos de forma recombinante usando a sequência de gene para expressar o anticorpo de forma recombinante em células hospedeiras. Os métodos para preparar derivados de anticorpos e anticorpos recombinantes são conhecidos na técnica.

Os anticorpos podem ser ligados a um veiculo por métodos convencionais na técnica, para utilização em, por exemplo, isolamento ou purificação das glicoproteínas F nativas de Hendra ou Nipah ou deteção das glicoproteínas F nativas de Hendra ou Nipah numa amostra ou espécime biológico. Os anticorpos neutralizantes podem ser administrados como imunoterapia passiva a um sujeito infetado ou suspeito de estar infetado com vírus Hendra ou Nipah.

Um anticorpo é uma glicoproteína heterotetramérica composta por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas (um anticorpo IgM consiste em cinco das unidades heterotetrâmero de base juntamente com um polipéptido adicional denominado cadeia J, e contêm, portanto, dez locais de ligação ao antigénio, enquanto que os anticorpos IgA secretados podem polimerizar para formar conjuntos polivalentes compreendendo duas a cinco das quatro unidades básicas da cadeia juntamente com a cadeia J) . A cadeia L de qualquer espécie de vertebrado pode ser atribuída a um de dois tipos claramente distintos, denominados capa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes e os métodos da presente invenção incluem o uso de anticorpos com uma cadeia L capa ou lambda. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das cadeias pesadas (CH) , as imunoglobulinas podem ser classificadas em diferentes classes ou isotipos. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, com cadeias pesadas designadas por alfa, delta, épsilon, gama e mu, respetivamente. As classes gama e alfa são ainda divididas em subclasses com base em diferenças relativamente pequenas na sequência CH e função, por exemplo, seres humanos expressam as seguintes subclasses: IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2. Os métodos da presente invenção incluem a utilização de anticorpos, incluindo anticorpos monoclonais, de qualquer uma das classes e/ou subclasses anteriores.

Tal como aqui utilizado, o termo "variável" está relacionado ao fato de certos segmentos dos domínios variáveis diferirem extensivamente em sequência entre anticorpos. 0 domínio variável media a ligação ao antigénio e define a especificidade de um anticorpo particular para o seu antigénio. No entanto, a variabilidade não está distribuída uniformemente em toda a extensão de 110 aminoácidos do domínio variável. Em vez disso, as regiões variáveis consistem em secções relativamente invariantes denominadas regiões estruturais (FR) de cerca de quinze a trinta aminoácidos separados por regiões mais curtas de extrema variabilidade chamadas "regiões hipervariáveis" que apresentam cerca de nove a doze aminoácidos de comprimento cada uma. Os domínios variáveis das cadeias pesadas e leves nativas compreendem quatro regiões estruturais cada um, adotando largamente uma configuração de folha beta, ligadas por três regiões hipervariáveis, que formam alças que ligam, e em alguns casos fazem parte da estrutura em folha beta. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade com a região estrutural e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação ao antigénio dos anticorpos (ver Rabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service, National Institutes of Health). Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas exibem várias funções efetoras, tais como participação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). 0 termo "região hipervariável" quando aqui utilizado refere-se a resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antigénio. A região hipervariável geralmente compreende os resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" que contribui para a especificidade do anticorpo. 0 termo "anticorpos ou seus fragmentos" pode estar relacionado com anticorpos ou seus fragmentos que se ligam especificamente a um polipéptido sF ou um fragmento de um polipéptido sF e não se ligam especificamente a outros polipéptidos não sF. Os anticorpos ou fragmentos que se ligam imunoespecif icamente a um polipéptido sF ou seu fragmento podem não reagir não especificamente de forma cruzada com outros antigénios (por exemplo, a ligação não pode ser impedida por competição com uma proteína não sF, por exemplo, BSA num imunoensaio apropriado). Os anticorpos ou fragmentos que se ligam imunoespecificamente a um polipéptido sF podem ser identificados, por exemplo, por imunoensaios ou outras técnicas conhecidas dos peritos na técnica. Os anticorpos incluem anticorpos sintéticos, anticorpos monoclonais, anticorpos produzidos de forma recombinante, intracorpos, diacorpos, anticorpos multiespecificos (incluindo anticorpos biespecificos) , anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, Fvs de cadeia simples (scFv) (incluindo scFv biespecíficos), anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, Fvs ligados por dissulfeto (sdFv), e anticorpos anti-idiotipos (anti-Id), e fragmentos de ligação ao epítopo de qualquer um dos acima. Os anticorpos incluem moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um local de ligação ao antigénio se liga imunoespecificamente a um antigénio sF (por exemplo, uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR) de um anticorpo anti-sF). 0 termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, ou seja, os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos exceto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em quantidades menores e incluem fragmentos de anticorpo tal como aqui definido. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. Além disso, em contraste com preparações de anticorpos policlonais que incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. Para além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos porque podem ser sintetizados sem contaminações por outros anticorpos. 0 modificador "monoclonal", não é para ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais úteis na presente invenção podem ser preparados pela metodologia de hibridoma, primeiramente descrita por Kohler et al. (1975) Nature 256, 495 ou pode ser feito usando métodos de ADN recombinante em células bacterianas, animais eucarióticas ou de plantas (ver Patente EUA 4,816,567). Os "anticorpos monoclonais" também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos de fagos utilizando as técnicas descritas em Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628 e Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222, 581-597, por exemplo.

Tal como aqui utilizado, um anticorpo "intato" é um que compreende um local de ligação ao antigénio bem como um Ci e pelo menos os domínios constantes de cadeia pesada, CHi e CH2 e CH3 · Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humanos) ou suas variantes da sequência de aminoácidos. Preferencialmente, o anticorpo intato tem uma ou mais funções efetoras.

Um "fragmento de anticorpo" compreende uma porção de um anticorpo intato, preferencialmente a CDR de ligação ao antigénio ou a região variável do anticorpo intato. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fv, Fab' e F(ab')2; diacorpos; anticorpos lineares (ver Patente dos EUA 5,641,870 e Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8, 1057-1062); moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo. A digestão com papaína de anticorpos produz dois fragmentos idênticos de ligação ao antigénio, denominados de fragmentos "Fab", e um fragmento residual "Fc", uma designação que reflete a capacidade para cristalizar facilmente. 0 fragmento Fab consiste em uma cadeia L completa juntamente com o domínio da região variável da cadeia H (VH) e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (CHi) . Cada fragmento Fab é monovalente no que diz respeito à ligação ao antigénio, isto é, tem um único local de ligação ao antigénio. 0 tratamento com pepsina de um anticorpo origina um único grande fragmento F(ab')2 que corresponde aproximadamente a dois fragmentos Fab ligados por dissulfeto com atividade divalente de ligação ao antigénio e é ainda capaz de ligação cruzada ao antigénio. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab por terem alguns resíduos adicionais no terminal carboxi do domínio CHi, incluindo uma ou mais cisteínas da região da dobradiça do anticorpo. A designação Fab'-SH é aqui utilizada para Fab' no qual o(s) resíduo (s) de cisteína dos domínios constantes possuem um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas de dobradiça entre eles. Outras associações químicas de fragmentos de anticorpo são também conhecidas. 0 fragmento Fc compreende as porções do terminal carboxi de ambas as cadeias H mantidas unidas por ligações dissulfeto. As funções efetoras dos anticorpos são determinadas pelas sequências na região Fc, região esta que é também a parte reconhecida pelos recetores Fc (FcR) encontrados em determinados tipos de células.

Tal como aqui utilizado, "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local completo de reconhecimento e ligação ao antigénio. Este fragmento consiste em um dímero de um domínio de região variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação estreita, não covalente. A partir da dobragem destes dois domínios nascem seis alças hipervariáveis (três alças por cada cadeia H e L) de resíduos aminoácidos que contribuem para a ligação ao antigénio e conferem especificidade de ligação do antigénio ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDR específicas para um antigénio) tem a capacidade de reconhecer e ligar o antigénio, embora com uma afinidade mais baixa do que o local de ligação completo.

Tal como aqui utilizado, "Fv de cadeia simples", também abreviado como "sFv" ou "scFv" são fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios de anticorpo VH e VL ligados numa única cadeia de polipéptido. De um modo preferido, o polipéptido sFv compreende adicionalmente um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite ao sFv formar a estrutura desejada para ligação ao antigénio (ver Rosenburg et al. (1994), The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp. 269 -315).

Como aqui utilizado, o termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo preparados através da construção de fragmentos sFv (ver o parágrafo anterior) com ligantes curtos (cerca de 5 a cerca de preparação 10 resíduos) entre os domínios VH e VL de tal modo que é alcançado emparelhamento intercadeia mas não intracadeia dos domínios V, resultando num fragmento bivalente, isto é, fragmento com dois locais de ligação do antigénio. Os diacorpos biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos sFv de "cruzamento" nos quais os domínios VH e VL dos dois anticorpos estão presentes em diferentes cadeias polipeptídicas. Os diacorpos são descritos em mais detalhe em, por exemplo, WO 93/11161 e Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 6444-6448.

Um "anticorpo isolado" é um que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que iriam interferir com o diagnóstico ou usos terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormonas e outros componentes proteináceos ou não proteináceos. Em formas de realização preferidas, o anticorpo será purificado até mais de 95% em peso de anticorpo, e mais preferencialmente mais do que 99% em peso. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ nas células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Normalmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos um passo de purificação.

Um anticorpo conjugado pode ligar-se a um epítopo no domínio citoplasmático de uma proteína específica para células cancerígenas (isto é, um marcador de células cancerígenas). Um anticorpo conjugado pode incluir, mas não está limitado a, um anticorpo que se liga a um epítopo no domínio citoplasmático de sF.

Composições farmacêuticas compreendendo a glicoproteína sF

Um outro aspeto da invenção é dirigido a uma composição farmacêutica contendo as glicoproteínas F solúveis da invenção. Os anticorpos e ácidos nucleicos da invenção podem também ser usados como parte de uma composição farmacêutica. As composições geralmente compreendem, a título de exemplo e não de limitação, uma quantidade eficaz de um ácido nucleico ou polipéptido (por exemplo, uma quantidade suficiente para induzir uma resposta imune) da invenção ou anticorpo da invenção (por exemplo, uma quantidade suficiente de um anticorpo neutralizante para atenuar a infeção, aliviar um sintoma de infeção e/ou prevenir a infeção). Os ácidos nucleicos, polipéptidos e anticorpos podem ainda compreender veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes, ou estabilizadores conhecidos na técnica (ver em geral Remington, (2005) The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams e Wilkins).

Os ácidos nucleicos, polipéptidos e anticorpos da presente invenção podem estar na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis podem ser não tóxicos para os recetores nas dosagens e concentrações que são administrados. Os veículos, excipientes ou estabilizantes podem ainda compreender tampões. Exemplos de tampões incluem, mas não estão limitados a, hidratos de carbono (tais como monossacáridos e dissacáridos), açúcares (tais como sacarose, manitol e sorbitol), fosfato, citrato, antioxidantes (tais como ácido ascórbico e metionina) , conservantes (tais como fenol, butanol, benzanol; parabenos de alquilo, catecol, cloreto de octadecildimetilbenzil amónio, cloreto de hexametónio, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol, cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio, e m-cresol), polipéptidos de baixo peso molecular, proteínas (tais como albumina do soro ou imunoglobulinas) , polímeros hidrofílicos de aminoácidos, agentes quelantes (tal como EDTA), contra-iões de formação de sal, complexos de metal (tais como os complexos Zn-proteína), e surfactantes não iónicos (tais como TWEEN™ e polietilenoglicol) . A composição farmacêutica da presente invenção pode ainda compreender agentes adicionais que servem para melhorar e/ou complementar o efeito desejado. A titulo de exemplo, para melhorar a imunogenicidade de uma glicoproteína F solúvel da invenção a ser administrada como uma vacina de subunidades, a composição farmacêutica pode ainda compreender um adjuvante.

Vacinas para Henipavírus

A divulgação é também dirigida para a utilização da glicoproteína sF como agente de vacinação. A formulação de uma vacina ou composição imunogénica irá utilizar uma quantidade eficaz de antigénio polipeptídico. Isto é, irá ser incluída uma quantidade de antigénio que irá fazer com que o sujeito produza uma resposta imunológica específica e suficiente de modo a conferir proteção ao sujeito na exposição subsequente a vírus Hendra ou Nipah. A glicoproteína sF de HeV ou NiV, ou uma sua combinação, pode ser administrada individualmente ou em combinação com um adj uvante.

Os adjuvantes incluem sais de alumínio (alum), Adjuvante Completo de Freund (CFA), Adjuvante de Freund Incompleto (IFA), Muramil dipéptido (MDP), os análogos sintéticos de MDP, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamil-L-alanina-2-[1,2-dipalmitoil-s-glicero-3-(hidroxifosforiloxi)]etilamida (MTP-PE) e composições contendo um óleo metabolizável e um agente emulsionante, em que o óleo e o agente emulsionante estão presentes sob a forma de uma emulsão óleo-em-água tendo gotículas de óleo da emulsão substancialmente todas as quais são menos do que um micron em diâmetro (ver, por exemplo, EP 0399843). O adjuvante pode compreender um ligando do recetor do tipo Toll (TLR) 4, em combinação com uma saponina. O ligando do recetor de tipo Toll (TLR) 4 pode ser, por exemplo, um agonista tal como um derivado do lípido A, em particular monofosforil lípido A ou mais particularmente monofosforil lípido A 3-desacilado (3 D - MPL) . O 3 D - MPL é vendido sob a marca comercial MPL® por Corixa Corporation e principalmente promove respostas de células T CD4+ com um fenótipo IFN-g (Thl) . Pode ser produzido de acordo com os métodos divulgados em GB 2220211A. Quimicamente, é uma mistura de monofosforil lípido A 3-desacilado com 3, 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. As composições podem utilizar pequenas partícula 3 D -MPL. As pequenas partículas 3 D -MPL tem um tamanho de partícula tal que podem ser esterilizadas por filtração através de um filtro de 0,22 ym. Tais preparações são descritas no Pedido de Patente PCT WO 9421292. O adjuvante pode também compreender um ou mais derivados sintéticos do lípido A que são conhecidos como sendo agonistas de TLR 4 incluindo, mas não limitados a: OM174 (2-desoxi-6-o-[2-desoxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetra-decanoilamino]-4-o-fosfοηο-β-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]-a-D- glucopiranosildihidrogenofosfato), como descrito no Pedido de Patente PCT WO 95/14026; OM 294 DP (3S, 9R)-3-[ (R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10-diol, 1,10-bis (dihidrogenofosfato) , como descritos em WO 9964301 e WO 00/0462; e OM 197 MP-Ac DP(3S,9R)-3-[ (R) - dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10-diol, 1-dihidrogenofosfato 10-(6-aminohexanoato) (WO 01/46127).

Outros ligandos de TLR4 incluem, mas não estão limitados a, alquil Glucosaminida fosfatos (AGPs tais como os divulgados em WO 98/50399 ou na Patente dos EUA 6,303, 347 (processos para a preparação de AGPs são também divulgados) , ou sais farmaceuticamente aceitáveis de AGPs como divulgado na Patente EUA 6,764,840. Alguns AGPs são agonistas do TLR4, e alguns são antagonistas do TLR4. Ambos podem ser usados como um ou mais adjuvantes.

Uma saponina preferida pode ser Quil A e seus derivados. Quil A é uma saponina isolada da árvore da América do Sul Quilaja Saponaria Molina e foi descrito pela primeira vez como tendo atividade adjuvante por Dalsgaard et al. (1974) "Saponin Adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, pp. 243-254. Os fragmentos purificados de Quil A foram isolados por HPLC retendo a atividade adjuvante sem a toxicidade associada com a Quil A (EP 0 362 278), por exemplo QS7 e QS21 (também conhecido como QA7 e QA21) . QS21 é uma saponina natural derivada da casca de Quillaja saponaria Molina que induz células T citotóxicas CD8+ (CTLs) , células Thl e uma resposta de anticorpos predominante IgG2a e é a saponina preferida no contexto da presente invenção.

Formulações particulares de QS21 têm sido descritas que são particularmente preferidas, estas formulações compreendendo adicionalmente um esterol (WO 96/33739) . As saponinas podem ser separadas na forma de micelas, micelas mistas (preferencialmente, mas não exclusivamente com sais biliares) ou podem estar sob a forma de matrizes de ISCOM (EP 0109942 Bl) , lipossomas ou estruturas coloidais relacionadas tais como complexos multiméricos tipo helicoidal ou tipo anel ou estruturas lipídicas/camadas e lamelas quando formulados com colesterol e lípido, ou na forma de uma emulsão de óleo em água (por exemplo, tal como em WO 95/17210). As saponinas podem estar associadas com um sal metálico, ou hidróxido de alumínio, tais como fosfato de alumínio (documento WO 98/15287) . A saponina pode ser apresentada sob a forma de um lipossoma, ISCOM ou uma emulsão de óleo em água.

Os adjuvantes podem ser combinações de 3D-MPL e QS21 (EP 0671948 Bl) e emulsões de óleo em água, compreendendo 3D-MPL e QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414). O uso da glicoproteína sF como uma vacina de subunidades está contemplado. Uma vacina de subunidades refere-se à utilização de um fragmento de um vírus como um agente de inoculação. Os peritos na técnica terão conhecimento de vacinas de subunidades que oferecem um meio para gerar anticorpos contra uma parte ou região particular de um vírus. A título de exemplo, uma forma recombinante de um recetor de superfície de um vírus pode servir como vacina de subunidade. Uma vacina de subunidades compreendendo a glicoproteína F solúvel de HeV ou NiV, ou suas combinações, podem ser administrada por vias oral, intravenosa, subcutânea, intra-arterial, intramuscular, intracardial, intraespinal, intratorácica, intraperitoneal, intraventricular, sublingual, e/ou transdérmica. Esquema de dosagem de administração e a eficácia de vacinas de subunidades pode ser determinado por métodos conhecidos na técnica.

Método de utilização de formas solúveis da glicoproteína F

Um aspeto da presente invenção é dirigido para a deteção de NiV e/ou HeV. Aspetos da presente divulgação referem-se ao tratamento e prevenção de NiV e/ou HeV. Um animal pode receber tratamento e/ou prevenção e/ou deteção de NiV e/ou HeV. 0 animal pode ser um ser humano. Os polipéptidos da presente invenção podem ser utilizados para produzir anticorpos in vivo contra NiV e/ou HeV. Os polipéptidos da presente invenção podem ser utilizados para determinar se um sujeito produz anticorpos contra NiV e/ou HeV. 0 polipéptido pode ser utilizado para isolar anticorpos. Os polipéptidos podem ser ligados a uma matriz de afinidade.

Os ácidos nucleicos podem ser utilizados para transformar e/ou transfectar células para produzir recombinantemente os polipéptidos e/ou anticorpos. Os ácidos nucleicos podem adicionalmente ser utilizados para tratar um sujeito infetado. Os ácidos nucleicos podem ser utilizados na inibição da expressão genética. Os ácidos nucleicos podem ser utilizados para determinar se um sujeito está infetado com NiV e/ou HeV. Isto pode ser conseguido utilizando métodos de hibridação de marcação radioativa.

Os anticorpos podem ser utilizados para reconhecer uma infeção por NiV e/ou HeV. Os anticorpos podem reconhecer glicoproteína nativa F como um antigénio. Os anticorpos podem ser também usados para combater uma infeção por NiV e/ou HeV. Os anticorpos humanizados ou anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpos podem empregar uma resposta imunitária própria de um sujeito a uma infeção de NiV e/ou HeV. Os anticorpos podem ser acoplados a uma citocina ou uma toxina ou uma enzima ou um marcador para auxiliar no tratamento e deteção de uma infeção.

Um aspeto da presente invenção refere-se a ensaios de diagnóstico. Muitos tipos de ensaio são conhecidos na técnica. Os especialistas na técnica reconhecerão a grande variedade de utilização da investigação baseada em polipéptidos, ácidos nucleicos e anticorpos. Polipéptidos, anticorpos e ácidos nucleicos podem ser, por exemplo, ser marcados, tal como com uma molécula radioativa, quimiluminescente, fluorescente e/ou de corante. Os anticorpos, ácidos nucleicos e polipéptidos são utilizados em ensaios, por exemplo, ensaios de ADN (tais como Southern blot) , ensaios de ARN (tais como Northern blot), ensaios de proteína (tais como Western blot), ensaios cromatográficos (tais como gás, líquido, HPLC, de exclusão por tamanho) , imunoensaios (tais como ELISA) e ensaios estruturais (tais como cristalografia e espectroscopia de RMN). Os anticorpos, polipéptidos e ácidos nucleicos podem adicionalmente ser utilizados como sondas. Os ensaios que amplificam os sinais de uma sonda são conhecidos dos peritos na técnica.

Kits de diagnóstico compreendendo formas solúveis da glicoproteína F

Outro aspeto da divulgação é dirigido para o uso da glicoproteína sF como parte de um kit utilizado para detetar a presença do vírus Hendra ou Nipah. Os kits podem incluir um ou mais recipientes compreendendo a título de exemplo, e não como limitação, ácidos nucleicos que codificam uma glicoproteína sF de HeV ou NiV ou suas combinações, uma glicoproteína sF de HeV ou NiV ou suas combinações e/ou anticorpos, e instruções para utilização das glicoproteinas sF e/ou anticorpos podem ser utilizados em uma variedade de imunoensaios para o virus Hendra e Nipah. A glicoproteina sF recombinante pode servir para funcionar como um antigénio para objetivo de anticorpo de deteção em amostras biológicas. Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens de conjunto (por exemplo, embalagens multidose) ou doses subunidade. Os kits podem estar em embalagens apropriadas. Também contemplados são embalagens para uso em combinação com um dispositivo especifico, tal como um inalador, dispositivo de administração nasal ou um dispositivo de infusão. Um estojo pode ter uma porta de acesso estéril. 0 recipiente pode também ter uma porta de acesso estéril. Os kits podem opcionalmente fornecer componentes adicionais tais como tampões e informação interpretativa.

Os seguintes exemplos práticos apontam formas de realização ilustrativas da invenção e não são para ser interpretados como limitando de qualquer forma o restante da divulgação.

EXEMPLOS

Todas as construções sF descritas nos exemplos abaixo foram manipuladas usando uma versão modificada do vetor de expressão disponível comercialmente pcADN 3.1 Hygo (+) (Invitrogen Corp.). 0 marcador de seleção de Higromicina permite a seleção de células transfectadas com sucesso na presença do antibiótico Higromicina B. 0 pcADN3.1 Hygro (+) foi modificado por incorporação da região promotora melhorada de citomegalovírus (CMV) de pHCMV (Gelantis). Este promotor de CMV melhorado permite a expressão elevada das sequências inseridas na estrutura base do vetor pcADN3.1 Hygro (+). A adição da sequência de ácidos nucleicos que codifica para uma sequência péptido S (SEQ ID NO:5) facilita a purificação da glicoproteina sF libertada. Outras sequências de ácidos nucleicos que foram introduzidas em algumas versões resultariam na codificação de regiões peptídicas adicionais tais como o local de clivagem de GPI-Fosfolipase D (SEQ ID N0:7), um motivo GCN4 trimérico (SEQ ID NO:9) e local de clivagem do Fator Xa (SEQ ID N0:11). As construções de plasmídeos de expressão foram geradas com estas sequências de ácidos nucleicos e usadas para gerar linhas celulares estáveis que expressam as várias versões das proteínas. A sequência de 13 aminoácidos do péptido S (Novagen) foi adicionada ao terminal C em todas as construções. A expressão do péptido S facilita a purificação por agarose da proteína S (Novagen), bem como imunodeteção por anticorpos anti-péptido S.

Exemplo 1: produção do trímero da glicoproteina sF de HeV e deteção por cromatografia de exclusão de tamanho

Materiais e Métodos. As células 293T foram transfectadas com o vetor pcADN 3.1 Hygro (+) modificado contendo uma inserção para codificar os primeiros 488 aminoácidos da glicoproteina F de HeV, seguido por uma sequência péptido S. A seleção para a transfecção foi efetuada utilizando

Higromicina B, e as células sobreviventes foram mantidas na presença de Higromicina utilizando protocolos padrão de cultura de tecidos. As células e os meios foram colhidos por protocolos padrão. As soluções resultantes foram analisadas por cromatografia de exclusão de tamanho, utilizando uma coluna de filtração com gel Superdex™ 200 10/300, com frações colhidas de 400 yL.

Resultados. O perfil de eluição por filtração em gel mostra um pico putativo do trimero que elui a ~ 299 kDa. As espécies de pesos moleculares mais elevados com um pico de ~ 552 kDa, e agregados maiores que eluem perto do volume vazio (Vo) (Figura 1).

Exemplo 2: Produção da glicoproteína sF de NiV por clivagem da Fosfolipase D

Materiais e métodos. Como a secreção da sF nativa de NiV era baixa, uma versão modificada da sF de NiV foi manipulada, por meio de que uma sequência sinal para a âncora de glicoilfosfatidilinositol (GPI) foi acrescentada à sequência de nucleótidos da sF de NiV. As células HeLa-PLD são uma versão modificada das células HeLa que expressam de forma estável Fosfolipase D (PLD) (Mann (2004) Biochem. J. 378:641-648). A PLD cliva então especificamente uma ligação fosfoglicerol em proteínas ancoradas a GPI. Isto resulta na libertação de proteínas ligadas a GPI da âncora na membrana. Este mecanismo leva à secreção de GPI da sF de NiV de células HeLa de GPI previamente ancorada.

As células HeLa-PLD foram transfectadas com o vetor modificado pcADN 3.1 Hygro (+) contendo uma inserção para codificar para os primeiros 488 aminoácidos da glicoproteína F de NiV, seguida por uma sequência péptido S e, em seguida, uma sequência GPI para permitir a clivagem PLD. A seleção para a transfecção foi efetuada utilizando Higromicina B, e as células sobreviventes foram mantidas na presença de Higromicina utilizando protocolos padrão de cultura de tecidos. As células e os meios foram colhidos por protocolos padrão. As soluções resultantes foram analisadas por cromatografia de exclusão de tamanho, utilizando uma coluna de filtração com gel Superdex™ 200 10/300, com frações colhidas de 400 yL. Amostras de 5 pL de cada fração foram desnaturados e analisadas por BN-PAGE. O gel resultante foi transferido para uma membrana, e seguindo protocolos padrão de bloqueio e de lavagem, foi marcada com anticorpos contra a sequência de péptido S conjugados com HRP para permitir a deteção quimiluminescente padrão.

Resultados. O perfil de eluição da filtração em gel da construção GPI sF de NiV mostra um pico putativo do trimero que elui a ~ 186 kDa, espécies de peso molecular mais elevado com um pico de ~ 357 kDa e agregados maiores que eluem perto do volume vazio (Vo) (Figura 2A).

Exemplo 3: estabilização de trímeros das glicoproteínas sF de HeV e NiV por motivo gcn4

Materiais e Métodos. As células 293T foram transfectadas com o vetor pcADN 3.1 Hygro (+) modificado contendo uma inserção para codificar os primeiros 488 aminoácidos da glicoproteína F de NiV ou HeV, seguido por sequência GCN, em seguida uma sequência de clivagem do Fator Xa e em seguida uma sequência péptido S. A seleção para a transfecção foi efetuada utilizando Higromicina B, e as células sobreviventes foram mantidas na presença de Higromicina utilizando protocolos padrão de cultura de tecidos. As células e os meios foram colhidos por protocolos padrão. As soluções resultantes foram analisadas por cromatografia de exclusão de tamanho, utilizando uma coluna de filtração com gel Superdex™ 200 10/300, com frações colhidas de 400 yL. Amostras de 5 yL de cada fração foram desnaturados e analisadas por BN-PAGE. O gel resultante foi transferido para um papel de nitrocelulose, e seguindo protocolos padrão de bloqueio e de lavagem, foi marcado com anticorpos contra a sequência de péptido S conjugados com HRP para permitir a deteção quimiluminescente padrão.

Resultados. Expressão e secreção das glicoproteínas sF de HeV e NiV contendo um motivo GCN4 foi melhorada em pelo menos 10 vezes do que as suas células do tipo selvagem sF respetivas. Isto indica que o motivo GCN4 afeta a otimização do codão e estabilização da sF.

As diferenças podem ser observadas nos perfis de eluição entre a sF do tipo selvagem e a sF-GCN. As espécies oligoméricas maiores observadas nos perfis de sF de tipo selvagem estavam ausentes em sF-GCN. Espécies agregadas maiores e um único pico de trimero putativo que eluiu a cerca de 327 e 30 6 kDa foi observado para sF-GCN de HeV e NiV, respetivamente (Figura 3A e a Figura 4A) . As espécies agregadas para sF-GCN de HeV eram muito menos em comparação com todas as outras sF. Isto sugere que a estabilização do trimero pelo motivo GCN elimina espécies oligoméricas maiores que se apresentam na sF não GCN. A análise em gel nativo utilizando o sistema PAGE Blue Native (BN) (Invitrogen) de todas as sF e as frações de todas as filtrações em gel mostram tamanhos correspondentes das espécies de trimeros (Figuras 2-4B e Figura 5), exceto para GPI sF de NiV, gue tem uma massa molecular aparente maior em gel Nativo quando comparada com a análise por filtração em gel (Figura 4).

Exemplo 4; Glicoproteínas sF de HeV e NiV são imunogénicas em ratinhos e podem provocar respostas de anticorpos policlonais cruzadas e neutralizantes

Materiais e Métodos. As sF de HeV marcadas com S e sF-GCN, e sF-GPI de NiV marcadas com S e sF-GCN foram usadas para imunizar ratinhos Balb/C. Cada ratinho foi sangrado antes da imunização para obter soro de controlo negativo. Cada ratinho foi sensibilizado e reforçado 3 vezes com preparações diferentes de sF como indicado na Tabela 1. Cada imunização foi realizada 10 lag de proteina usando TiterMax® Gold Adjuvant (Sigma) com intervalos de 28 dias. Os ratinhos foram sangrados 10 dias após imunização e amostras de soro foram colhidas. O soro recolhido do segundo e terceiro reforço foi combinado e analisado por ELISA. O soro de ratinho imunizado com sF foi também testado para a capacidade para imunoprecipitar a F comprimento total não marcada de HeV e NiV. O soro de ratinho imunizado com sF foi também testado para a capacidade de neutralizar viriões retrovirais repórter de luciferase do pseudotipo NiV.

Anticorpo com reatividade cruzada especifico da F de HeV e NiV foi observado em todos os ratinhos, tal como indicado no ensaio de ELISA (Figura 6A e 6B) e como demonstrado pelo ensaio de imunoprecipitação conduzidos com F de comprimento total de HeV e NiV (Figura 7) . Uma resposta mais baixa de titulo do anticorpo contra a cauda GCN foi evidente quando uma proteína não relacionada (glicoproteína-GCN do envelope do HIV-1) foi usada para revestir a placa (Figura 5C) . Os ratinhos imunizados com a sF não GCN não mostraram reatividade contra GCN do envelope do HIV-1. Anticorpos de neutralização e de neutralização de reatividade cruzada foram também gerados como indicado pela neutralização do gene que codifica a luciferase de retrovirus pseudotipado com ensaio F e G de NiV. 0 ensaio foi realizado usando diluições de soro (Tabela 2) de ratinhos imunizados com as glicoproteínas sF-GCN para bloquear a entrada do vírus vivo NiV e HeV (Figura 8) . Isto também indica que os ratinhos imunizados com estas preparações de sF podem ser utilizados para gerar anticorpos monoclonais específicos de murino para F, alguns dos quais são esperados ter reatividade cruzada. Os resultados indicam que as preparações da glicoproteína sF são imunogénicas, irão induzir anticorpos que podem reconhecer as glicoproteínas F nativas de comprimento total, irão induzir anticorpos com reatividade cruzada e irão induzir anticorpos neutralizadores do vírus com reatividade cruzada quando administradas como uma vacina. Além disso, os dados indicam que a sF pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico para a deteção de anticorpos anti-HeV ou anti-NiV de fontes animais ou humanas.

Tabela 1: Resumo das diferentes imunizações de ratinho com diferentes preparações de proteína sF. Ratinhos Balb/c foram sensibilizados com o antigénio indicado e, subsequentemente, 3 vezes um reforço com um antigénio sF de proteína S diferente purificada por afinidade (em alguns casos, o marcador péptido S foi removido), com intervalos de 28 dias. Os ratinhos foram sangrados 10 dias após cada imunização de reforço. O soro foi recolhido e combinado.

Tabela 2: Neutralização do soro de NiV e HeV. O soro de ratinhos imunizados com as proteínas indicadas foi diluído em série numa placa de 96 poços em EMEM e misturado com 200 TCID50 quer de HeV ou NiV durante 30 min a 37 °C. Células Vero 2 x 104 foram adicionadas a cada poço, incubadas durante 3 dias a 37 °C e observadas para os sinais de efeito citopático viral (CPE). O título do soro foi determinado como a diluição mais elevada na qual CPE virai foi completamente neutralizado.

Exemplo 5: Experiências de equilíbrio de sedimentação

Materiais e Métodos. Medições de ultracentrifugação analítica foram realizadas numa ultracentrifuga analítica Beckman XL-A Optima com um rotor An-60 Ti a 4 °C. As amostras de proteína foram dialisadas durante a noite contra PBS com tampão Triton X-100 a 0,01%, carregado em concentrações iniciais de 0,75, 1,5 e 3 mg/mL, e analisadas a velocidades de rotor de 6000 e 7500 rpm. Os dados foram adquiridos em dois comprimentos de onda por cada velocidade do rotor e foram ajustados utilizando o programa NONLIN para um modelo de uma única espécie do logaritmo natural da absorvância em função da distância radial ao quadrado. (Johnson et al. (1981) Biophys. J. 36 (3):575-88). A densidade do solvente e parâmetros de volume específicos parciais de proteínas foram calculados tendo em conta solvente e a composição de proteína, respetivamente. (Laue et al. (1992), Royal Society of Chemistry, Cambridge, Reino Unido).

Resultados. As medições de equilíbrio de sedimentação foram realizadas para determinar o estado oligomérico da purificada sF GCN de HeV. A proteína é trimérica, com uma massa molecular aparente de ~ 215 kDa (Figura 9). Não havia nenhuma dependência sistemática da massa molecular aparente da concentração de proteína ao longo de um intervalo de 4 vezes da concentração da proteína em estudo. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <11Q> Brocier, Christopher C Chan, Yee-Peng c 120> Formas Solúveis de glicoproteína F do Virus Bendra e Nipah e Suas Utilizações

<130» 044508-5020-WO <150» US 61/006,107 <151> 2807-12-19 <160- 12 <170> Patent in versão 3.4 <210» 1 <211»1464 <212» DMA <213» Virus Hsridra <400» 1 atggctacac aagaggtcag gctaaagtgt ttgctctgtg ggatcatagt tctggttttg 60 tcattagaag ggctagggat actacattat gagaaactta gtaagatagg gctggttaaa 120 ggtattacaa gaaagtacaa gattaagagt aaccctttga ccaaggatat tgtgatcaaa 180 atgatcccta atgtctcgaa tgtctcaaag tgcaeeggga ctgttatgga gaattaeaaa 240 agcagactca cagggattcc ctcaccsatc aaaggcgcca tcgaactgta caataataac 300 acgcatgacc tagttggtga tgtcaagctt gcaggtgtgg tgatggcagg gattgcaatc 360 gggatagcta ctgctgcaca aatcacagca ggtgttgcct tatatgaggc aatgaagaac 420 gcagacaata tcaataaact caagagcagc atagagtcta caaatgaggc tgttgfccaaa 480 ttacaggaaa cagctgagaa aacagtctac gtccttactg ctcttcaaga ttacatcaac 540 actaaccttg ttcctacaat agatcaastt agctgcaagc aaacagagct cgcattagac 600 ttggegttgt ctaagtatct gtctgatctg ctctttgttt tcggacctaa cttacaggat 660 ccagtctcta attccatgac tatccaagca atatctcaag catttggggg caattacgaa 720 accttactga gaacgcttgg ttacgcgacc gaggacttcg acggcctttt agaaagtgat 780 agcataacag gccagatagt ctatgtagat ctcagtagct attaeataat agtaagggtg 840 tattttccca tactaacaga gatccaacag gcfctatgtgc aggagttgct tccagtgagt 900 tttaataacg ataattcaga atggatcagc attgtcccga atttcgtgct gattaggaac 960 acgctgattt caaatataga agtcaagtac tgcttaatca ccaagaaaag tgtgatttgt 1020 aatcaggact atgctacacc catgacggct agcgtgagag aatgcttgac aggatccaca 1080 gataagtgcc caagggagtt agtagtctca tcccatgttc caagatttgc cctctcagga 1140 ggagtettgt ttgcaaattg tataagtgtg acatgtcagt gteagactac tgggagggca 1200 atatctcaat caggggaaca gacactactg atgattgaca atactacctg cacaacagtt 1260 gttctaggaa acataatcat aagccttgga aaatatttgg gatcaataaa ttacaattct 1320 gagagcattg ctgttgggcc accagtctat acagacaaag ttgatatctc aagtcagata 1380 tctagtstga atcaatcact acaacaatct aaggattaca ttaaagaagc tcaaaagatc 1440 ttggacactg tgaatccgtc gttg 1464

<21Q> 2 ¢211 >488 <2t2> PRT <213> Virus Kendra

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Val Ser Ser His Val Pro Arg Phe Ala Leu Ser Asn Sly Val Leu Phe 370 375 380

Ala Asn Cys Tie Ser Val Thr Cys Gin Cys Gin Thr Thr Gly Arg Ala 385 390 395 400 fie Ser Gin Ser Gly Glu Gin Thr Leu Leu Met He Asp Asn Thy Thr 405 410 415

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<223>Sequência de nucleótidos para péptido S <4QG> 5 aagga gaccg ctgcigctaa gtiegaaege cagcacatgg afiertga 48 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificiai <220>

<223> Sequência de aiainoãcidos para péptido S <4Q0> 6

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<223> Sequência de nucleotides para GPI «400»7 atcgatccaa ataaaggaag tggaaccact tcaggtacta cccgtcttct atctgggcac 60 acgtgtttca cgttgacagg tttgcttggg aegetagtaa ccatgggctt gctgact 117 <218»8 «211» 39 «212» PRT <213» Artificia! <228»

<223» Sequência de aríinoácidos para GPI «408» 8 lie Asp Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu 15 10 15

Leu Ser Gly Bis Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu 20 25 30

Vai Thr Met Gly Leu Leu Thr 35 «210» 9 «211» 93 «212» DNA <213» Artificial «220» <223» Sequência de nucleótidos para GCN4 <400» 9 atgaagcaga tegaggacaa gatcgaggag atcctgagca agatctacca catcgagaac 60 gagatcgcca ggateaagaa gctgatcggc gag 93 <21 S> 10 <211 >31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sequência de araincácidos para GCN4 <400> 10

Met Lys Gin lie Glu Asp Lys He Glu Glu He Leu Ser Lys He Tyr 1 5 10 15

His He Glu Asn Glu He Ala Arg He Lys Lys Leu He Gly Glu 20 25 30

«210 11 <211>12 «212» DNA <213> Artificiai <220> <223> Sequência de nucleotides para Fetor Xa <400> 11 ategagggea gg 12 <210> 12 <211> 4 <212* PRT <213> Artificiai <220> <223> ,Sequência de aminoàcidos para Fator Xa

He Glu Gly Arg 1

Lisboa, 7 de junho de 2017

Claims (14)

REIVINDICAÇÕES

1. Um polipéptido isolado compreendendo uma forma antigénica solúvel da glicoproteína F de Vírus Hendra, em que o polipéptido compreende os aminoácidos 1 a 488 da SEQ ID NO:2, ou uma forma antigénica solúvel da glicoproteína F do Vírus Nipah, em que o polipéptido compreende os aminoácidos 1 a 488 da SEQ ID NO:4.

2. 0 polipéptido isolado de acordo com a reivindicação 1, em que o polipéptido é fundido com um segundo polipéptido.

3. 0 polipéptido isolado de acordo com a reivindicação 2, em que o segundo polipéptido compreende um polipéptido selecionado do grupo que consiste em: um epítopo péptido S, um local de clivagem Fator Xa e um domínio de trimerização.

4. 0 polipéptido isolado de acordo com a reivindicação 3, em que o domínio de trimerização é a SEQ ID NO:10.

5. Uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Uma composição farmacêutica compreendendo o polipéptido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

7. Um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio gue liga especificamente o polipéptido, de acordo com qualguer uma das reivindicações 1 a 4.

8. Uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo, de acordo com a reivindicação 7, e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

9. Um kit de diagnóstico para detetar uma infeção de Henipavirus num sujeito compreendendo o polipéptido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou o anticorpo, de acordo com a reivindicação 7.

10. Um método de deteção de Henipavirus numa amostra biológica compreendendo pôr em contato uma amostra biológica com i) o anticorpo, de acordo com a reivindicação 7, e detetar a ligação do anticorpo, em que a ligação do anticorpo é indicativa da presença de Henipavirus na amostra biológica, ou ii) o polipéptido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e detetar a ligação do polipéptido, em que a ligação do polipéptido é indicativa da presença de Henipavirus na amostra biológica.

11. Um polipéptido isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, para utilização como um medicamento.

12. Um polipéptido isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, para utilização na prevenção de infeção por um Henipavirus.

13. Um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga especificamente ao polipéptido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, para utilização como um medicamento.

14. Um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga especificamente ao polipéptido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, para utilização no tratamento ou prevenção da infeção por um Henipavirus. Lisboa, 7 de junho de 2017