PT2046831E

PT2046831E - Novas imunoglobulinas polivalentes

Info

Publication number: PT2046831E
Application number: PT07718518T
Authority: PT
Inventors: Florian Rueker; Gottfried Himmler; Gordana Niak-Knopp
Original assignee: Star Biotechnologische Forschungs Und Entwicklungsges M B H F
Priority date: 2006-07-05
Filing date: 2007-06-26
Publication date: 2012-04-24
Also published as: PL2046831T3; EP2046831A2; JP6681855B2; EP2046831B1; ES2380127T3; CN110041430A; JP5924751B2; JP2013240338A; AT503889B1; SI2046831T1; WO2008003103A3; PL2463302T3; JP6215603B2; AT503889A1; US11827720B2; WO2008003103A2; HUE025035T2; DK2463302T3; JP2017163998A; EP2463302B1

Description

Descrição

NOVAS IMUNOGLOBULINAS POLIVALENTES A presente invenção providencia uma imunoglobulina polivalente ou parte da mesma que se liga especificamente a, pelo menos, duas moléculas de superfície celular de uma única célula, com pelo menos uma modificação em, pelo menos, uma região de alça estrutural da dita imunoglobulina, determinando a ligação a um epítopo das ditas moléculas de superfície celular em que a imunoglobulina não modificada não liga significativamente ao dito epítopo.

Os anticorpos monoclonais são úteis em muitas aplicações terapêuticas, analíticas e diagnósticos. A estrutura de anticorpo básica será aqui explicada usando como exemplo uma imunoglobulina IgGl intacta. Duas cadeias pesadas (H) idênticas e duas leves (L) idênticas combinam para formar a molécula anticorpo em forma de Y. As cadeias pesadas têm cada uma delas quatro domínios. Os domínios amino-terminais variáveis (VH) estão nas pontas do Y. Estes são seguidos por três domínios constantes. CHI, CH2, e o C-terminal CH3, na base da haste do Y. Um curto conector, liga a cadeia pesada variável e regiões constantes. A articulação liga CH2 e CH3 (o fragmento Fc) ao restante do anticorpo (os fragmentos Fab). Um fragmento Fc e dois fragmentos Fab idênticos podem ser produzidos por clivagem proteolítica da articulação numa molécula de anticorpo intacta. As cadeias leves são constituídas por dois domínios, variável (VL) e constante (CL), separados por um conector.

As ligações dissulfureto na região da articulação ligam as duas cadeias pesadas. As cadeias leves são acopladas às cadeias pesadas por ligações dissulfureto adicionais. As partes de hidratos de carbono ligadas por Asn são fixas em diferentes posições em domínios 1/112 constantes dependendo da classe da imunoglobulina. Para IgGl, duas ligações dissulfureto na região da articulação, entre os pares Cys235 e Cys238, unem as duas cadeias pesadas. As cadeias leves são acopladas às cadeias pesadas por duas ligações dissulfureto adicionais, entre Cys229s nos dominios CHI e Cys214s nos domínios CL. As partes de hidratos de carbono são fixas a Asn306 de cada CH2, gerando uma protuberância pronunciada na haste do Y.

Estas características aprofundaram consequências funcionais. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves (VH) e (VL) permanecem nas "pontas" do Y, onde estão posicionadas para reagir com o antígeno. Esta ponta da molécula é o lado no qual o N-terminal da sequência de aminoácido está localizado. A haste do Y projecta-se de uma forma a mediar eficazmente funções efectoras, tais como a activação de complemento e interacção com os receptores Fc, ou ADCC e ADCP. Os seus domínios CH2 e CH3 tornam-se salientes para facilitar a interacção com proteínas efectoras. 0 C-terminal da sequência de aminoácido está localizado no lado oposto da ponta, a qual pode ser denominada "parte inferior" do Y.

Dois tipos de cadeia leve, chamados lambda (λ) e kappa (k) são encontrados nos anticorpos. Uma dada imunoglobulina ou tem cadeias κ ou cadeias λ, nunca uma de cada. Não foi encontrada nenhuma diferença funcional entre anticorpos com cadeias leves λ ou κ.

Cada domínio numa molécula de anticorpo tem uma estrutura semelhante de duas folhas beta colocadas juntamente uma contra outra numa barril beta antiparalelo comprimido. Esta estrutura conservada é chamada de dobra da imunoglobulina. A dobra da imunoglobulina de domínios constantes contém uma folha de 3 cadeias colocada contra uma folha de 4 folhas. A dobra é estabilizada por ligação de hidrogénio entre as cadeias beta de cada folha, por ligação hidrofóbica entre resíduos de folhas opostas no interior, e por uma ligação dissulfureto entre as folhas. A folha de 3 cadeias 2/112 compreende cadeias C, F, e G, e a folha de 4 cadeias tem cadeias A, B, E, e D. As letras A até G denotam as posições sequenciais das cadeias beta ao longo da sequência de aminoácido da dobra da imunoglobulina. A dobra de domínios variáveis tem 9 cadeias betas colocadas em duas folhas de 4 e 5 cadeias. A folha de 5 cadeias é estruturalmente homóloga à folha de 3 cadeias de domínios constantes, mas contém as cadeias extra C' e C". As restantes cadeias (A, B, C, D, E, F, G) têm a mesma topologia e estrutura semelhante como as suas contrapartes em dobras de imunoglobulina em domínio constante. A ligação dissulfureto liga as cadeias B e F às folhas opostas, como nos domínios constantes.

Os domínios variáveis das cadeias de imunoglobulina leves e pesadas contêm três alças hipervariáveis, ou regiões determinantes de complementaridade (CDR). As três CDR de um aglomerado de domínio V (CDRl, CDR2, CDR3) numa extremidade do barril beta. As CDR são alças que ligam cadeias beta B-C, C’-C", e F-G da dobra de imunoglobulina. Os resíduos nas CDR variam de uma molécula de imunoglobulina para a seguinte, transmitindo a especificidade do antígeno para cada anticorpo.

Os domínios VL e VH nas pontas das moléculas de anticorpo são colocados juntamente, de tal forma que as 6 CDR (3 em cada domínio) cooperam na construção de uma superfície (ou cavidade) para ligação específica do antígeno. 0 local de ligação do antígeno natural de um anticorpo é, desta forma, composto por alças que ligam cadeias B-C, C'-C ', e F-G do domínio variável de cadeia leve e cadeias B-C, C'-C'', e F-G do domínio variável de cadeia pesada.

As alças que não são alças CDR numa imunoglobulina nativa, ou não fazem parte da bolsa de ligação de antígeno como determinado pelas alças do CDR, não têm especificidade de ligação de antígeno ou 3/112 ligação de epítopo, mas contribuem para a dobra correcta de toda a molécula de imunoglobulina e/ou as suas funções efectoras ou outras e são, por isso, chamadas de alças estruturais para efeitos desta invenção. Documentos da técnica anterior mostram que a estrutura tipo imunoglobulina tem sido utilizada até agora para efeitos de manipulação do local de ligação de antigeno existente, por isso introduzindo novas propriedades de ligação. Contudo, até agora, apenas as regiões CDR foram criadas para a ligação de antigeno, por outras palavras, no caso da dobra da imunoglobulina, apenas o local de ligação de antigeno natural foi modificado no sentido de alterar a sua afinidade ou especificidade de ligação. Existe um vasto corpo de literatura, o qual descreve formatos diferentes de tais imunoglobulinas manipuladas, frequentemente expressas na forma de fragmentos Fv de cadeia única (scFv) ou fragmentos Fab, dispostos na superfície de partículas de fago ou soluvelmente expressas em vários sistemas de expressão procarióticos ou eucarióticos. 0 documento PCT/EP2006/050059 descreve um método para conceber uma imunoglobulina que compreende uma modificação numa região de alça estrutural para obter novos locais de ligação de antigeno. Este método é amplamente aplicável a imunoglobulinas e pode ser usado para produzir uma série de imunoglobulinas que se destinam a uma variedade de antígenos. Ligantes polivalentes de alvos de superfície celular não são explicitamente descritos. 0 documento US2005/266000A1 descreve polipéptidos que compreendem um domínio de estrutura variável de cadeia pesada variante (VFR). Um VFR é a parte da bolsa ou sulco de ligação do antigeno que pode contactar o antigeno. Os VFR fazem parte da região de alça da CDR e estão localizados num domínio variável no lado das alças da CDR para suportar a ligação de antigeno através da região de alça da CDR. As alças de estrutura, que não os VFR, não sofreram mutações para efeitos de concepção de um local de ligação de antigeno. 4/112

As proteínas de superfície celular associadas aos cancros humanos, podem ser alvos eficazes para terapia monoclonal. Os anticorpos podem obter respostas anti-tumorais por activação celular modular ou através de recrutamento do sistema imunitário.

Alguns mAbs exercem parte do seu efeito na reticulação do alvo, que podem agrupar os alvos e resultam na activação, inibição, ou amplificação da sinalização celular, finalmente terminando em paragem celular e/ou apoptose para o alvo celular.

Tem sido demonstrado que alguns MAbs (anti-CD19, -CD20, - CD21, e -CD22) que têm pouca ou nenhuma actividade anti-crescimento inerente nas linhas celulares de linfoma, podem ser convertidos em potentes agentes anti-tumorais ao usá-los como homodímeros tetravalentes. Estas actividades podem ser melhoradas in vivo através do recrutamento de células efectoras e/ou complemento.

Outra estratégia usada para mAbs terapêuticos destina-se a unir um medicamento citotóxico ao mAb. Tal imunotoxina pode ligar-se à superfície celular alvo seguida por internalização, libertando o medicamento para matar a célula. Pode ser necessária agregação do alvo como um pré-requisito para a internalização.

Para melhorar a potência dos mAbs que exercem o seu efeito através da aglomeração das moléculas alvo, foram criados vários formatos Ab polivalentes. Foram criados os IgGs de comprimento total ligados de forma covalente que formam Abs tetravalentes e os IgM e IgG Abs que ocorrem de forma natural que imitam IgM e IgA poliméricos através do uso da sua extremidade secretora. Outro formato tetravalente foi criado ao adicionar Fab no C-terminal de cada cadeia H de um IgG de comprimento total.

Para melhorar a penetração no tumor, construtos mais pequenos que usam fragmentos Fv (scFv)2 de cadeia única (cada Fv consistindo de 5/112 domínios leves variáveis e pesados variáveis ligados por ligantes peptídeos) têm sido unidos para formar complexos polivalentes. Tais construtos podem ter meias-vidas relativamente curtas (em comparação com aquelas dos mAbs de comprimento total), consequentemente, isto foi tratado ao adicionar estes multímeros sCFv aos fragmentos IgG Fc. Com scFv e formatos semelhantes é difícil controlar a formação do grau exacto de multimerização, isto é, dímeros, trímeros, tetrâmeros e complexos maiores podem formar-se em vários rácios dependendo do construto básico e 0 documento W02006/036834A descreve moléculas e métodos nos quais péptidos biologicamente activos são incorporados numa região de alça do domínio Fc. 0 documento WOOl/83525 A descreve uma fusão dos domínios Fc com péptidos biologicamente activos para aumentar as meias-vidas in vivo dos péptidos.

Adachi Masaaki et. al. (Protein Science, Cambridge University Press, Cambridge, GBvol. 12, no. 10 (2003) 2125-2131) descreve a modificação de CL-CH1 para controlar a afinidade antígeno-anticorpo do Fv. O documento WO02/32925 A descreve bibliotecas de fragmentos de fibronectina com alças tipo CDR aleatórias nos domínios variáveis.

Qualquer um dos formatos conhecidos para produzir imunoglobulinas polivalentes tem certas desvantagens, sejam problemas de imunogenicidade, meia-vida in vivo ou produção. É objecto da presente invenção providenciar um sistema modular que permite conceber uma imunoglobulina polivalente alvo de acordo com 6/112 a necessidade respectiva, para resolver problemas da técnica anterior.

Breve descrição da invenção: A presente invenção providencia domínios de imunoglobulina que ligam às proteínas de superfície celular através de alças estruturais modificadas para providenciar ligação adicional às moléculas de superfície celular, permitindo assim reticulação de receptores de superfície celular.

De acordo com a presente invenção, uma imunoglobulina polivalente, ou parte de ligação da mesma, é provida que se liga especif icamente a, pelo menos, duas moléculas de superfície celular de célula única, em que a imunoglobulina é ligada especificamente a, pelo menos, o primeiro epítopo e é compreendida em, pelo menos, uma modificação em, pelo menos, uma região de alça estrutural CH3 da dita imunoglobulina, resultando numa substituição, eliminação e/ou inserção de um ou mais nucleótidos ou aminoácidos para introduzir um novo local de ligação de antígeno que liga a uma molécula de superfície celular, cujo epítopo inclui estruturas de propriedades antigénicas, localizadas numa única célula ou disponíveis numa população de células homogéneas, em que a imunoglobulina não modificada não liga significativamente ao dito epítopo.

De acordo com a presente invenção, a imunoglobulina polivalente inventiva pode ser ainda combinada com uma ou mais imunoglobulinas modificadas ou com imunoglobulinas não modificadas, ou partes das mesmas, para obter uma combinação de imunoglobulina.

Preferivelmente, a modificação do domínio da alça estrutural no nucleótido ou sequência de aminoácido é uma eliminação, uma substituição, uma inserção ou uma combinação das mesmas. 7/112 A presente invenção também providencia um ácido nucleico que codifica a imunoglobulina inventiva ou parte da mesma e um método para conceber uma imunoglobulina polivalente de acordo com a invenção que compreende os passos de: - Providenciar um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina que se liga especificamente ao, pelo menos, um epitopo e compreendendo, pelo menos, uma região de alça estrutural CH3, - Modificar, pelo menos um resíduo nucleótido de, pelo menos, uma região de alça estrutural CH3 codificada pelo dito ácido nucleico, - Transferir o dito ácido nucleico modificado num sistema de expressão, - Expressar a dita imunoglobulina modificada, - Contactar a imunoglobulina modificada expressada com um segundo epitopo de um antígeno de superfície celular, e - Determinar se a dita imunoglobulina modificada se liga especificamente ao segundo epitopo.

Adicionalmente, é provido o uso de imunoglobulina polivalente de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para uso terapêutico, por exemplo, para tratamento de células tumorais e células infectadas por patogéneo.

Descrição detalhada da invenção:

Os domínios de imunoglobulina modificada de acordo com a invenção podem ser usados como tal ou incorporados em vários formatos de anticorpos conhecidos, tais como anticorpos completos, e semelhantes para providenciar os locais de ligação adicionais para epítopos de superfície celular ou receptores. 8/112

Em particular, a presente invenção relaciona-se com um método para conceber uma imunoglobulina que se liga especificamente aos epitopos de antigenos. Através da modificação na região de alça estrutural, a imunoglobulina pode ser concebida para ligar ao epitopo. Numa forma de realização preferida, a imunoglobulina é ligada especificamente em, pelo menos, dois tais epitopos que diferem uns dos outros, que originam de ou imitando o mesmo antigeno ou antigenos diferentes.

Por exemplo, o método de acordo com a invenção refere-se à concepção de uma imunoglobulina que se liga especificamente a, pelo menos, um primeiro epitopo e que compreende, pelo menos, uma modificação em, pelo menos, uma região de alça estrutural da dita imunoglobulina, e que determina a ligação especifica da dita, pelo menos, uma região de alça a, pelo menos, um segundo epitopo, em que a região de alça estrutural não modificada (região não CDR) não liga especificamente ao dito, pelo menos, um segundo epitopo, que compreende os passos de: - Providenciar um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina que se liga especificamente a, pelo menos, um primeiro epitopo e que compreende, pelo menos, uma região de alça estrutural CH3, _ Modificar, pelo menos, um resíduo nucleótido de, pelo menos, uma das ditas regiões de alças codificadas pelo dito ácido nucleico, - Transferir o dito ácido nucleico modificado num sistema de expressão, - Expressar a dita imunoglobulina modificada, - Contactar a imunoglobulina modificada expressada com, pelo menos, um segundo epitopo, e - Determinar se a dita imunoglobulina modificada se liga especificamente ao segundo epitopo. 9/112 0 método de acordo com a invenção relaciona-se preferivelmente com, pelo menos, uma modificação em, pelo menos, uma região de alça estrutural CH3 da dita imunoglobulina, e determina a ligação especifica de, pelo menos, uma região de alça CH3 a, pelo menos, uma molécula seleccionada do grupo que consiste de antigenos de superfície celular, em que a imunoglobulina que contém uma região de alça estrutural não modificada não se liga especificamente à dita, pelo menos, uma molécula. 0 termo “imunoglobulina" como aqui usado inclui a imunoglobulina ou partes, fragmentos ou derivados de imunoglobulinas. Assim, inclui um "peptídeo de domínio de imunoglobulina" a ser modificado de acordo com a presente invenção (como aqui usados, os termos imunoglobulina e anticorpo são intermutáveis), assim como os domínios de imunoglobulina ou partes da mesma que contêm uma alça estrutural, ou uma alça estrutural de tais domínios, tais como um mini-domínio. As imunoglobulinas podem ser usadas como peptídeos isolados ou como moléculas de combinação com outros peptídeos. Em alguns casos, é preferível usar uma alça estrutural modificada definida ou uma região de alça estrutural, ou partes da mesma, como moléculas isoladas para efeitos de ligação ou combinação. 0 "domínio de imunoglobulina" como aqui definido contém tais peptídeos ou polipéptidos de domínio de imunoglobulina que podem ter características de ligação específicas após modificar e conceber. Os peptídeos são homólogos às sequências de domínio de imunoglobulina e têm preferivelmente pelo menos 5 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente pelo menos 10 ou até mesmo, pelo menos, 50 ou 100 aminoácidos de comprimento, e constituem, pelo menos, parcialmente uma alça estrutural ou região de alça estrutural, ou a região de alça não CDR do domínio. Preferivelmente, os peptídeos excluem aquelas inserções que são consideradas aminoácidos não funcionais, regiões CDR híbridas ou quiméricas ou regiões do tipo CDR e/ou estruturas canónicas de regiões CDR. As 10/112 características de ligaçao relacionam-se com a ligaçao, afinidade e avidez de epítopo específico.

Um derivado de uma imunoglobulina de acordo com a invenção é qualquer combinação de uma ou mais imunoglobulinas da invenção e/ou uma proteína de fusão, na qual qualquer domínio ou mini-domínio da imunoglobulina da invenção possa ser fundido em qualquer posição de uma ou mais outras proteínas (tais como outras imunoglobulinas, ligantes, proteínas de estrutura, enzimas, toxinas e similares). Um derivado da imunoglobulina da invenção pode também ser obtido por técnicas de recombinação ou ligação a outras substâncias por várias técnicas químicas tais como união covalente, interacção electrostática, ligação dissulfureto, etc.

As outras substâncias ligadas às imunoglobulinas podem ser lípidos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, moléculas orgânicas e anorgânicas ou qualquer combinação dos mesmos (por ex., PEG, pró-fármacos ou medicamentos). Um derivado é também uma imunoglobulina com a mesma sequência de aminoácido mas realizada total ou parcialmente de aminoácidos não naturais ou quimicamente modificados.

As moléculas concebidas de acordo com a presente invenção serão úteis como proteínas isolada, assim como proteínas de fusão ou derivadas, mais tipicamente fundidas de tal forma para fazerem parte de estruturas de anticorpo maiores ou moléculas anticorpo completas, ou partes das mesmas tais como fragmentos Fc e outros.

Será possível usar as proteínas concebidas para produzir moléculas, as quais são biespecíficas, triespecíficas e até mesmo possuir mais especificidades ao mesmo tempo, e será possível, ao mesmo tempo, para controlar e pré-seleccionar a valência da ligação ao mesmo tempo de acordo com os requisitos do uso planeado de tais moléculas. 11/112

Outro aspecto da presente invenção relaciona-se com uma imunoglobulina com, pelo menos, uma região de alça CH3, caracterizada pelo facto de que, pelo menos, uma região de alça CH3 compreende, pelo menos, uma modificação de aminoácido formando, pelo menos, uma região de alça CH3 modificada, em que a dita, pelo menos, uma região de alça CH3 modificada se liga especificamente a, pelo menos, um epítopo de um antigeno. É preferido para combinar molecularmente, pelo menos, um domínio anticorpo modificado, o qual é ligado ao parceiro específico através de sequências não variáveis ou uma alça estrutural, com pelo menos uma outra molécula de ligação que pode ser um anticorpo, fragmento anticorpo, um receptor solúvel, um ligante ou outro domínio anticorpo modificado. A molécula que funciona como uma parte de um par de ligação que é especificamente reconhecido pela imunoglobulina de acordo com a invenção é preferivelmente seleccionada de um grupo que consiste de moléculas proteináceas, ácidos nucleicos e hidratos de carbono.

As regiões de alça das imunoglobulinas podem especif icamente ligar a qualquer tipo de moléculas de ligação ou estruturas, em particular a antígenos, moléculas proteináceas, proteínas, peptídeos, polipéptidos, ácidos nucleicos, glicanos, hidratos de carbono, lípidos, pequenas moléculas orgânicas, moléculas anorgânicas, ou combinações ou fusões dos mesmos. É evidente, as imunoglobulinas modificadas podem compreender, pelo menos, duas alças ou regiões de alça em que cada uma das alças ou regiões de alça podem especificamente ligar a diferentes moléculas ou epítopos.

De acordo com a presente invenção, as regiões de ligação a antígenos ou locais de ligação de antígenos de todos os tipos de antígenos de superfície celular podem ser introduzidos numa alça estrutural CH3 de uma determinada estrutura anticorpo. 12/112 0 termo "antigeno", de acordo com a presente invenção, deve significar moléculas ou estruturas conhecidas para interagir ou capazes de interagir com a região de alça CDR de imunoglobulinas. As regiões de alças estruturais da técnica anterior que se referem a anticorpos nativos, não interagem com antigenos mas contribuem sim para a estrutura geral e/ou para a ligação de moléculas efectoras. Apenas durante a concepção de acordo com a invenção estrutural, as alças podem formar bolsas de ligação ao antigeno sem envolvimento de alças CDR ou a região CDR. 0 termo “antigenos de superfície celular", de acordo com a presente invenção, deve incluir todos os antigenos capazes de serem reconhecidos por uma estrutura de anticorpo na superfície de uma célula, e fragmentos de tais moléculas. "Antigenos de superfície celular" preferidos são aqueles antigenos, que já provaram ser ou que são capazes de serem imunológica ou terapeuticamente relevantes, especialmente aqueles para os quais foi testada a eficácia pré-clínica ou clínica. Aquelas moléculas de superfície celular são especificamente relevantes para os efeitos da presente invenção, que mediam a actividade de morte celular. Durante a ligação da imunoglobulina de acordo com a invenção a, pelo menos, duas daquelas moléculas de superfície celular, o sistema imune providencia citólise ou morte celular, deste modo podem ser providenciados meios potentes para atacar as células humanas.

Preferivelmente, o antigeno é seleccionado dos antigenos de superfície celular, incluindo receptores, em particular do grupo que consiste de quinases tirosina de receptor erbB (tais como EGFR, HER2, HER3 e HER4, mas não limitados a esses) , moléculas da superfamília de receptor TNF, tal como receptor Apo-1, TNFR1, TNFR2, receptor de factor de crescimento nervoso NGFR, CD40, moléculas de superfície de célula-T, Receptores de célula-T, antigeno célula-T 0X40, receptor TACI, BCMA, Apo-3, DR4, DR5, DR6, receptores engodo, tais como DcRl, DcR2, CARI, HVEM, GITR, ZTNFR-5, 13/112 NTR-1, TNFL1, mas não são limitados a essas moléculas, antígenos de superfície de célula-B, tais como CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, antígenos de tumores sólidos ou células cancerígenas hematológicas, células de linfoma de leucemia, outras células sanguíneas incluindo plaquetas sanguíneas, mas não limitado a estas moléculas.

De acordo com uma forma de realização preferida adicional, o antígeno ou a molécula gue liga à região de alça estrutural CH3 é seleccionado do grupo gue consiste de antígenos associados ao tumor, em particular EpCAM, glicoproteína-72 associada a tumor (TAG-72), antígeno CA 125 associado a tumor, antígeno de membrana específica de próstata (PSMA), antígeno associado a melanoma de elevado peso molecular (HMW-MAA), antígeno associado a tumor que expressa hidratos de carbono relacionados com Lewis Y, antígeno carcinoembriónico (CEA), CEACAM5, HMFG PEM, mucina MUC1, MUC18 e antígeno de citoqueratina associado a tumor, antígenos bacterianos, antígenos virais, alérgenos, moléculas IgE relacionadas com alergia, cKIT e Fc-epsilon-receptorI, IRpôO, receptor IL-5, CCR3, receptor de eritrócitos (CRI), albumina de soro humano, albumina de soro de camundongo, albumina de soro de rato, Fc-gama-receptor FcRn neonatal, Fc-gama-receptor Fc-gama RI, Fc-gama-RII, Fc-gama RIII, Fc-alfa-receptor, Fc-epsilon-receptor, fluoresceína, lisozima, receptor 9 tipo-toll, eritropoetina, CD2, CD3, CD3E,CD4, CD11, CDlla, CD14, CD16, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33 (proteína p67) , CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD64, CD80, CD147, GD3, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, LIF, OSM, interferão alfa, interferão beta, interferão gama; TNF-alfa,TNFbeta2, TNFalfa, TNFalfabeta, TNF-Rl, TNF-RII, FasL, CD27L, CD30L, 4-1 BBL, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL,BAFF, LIGHT, VEG1, OX40L, TRAIL Receptor-1, Receptor de adenosina Al, Receptor beta linfotoxina, TACI, BAFFR, EPO; LFA-3, ICAM-1, ICAM-3, betai integrina, beta2 integrina, alfa4/beta7 integrina, alfa2 14/112 integrina, alfa3 integrina, alfa4 integrina, alfa5 integrina, alfaô integrina, alfav integrina, alfaVbeta3 integrina, FGFR-3, Factor de Crescimento dos Queratinócitos, GM-CSF, M-CSF, RANKL, VLA-1, VLA-4, L-selectina, anti-Id, E-selectina, HLA, HLA-DR, CTLA-4, receptor de célula-T, B7-1, B7-2, VNRintegrina, TGFbetal, TGFbeta2, eotaxinal, BLyS (Estimulador De Linfócito B) , complemento C5, IgE, IgA, IgD, IgM, IgG, factor VII, CBL, NCA 90, EG FR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB4), Factor de Tecido, VEGF, VEGFR, receptor de endotelina, VLA-4, hidratos de carbono tais como antigenos do grupo sanguíneo e hidratos de carbono relacionados, Glicosilação Galili, Gastrina, Receptores de gastrina, hidratos de carbono associados a tumor, Hapteno NP-cap ou ΝΙΡ-cap, receptor alfa/beta de célula-T, E-selectina, P-glicoproteína, MRP3, MRP5, pi glutationa-S-transferase (proteínas com resistência a múltiplos fármacos), proteína de membrana grânulo alfa(GMP) 140, digoxina, Fosfatase Alcalina Placentária(PLAP) e Fosfatase Alcalina tipo PLAP testicular , receptor de transferrina, Heparanase I, miosina cardíaca humana, Glicoproteína Ilb/IIIa (GPIIb/IIIa), glicoproteína de envelope gH do citomegalovírus humano (HCMV), HIV gpl20, HCMV, vírus RSV F sincicial respiratório, RSVF Fgp, VNRintegrina, Hep B gpl20, CMV, gpllbllla, HIV IIIB gpl20 V31oop, vírus sincicial respiratório (RSV) Fgp, glicoproteína gD do vírus do herpes simples (HSV), glicoproteína gB HSV, glicoproteína de envelope gB HCMV, toxina Clostridium perfringens e fragmentos dos mesmos.

As subestruturas de antigenos são normalmente referidas como "epítopos" (por ex., epítopos de célula-B, epítopos de célula-T), desde que sejam imunologicamente relevantes, isto é, são também reconhecíveis por anticorpos naturais ou monoclonais. O termo "epítopo" de acordo com a presente invenção deve significar uma estrutura molecular que pode completamente constituir um parceiro de ligação específico ou fazer parte de um parceiro de ligação 15/112 específico para o domínio de ligaçao ou a imunoglobulina da presente invenção.

Quimicamente, um epítopo pode ser composto por um hidrato de carbono, um péptido, um ácido gordo, uma substância anorgânica ou derivados dos mesmos e quaisquer combinações dos mesmos. Se um epítopo é um péptido ou polipéptido, existirá normalmente, pelo menos, 3 aminoácidos, preferivelmente 8 a 50 aminoácidos, e mais preferivelmente entre cerca de 10-20 aminoácidos incluídos no péptido. Não existe nenhum limite superior crítico para o comprimento do péptido, que pode compreender quase o comprimento total da sequência do polipéptido. Os epítopos podem ser lineares ou epítopos conformacionais. Um epítopo linear é compreendido por um único segmento de uma sequência primária de uma cadeia de polipéptido. Os epítopos lineares podem ser contíguos ou sobrepostos. Os epítopos conformacionais são compreendidos por aminoácidos trazidos em conjunto ao dobrar o polipéptido para formar uma estrutura terciária, e os aminoácidos não são necessariamente adjacentes um ao outro numa sequência linear.

Especificamente, os epítopos são, pelo menos, parte de moléculas diagnosticamente relevantes, isto é, a ausência ou presença de um epítopo numa amostra é qualitativamente ou quantitativamente correlacionado a uma doença, ou estado de saúde ou um estado de processo no fabrico, ou estado ambiental e alimentar. Os epítopos podem também fazer, pelo menos, parte de moléculas terapeuticamente relevantes, isto é, que podem ser destinadas por um domínio de ligação específica que altera o curso da doença.

Preferivelmente, os novos locais de ligação antígeno nas alças estruturais são introduzidos por substituição, eliminação e/ou inserção de um ou mais elementos na sequência da imunoglobulina, em particular na sequência de nucleótido. 16/112

De acordo com outra forma de realização preferida da presente invenção, a modificação de, pelo menos, um nucleótido resulta numa substituição, eliminação e/ou inserção da sequência de aminoácido da imunoglobulina codificada pelo dito ácido nucleico. A modificação de, pelo menos, uma região de alça pode resultar numa substituição, eliminação e/ou inserção de 1 ou mais nucleótidos ou aminoácidos, preferivelmente uma mutação de ponto, ou mesmo a mudança da totalidade das alças, mais preferivelmente a mudança de, pelo menos, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, até 30 aminoácidos. Assim, a sequência modificada compreende aminoácidos não incluídos nas regiões conservadas das alças estruturais, os aminoácidos recentemente introduzidos que ocorrem naturalmente, mas estranhos ao local da modificação, ou substitutos de aminoácidos que ocorrem naturalmente. Quando o aminoácido estranho é seleccionado de um grupo específico de aminoácidos, tais como aminoácidos com polaridade específica, ou hidrofobicidade, uma biblioteca enriquecida no grupo específico de aminoácidos em posições aleatórias pode ser obtida de acordo com a invenção. Tais bibliotecas são também chamadas bibliotecas "focadas". A molécula de ácido nucleico aleatoriamente modificada pode compreender as unidades de repetição aqui identificadas, que codificam todos os aminoácidos naturalmente conhecidos ou um subconjunto dos mesmos. Aquelas bibliotecas que contêm sequências modificadas em que um subconjunto específico de aminoácidos é usado para efeitos de modificação são chamadas bibliotecas "focadas". O membro de tais bibliotecas tem uma probabilidade aumentada de um aminoácido de tal subconjunto na posição modificada, que é pelo menos duas vezes mais elevado que o normal, preferivelmente pelo menos 3 vezes ou pelo menos 4 vezes mais elevado. Tais bibliotecas têm também um número limitado ou inferior de membros de biblioteca, para que o número de membros de biblioteca actuais atinja o número de membros biblioteca teóricos. Em alguns casos, o número de membros 17/112 de biblioteca de uma biblioteca focada não é inferior a 103 vezes o número teórico, preferivelmente não inferior a 102 vezes, mais preferivelmente não inferior a 10 vezes.

Uma biblioteca de acordo com a invenção pode ser designada como uma biblioteca dedicada que contém, pelo menos, 50% de formatos específicos, preferivelmente pelo menos 60%, mais preferido a pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, ou aqueles que consistem principalmente de formatos anticorpos específicos. Formatos anticorpos específicos são preferidos, de tal forma que a biblioteca preferida de acordo com a invenção é seleccionada do grupo que consiste de uma biblioteca VH, biblioteca VHH, biblioteca Vkappa, biblioteca Vlambda, biblioteca Fab, biblioteca CHI/CL e uma biblioteca CH3. As bibliotecas caracterizadas pelo conteúdo das moléculas de compósito, que contêm mais de um domínio anticorpo, tal como a biblioteca IgG ou biblioteca Fc, são especialmente preferidas. Outras bibliotecas preferidas são aquelas que contêm receptores célula-T, que formam bibliotecas receptoras de célula-T. Bibliotecas ainda mais preferidas são bibliotecas epítopo, em que a proteína de fusão compreende uma molécula com uma variante de um epítopo, também permitindo a selecção de moléculas competitivas com função de ligação similar, mas funcionalidade diferente. Exemplar é uma biblioteca TNFalfa, em que trímeros da proteína de fusão TNFalfa são exibidos por um único pacote genético.

Contudo, o número máximo de aminoácidos inseridos na região de alça de uma imunoglobulina pode preferivelmente não exceder o número de 30, preferivelmente 25, mais preferivelmente 20 aminoácidos no máximo. A substituição e a inserção dos aminoácidos ocorrem preferivelmente de forma aleatória ou semi-aleatória usando todos os aminoácidos possíveis ou uma selecção de aminoácidos preferidos para efeitos de aleatorização, por métodos conhecidos na técnica e como descrito no presente pedido de patente. 18/112 0 local da modificação pode ser numa alça estrutural única especifica ou uma região de alça estrutural. Regiões de alça são normalmente compostas por pelo menos duas, preferivelmente em, pelo menos 3, ou pelo menos 4 alças que são adjacentes umas às outras, e as quais podem contribuir para a ligação de um antigeno através da formação de um local de ligação antigeno ou bolsa de ligação de antigeno. É preferido que um ou mais locais de modificação estejam localizados dentro de uma área de 10 aminoácidos, mais preferivelmente dentro de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 até 100 aminoácidos, em particular dentro de uma região estrutural para formar uma superfície ou bolsa onde o antigeno pode estericamente aceder às regiões de alça. A, pelo menos, uma região de alça é preferencialmente mutada ou modificada para produzir bibliotecas, preferencialmente por métodos de mutagénese aleatórios, semi-aleatórios ou, em particular, aleatórios direccionados ao local, em particular para eliminar, mudar ou introduzir insertos aleatoriamente gerados nas alças estruturais. Alternativamente preferido, é o uso de abordagens combinatoriais. Qualquer um dos métodos de mutagénese conhecidos pode ser usado, entre eles, mutagénese de cassete. Esses métodos podem ser usados para fazer modificações de aminoácido em posições desejadas da imunoglobulina da presente invenção. Em alguns casos, as posições são escolhidas aleatoriamente, por ex., com qualquer um dos possíveis aminoácidos ou uma selecção de aminoácidos preferidos para aleatorizar as sequências de alça, ou mudanças de aminoácidos são realizadas usando regras simplistas. Por exemplo, todos os resíduos podem ser mutados preferencialmente para especificar aminoácidos, tais como alanina, referido como aminoácidos ou análise de alanina. Tais métodos podem ser acoplados a mais abordagens concebidas sofisticadas que usam métodos de selecção para analisar níveis mais altos de diversidade de sequência. 19/112

Um método preferido de acordo com a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico aleatoriamente modificada que codifica uma imunoglobulina, domínio de imunoglobulina ou uma parte da mesma que compreende, pelo menos, uma unidade de repetição de um nucleótido dentro de uma região de codificação de alça estrutural com a sequência 5'-NNS-3', δ’-ΝΝΝ^', 5'-NNB-3' ou 5'-NNK-3'. Em algumas formas de realização, o ácido nucleico modificado compreende codões nucleótidos seleccionados do grupo de TMT, WMT, BMT, RMC, RMG, MRT, SRC, KMT, RST, YMT, MKC, RSA, RRC, NNK, NNN, NNS ou qualquer combinação dos mesmos (o código é de acordo com o IUPAC). A modificação da molécula de ácido nucleico pode ser executada ao introduzir os oligonucléotidos sintéticos num segmento maior do ácido nucleótido, ou por síntese de novo de uma molécula de ácido nucleico completa. A síntese de ácido nucleico pode ser executada com componentes básicos de trinucleótido que poderia reduzir o número de combinações de sequência sem sentido se um subconjunto de aminoácidos deve ser codificado (por ex., Yanez et al. Nucleic AcidsRes. (2004) 32 : el58; Virnekas et al. Nucleic Acids Res . (1994) 22:5600-5607). A molécula de ácido nucleico aleatoriamente modificada pode compreender as unidades de repetição acima identificadas, que codificam todos os aminoácidos naturalmente conhecidos.

Como bem conhecido da técnica, existe uma variedade de tecnologias de selecção que podem ser usadas para a identificação e isolamento de proteínas com certas características e afinidades de ligação, incluindo, por exemplo, tecnologias de descrição tais como phage display, ribosome display, cell surface display, e similares, como em baixo descrito. Métodos para produção e selecção de variantes de anticorpos são bem conhecidos na técnica. Os métodos gerais para a biologia, expressão, purificação e selecção molecular de 20/112 anticorpos são descritos em Antibody Engineering, edited by Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; e Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683- 689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76.

Uma "alça estrutural" ou "alça não CDR", de acordo com a presente invenção, deve ser compreendida da seguinte forma: as imunoglobulinas são feitas de domínios com a chamada dobra da imunoglobulina. Na realidade, as folhas beta antiparalelas são ligadas por alças para formar um barril beta antiparalelo comprimido. Na região variável, algumas das alças dos domínios contribuem essencialmente para a especificidade do anticorpo, isto é, a ligação a um antígeno por um local de ligação natural de um anticorpo. Essas alças são chamadas de alças CDR. As alças CDR estão localizadas dentro da região de alça CDR, que podem, em alguns casos, também ter uma região de estrutura variável (chamada "VFR") adjacente às alças CDR. É conhecido que as VFR podem contribuir para a bolsa de ligação de antígeno de um anticorpo, que geralmente é principalmente determinada pelas alças CDR. Deste modo, aquelas VFR são consideradas como parte da região de alça CDR, e não seriam adequadamente usadas para o propósito da invenção. Contrariamente àquelas VFR dentro da região de alça CDR ou localizadas próximas das alças CDR, outras VFR de domínios variáveis seriam particularmente adequadas para serem usadas de acordo com a invenção. Aquelas são as alças estruturais das VFR localizadas no lado oposto da região de alça CDR, ou no lado do C-terminal de um domínio de imunoglobulina variável.

Todas as outras alças de domínios anticorpo contribuem bastante para a estrutura da molécula e/ou a função efectora. Essas alças são aqui definidas como "alças estruturais" ou alças não CDR, que também excluiriam quaisquer VFR dentro da região de alça CDR. 21/112

As moléculas de ácido nucleico que codificam as imunoglobulinas modificadas (e sempre incluídas em toda a especificação na sua totalidade em baixo: Fragmentos de imunoglobulina ou derivados) podem ser clonadas em células hospedeiras, expressas e testadas em termos das suas especificidades de ligação. Estas práticas são realizadas usando procedimentos bem conhecidos, e uma variedade de métodos que podem ser usados na presente invenção são descritos em Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 3.sup.rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001), e Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons). Os ácidos nucleicos que codificam as imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser incorporados num vector de expressão no sentido de expressar as ditas imunoglobulinas. Os vectores de expressão compreendem normalmente uma imunoglobulina operavelmente ligada que é colocada numa relação funcional, com sequências de controlo ou regulatórias, marcadores seleccionáveis, quaisquer parceiros de fusão, e/ou elementos adicionais. As imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser produzidas ao cultivar uma célula hospedeira transformada com ácido nucleico, preferivelmente um vector de expressão contendo ácido nucleico que codifica as imunoglobulinas modificadas, sob as condições adequadas para induzir ou causar expressão das imunoglobulinas modificadas. Os métodos para introduzir moléculas de ácido nucleico exógeno num hospedeiro são bem conhecidos na técnica, e vão variar com o hospedeiro usado. Claro que também podem ser usados sistemas de expressão acelulares ou sem células para a expressão de imunoglobulinas modificadas. O termo “sistema de expressão" refere-se a moléculas de ácido nucleico que contêm umas sequências de codificação desejadas e sequências de controlo numa ligação operável, para que as hospedeiras transformadas ou transfectadas com essas sequências sejam capazes de produzir as proteínas codificadas. No sentido de efectuar a transformação, o sistema de expressão pode ser incluído 22/112 num vector; contudo, o ADN relevante pode então também ser integrado no cromossoma hospedeiro.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o sistema de expressão compreende um vector. Qualquer vector de expressão conhecido da técnica pode ser usado para este fim como adequado. A imunoglobulina modificada é preferivelmente expressa num hospedeiro, preferivelmente numa célula bacteriana, levedura, célula vegetal, numa célula animal ou numa planta ou animal.

Uma ampla variedade de células hospedeiras adequadas pode ser usada para expressar a imunoglobulina modificada, incluindo mas não limitadas a células mamíferas (células animais) ou células vegetais), bactérias (por ex., Bacillus subtilis, Escherichia coli), células de insecto, e levedura (por ex., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae). Por exemplo, uma variedade de linhas celulares que podem ser usadas na presente invenção é descrita no catálogo de linha celular ATCC, disponível a partir da American Type Culture. Além disso, também as plantas e animais podem ser usados como hospedeiros para a expressão da imunoglobulina de acordo com a presente invenção. A expressão, assim como os vectores de transfecção ou cassetes, podem ser seleccionados de acordo com o hospedeiro usado.

Claro que também podem ser usados sistemas de expressão de proteína sem células ou acelulares. Plataformas de expressão de proteína de transcrição/translação in vitro, que produzem quantidades suficientes de proteína, oferecem muitas vantagens de uma expressão proteica sem células, eliminando a necessidade de passos difíceis a montante ou a jusante (por ex., transformação, cultivo ou lise de células hospedeiras) normalmente associados a sistemas de expressão com base em célula. 23/112

Numa forma de realização preferida da presente invenção, as imunoglobulinas modificadas são purificadas ou isoladas após expressão. As imunoglobulinas podem ser isoladas ou purificadas numa variedade de formas conhecidas dos especialistas da técnica. Os métodos de purificação padrão incluem técnicas cromatográficas, incluindo cromatografia de afinidade, cromatografia de troca de iões ou hidrofóbica, electroforética, imunológica, precipitação, diálise, filtração, concentração, e técnicas de cromatofocagem. A purificação é muitas vezes permitida por um parceiro de fusão particular. Por exemplo, os anticorpos podem ser purificados ao usar resina de glutationa se for usada uma fusão GST, cromatograf ia de afinidade Ni + 2 se for usada uma marcação His ou anticorpo anti-flag imobilizada se for usada uma marcação flag. Para orientação geral em técnicas de purificação adequadas, ver Antibody Purification: Principies and Practice, 3.sup.rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994. É evidente que também é possível expressar as imunoglobulinas modificadas de acordo com a presente invenção na superfície de um hospedeiro, em particular na superfície de uma bactéria, insecto ou célula de levedura ou na superfície de fagos ou vírus.

As imunoglobulinas modificadas podem ser analisadas usando uma variedade de métodos, incluindo mas não limitado àqueles usados em ensaios in vitro, in vivo e ensaios com base em células e tecnologias de selecção. A automação e tecnologias de análise de alto rendimento podem ser utilizadas nos procedimentos de análise. A análise pode utilizar um parceiro de fusão ou marcação, por exemplo uma enzima, uma marcação imune, marcação isotópica, ou marcação de pequena célula tal como uma tinta fluorescente ou colorimétrica ou uma molécula luminogénica.

Numa forma de realização preferida, as propriedades funcionais e/ou biofísicas das imunoglobulinas são analisadas num ensaio in vitro. Numa forma de realização preferida, o anticorpo é seleccionado para 24/112 funcionalidade, por exemplo a sua capacidade de catalisar uma reacção ou a sua afinidade de ligação ao seu alvo.

Os ensaios podem empregar uma variedade de métodos de detecção incluindo, mas não limitado a, marcações cromogénicas, fluorescentes, luminescentes ou isotópicas.

Como é conhecido da técnica, um subconjunto de métodos de análise são aqueles que seleccionam membros favoráveis de uma biblioteca. Os métodos são aqui referidos como "métodos de selecção" e aqueles métodos são úteis na presente invenção para análise de imunoglobulinas modificadas. Quando as bibliotecas de imunoglobulinas são seleccionadas usando um método de selecção, apenas aqueles membros de uma biblioteca que são favoráveis, que cumprem alguns critérios de selecção, são propagados, isolados e/ou observados. Como será apreciado, porque apenas as variantes mais adequadas são observadas, tais métodos permitem a análise de bibliotecas que são maiores que aquelas seleccionáveis por métodos que ensaiam a adequação individualmente dos membros de biblioteca. A selecção é permitida por qualquer método, técnica, ou parceiro de fusão que liga, covalente ou não covalentemente, o fenótipo de imunoglobulina com o seu genótipo, que é a função de um anticorpo com o ácido nucleico que o codifica. Por exemplo, o uso de phage display como um método de selecção é permitido pela fusão dos membros de biblioteca à proteína de gene III. Desta forma, a selecção ou isolamento de imunoglobulinas modificadas que cumprem alguns critérios, por exemplo afinidade de ligação para o alvo da imunoglobulina, também selecciona ou isola o ácido nucleico que o codifica. Uma vez isolado, o gene ou genes que codificam as imunoglobulinas podem então ser amplificados. Este processo de isolamento e amplificação, referido como selecção, pode ser repetido, permitindo variantes anticorpo favoráveis na biblioteca a ser melhorada. A sequenciação do ácido nucleico do ácido nucleico em anexo no final permite a identificação do gene. 25/112

Uma variedade de métodos de selecção é conhecida na técnica que podem ser utilizados na presente invenção para analisar bibliotecas de imunoglobulina. Estas incluem, mas não são limitadas a, phage display (Phage display of peptides and antibodies: a laboratory manual, Kay et al., 1996, Academic Press, San Diego, Calif., 1996; Low-man et al., 1991, Biochemistry 30:10832-10838; Smith, 1985, Science 228:1315-1317) e os seus derivados tais como infecção de fago selectiva (Malmborg et al., 1997, J Mol Biol 273 :544-551), fago de infecção selectiva (Krebber et al., 1997, J Mol Biol 268:619-630), e selecção de infecciosidade retardada (Benhar et al., 2000, J Mol Biol 301:893-904), cell surface display (Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399) tais como display em bactérias (Georgiou et al., 1997, Nat Biotechnol 15:29-34; Georgiou et al., 1993, Trends Biotechnol 11:6-10; Lee et al., 2000, Nat Biotechnol 18:645-648; Junetal., 1998, Nat Biotechnol 16 :576-80), levedura (Boder & Wittrup, 2000, Methods Enzymol 328:430-44; Boder & Wittrup, 1997, Nat Biotechnol 15:553- 557), e células mamíferas (Whitehorn et al., 1995, Bio/technology 13:1215-1219), assim como tecnologias de display in vitro (Amstutz et al., 2001, Curr Opin Biotechnol 12:400-405) tal como polysome display (Mattheakis et al., 1994, Proc Natl Acad Sei USA 91 :9022-9026), ribosome display (Hanes et al., 1997, Proc Natl Acad Sei USA 94:4937-4942), mRNA display (Roberts & Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sei USA 94:12297-12302; Nemoto et al., 1997, FEBS Lett 414:405- 408), e sistema de display de inactivação de ribossoma (Zhou et al., 2002, J Am Chem Soc 124, 538-543).

Outros métodos de selecção que podem ser usados na presente invenção incluem métodos que não se baseiam no display, tais como métodos in vivo, incluindo mas não limitado à expressão periplásmica e análise citométrica (Chenetal., 2001, Nat Biotechnol 19:537-542) , o estudo de complementação de fragmento anticorpo (Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc Natl Acad Sei USA 91:10340-10344; Pelletier et al., 1998, Proc Natl Acad Sei USA 95:12141-12146) , e a selecção 26/112 de dois híbridos em levedura (Fields & Song, 1989, Nature 340:245-246) usado no modo de selecção (Visintin et al., 1999, Proc Natl Acad Sei USA 96:11723-11728). Numa forma de realização alternativa é permitida a selecção por um parceiro de fusão que liga a uma sequência específica no vector de expressão, deste modo ligando covalente ou não covalentemente o parceiro de fusão e associado ao membro de biblioteca variante Fc com o ácido nucleico que os codifica.

Numa forma de realização alternativa, a selecção in vivo pode ocorrer se a expressão do anticorpo transmitir algum crescimento, reprodução ou vantagem de sobrevivência à célula.

Um subconjunto de métodos de selecção referido com métodos de “evolução direccionada" são aqueles que incluem a conjugação ou cultura das sequências favoráveis durante a selecção, algumas vezes com a incorporação de novas mutações. Como será apreciado por aqueles peritos na técnica, os métodos de evolução direccionada podem facilitar a identificação das sequências mais favoráveis numa biblioteca, e podem aumentar a diversidade de sequências que são analisadas. Vários métodos de evolução direccionada são conhecidos na técnica que podem ser utilizados na presente invenção para seleccionar variantes de anticorpo, incluindo mas não limitado a transposição de ADN (PCT WO 00/42561 A3; PCT WO 01/70947 A3), transposição de exões (Patente americana n° 6,365,377; Kolkman & Stemmer, 2001, Nat Biotechnol 19:423-428), transposição de família (Crameri et al., 1998, Nature 391:288-291; Patente americana n° 6,376,246), RACHITT.TM. (Coco et al., 2001, Nat Bio-technol 19:354-359; PCT WO 02/06469), STEP e iniciação aleatória para recombinação in vitro (Zhao et al., 1998, Nat Biotechnol 16:258-261; Shao et al., 1998, Nucleic Acids Res 26:681-683), montagem de genes mediada por exonuclease (Patente americana n° 6,352,842; Patente americana n° 6,361,974), Gene Site Saturation Mutagenesis.TM. (Patente americana n° 6,358,709), Gene 27/112

Reassembly. TM. (Patente americana n° 6, 358, 709), SCRATCHY (Lutz et al., 2001, Proc Natl Acad Sei USA 98:11248-11253), métodos de fragmentação de ADN (Kikuchi et al., Gene 236:159-167), transposição de ADN de cadeia simples (Kikuchi et al., 2000, Gene 243:133-13 7) , e AMEsystem.TM. tecnologia de concepção de anticorpo de evolução direccionada (Applied Molecular Evolution) (Patente americana n° 5,824,514; Patente americana n° 5,817,483; Patente americana n° 5,814,476; Patente americana n° 5,763,192; Patente americana n° 5,723,323).

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção a ligação especifica da imunoglobulina modificada para a molécula é determinada por um ensaio de ligação seleccionado a partir do grupo que consiste de ensaios imunológicos, preferivelmente ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA), ensaios de ressonância plasmónica superficial, espectroscopia de ressonância magnética nuclear de diferença de transferência de saturação, espectroscopia de ressonância magnética nuclear de NOE (trNOE), ensaios competitivos, ensaios de ligação de tecido, ensaios de ligação de célula viva e ensaios de extracto celular.

Os ensaios de ligação podem ser realizados usando uma variedade de métodos conhecidos da técnica, incluindo mas não limitado a ensaios com base em FRET (Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência) e BRET (Transferência de Energia de Ressonância de Bioluminescência) , AlphaScreenTM (Ensaio Homogéneo Amplificado da Proximidade Luminescente), Ensaio de Cintilação por Proximidade, ELISA (Ensaio de Imunoabsorção Enzimática), SPR (Ressonância Plasmónica Superficial, também conhecido como BIACORETM), calorimetria de titulação isotérmica, calorimetria diferencial de análise, electroforese de gel e cromatografia incluindo filtração por gel. Estes e outros métodos podem ter a vantagem de algum parceiro de fusão ou marcação. 28/112 A imunoglobulina modificada é preferencialmente conjugada com uma marcação ou molécula repórter, seleccionada do grupo que consiste de moléculas orgânicas, marcações enzimáticas, marcações radioactivas, marcações coloridas, marcações fluorescentes, marcações cromogénicas, marcações luminescentes, haptenos, digoxigenina, biotina, complexos metais, metais, ouro coloidal e misturas dos mesmos. As imunoglobulinas modificadas conjugadas com marcações ou moléculas repórter podem ser usadas, por exemplo, em métodos de diagnóstico. A imunoglobulina modificada pode ser conjugada com outras moléculas que permitem a simples detecção do dito conjugado, por exemplo, ensaios de ligação (por ex., ELISA) e estudos de ligação.

Numa forma de realização preferida, as variantes de anticorpo são seleccionadas usando um ou mais ensaios celulares ou in vivo. Para tais ensaios, as imunoglobulinas modificadas purificadas ou não purificadas são normalmente adicionadas exogenamente de tal forma que as células são expostas a imunoglobulinas individuais ou conjuntos de imunoglobulinas que pertencem a uma biblioteca. Esses ensaios são normalmente, mas não sempre, baseados na função da imunoglobulina; isto é, a capacidade do anticorpo para ligar o seu alvo e mediado algum evento bioquímico, por exemplo função efectora, inibição de ligação de ligante/receptor, apoptose, e similares. Tais ensaios envolvem muitas vezes a monitorização da resposta de células para o anticorpo, por exemplo sobrevivência celular, morte celular, mudança na morfologia celular, ou activação transcricional tal como expressão celular de um gene natural ou gene repórter. Por exemplo, tais ensaios podem medir a capacidade das variantes de anticorpo para obter ADCC, ADCP ou CDC. Para algumas células ou componentes adicionais de ensaios, que é uma adição às células alvo, pode ser necessário ser adicionado, por exemplo, complemento de soro, ou células efectoras tais como monócitos sanguíneos periféricos (PBMCs), células NK, macrófagos, e 29/112 similares. Tais células adicionais podem ser de qualquer organismo, preferivelmente humanos, camundongo, rato, coelho e macaco. As imunoglobulinas podem provocar apoptose de certas linhas celulares que expressam o alvo, ou podem mediar o ataque nas células alvo por células imunes que foram adicionadas ao ensaio. Os métodos para monitorizar a morte celular ou viabilidade são conhecidos da técnica, e incluem o uso de tintas, imunoquímica, citoquímica e reagentes radioactivos. Por exemplo, ensaios com marcação de caspase podem permitir que a apoptose seja medida e absorver ou libertar substratos radioactivos ou tintas fluorescentes tais como o azul alamar, podem permitir o crescimento celular ou activação a ser monitorizada.

Numa forma de realização preferida, o ensaio de citotoxicidade com base em DELFIART EuTDA (Perkin Elmer, MA) pode ser usado. Alternativamente, as células alvo mortas ou danificadas podem ser monitorizadas pela medição da libertação de um ou mais componentes intracelulares naturais, por exemplo lactato desidrogenase. A activação transcricional pode também servir como um método para a função de testar em ensaios celulares. Neste caso, a resposta pode ser monitorizada ao testar os genes naturais ou imunoglobulinas que podem ser regulados de forma ascendente, por exemplo a libertação de certas interleucinas pode ser medida, ou alternativamente a leitura pode ser via uma construção em repórter. Os ensaios celulares podem também envolver a medição de alterações morfológicas de células como uma resposta à presença de imunoglobulinas modificadas. Os tipos de células para tais ensaios podem ser procarióticas ou eucarióticas, e uma variedade de linhas celulares que são conhecidas da técnica podem ser usadas. Alternativamente, as selecções celulares são executadas usando células que foram transformadas ou transfectadas com ácidos nucleicos que codificam as variantes. Isto é, variantes anticorpos não são adicionadas exogenamente às células. Por exemplo, numa forma de realização, a selecção celular utiliza cell surface 30/112 display. Um parceiro de fusão pode ser usado que permite o display de imunoglobulinas modificadas na superficie das células (Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399).

Numa forma de realização preferida, a imunogenicidade das imunoglobulinas modificadas pode ser determinada experimentalmente usando um ou mais ensaios celulares. Numa forma de realização preferida, os ensaios de activação de célula-T ex vivo são usados para quantificar experimentalmente a imunogenicidade. Nestes métodos, as células que apresentam antigeno e células-T naives dos doadores correspondentes são desafiadas uma ou mais vezes com um péptido ou anticorpo total de interesse. Então, a activação de célula-T pode ser detectada usando um número de métodos, por exemplo ao monitorizar a produção de citocinas ou medindo a absorção de timidina tritiada. Na maioria das formas de realização preferidas, são monitorizadas usando ensaios Elispot (Schmittel et. al., 2000, J. Immunol. Meth., 24: 17-24).

As propriedades biológicas das imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser caracterizadas ex vivo na célula, tecido, e todas as experiências de organismo. Como é conhecido da técnica, os medicamentos são muitas vezes testados in vivo em animais, incluindo mas não limitado a camundongos, ratos, coelhos, cães, gatos, porcos e macacos, no sentido de medir a eficácia do medicamento para o tratamento face ao modelo de doença, ou para medir farmacocinéticos, farmacodinâmicos, toxicidade e outras propriedades do medicamento. Os animais podem ser referidos como modelos de doença. As terapêuticas são muitas vezes testadas em camundongos, incluindo mas não limitado a camundongos sem pêlo, camundongos SCID, camundongos com xenotransplantes e camundongos transgénicos (incluindo knockins e knockouts). Tal experimentação pode providenciar dados significativos para a determinação do potencial do anticorpo a ser usado como terapêutica com a meia-vida adequada, função efectora, actividade apoptótica, actividade 31/112 citotóxica ou citolítica. Qualquer organismo, preferencialmente mamíferos, pode ser usado para testar. Por exemplo, devido à sua semelhança com os humanos, os primatas, macacos podem ser modelos de doença adequados, e assim podem ser usados para testar a eficácia, toxicidade, farmacocinéticos, farmacodinâmicos, meia-vida ou outras propriedades das imunoglobulinas modificadas da presente invenção. Testes das substâncias em humanos são necessários, em último lugar, para aprovação como medicamentos, e assim claro, estas experiências são contempladas. Assim, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser testadas em humanos para determinar a sua eficácia terapêutica, toxicidade, imunogenicidade, propriedade farmacocinéticas e/ou outras propriedades clínicas. Especialmente aquelas imunoglobulinas polivalentes de acordo com a invenção que ligam à célula única através de, pelo menos, dois antígenos de superfície, preferivelmente ligação de, pelo menos, três estruturas que reticulam células alvo, será considerada actividade pró-apoptótica e exercer actividade apoptótica durante o targeting e reticulação celular. A ligação polivalente providencia uma associação relativamente grande dos parceiros de ligação, também chamada reticulação, que é um pré-requisito para a apoptose.

As imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser úteis numa ampla variedade de produtos de anticorpo. Numa forma de realização, o anticorpo variante da presente invenção é usado para terapia ou profilaxia, por ex., como uma imunoterapia activa ou passiva, para utilização preparativa, industrial ou analítica, como um diagnóstico, um composto industrial ou um reagente de pesquisa, preferencialmente uma terapêutica. A imunoglobulina modificada ou variante anticorpo pode ser usada numa composição anticorpo que é monoclonal ou policlonal. Numa forma de realização preferida, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção são usadas para capturar ou matar células alvo que suportam o antígeno alvo, por exemplo células cancerígenas. Numa forma de realização 32/112 alternativa, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção são usadas para bloquear, antagonizar ou agonizar o antigeno alvo, por exemplo ao antagonizar uma citocina ou receptor de citocina.

Numa forma de realização alternativamente preferida, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção são usadas para bloquear, antagonizar, ou agonizar factores de crescimento ou receptores de factor de crescimento e assim mediar a morte das células alvo que suportam ou necessitam do antigeno alvo.

Numa forma de realização alternativamente preferida, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção são usadas para bloquear, antagonizar ou agonizar enzimas e substrato de enzimas.

As imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser usadas para vários efeitos terapêuticos, preferivelmente para imunoterapia activa ou passiva.

Especif icamente, a imunoglobulina de acordo com a presente invenção ou obtida por um método de acordo com a presente invenção, pode ser usada para a preparação de uma vacina para imunização activa.

Deste modo, a imunoglobulina é usada como uma substância antigénica para formular uma vacina ou usada para fishing ou capturar estruturas antigénicas ex vivo ou in vivo para utilização numa formulação de vacina.

Numa forma de realização preferida, um anticorpo compreendendo as imunoglobulinas modificadas é administrado a um paciente para tratar um distúrbio especifico. Um "paciente" para os efeitos da presente invenção inclui humanos e outros animais, preferivelmente mamíferos, e mais preferivelmente humanos. Por "distúrbio específico" aqui significa um distúrbio que pode ser melhorado ao 33/112 administrar uma composição farmacêutica que compreende uma imunoglobulina modificada da presente invenção.

Numa forma de realização, uma imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção é o único agente terapeuticamente activo administrado a um paciente. Alternativamente, a imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção é administrada em combinação com um ou mais agentes terapêuticos, incluindo mas não limitado a agentes citotóxicos, agentes quimioterapêuticos, citocinas, agentes inibidores de crescimento, agentes anti-hormonais, inibidores de quinase, agentes anti-angiogénicos, cardioprotectores ou outros agentes terapêuticos. As imunoglobulinas modificadas podem ser administradas concomitamente com um ou mais outros regimes terapêuticos. Por exemplo, uma variante anticorpo da presente invenção pode ser administrada ao paciente juntamente com quimioterapia, terapia de radiação, ou quimioterapia e terapia de radiação em conjunto. Numa forma de realização, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser administradas em conjunto com um ou mais anticorpos, que podem ou não compreender uma variante anticorpo da presente invenção. De acordo com outra forma de realização da invenção, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção e uma ou mais terapias anticancerigenas são usadas para tratar células cancerígenas ex vivo. É contemplado que tal tratamento ex vivo possa ser útil no transplante de medula óssea e particularmente, transplante de medula óssea autóloga. É evidentemente contemplado que os anticorpos da invenção podem ser usados em combinação com ainda outras técnicas terapêuticas, tais como cirurgia.

Uma variedade de outros agentes terapêuticos pode ser útil para administração em imunoglobulinas modificadas da presente invenção. Numa forma de realização, a imunoglobulina modificada é administrada com um agente anti-angiogénico, que é um componente que bloqueia, ou interfere com alguns níveis, o desenvolvimento de 34/112 vasos sanguíneos. 0 factor anti-angiogénico pode, por exemplo, ser uma pequena molécula ou uma proteína, por exemplo um anticorpo, molécula de fusão Fc ou citocina, que liga a um factor de crescimento ou receptor de factor de crescimento envolvido na promoção de angiogénese. 0 factor anti-angiogénico aqui preferido é um anticorpo que liga a um Factor de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF). Numa forma de realização alternativa, a imunoglobulina modificada é administrada com um agente terapêutico que induz ou melhora a resposta imune adaptativa, por exemplo, um anticorpo que tem como alvo CTLA-4. Numa forma de realização alternativa, a imunoglobulina modificada é administrada comum inibidor de quinase tirosina, a qual é uma molécula que inibe de alguma forma a actividade quinase tirosina de uma quinase de tirosina. Numa forma de realização preferida, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção são administradas com uma citocina. Por "citocina" como aqui usada significa um termo genérico para proteínas libertadas por uma população celular que age noutra célula como mediadora intercelular incluindo quimiocinas.

As composições farmacêuticas são contempladas em que imunoglobulinas modificadas da presente invenção e um ou mais agentes terapeuticamente activas são formulados. Formulações estáveis das variantes de anticorpo da presente invenção são preparadas para armazenamento ao misturar a dita imunoglobulina com o grau desejado de pureza com portadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais, excipientes ou estabilizadores (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. As formulações a serem usadas para administração in vivo são preferencialmente estéreis. Isto é rapidamente conseguido por filtração através de membranas de filtração estéril ou outros métodos. As imunoglobulinas modificadas e outros agentes terapeuticamente activos aqui descritos podem também ser formulados como imunolipossomas e/ou colocado em microcápsulas. 35/112 A administração da composição farmacêutica que compreende uma imunoglobulina modificada da presente invenção, preferivelmente na forma de uma solução aquosa estéril, pode ser efectuada de várias formas, incluindo, mas não limitado a, oralmente, subcutaneamente, intravenosamente, intranasalmente, intraopticamente, transdermicamente, mucosamente, topicamente (por ex., géis, salves, loções, cremes, etc.), intraperitonealmente, intramuscularmente, intrapulmonar (por ex., AERx™ tecnologia comercialmente disponível da Aradigm, ou sistema de administração pulmonar Inhance™ comercialmente disponível de Inhale Therapeutics), vaginalmente, parenteralmente, rectalmente ou intraocularmente.

Como aqui usado, o termo "especificamente ligado" refere-se a uma reacção de ligação que é determinativa do ligante cognato de interesse numa população heterogénea de moléculas. Deste modo, sob condições designadas (por ex., condições de imunoensaio no caso de uma imunoglobulina, o anticorpo especificado liga a um "alvo" particular e não liga numa quantidade significativa a outras moléculas presentes numa amostra. Comparável às CDR de anticorpos, as regiões de alça estrutural modificadas são partes de proteína que ligam antigeno, estrutura ou molécula, e não antígenos, como tal.

Outro aspecto da invenção refere-se a um método para produzir uma imunoglobulina ou uma preparação farmacêutica da mesma que compreende pelo menos, uma modificação na região de alça estrutural CH3 da dita imunoglobulina e determinando a ligação da dita imunoglobulina a um epítopo de um antigeno, em que a imunoglobulina não modificada não liga significativamente ao dito epítopo, que compreende os passos de: - Providenciar um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina que compreende, pelo menos, uma região de alça, 36/112 - Modificar pelo menos um resíduo nucleótido de, pelo menos, uma dita região de alça, - Transferir o dito ácido nucleico modificado num sistema de expressão, - Expressar a dita imunoglobulina modificada, - Contactar a imunoglobulina modificada expressa com um epítopo, - Determinar se a dita imunoglobulina modificada liga ao dito epítopo, e - Providenciar a ligação de imunoglobulina modificada ao dito epítopo e opcionalmente acabando-a para uma preparação farmacêutica.

Numa forma de realização preferida, a imunoglobulina de acordo com a invenção é um anticorpo biespecífico ou um anticorpo de cadeia simples biespecífico. Ainda preferido é que a imunoglobulina compreende um domínio biespecífico, ou uma parte do mesmo, incluindo um mini-domínio.

Em particular, a presente invenção refere-se a um método para produzir uma imunoglobulina multiespecífica que se liga especificamente a, pelo menos, uma primeira molécula ou uma preparação farmacêutica da mesma, que compreende, pelo menos, uma modificação em, pelo menos, uma região de alça estrutural CH3 da dita imunoglobulina, e determinando a ligação específica da dita, pelo menos, uma região de alça a, pelo menos, uma segunda molécula, a qual é um antígeno tal como seleccionado do grupo que consiste de alérgenos, antígenos associados ao tumor, auto-antígenos, enzimas, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, antígenos protozoários e antígenos virais, em que a imunoglobulina que continha uma região de alça estrutural não modificada não liga especificamente à dita, pelo menos, uma segunda molécula, que compreende os passos de: 37/112 - Providenciar um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina que liga especif icamente a, pelo menos, uma primeira molécula que compreende, pelo menos, uma região de alça estrutural CH3, - Modificar pelo menos um resíduo nucleótido de, pelo menos, uma das ditas regiões de alça codificadas pelo dito ácido nucleico, - Transferir o dito ácido nucleico modificado num sistema de expressão, - Expressar a dita imunoglobulina modificada, - Contactar a imunoglobulina modificada expressa com a dita, pelo menos, uma segunda molécula, e - Determinar se a dita imunoglobulina modificada se liga especificamente à segunda molécula, e - Providenciar a imunoglobulina modificada que liga especificamente à dita, pelo menos, segunda molécula e opcionalmente fishing para uma preparação farmacêutica. A concepção de mais de uma especificidade para um membro de um par de ligação específico é preferida (Kufer et al. (2004) Trends in Biotechnology vol. 22 pages 238-244). Várias tentativas têm sido feitas para produzir anticorpos multiespecíficos, por ex., biespecíficos ou fragmentos de anticorpos. Um problema na produção de anticorpos biespecíficos feitos a partir de duas cadeias de polipéptidos diferentes (cadeia pesada e leve) é a necessidade de expressar quatro cadeias diferentes (duas cadeias pesadas e duas leves) numa célula que resulta num número de várias combinações que devem ser separadas da molécula biespecífica desejada na mistura. Devido à sua semelhança, a separação destas moléculas é difícil e dispendiosa. Várias técnicas têm sido usadas para minimizar a ocorrência de tais combinações não desejadas (Cárter (2001) Journal of Immunological Methods, vol 248, pages 7-15). 38/112

Uma solução para o problema é a produção de uma cadeia de polipéptido com duas especificidades, como por ex., dois scFvs ligados um ao outro, ou a produção dos chamados diabodies. Tem-se mostrado que tais moléculas estão bem longe da dobra de uma molécula natural e são notoriamente difíceis de produzir (Le-Gall et al. (2004) Protein Engineering, Design & Selection vol 17 pages 357-366).

Outro problema da presente concepção de anticorpos biespecíficos é o facto de que mesmo se os anticorpos forem bivalentemente ligados ao seu parceiro de ligação respectivo (por ex., IgG), o anticorpo biespecífico resultante é monovalente para cada um dos parceiros de ligação respectivos.

As moléculas multiespecíficas preferidas da presente invenção resolvem estes problemas: A expressão de uma molécula biespecífica com uma cadeia polipeptídica é possível (um domínio Ig modificado com duas especificidades de ligação, ver secção exemplo), a qual é mais fácil de atingir do que a expressão de duas cadeias polipeptídeas de anticorpo (Cabilly et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3273-3277 (1984)) .

Também pode ser produzido como uma molécula tipo anticorpo (isto é, feito de duas cadeias polipeptídicas, homidiméricas ou heterodiméricas), devido ao facto de que a segunda especificidade está localizada na parte não variável da molécula, não sendo necessárias duas cadeias leve e pesada diferentes. Deste modo, não há a possibilidade de combinação errada das duas cadeias.

Um anticorpo da presente invenção pode consistir de uma cadeia pesada e uma cadeia leve, que forma em conjunto uma região variável que liga a um parceiro de ligação específico por uma primeira especificidade. A segunda especificidade pode ser formada por uma alça modificada de quaisquer alças estruturais de cadeia pesada ou cadeia leve. O local de ligação também pode ser formado por mais 39/112 de uma alça não CDR que pode ser estruturalmente próximos (na cadeia pesada ou na cadeia leve ou em ambas as cadeias). 0 anticorpo modificado ou derivado pode ser um anticorpo completo ou um fragmento de anticorpo (por ex., CH2-CH3, Fc, com ou sem a região de articulação).

Pode ser ligado de forma mono ou polivalente ao mesmo, ou parceiros de ligação diferentes, ou mesmo com diferente valência para os diferentes parceiros de ligação, dependendo da concepção.

Como existe um número de várias alças disponíveis para selecção e concepção de um local de ligação específico nas regiões não CDR de cadeias pesadas e leves, é possível conceber derivados de anticorpos com ainda mais do que duas especificidades sem os problemas acima mencionados.

Os domínios de ligação específicos dentro de uma cadeia polipeptídica podem ser ligados com ou sem um ligante peptídico. A região de alça estrutural modificada da dita imunoglobulina inventiva pode estar dentro do domínio constante da dita imunoglobulina. Está preferivelmente dentro de CH3, ou uma parte do mesmo.

De acordo com uma forma de realização da presente invenção, a imunoglobulina é de origem humana ou murina.

Uma vez que a imunoglobulina modificada pode ser utilizada para vários fins, em particular em composições farmacêuticas, a imunoglobulina é preferivelmente de origem humana ou murina. Obviamente, a imunoglobulina modificada pode também ser imunoglobulina humanizada ou quimérica. 40/112

De acordo com outra forma de realização preferida da presente invenção, a imunoglobulina humana é seleccionada do grupo que consiste de IgAl, IgA2, IgD, IgE, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM. A imunoglobulina murina é preferivelmente seleccionada do grupo que consiste de IgA, IgD, IgE, IgGl, IgG2A, IgG2B, IgG2C, IgG3 e IgM. A imunoglobulina modificada pode ser derivada de uma das classes de imunoglobulina acima identificadas, e estruturalmente alteradas depois. A imunoglobulina compreende preferivelmente uma cadeia pesada ou leve da imunoglobulina ou uma parte da mesma. Tanto a molécula heterodimérica ou uma homodimérica pode ser preferivelmente provida para efeitos da invenção, assim como imunoglobulinas monoméricas. A imunoglobulina modificada pode compreender uma cadeia leve e/ou pesada, e pelo menos um dominio variável e/ou constante. A imunoglobulina de acordo com a presente invenção compreende preferivelmente, pelo menos, um dominio constante e/ou, pelo menos, um variável da imunoglobulina ou uma parte da mesma que inclui um mini-domínio.

Um domínio constante é uma unidade de dobra da imunoglobulina da parte constante de uma molécula de imunoglobulina, também referida como um domínio da região constante (por ex., CHI, CH2, CH3, CH4, Ck, Cl).

Um domínio variável é uma unidade de dobra de imunoglobulina da parte variável de uma imunoglobulina também referida como um domínio da região variável (por ex., Vh, Vk, VI, Vd).

Uma imunoglobulina preferida de acordo com a invenção consiste de um domínio constante seleccionado a partir do grupo que consiste 41/112 de CHI, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-C, ou uma parte ou combinações dos mesmos, incluindo um mini-dominio, com pelo menos uma região de alça CH3, e é caracterizada pelo facto de que a dita, pelo menos, região de alça CH3 compreende, pelo menos, uma modificação de aminoácido que forma, pelo menos, uma região de alça CH3 modificada, em que a dita, pelo menos, uma região de alça CH3 modificada liga especificamente a, pelo menos, um epítopo de um antigeno. A imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção pode compreender um ou mais domínios constantes (por ex., dois, três, quatro, cinco, seis, dez domínios) . Se mais do que um domínio estiver presente na imunoglobulina modificada, esses domínios podem ser do mesmo tipo ou tipos variantes (por ex., CH1-CH1-CH2, CH3-CH3, região Fc,(CH2)2-(CH3)2). Claro que também a ordem dos domínios únicos podem ser de qualquer tipo (por ex., CH1-CH3-CH2, CH4-CH1-CH3-CH2).

De acordo com outra forma de realização preferida da presente invenção, as regiões de alça modificadas de CH3 compreendem aminoácidos 7 a 21, aminoácidos 25 a 39, aminoácidos 41 a 81, aminoácidos 83 a 85, aminoácidos 89 a 103 e aminoácidos 106 a 117.

De acordo com qualquer outra forma de realização da presente invenção, os resíduos de aminoácidos das posições 15 a 17, 29 a 34, 85,4 a 85,3, 92 a 94, 97 a 98 e/ou 108 a 110 de CH3 são modificados.

Ainda outro aspecto da presente invenção relaciona-se com um método para ligar e/ou detectar especificamente uma molécula que compreende os passos de: (a) Contactar uma imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção ou uma imunoglobulina modificada obtida por um método de acordo com a presente invenção com uma amostra teste suspeita de conter a dita molécula, e 42/112 (b) Detectar a formaçao potencial de um complexo de imunoglobulina específica/molécula.

Outro aspecto da presente invenção relaciona-se com um método para isolar especificamente uma molécula que compreende os passos de: (a) Contactar a imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção ou uma imunoglobulina obtida por um método de acordo com a presente invenção com uma amostra que contém a dita molécula, (b) Separar o complexo de imunoglobulina/molécula especifica formada, e (c) Opcionalmente isolar a molécula do dito complexo.

As imunoglobulinas de acordo com a presente invenção podem ser usadas para isolar especif icamente moléculas de uma amostra. Se as imunoglobulinas multiespecificas são usadas, mais do que uma molécula pode ser isolada de uma amostra. É especialmente vantajoso usar imunoglobulinas modificadas em tais métodos porque permite, por ex., gerar uma matriz com uma superfície homogénea com quantidades definidas de parceiros de ligação (isto é, imunoglobulinas modificadas) imobilizadas no mesmo que é capaz de ligar às moléculas a serem isoladas. Em contraste do mesmo, se forem usados parceiros de ligação monoespecíficos não pode ser gerada qualquer matriz homogénea porque os parceiros de ligação únicos se não ligam com a mesma eficiência à matriz.

Outro aspecto da presente invenção relaciona-se com um método para atingir um composto para um alvo que compreende os passos de: (a) Contactar a imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção ou uma imunoglobulina modificada obtida por um método de acordo com a presente invenção capaz de se ligar, especificamente, ao dito composto, 43/112 (b) Administrar o complexo imunoglobulina/composto ao alvo.

As imunoglobulinas modificadas de acordo com a presente invenção podem ser usada para administrar, pelo menos, um composto ligado às CDR e/ou regiões de alça modificadas a um alvo. Tais imunoglobulinas podem ser usadas para atingir substâncias terapêuticas para um local de acção preferido no curso do tratamento de uma doença.

Outro aspecto da presente invenção relaciona-se com a utilização de uma imunoglobulina de acordo com a presente invenção ou obtida através de um método de acordo com a presente invenção para a preparação de uma biblioteca de proteína de imunoglobulinas. Outras biblioteca de acordo com a invenção contêm, não só, uma variedade de proteínas ou proteínas de fusão, pacotes genéticos, mas também precursores de proteínas, ácidos nucleicos, ribossomas, células, vírus, fagos e outros sistemas de biblioteca, os quais expressam informação de codificação de proteínas e/ou as proteínas como tal.

Outro aspecto da presente invenção relaciona-se com uma biblioteca de proteína compreendendo uma imunoglobulina de acordo com a presente invenção ou obtida por um método de acordo com a presente invenção.

Os métodos preferidos para construir a dita biblioteca podem ser encontrados acima e nos exemplos. A biblioteca de acordo com a presente invenção pode ser usada para identificar imunoglobulinas que se ligam a uma molécula distinta.

Em particular, a presente invenção relaciona-se com a utilização de uma biblioteca compreendendo uma proteína de acordo com a presente invenção ou obtida através de um método de acordo com a presente invenção para a preparação de derivados de imunoglobulina. 44/112

Uma imunoglobulina existente pode ser alterada para introduzir locais de ligação de antigeno em qualquer dominio ou mini-dominio usando uma biblioteca de proteína do respectivo domínio de, pelo menos, 10, preferencialmente 100, mais preferencialmente 1000, mais preferencialmente 10 000, mais preferencialmente 100 000, mais preferencialmente mais de 1 000 000 domínios variantes ou mini-domínios com, pelo menos, uma alça modificada, em particular uma ou mais alças estruturais. O número de membros de uma biblioteca pode ser ainda mais elevado, na maioria dos casos até 1012, com alguns sistemas de display, tais como ribosome display, o número pode ser ainda mais elevado do que esse. A biblioteca é então filtrada em termos de união para o antigeno específico. Após caracterização molecular para as propriedades desejadas, o domínio ou mini-domínio seleccionado é clonado na imunoglobulina original através de técnicas de engenharia genética, de modo a que substitua a região do tipo selvagem. Alternativamente, apenas a codificação de ADN para as alças ou codificação para os aminoácidos mutados podem ser trocadas para obter uma imunoglobulina com o local de ligação adicional para o antigeno específico. A escolha do local para a alça estrutural específica para antigeno mutada é dependente da estrutura da imunoglobulina original e do objectivo de local de ligação adicional. Se, por exemplo, a molécula original for uma imunoglobulina completa que necessite de ser inserida num local de ligação de antigeno adicional sem perturbação de uma função efectora, as alças a serem modificadas seriam seleccionadas de diferentes domínios distantes de CH2 e CH3, os quais são parceiros de ligação naturais para moléculas Fc-efectoras. Se a imunoglobulina original for um fragmento Fab, é possível a modificação de alças em domínios constantes das cadeias leves ou cadeias pesadas, ou respectivos domínios variáveis. Para gerar uma biblioteca podemos preparar bibliotecas de moléculas 45/112 originais mutantes que têm mutações em uma ou mais alças estruturais de um ou mais domínios. A selecção com moléculas originais mutadas completas pode ter algumas vantagens na medida que a selecção para a ligação de antígeno com uma alça estrutural modificada irá aplicar as modificações estericamente vantajosas se testadas também para outras propriedades que a imunoglobulina deve agora mostrar. Em particular, a biblioteca Fc é preferida, por exemplo, com locais de ligação na região de alça C-terminal. 0 requisito de dimensão (isto é, o número de proteínas variantes) de uma biblioteca de proteína de um domínio ou mini-domínio mutado, ou uma molécula de fusão de um domínio, é dependente da tarefa. Em geral, uma biblioteca para gerar novamente um local de ligação de antígeno necessita de ser maior do que a biblioteca usada para modificar ainda mais um local de ligação de antígeno criado já existente, feito a partir uma alça estrutural modificada (por exemplo, para melhorar a afinidade ou alterar a especificidade fina para o antígeno). A presente invenção também se relaciona com uma biblioteca de imunoglobulina ou biblioteca de ácido nucleico, compreendendo uma pluralidade de imunoglobulina, por exemplo, um domínio variável ou constante, um mini-domínio e/ou, pelo menos, uma região de alça estrutural contida num mini-domínio, ou moléculas de ácido nucleico que codificam o mesmo. A biblioteca contém membros com diferentes modificações, em que a pluralidade é definida pelas modificações na, pelo menos, uma região de alça estrutural. A biblioteca de ácido nucleico inclui, preferencialmente, pelo menos, 10 diferentes membros com uma diferença na sequência nucleótida para obter, pelo menos, um aminoácido diferente (resultando numa troca de aminoácido) , e mais preferencialmente inclui, pelo menos 100, mais preferencialmente 1 000 ou 10 000 membros diferentes (por exemplo, criados por estratégias de aleatorização ou técnicas combinatórias). Ainda mais números de membros individuais 46/112 diversificados, tais como, pelo menos, 1 000 000 ou, pelo menos, 10 000 000 são também preferidos.

Um outro aspecto da invenção é a combinação de duas imunoglobulinas, domínios ou mini-domínios diferentes seleccionados de, pelo menos, duas bibliotecas de acordo com a invenção, de modo a gerar imunoglobulinas multiespecíficas. Estas imunoglobulinas específicas seleccionadas podem ser combinadas entre si e com outras moléculas, de forma semelhante aos componentes básicos, para conceber a disposição óptima dos domínios ou míni-domínios para obter as propriedades desejadas. Por exemplo, uma molécula baseada em Fc pode ser usada como tal, com propriedades de ligação de antígeno, como um portador para outros motivos de ligação ou como um componente básico para criar uma imunoglobulina com domínios constantes ou variáveis, ou de outro modo, combinados com apenas domínios constantes, tais como moléculas Fc multiméricas, preferencialmente com 2, 3 ou 4 locais de ligação de antígeno.

Além disso, uma ou mais imunoglobulinas modificadas de acordo com a invenção podem ser produzidas em vários ou em todos os diferentes locais de uma proteína, sem destruição da estrutura da proteína. Através de tal técnica de “transposição de domínio", as novas bibliotecas são criadas, as quais podem novamente ser seleccionadas para as propriedades desejadas.

Preferencialmente, a imunoglobulina de acordo com a presente invenção é composta por, pelo menos, dois domínios de imunoglobulina, ou parte da mesma, incluindo um mini-domínio, e cada domínio contém, pelo menos, um local de ligação de antígeno.

Também preferida é uma imunoglobulina de acordo com a invenção, a qual compreende, pelo menos, um domínio da região constante e/ou, pelo menos, um domínio da região variável da imunoglobulina, ou uma parte da mesma, incluindo um mini-domínio. Assim, os domínios 47/112 variáveis, os quais são, por exemplo modificados na região C-terminal, ou o domínio variável ligado a uma região CHI modificada, por exemplo, um mini-domínio modificado CHI é uma das formas de realização preferidas. A biblioteca preferida contém, imunoglobulinas de acordo com a invenção, seleccionadas do grupo que consiste dos domínios de uma imunoglobulina, mini-domínios ou derivados dos mesmos.

Uma forma de realização preferida da presente invenção é uma molécula de ligação para um antígeno (antígenos, molécula de ligação) compreendendo, pelo menos, um domínio de imunoglobulina e uma região de alça estrutural modificada de acordo com a presente invenção para se ligar ao antígeno, em que a dita molécula de ligação não compreende o domínio variável do anticorpo. Pode compreender outras partes utilizáveis para actividades de anticorpo (por exemplo, tais como regiões naturais ou modificadas efectoras (sequências); contudo, falta a região de ligação natural dos anticorpos, isto é, os domínios variáveis ou alças CDR, incluindo alças VFR dentro da região CDR, na sua posição natural. As moléculas de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção, tem as vantagens descritas acima para as presentes moléculas; no entanto, sem as actividades de ligação específicas dos anticorpos mediados por alças CDR; contudo, com uma actividade recém-introduzida de ligação específica na região de alça estrutural.

Preferencialmente, estas moléculas de ligação de antígeno de acordo com a presente invenção compreendem CHI, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-C e combinações das mesmas; as ditas combinações compreendem, pelo menos, preferencialmente, pelo menos, quatro, especialmente seis domínios constantes e, pelo menos, uma alça estrutural CH3 ou uma região de alça CH3, modificada de acordo com a presente invenção. Preferencialmente, estas regiões de alça estrutural CH3 são ligadas através da região de alça estrutural modificada de acordo com a 48/112 presente invenção, ou as alças estruturais estando naturalmente presentes entre os dois ditos domínios constantes. Uma forma de realização destas moléculas de ligação de antígeno, de acordo com a presente invenção, consiste de uma região Fc de um anticorpo com, pelo menos, uma modificação numa alça estrutural CH3 de acordo com a presente invenção. Também para as moléculas de ligação de antígeno, de acordo com a presente invenção, é preferido que os novos locais de ligação de antígeno nas alças estruturais sejam introduzidos por tecnologias de aleatorização, isto é, ao alterar um ou mais resíduos aminoácidos da alça por técnicas de aleatorização, ou por introduzir insertos gerados aleatoriamente em tais alças estruturais. Alternativamente, é preferida a utilização de abordagens combinatórias. Preferencialmente, os locais de ligação de antígeno nas alças estruturais CH3 modificadas são seleccionados de bibliotecas adequadas.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção relaciona-se com uma imunoglobulina modificada tendo um local de ligação de antígeno para providenciar uma especificidade estranha à imunoglobulina não modificada e incorporada em uma ou mais alças estruturais. 0 termo "estranho" significa que o antígeno não é reconhecido pela região de ligação CDR específica ou outras regiões de ligação naturais ou intrínsecas da imunoglobulina. Um parceiro de ligação estranho, mas não o parceiro de ligação natural de uma imunoglobulina, pode então ser ligado pelo local de ligação de antígeno recém-formado por uma alça estrutural, isto significa que um parceiro de ligação natural, tal como um receptor-Fc ou um efector do sistema imune, não é considerado ser ligado pelo local de ligação de antígeno estranho à imunoglobulina não modificada.

As imunoglobulinas preferidas de acordo com a presente invenção compreendem, pelo menos, dois locais de ligação de antígeno, o primeiro local ligando-se a um primeiro epítopo e o segundo local ligando-se a um segundo epítopo. 49/112

De acordo com uma forma de realização preferida, a presente imunoglobulina compreende, pelo menos, duas regiões de alça, a primeira região de alça ligando-se a um primeiro epitopo, e uma segunda região de ligação de alça ligando-se a um segundo epitopo. Tanto, pelo menos, a primeira ou, pelo menos, segunda região de alça, ou ambas podem conter uma alça estrutural CH3. As imunoglobulinas de acordo com a presente invenção incluem os fragmentos das mesmas, conhecidas na técnica como sendo funcionais, as quais contêm os elementos essenciais de acordo com a presente invenção: a alça estrutural ou região de alça modificada de acordo com a presente invenção. A imunoglobulina preferida de acordo com a invenção compreende um dominio que tem, pelo menos, 50% de homologia com o domínio não modificado. O termo “homologia" indica que os polipéptidos têm os mesmos resíduos ou resíduos conservados numa posição correspondente à posição na sua estrutura primária, secundária ou terciária. O termo também se estende a duas ou mais sequências nucleótidas que codificam os polipéptidos homólogos. "Domínio de imunoglobulina homóloga" significa um domínio de imunoglobulina de acordo com a invenção tendo, pelo menos, cerca de 50% de identidade de sequência de aminoácido relativamente a uma sequência de domínio de imunoglobulina de sequência nativa de comprimento total, ou quaisquer outros fragmentos de uma sequência de domínio de imunoglobulina de comprimento total como aqui descrito. Preferencialmente, um domínio de imunoglobulina homóloga terá, pelo menos cerca de 50% de identidade de sequência de aminoácido, preferencialmente, pelo menos, cerca de 55% de identidade de sequência de aminoácido, mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 60% de identidade de sequência de aminoácido, mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 65% de identidade de 50/112 sequência de aminoácido, mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 70% de identidade de sequência de aminoácido, mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 75% de identidade de sequência de aminoácido, mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácido, mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 85% de identidade de sequência de aminoácido, mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácido, mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 95% de identidade de sequência de aminoácido com uma sequência de domínio de imunoglobulina nativa, ou qualquer outro fragmento especificamente definido de uma sequência de domínio de imunoglobulina de comprimento total como aqui descrita. "Porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácido" relativamente às sequências de domínio de imunoglobulina aqui identificadas é definido como a porcentagem de resíduos de aminoácido numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácido na sequência de domínio de imunoglobulina específica, após alinhar a sequência e introduzir espaços, se necessário, para conseguir uma porcentagem de sequência de identidade máxima, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade da sequência. O alinhamento para efeitos de determinar a porcentagem de identidade de sequência de aminoácido, pode ser conseguido de várias formas que estão dentro da competência da técnica, por exemplo, usando software informático publicamente disponível tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Aqueles com experiência na técnica podem determinar parâmetros adequados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para conseguir alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências que estão a ser comparadas.

Os valores de porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácido podem ser obtidos como descrito em baixo usando o 51/112 programa informático WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266 : 460-480 (1996). A maioria dos parâmetros de pesquisa do WU-BLAST-2 é definida pelos valores por defeito. Aqueles não definidos em valores por defeito, por exemplo, os parâmetros ajustáveis, são definidos com os seguintes valores: overlap span=l, overlap fraction=0.125, word threshold (T)=ll, e scoring matrix=BLOSUM62. Quando é utilizado o WU-BLAST—2, é determinado um valor de sequência de % de aminoácido ao dividir (a) o número de resíduos de aminoácido idênticos correspondentes entre a sequência de aminoácido do domínio de interesse da imunoglobulina tendo uma sequência derivada do domínio de imunoglobulina nativa e a sequência de aminoácido de comparação de interesse (isto é, a sequência face à qual o domínio de imunoglobulina de interesse está a ser comparada, o qual pode ser um domínio de imunoglobulina não modificada) como determinado por WU-BLAST-2 por (b) o número total de resíduos aminoácidos das partes não aleatorizadas do domínio de imunoglobulina de interesse.

Por exemplo, na declaração "um polipéptido" compreendendo "uma sequência de aminoácido A, a qual tem, ou tendo, pelo menos, 80% de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido B", a sequência de aminoácido A é a sequência de aminoácido de comparação de interesse e a sequência de aminoácido B é a sequência de aminoácido do domínio de imunoglobulina ou interesse.

Outro aspecto da presente invenção relaciona-se com um kit de parceiros de ligação contendo (a) uma imunoglobulina modificada tendo um local estranho de ligação de antígeno para a imunoglobulina incorporada em uma ou mais alças estruturais CH3, e (b) uma molécula de união contendo um epítopo do dito antígeno.

Tal molécula de união deste kit, de acordo com a presente invenção, pode ser usada como agente de captura para identificar a 52/112 especificidade de ligação da imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção. Ao utilizar a molécula de ligação deste kit de acordo com a presente invenção, a potência das imunoglobulinas de acordo com a presente invenção pode ser determinada. A potência como aqui definida é a propriedade de ligação da molécula modificada para o seu antígeno. A ligação pode ser determinada quantitativamente e/ou qualitativamente em termos de especificidade e/ou afinidade e/ou avidez, como usada para efeitos de controlo de qualidade.

As propriedades de ligação das moléculas de acordo com a invenção obtidas após modificação podem ainda ser afinadas através de técnicas padrão, tais como maturação de afinidade. Deste modo a sequência nucleótida, dentro ou à volta do local de ligação de antigeno, é ainda trocada para modular as propriedades de ligação.

Além disso, a molécula de união de um kit de acordo com a presente invenção pode ser usada para seleccionar a imunoglobulina modificada com a potência adequada de acordo com a presente invenção de uma biblioteca que consiste de, pelo menos, 10, preferencialmente, pelo menos, 100, mais preferencialmente, pelo menos 1 000, mais preferencialmente, pelo menos, 10 000, especialmente, pelo menos 100 000 imunoglobulinas com diferentes modificações nas alças estruturais.

Os exemplos mostraram que uma das caracteristicas chave é conceber esses domínios ou regiões de imunoglobulina, as quais não estão normalmente envolvidas nas funções intrínsecas desejáveis de um anticorpo, tais como ligação de antígeno. Assim, modificar em regiões que não a região CDR, incluindo aquelas alças adjacentes às alças CDR de um anticorpo, preservaria a sua função de ligação de antígeno. Foi observado que a dobra específica dos domínios de 53/112 imunoglobulina permite a introdução de mutações aleatórias em regiões as quais são estruturalmente análogas às CDR, mas diferentes em posição e sequência. As regiões identificadas pela presente invenção são, como CDR, regiões de alça que ligam as cadeias beta da dobra da imunoglobulina.

Mais especificamente, é aqui descrito que ao introduzir mutações, por exemplo, mutações aleatórias nas alças que ligam as cadeias beta A-B e E-F do domínio humano IgGl CH3, foram seleccionados domínios CH3 mutados que se ligam especif icamente a receptores tipo-Toll de 9-péptidos (TLR-9) ou a lisossoma de ovo de galinha, que são um péptido e uma proteína, respectivamente, que não são normalmente reconhecidas e ligadas por domínios CH3 humanos de IgGl. As mutações introduzidas por nós incluem mutações, nas quais os resíduos de aminoácido seleccionados na sequência do tipo selvagem foram substituídos por resíduos escolhidos aleatoriamente, e também incluem inserções de resíduos de aminoácido extra nas alças acima mencionadas.

Por analogia, os domínios de imunoglobulina de quaisquer classes de imunoglobulinas e de imunoglobulinas de quaisquer espécies são receptivos a este tipo de concepção. Além disso, não só as alças específicas indicadas na presente invenção podem ser manipuladas, mas quaisquer cadeias beta de ligação de alça em domínios de imunoglobulina podem ser manipulados do mesmo modo.

Os domínios de imunoglobulina criados de qualquer organismo e a partir de qualquer classe de imunoglobulina podem ser produzidos de acordo com a presente invenção, quer como tal (como domínios únicos), ou como parte de uma molécula maior. Por exemplo, pode ser parte de uma imunoglobulina intacta, o que deste modo poderia ter as suas regiões de ligação de antígeno "normais" formadas por 6 CDR e a nova região de ligação de antígeno criada. Deste modo, uma imunoglobulina multiespecíf ica, por exemplo, biespecífica, poderá 54/112 ser gerada. Os domínios de imunoglobulina criados podem também fazer parte de qualquer proteína de fusão. A utilização destes domínios de imunoglobulina criados é o campo geral da utilização das imunoglobulinas.

Excepto onde indicado de outro modo, toda a numeração das sequências de aminoácido das imunoglobulinas está de acordo com o esquema de numeração IMGT (IMGT, the International ImMunoGeneTics Information system@imgt.cines.fr; http;//imgt.cines.fr; Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res . 27: 209-212; Ruiz et al., 2000 Nucleic Acids Res . 28: 219-221; Lefranc et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29: 207- 209; Lefranc et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31: 307-310; Lefranc et al., 2005, Dev Comp Immunol 29:185-203). SEQ ID No.l

PREPQVYTL.PPSRDELTKNQVSI.TCLVKQF ypsdiavbkesngqpennykttppvldsdg

SFFLYSKLTVDKS RWQQGNV FS CS VMHEAL HNHYTQKSLSLSPGKAAA SEQ ID NO.2 ccatggcccc ccgagaacca c&ggtgfcaca ccctgccccc atcccgtgac gagctcnnsn nsnnscaagt cagcctgacc tgcctggtca aaggcfctcta tcccagcgac atcgccgtgg agfcgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac eaçgcctccc gtgctggaot ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc ttaccgtgnn snnsnnsagg tggnnsrmsq ggaacgtctfc ctcatgcfccc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagoaga gcctctccct gfcctccgggt aaagcggccg ca // SEQ ID No.3

DiAP RE PQVYTLPPSRDELXXXOV S LTCI.VK GFYPSDIAVEWBSNGQPENNYKTTPPVI.DS CGS FFGySKLTVXXXRWXXGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSIS LS PGKAAA SEQ ID No. 4 cttgceatgg ccccccgaga accacaggtg tac SEQ ID NO. 5 agtcgagctc gtcacgggat gggggcaggg SEQ IO Bo.6 gtacgagctc nnstmsonsc aagtcagcct gacctgcctg g SEQ ID No.7 tgccaagctt gctgfcagagg aagaaggagc cg SEQ TD No.8 tgccaagctt accgtgnnsn nsnnaaggtg gnnsnnsggg aacgtcttct catgctceg SSQ ID No.9 agttgcggcc gctfctacccg gagscaggga gag SEQ ID No.10

MAPRSPQVYTLP PSRDELXXXQV3LTCI.YK GFYPSDia.VEMESNGQPENNYKTTPPVI.DS OGSFFLYSKLTVXXXXXXSWXXGNVFSCSV MHSAi!ttJHYTQKSLSI.SPGKAAA

SSQ ID No. IX ccatggcccc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgtgac gagctcrmsh nsnnscaagt cagcctgacc tgcctggtca aaggcfctcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 55/112 ccggagaaea actacaagac caegccfcccc gfcgcfcggaefc cegacggctc cttcfctcctç t&cagceagc ttaccgfcgnxí sjjasnnssms nnsnnsaggt ggrmsnasgg gaacgtettc fcc&tgcfcccg tgafcgcatga ggctcfcgcac aaccacfcaea çaeagsagag cctctccetg tctccgggta aageggccgc a SEO X» 80.12 tgecaagctt accgtgnnsn nsrmsnrsaim sansaggfcgg nasnnsggga acgtcttctc afcgcfcccg SEQ IO 80.13 JíR?REPaVirTl??SRDSI>XXXQVSMCI.Vg:

Gr¥OSDXAV:E8E5KSQSS8KYKSSS>FVJiBS DGSEr^XSKlTVXXXXXXXXRvSXXSHVESCSV KHERIHf?HYTQSSX<Sl>S PGSÃfiA SEQ IO -80.14 ceatggcccc ccgagaacca caggtgtaca «ocfcgcccçc afccccgtgac gagcfccnnsn naasscaagfc cagoctgacc tgectggtca aaggetfcct» tecoagcgac atcgecgfegg agtgggagag eaatgggcag ccggagaaca actacaagaç cacgeotecc gcgctggacfc ccgacggctc cttcfefccctc tacagcaagc fctaccgfcgrm sRtujimsnn# nas»ns»aan asaggtggaa snnsgggaac gtsAfcctcat gctccgfcgat gcatgagget cfcgcacaacc actacacaca g&agagcctc t.ex;cfcgtctc egggtaaagc ggacgca

SSQ XO 80. IS tgccaagcfcfc aocgtgnnaa nssmstmsnn anaannsans aggfcggmssa nsgggaacgt; cfctofccatgc tcog

Exemplo 1 Construção da biblioteca CH3 e phage surface display A estrutura de cristal de um fragmento IgGl Fc, z qual é publicado na Base de Dados Brookhaven como entrada lOQO.pdb foi usada como ajuda na concepção do domínio CH3 mutado. A sequência que foi usada como a base para a construção da biblioteca CH3 é indicada na SEQ ID N°. 1. Nesta sequência, o primeiro aminoácido corresponde à Prolina 343 da cadeia A da base de dados Brookhaven entrada loqo.pdb. 0 último resíduo obtido em loqo.pdb é Serina 102 da SEQ ID N°.l. Após análise detalhada da estrutura do loqo.pdb, e através da inspecção visual dos resíduos que formam as alças que ligam as cadeias beta, foi decidido aleatorizar os resíduos 17, 18 e 19, os quais fazem parte da alça que liga a cadeia beta A-B, assim como 71, 72, 73, 76 e 77, que fazem parte da alça que liga a cadeia beta E-F da SEQ ID N°. 1. 0 gene criado foi produzido por uma série de reacções PCR seguidas por ligação dos resultantes produtos PCR. Para facilitar a ligação, alguns dos codões da sequência de nucleótido que codifica a SEQ ID N°. 1 foram modificados para produzir locais de restrição sem alterar as sequências de aminoácido (mutações silenciosas). Para inserção no 56/112 vector de clonagem pHENl (Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11; 19 (15) :4133-7. Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G.) na estrutura com o sinal de secreção pelB, foram anexados resíduos de nucleótido extra codificando Met-Ala na extremidade 5' da sequência para criar um local de restrição Ncol. Para os resultados aleatorizados, o codão NNS (código IUPAC, em que S significa C ou G) foi o escolhido, o qual codifica todos os 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente, mas evita 2 de 3 codões de stop. A sequência criada é indicada como sequência nucleótida na SEQ ID N° . 2 e como sequência de aminoácido na SEQ ID N°. 3. A Letra X na SEQ ID N°. 3 denota resíduos de aminoácido aleatorizados. As sequências dos iniciadores PCR usados para montagem do domínio CH3 mutado são indicadas na SEQ ID N°. 4 até 9. O cDNA da cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 3D6 (Felgenhauer M, Kohl J, Ruker F. Nucleotide sequences of the cDNAs encoding the V-regions of H- and L-chains of a human mono-lonal antibody specific to HIV-l-gp41. Nucleic Acids Res. 1990 Aug 25;18 (16) :4927.) foi usado como modelo para as reacções PCR. Os 3 produtos PCR foram digeridos com Saci e/ou HindIII, respectivamente e ligado em conjunto. O produto de ligação foi ainda mais digerido com Ncol e Not I e ligado no vector fagomídeo de surface display pHenl, o qual foi previamente digerido com Ncol e NotI. Um número de clones seleccionados foi controlado por análise de restrição e por sequenciação de ADN e foi descoberto conterem o inserto como planeado, incluindo as sequências aleatorizadas inseridas correctamente. Para os seguintes passos da preparação do fago foram seguidos os protocolos padrão. Resumidamente, a mistura de ligação foi transformada em células E.coli TG1 por electroporação. Subsequentemente, as partículas de fago foram salvas das células E.coli TG1 com fago ajudante M13-K07. As partículas de fago foram precipitadas de um supernadante de cultura com PEG/NaCl em dois 57/112 passos, dissolvidas em água e usadas para selecçao ao peneirar ou, alternativamente, foram armazenadas a 80 °C negativos.

Exemplo 2: - Construção de biblioteca CH3+3

Esta biblioteca foi construída e clonada do mesmo modo que a biblioteca CH3. A sequência de aminoácido do construto é indicada na SEQ ID N°.10, a sequência nucleótida correspondente na SEQ ID N°. 11, e os iniciadores usados para construção foram SEQ ID N°. 4-7, SEQ ID N°. 9 e SEQ ID N°. 12.

Exemplo 3 Construção da biblioteca CH3+5

Esta biblioteca foi construída e clonada do mesmo modo que a biblioteca CH3. A sequência de aminoácido do construto é indicada na SEQ ID N°. 13, a sequência nucleótida correspondente na SEQ ID N°. 14, e os iniciadores usados para construção foram SEQ ID N°. 4-7, SEQ ID N°. 9 e SEQ ID N°. 15.

Exemplo 4 Construção de uma biblioteca CHI

Na biblioteca de IgCl CHI humano, Ser93, Ser94, Ser95, Gly98, Thr99 e GlnlOO foram aleatorizados e 3 resíduos aleatórios inseridos adicionalmente usando mutagénese aleatória direccionada ao local. O Leu96 não foi mutado. Em outra biblioteca de IgCl CHI humano, Pro92, Ser93, Ser94, Ser95 Leu96 ThrlOl, Gly98, Thr99 e GlnlOO foram aleatorizados e 3 resíduos aleatórios inseridos adicionalmente usando mutagénese aleatória direccionada ao local. A codificação dos genes das bibliotecas foi clonada na estrutura com o líder pelB no N-terminal e na estrutura com proteína III do fago fd no C-terminal, usando os locais de restrição Ncol e Notl do vector fagomídeo pHENl. A preparação das partículas de fago, selecção e selecçao de clones de ligação específicos foi realizada usando procedimentos padrão. 58/112

Sequência da biblioteca:

Sequência nucleótida da primeira biblioteca CHI:

1 CCCTCCACCA AGGGCCCATC GCTÇTTCCCC CTGGCACCCT CCTCCAAGAG CACCYCTGCC G6CACM3CÇG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAO GACTACTTCC 101 CC&MCCGG? OACCGTGTCG TGGAACTCAG CGGCCC7GAC CAGCSGCGTG CACACCTTCC CSGCTGTCCT ACAGTCCTCA GGACTCTACT CCCTCAGCAfi

201 COtCGTGACC OtGCCUtKSH HBHHSTTGltH &NH3HHSNH3 NN9HHSACCT ACATCfGCAA CÇTCAATCAC AAGCCCAGCA ACACCAACWt GGACAAGAAA

301GTTOAOCCCA AATCTGCGGC CGCA

Sequência de aminoácido da primeira biblioteca CHI:

ΗΚΥί£ΡΤΑΑΑΰΙ<Ιι1ιΙιΑΛΟΡΜ4λΑ5ΤΚ6ΐ5νΡ?1ιλΡ55ΚΕ»Τ£66ΤΑλ1*601ινΐΦΥΓΡΕΐντν£ΗΝ£6ΑΙ?8(;νΚΤΡΡΑνΐΧ)3άάΉ5 LSSWTVPXXXLXJOCXXXTYICNVHHKPSÍJTXVDK KVEPK8AAA

Sequência nucleótida da segunda biblioteca CHI:

1 GCCTCCACCA AGGGCCCATC GSTCTTCett CTGGCACCCT CCTCCAAGAG CACCTCTGGG GGCACAGCM CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG SACTASTTCC

101 CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG GCGCCCTGAC CAGCGGCGtG CACACCTTCC CGGCTGTCCT GCA3TCCTCA GGACTCTACT CCCTCAGCAG 201 CGTGGTGACC GTGHNStWSH HSHHSKNGHN SHKSHHSHHB HXSBNSHHBT ACATCTGCAA CGTGAATCAC AAGCCCAGCA ACACCAAGCT GGACAAGAAA 301 GTTGACCCCA AATCTGCGGC CGCT

Sequência de aminoácido da segunda biblioteca CHI:

ASTKGPSVFÍ'LAe5SKSTSCGTAAI.CCLVKnYFfGPVTV5WNSGÃl.TSGVHTFTAVlC|SSQlTBLaSWTVa«»DOCOOO<JCÍlC(WHHKP5HTKVDXKVEFKSAAA

Exemplo 4 Construção de uma biblioteca CL

Na biblioteca de IgGl CL humana, Ser92, Lys93, Ala94, Asp95, Glu97, Lys98 e His99 foram aleatorizados e 3 resíduos aleatórios foram inseridos adicionalmente entre o Serl6 e Glyl7 usando mutagénese aleatória direccionada ao local. A codificação dos genes para as bibliotecas foi clonada na estrutura com o líder pelB no N-terminal e na estrutura com a proteína III a partir do fago fd no C-terminal usando os locais de restrição Ncol e Notl do vector fagomídeo pHENl. A preparação das partículas de fago, selecção e selecção de clones de ligação específicos foi realizada usando procedimentos padrão.

Sequência nucleótida da biblioteca CL: 59/112

1 KTGGCTCCAC CATCTCTCTT CATCtTCCCG GCKECTGAtS AGCAGTTGAA ATCTWtEHBS HBSGGAACTG CCÍCIGTTGT GTGCCTGCTO AATAACTTCT

101 ATCCCAGAGA GGtXAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAAICG GGTAACTCCC AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAG6 ACAGCACCTA

201 CAGCCTCACG TCGACCCTGA CGCTGHHSHH SHHSHSSTAC XNSHHSHNSA AAGTCTACGC CtGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGtCACA

»1 AAGACCTTCA ACAGGGGAGA G

Sequência de aminoácido da biblioteca CL: VAAP$vriFr?$MQI.K*>0WGTXSVVCLfcKNFYPftCM<V0WKVt>tlAlQ$GtfSQEmEQDSKDSTYSLtoTLTIiXWWíX#XKmcEVTHQ6LS5PVTK5FNRGe

Exemplo 5 Selecção do CH3 - biblioteca do fago no péptido RplO-L

Foram realizadas 3 rondas de selecção. As placas activadas com maleimida (Pierce) foram revestidas com um péptido sintético RplO-L, representando um mimo topo de marcador molecular de célula-B CD20 (Perosa et al. Ann NY Acad Sei. (2005) 51:672-83). A sua sequência de aminoácido deduzida é como se segue: ITPWPHWLERSS. 200 μΐ da seguinte solução foram adicionados por poço: PBS, pH=7,2, com as seguintes concentrações de péptidos dissolvidos:

Ia ronda de selecção : 100 pg/ml 2a ronda de selecção : 100 yg/ml 3a ronda de selecção : 50 ρμ/ml. A incubação foi realizada durante a noite a 4 °C, seguida por bloqueio com 10 pg/ml de cisteina-HCl em PBS, com 200 μΐ por poço durante 2 h à temperatura ambiente. A biblioteca de surface display phage, contendo concentrações iguais de fago das bibliotecas CH3, CH3+3, CH3+5 e CH3+7, foi então deixada a reagir com o péptido ligado ao adicionar suspensão de fago e 2% de BSA-PBS até 200 μΐ, seguido por incubação durante 45 min. com agitação e 90 min. sem agitação à temperatura ambiente.

As partículas de fago não unidas foram lavadas do seguinte modo:

- Após a Ia ronda de selecção : 15x200 μΐ T-PBS, 5x200 μΐ T- PBS 60/112

- Após a Ia ronda de selecçao : 15x200 μΐ T-PBS, 10x200 μΐ T- PBS - Após a Ia ronda de selecção : 20x200 μΐ T-PBS, 20x200 μΐ T- PBS. A eluição de partículas unidas foi realizada ao adicionar 200 μΐ por poço de 0,1 M de glicina, pH=2,2, e incubação com agitação durante 30 min. à temperatura ambiente. Subsequentemente, a suspensão de fago foi neutralizada ao adicionar 60 μΐ 2M Tris-base, seguido pela infecção de células E.coli TGI ao misturar 10 ml de cultura de crescimento exponencial com 0,5 ml de fago eluído e incubação durante 30 min. a 37 °C. Finalmente, as bactérias infectadas foram colocadas em meio TYE com 1% de glucose e 100 pg/ml de ampicilina, e incubadas a 30 °C durante a noite.

Resultados da selecção do CH3 - biblioteca do fago no péptido RplO-L

Titulações do fago

Ronda de selecção Concentração de RplO-L Entrada (fago/ml) Saída (fago/ml) Ia 100 pg/ml 2xl014 2xlOiU 2a 100 pg/ml 3xl017 3xlOiU 3“ 50 pg/ml 6, 02xl014 1, 5xl0lu

Exemplo 6 Clonagem de clones seleccionados para expressão solúvel.

As sequências de domínio CH3 de codificações alteradas, contidas dentro das partículas de fago eluídas, foram amplificadas em lote com PCR. Após restrição com Ncol e Notl, foram inseridas em pNOTBAD (Vector pBAD da Invitrogen com local Notl subsequentemente inserido). Após transformação em E.coli E104, as células foram seleccionadas no meio TYE com 1% de glucose e 100 pg/ml de ampicilina a 30 °C.

Expressão solúvel de clones seleccionados e selecção 61/112

Foram cultivadas 4x96 colónias de ampicilina resistente em 200 μΐ de meio 2xYT com ampicilina emplacas de microtitulação num agitador durante a noite a 30 °C. Foram então induzidas em L-arabinose adicionada à concentração de 0,1%. Após outra incubação durante a noite, as células foram recolhidas ao centrifugar 15 min. a 2000 rpm, à temperatura ambiente e as suas proteinas de periplasma foram libertadas ao suspender novamente em 100 μΐ de solução-tampão de Na-borato (160 mM Na-borato, 200 mM NaCl, pH=8,0) e incubação durante, pelo menos, 6 horas.

Para selecção, 4 placas de maleimida foram cobertas com uma solução de 100 yg/ml de 50 yg/ml de péptido RplO-L, dissolvido em PBS, pH=7,2, durante a noite a 4 °C. As placas foram bloqueadas com 10 pg/ml de cisteina-HCl em PBS, com 200 μΐ por poço durante 2 h, à temperatura ambiente. A proteína periplásmica foi então deixada a reagir com o péptido ligado ao adicionar 50 μΐ de lisato e 50 μΐ de 2% de BSA-PBS, seguido por uma incubação durante a noite, à temperatura ambiente. A ligação das proteínas marcadas por his foi revelada por incubação de 90 min. com uma solução de anticorpos de 100 μΐ por poço, face à tetra-his (QIAgen), diluído 1:1000 em 1% de BSA-PBS, e uma incubação de 90 min. com uma solução de 100 μΐ por poço de anticorpos de cabra anti-camundongo, marcados com HRP (Sigma), diluído 1:1000 em 1% de BSA-PBS. Foram observados sinais após a adição de substrato OPD (3 mg/ml) em solução-tampão Na-citrato/fosfato, pH=4,5 e 0,4 μΐ/ml H202. A reacção foi parada ao adicionar 100 μΐ de 1,25 M H2S04.

Os resultados de selecção para ligar RplO-L num único poço por clone.

Clone Α.21 A.57 B63 B78 C50 C55 D5 D37 D39 D80 D83 D91 A492/620 0,395 0,039 0,063 0,075 0,190 0,045 0,644 0,071 0,448 0,077 0,426 0,142 62/112

Reacção Anterior

Placa ã-492/620 A 0,027 B 0,035 C 0,037 D 0,035

Os clones que revelem um sinal positivo foram cultivados em 20 ml de 2xYT com ampicilina, a 30 °C durante a noite. Depois foram inoculados 1:20 em meio novo, e após 3 h a 30 °C foram induzidos com concentração final de 0,1% de L-arabinose, e deixados para expressar o domínio CH3 recombinante durante a noite a 16 °C. O periplasma das células expressantes foi então lisado em 1 ml de solução-tampão de Na-borato, pH=8,0, durante um mínimo de 6 h. O extracto periplásmico foi deixado a reagir com o péptido RplO-L e a ligação foi revelada exactamente como acima descrito.

Resultados de selecção para ligação de RplO-L clone A.21 a57 s63 b78 C50 c55 d5 d37 D39 d80 d83 d91 ΚρΙΟ- ί pg/ml - 0,265 0,006 0,006 0,005 0,803 0,006 0, 035 0, 006 0,469 0,004 0,088 0,009 0,81 0,362 0,005 0,007 0,006 1,202 0,008 0,052 0,008 0,660 0,007 0, 106 0,009 1,63 0,383 0,006 0,007 0,006 1,308 0,014 0,050 0,014 0,719 0,008 0,129 0,005 3,13 0,352 0,008 0,010 0,005 1,453 0,006 0,060 0,006 0,719 0,008 0,210 0,006 6,25 0,343 0,005 0,008 0,006 1,516 0,007 0,057 0,007 0,694 0,006 0,114 0,008 12,5 0,315 0,007 0,009 0,006 1,495 0,007 0,064 0,007 0,770 0,007 0,130 0,009 25,0 0,335 0,008 0, 010 0,008 1,603 0,009 0,063 0,009 0,868 0,008 0,120 0,007 50,0 0,398 0,009 0,011 0,009 1,632 0,009 0,070 0,009 0,765 0,008 0,125 0,008

Clonagem de clones seleccionados para expressão solúvel em pET27b

As sequências de codificação de domínio CH3 alteradas, contidas dentro dos clones que produziram um sinal significativo da ligação 63/112 a RplO-L, foram amplificadas com PCR. Após restrição com Ncol e Notl, foram inseridas em pET27b (Novagen). Após transformação em E.coli BL21 (DE3), as células transformadas foram seleccionadas no meio TYE com 1% de glucose e 50 yg/ml de canamicina a 30 °C.

Os clones que revelam um sinal positivo foram cultivados em 20 ml de meio M9ZB com 2% de glucose e canamicina, a 30 °C durante a noite. Foram inoculados 1:20 em meio novo, e após 3 h a 30 °C foram induzidos com meio contendo 1% de glicerina em vez de glucose, canamicina e lmM IPTG, e deixados a expressar o domínio CH3 recombinante a 16 °C durante a noite. O periplasma das células expressantes foi então lisado em 1 ml de solução-tampão de Na-borato, pH=8,0, durante um mínimo de 6 h. O extracto periplásmico foi analisado para a presença da proteína recombinante com western blotting e detecção com anticorpos anti tetra-his (QIAgen).

As sequências nucleótidas e sequências proteicas inferidas de clones de ligação CD-20

Clone 1° grupo 20 grupo 3 ° grupo Biblioteca fonte A21 VDG PWGPRD WP CH3+3 C50 * LTH ALCRWF VQ CH3+3 D5 ALR FCGGW GL CH3+3 D39 GWW QQKPFA TD CH3+3 D83 APP DLVHVA MV CH3+3 *uma inserção de dois nucleótidos no 2o grupo de resíduos mutados provoca uma inserção de G entre resíduos R e W, de outro modo constantes, separando o 2o e 3o grupos de resíduos mutados

Sequência proteica de clone D83 de biblioteca CH3+3 específica CD20 (numeração IMGT) 64/112 15-17 92-94

MAPREPQVYTLPPSRDELAPPQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV

DLV 97-98 hvarwmvgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkma

Análise de ligação do CD-20, expresso em células, usando FACS

Aproximadamente 105 células Daudi foram lavadas com PBS (800 rpm, 5 min., temperatura ambiente) e o domínio CH3 recombinante em 1% de BSA-PBS foi deixado a ligar durante 2h em gelo. As células foram lavadas novamente em PBS e depois foram deixadas a reagir com 2 pg/ml de anticorpo anti penta His-Alexa Fluor 488 (QIAgen), diluídas em 1% de BSA-PBS, durante 30 minutos em gelo. Após lavar, as células foram analisadas em FACS. As células não marcadas, do domínio do tipo selvagem CH3 e linha celular K562 foram usadas como controlos.

Exemplo 7 ISOLAMENTO DE CHI - antigénio CD20 de ligação de proteínas mutantes

Foram realizadas 3 rondas de selecção. As placas activadas por maleimida (Pierce) foram revestidas com um péptido sintético, representando um mimotopo de marcador molecular célula-B CD20. 200 μΐ da seguinte solução foram adicionados por poço: PBS, pH=7,2, com as seguintes concentrações de péptidos dissolvidos:

Ia ronda de selecção : 100 yg/ml 2a ronda de selecção : 100 yg/ml 3a ronda de selecção : 50 pg/ml. A incubação foi realizada durante a noite a 4 °C, seguida por bloqueio com 10 yg/ml de cisteína-HCl em PBS, com 200 μΐ por poço durante 2 h, à temperatura ambiente. 65/112 A biblioteca de surface display phage, mostrando domínio CHI mutado, foi então deixada a reagir com o péptido ligado ao adicionar suspensão de fago e 2% de BSA-PBS até 200 μΐ, seguido por incubação durante 45 min. com agitação e 90 min. sem agitar, à temperatura ambiente.

As partículas de fago não ligadas foram lavadas do seguinte modo:

- Após a Ia ronda de selecção : 10x200 μΐ T-PBS, 5x200 μΐ T-PBS

- Após a Ia ronda de selecção : 15x200 μΐ T-PBS, 10x200 μΐ T-PBS - Após a Ia ronda de selecção : 20x200 μΐ T-PBS, 20x200 μΐ T-PBS. A eluição de partículas ligadas foi realizada ao adicionar 200 μΐ por poço de 0,1 M de glicina/ pH=2,2, e incubação com agitação durante 30 min., à temperatura ambiente. Subsequentemente, a suspensão de fago foi neutralizada ao adicionar 60 μΐ 2M Tris-base, seguido pela infecção de células E.coli TG1 ao misturar 10 ml de cultura de crescimento exponencial com 0,5 ml de fago eluído e incubação durante 30 min. a 37 °C. Finalmente, as bactérias infectadas foram colocadas em meio TYE com 1% de glucose e 100 pg/ml de ampicilina, e incubadas a 30 °C durante a noite.

Resultados da selecção do CHI - biblioteca de fago em péptido RplO-L

Titulações de fago

Ronda de Concentração Entrada (fago/ml) Saída (fago/ml) selecção RplO-L 1“ 100 pg/ml 5, 6xl0i4 1,6xl0lb 2a 100 pg/ml 4, 04xl014 8,55xl08 3a 50 yg/ml 3,53xl014 1,19xl012

Clonagem dos clones seleccionados para expressão solúvel 66/112

Sequências de codificação de domínio CHI alteradas, contidas dentro de partículas de fago eluídas, foram amplificadas em lote com PCR. Após restrição com iVcol e Notl, foram inseridos em pNOTBAD (Invitrogen vector pBAD com local Notl inserido subsequentemente) . Após transformação em E.coli E104, as células foram seleccionadas em meio TYE com 1% de glucose e 100 yg/ml de ampicilina a 30 °C.

Expressão solúvel de clones seleccionados e selecção 4x96 de colónias resistentes a ampicilina foram cultivados num meio de 200 μΐ 2xYT com ampicilina em placas de microtitulação num agitador durante a noite a 30 °C. Foram então induzidos com L-arabinose adicionado na concentração final de 0,1%. Após outra incubação durante a noite, as células foram recolhidas ao centrifugar 15 minutos a 2000 rpm à temperatura ambiente e suas proteínas de periplasma foram libertadas ao ressuspender em 100 μΐ de solução-tampão Na-borato (160 mM Na-borato, 200 mMNaCl, pH=8,0) e incubação durante, pelo menos, 6 horas.

Para selecção, 4 placas de maleimida foram revestidas com 100 pg/ml de uma solução de 50 pg/ml de péptido RplO-L, dissolvida em PBS, pH=7,2, durante a noite a 4 °C. As placas foram então bloqueadas com 10 pg/ml de cisteína-HCl em PBS, com 200 μΐ por poço durante 2 h, à temperatura ambiente. A proteína periplásmica libertada foi então deixada a reagir com o péptido de ligação ao adicionar 50 μΐ de lisato e 50 μΐ de 2% de BSA-PBS, seguido por uma incubação durante a noite, à temperatura ambiente. A ligação da proteína marcada por his foi revelada por uma incubação de 90 minutos com 100 μΐ por solução de poço de anticorpos contra tetra-his (QIAgen), diluídos 1:1000 em 1% de BSA-PBS, e uma incubação de 90 minutos com 100 μΐ por solução de poço de anticorpos 67/112 de cabra anti-camundongo, marcados com HRP. (Sigma), diluídos em 1:1000 em 1% de BSA-PBS. Foram observados sinais após a adição de substrato OPD (3 mg/ml) em solução-tampão Na-citrato/fosfato, pH=4,5, e 0,4 μΐ/ml H2O2. A reacção foi interrompida com a adição de 100 μΐ de 1,25 M H2S04.

Resultados de selecção para ligação de RplO-L num poço único por clone

Clone A13 A79 A96 B6 B17 B19 B21 B23 A492/ 620 0, 027 0,353 0, 023 0, 038 0,036 0, 037 0, 032 0, 035 clone C14 C45 C49 C68 C79 C81 D36 D82 A492/ 620 0, 025 0,021 0, 044 0, 025 0,051 0,021 0,027 0,086

Reacção Anterior

Placa ã-492/620 A 0, 008 B 0,012 C 0, 015 D 0, 015

Os clones que revelam um sinal positivo foram cultivados em 20 ml de 2xYT com ampicilina, a 30 °C durante a noite. Depois, foram inoculados 1:20 num meio novo, e após 3 h a 30 °C foram induzidos com uma concentração final de 0,1% de L-arabinose, e deixados a expressar o domínio CHI recombinante durante a noite a 16 °C. O periplasma das células expressantes foi então lisado em 1 ml de solução - tampão de Na-borato, pH=8,0, durante um mínimo de 6 h. 0 extracto periplásmico foi deixado a reagir com péptido RplO-L e a ligação foi revelada exactamente como acima descrito. 68/112

Resultados de selecção para ligação de RplO-L clone + - clone + - A13 -0,002 -0,006 C14 0, 015 0, 017 A79 0, 004 0, 001 C45 0, 004 0, 001 A96 0, 010 0, 006 C49 0, 005 -0,001 B6 0, 004 0, 001 C68 0, 003 0, 001 BI 7 0, 002 0, 007 C79 0, 005 0, 002 B19 -0,002 0, 007 C81 0, 004 0, 002 B21 0, 002 0, 001 D36 0, 029 0, 019 B23 0, 055 0, 020 D62 0,137 0,126

Clonagem de clones seleccionados para expressão solúvel em pET27b

Sequências que codificam o domínio CHI alteradas, contidas nos clones que produzem um sinal significativo na ligação a RplO-L, foram amplificadas com PCR. Após restrição com Ncol e Notl, foram inseridos em pET27b (Novagen). Após transformação em E.coli BL21 (DE3) , as células transformadas foram seleccionadas em meio TYE com 1% de glucose e 50 yg/ml de ampicilina a 30 °C.

Clones revelando um sinal positivo foram cultivados num meio de 20 ml de M9ZB com 2% de glucose e canamicina, a 30 °C durante a noite. Depois, foram inoculados 1:20 num meio novo, e após 3 h a 30 °C foram induzidos com um meio com 1% de glicerina em vez de glucose, canamicina e lmM IPTG, e deixados a expressar o domínio CHI recombinante durante a noite a 16 °C. O periplasma das células de expressão foi então lisado em 1 ml de solução - tampão Na-borato, pH=8,0, durante um mínimo de 6 h. O extracto periplásmico foi analisado para a presença de proteína recombinante com western blotting e detecção com anticorpos anti tetra-his (QIAgen).

Sequência de SMID CHI específico CD20, clone C45 69/112

LOCUS C45 324 bp ds-DKA $YN 4-JUL-2005 l gcctccacca aggqcccatç ggtcttcccc ctggeaccct cetccaegaç eaeetctggg et ggeftctgcag ccctgggctg cetgptcaag gactactbcc ccgaaccggt çacpgtgtcg 121 tggaacbcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttec eggctgteet geagtccfcca 181 ggnetcbact cccteagcag cgtggtgaee gtggcccctc tgggtgttgg tgggcatctc 241 gtcçtgcact acatctgeaa cgtgaatc*C aageccagca acaccaaggt ggacaaghaa 301 gttgsgçcca oatCtgcggç cgot tf SM TKf C4 5 5 10 15 20 25 30

1 ASfKCPÍVFfLAMSKSfSGGTAALGGLVK 31 OyfPBPVTVâWN$(IAli¥SGVHlFFAVLQSS fil GLVSLSSVVTVAPLGVGOHLVLHYICKVHH 91 KPSHTKVDKKVEPK3AAA

Análise de ligação de CD20 expressa nas células, usando FACS

Aproximadamente 101 2 3 4 5 6 células Daudi foram lavadas com PBS (800 rpm, 5 min., temperatura ambiente) e o domínio CH3 recombinante em 1% de BSA-PBS foi deixado a ligar durante 2h em gelo. As células foram lavadas novamente com PBS e deixadas a reagir com 2 yg/ml de anticorpo anti-penta His- Alexa Fluor 488 (QIAgen), diluídas em 1% de BSA-PBS, durante 30 minutos em gelo. Após lavagem, as células foram analisadas em FACS. Células não marcadas, domínio CHI do tipo selvagem e linha celular K562 foram usados como controlos. EXEMPLO 8 ISOLAMENTO DE CL - antígeno CD20 de ligação de proteínas mutantes 1

Foram executadas 3 rondas de selecção. Placas activadas por maleimida (Pierce) foram revestidas com um péptido sintético, representando um mimotopo de marcador molecular célula-B CD20. 200 μΐ da seguinte solução foram adicionados por poço: PBS, pH-7,2, com as seguintes concentrações do péptido dissolvido: 2 a ronda de selecção : 100 yg/ml 3 a ronda de selecção : 100 yg/ml 4 a ronda de selecção : 50 pg/ml. 5 A incubação realizou-se durante a noite a 4 °C, seguida por bloqueio com 10 pg/ml de cisteína-HCl em PBS, com 200 μΐ por poço durante 2 h, à temperatura ambiente. 6 70/112 A biblioteca de surface display phage, que mostra domínio CL mutado, foi então deixada a reagir com o péptido ligado ao adicionar suspensão de fago e 2% de BSA-PBS até 200 μΐ, seguido por incubação durante 45 min. com agitação e 90 min. sem agitação, à temperatura ambiente.

Partículas de fago não ligadas foram lavadas do seguinte modo:

- Após a Ia ronda de selecção : 10x200 μΐ T-PBS, 5x200 μΐ T-PBS

- Após a Ia ronda de selecção : 15x200 μΐ T-PBS, 10x200 μΐ T- PBS - Após a Ia ronda de selecção : 20x200 μΐ T-PBS, 20x200 μΐ T- PBS. A eluição de partículas de ligação foi executada ao adicionar 200 μΐ por poço de 0,1 M de glicina, pH=2,2, e incubação com agitação durante 30 min., à temperatura ambiente. Subsequentemente, a suspensão de fago foi neutralizada pela adição de 60 μΐ de 2M Tris-base, seguido pela infecção de células E.coli TG1 ao misturar 10 ml de cultura de crescimento exponencial com 0,5 ml de fago eluído e incubação durante 30 min a 37 °C. Finalmente, as bactérias infectadas foram transferidas para placas em meio TYE com 1% de glucose e 100 pg/ml de ampicilina, e incubadas a 30 °C durante a noite.

Resultados da selecção do CL- biblioteca de fago em péptido RplO-L

Titulações de Fago

Ronda de selecção Concentração RplO-L Entrada (fago/ml) Saída (fago/ml) Ia 100 pg/ml 2, 8xl01J 3,6xl07 2a 100 pg/ml 4, 29xl014 6,88xl09 3a 50 pg/ml lxl0lb 6,54x1o11 71/112

Clonagem dos clones seleccionados para expressão solúvel

Sequências de codificação de domínio CL alteradas, contidas dentro de partículas de fago eluídas, foram amplificadas em lote com PCR. Após restrição com NcoJ e Notl, foram inseridas em pNOTBAD (Invitrogen vector pBAD com local Notl inserido subsequentemente) . Após transformação em E.coli E104, as células foram seleccionadas em meio TYE com 1% de glucose e 100 yg/ml de ampicilina a 30 °C.

Expressão solúvel de clones seleccionados e selecção 4x96 de colónias resistentes a ampicilina foram cultivados num meio de 200 μΐ de 2xYT com ampicilina em placas de microtitulação num agitador durante a noite a 30 °C. Foram então induzidos com L-arabinose adicionada à concentração final de 0,1%. Após outra incubação durante a noite, as células foram recolhidas ao centrifugar 15 minutos a 2000 rpm à temperatura ambiente e suas proteínas de periplasma foram libertadas ao ressuspender em 100 μΐ de solução-tampão Na-borato (160 mMNa-borato, 200 mMNaCl, pH=8,0) e incubação durante, pelo menos 6 horas.

Para selecção, 4 placas de maleimida foram revestidas com 100 pg/ml de uma solhão de 50 pg/ml de péptido RplO-L, dissolvida em PBS, pH=7,2, durante a noite a 4 °C. As placas foram então bloqueadas com 10 pg/ml de cisteína-HCl em PBS, com 200 μΐ por poço durante 2 h à temperatura ambiente. A proteína periplásmica libertada foi então deixada a reagir com o péptido ligado ao adicionar 50 μΐ de lisato e 50 μΐ de 2% de BSA-PBS, seguido por uma incubação durante a noite, à temperatura ambiente. A ligação da proteína marcada por his foi revelada por uma incubação de 90 minutos com 100 μΐ por solução de poço de anticorpos contra 72/112 tetra-his (QIAgen), diluídos em 1:1000 de 1% de BSA-PBS, e uma incubação de 90 minutos com 100 μΐ por solução de poço de anticorpos de cabra anti-camundongo, marcados com HRP (Sigma), diluídos em 1:1000 em 1% de BSA-PBS. Foram observados sinais após a adição de substrato OPD (3 mg/ml) em solução-tampão Na-citrato/fosfato, pH=4,5, e 0,4 μΐ/ml H2C>2. A reacção foi interrompida com a adição de 100 μΐ de 1,25 M H2S04.

Resultados de selecção para ligação de RplO-L num poço único por clone

Clone A2 A51 A57 A64 B21 B23 B44 B92 A492/ 620 0, 048 0, 083 0, 035 0,032 0,037 0, 036 0, 041 0, 154 clone C18 C19 C28 C56 C76 D2 D51 D82 A492/ 620 0,153 0, 033 0, 042 0,062 0,030 0, 016 0, 033 0, 046

Reacção Anterior

Placa A492/620 A 0, 016 B 0, 016 C 0, 012 D 0, 014

Os clones que revelam um sinal positivo foram cultivados em 20 ml de 2xYT com ampicilina, a 30 °C durante a noite. Depois, foram inoculados 1:20 num meio novo, e após 3 h a 30 °C foram induzidos com uma concentração final de 0,1% de L-arabinose, e deixados a expressar o domínio CL recombinante durante a noite a 16 °C. O periplasma das células expressantes foi então lisado em 1 ml de solução - tampão de Na-borato, pH=8,0, durante um mínimo de 6 h. O extracto periplásmico foi deixado a reagir com péptido RplO-L e a ligação foi revelada exactamente como acima descrito. 73/112

Resultados de selecção para ligação do RplO-L

Clone + - clone + - A2 0,002 0,001 C18 0, 025 0, 041 A57 0,006 0, 004 C19 0,006 0, 003 A62 0,016 0, 005 C28 0,010 0, 003 A64 0,006 0,006 C56 0,026 0,010 B21 0, 005 -0,002 C76 0, 075 0, 034 B23 0, 004 0, 004 D2 0, 003 0,002 B44 0, 007 0,002 D82 0, 007 -0,007 B92 0, 038 0, 017

Clonagem de clones seleccionados para expressão solúvel em pET27b

Sequências que codificam domínio CL alteradas, contidas nos clones que produzem um sinal significativo na ligação a RplO-L, foram amplificadas com PCR. Após restrição com Ncol e Notl, foram inseridas em pET27b (Novagen). Após transformação em E.coli BL21 (DE3) , as células transformadas foram seleccionadas em meio TYE com 1% de glucose e 50 yg/ml de canamicina a 30 °C.

Clones revelando um sinal positivo foram cultivados num meio de 20 ml de M9ZB com 2% de glucose e canamicina, a 30 °C durante a noite. Depois foram inoculados 1:20 em meio novo, e após 3 h a 30 °C foram induzidos com meio contendo 1% de glicerina em vez de glucose, canamicina e 1 mM IPTG, e deixados a expressar o domínio CL recombinante durante a noite a 16 °C. O periplasma das células expressantes foi então lisado em 1 ml de solução-tampão Na-borato, pH=8,0, durante o mínimo de 6 h. O extracto periplásmico foi analisado para a presença de proteína recombinante com western blotting e detecção com anticorpos anti tetra-his (QIAgen). 74/112 EXEMPLO 9 Clonagem, expressão e caracterização de um Fcab de ligaçao a integrina 0 péptido CRGDCL potencialmente cíclico foi originalmente isolado por Koivunen et al 1993 (J. Biol. Chem. 1993 Sep 25; 268(27):20205-10) de uma biblioteca de péptido com 6 aminoácidos expressado em fago filamentoso e mostrou inibir a ligação de fago que expressa RGD para integrina ανβι ou adesão de células que expressam ανβι à fibronectina. O péptido também inibiu a adesão celular mediada pelas integrinas ανβι, ανβ3 e ανβ5.

Inserimos a sequência GCRGDCL na alça estrutural (a alça "EF") do domínio CH3 do IgGl humano. Para esse efeito, os resíduos Asp92 e Lys 93 (numeração IMGT) foram mutados para Gly e Leu respectivamente, e os 5 resíduos CRGDC foram inseridos entre esses resíduos mutados 92 e 93 para criar a alça com o motivo RGD com ligação à integrina, usando as técnicas de clonagem padrão. No C-terminal do inserto, a sequência foi fundida na estrutura com a estrutura de múltipla clonagem do vector para que a marcação HSV e marcação His sejam anexos de forma C-terminal à proteína recombinante. O nome desta proteína recombinante Fcab-RGD4, ou RGD4 curto. A sequência de ADN que codifica Fcab-RGD4 e a tradução em sequência de aminoácido são mostradas em baixo.

4-3 Μ K Y I* Ιι ϊ T A A -A G L : Ir L L A A OP A «AM A t".' V ~ K"—3~~ ~ jt~ T~'~B

1 ATGAAATACe TGCTGCCGAC CGCTCCTCCt GGYCTGCtGC TCCTCGCGCC CCAGCCGGCG ATGGCCÁTGO CCGAGCCCAA ÀTCTtGTGAC AAAÀCTCÂCA 75/112 TACTTTATCC ACGACGCCTG GCGaCCACGA CCACACQACG AGGAGCGÇCQ GOTCGGCCSC TACCGGTACC GGCTCGGGTT TACAACACTG rrrrGAGTGr +3 τ “p ",7c p "A ·3Γ*_« ^ “CTÇ“ SiJt' s V^-γ'.ΠΓ Pg _p__k· d jr l η ΓΓΤ5 pT.t p s

101 CATGCCCÂCC 'ÓTCCCCAGCA* CCTGÃACTCC TGGGGGGACC GTCÃGTCrppc CTCTtCCCCC* CAAAACCCAA GCACACCCTC ATGAtCTCCC GGACCCCtGA GTACGfiGlGG CACGGOTCGT GGACTTGAGG ACCCCCCTGG CAGTCAGAAJj GAOAAQGQGS OTTttGGGTT CCTGTGGGAC TACTAQAGGG cçtgçggact *3 v T~* c* Tv WΓν" p—ν···&—ΐ<· s~ 5'“r" e'~v ""Τϊ *~γ ~lf~y ν Γν"ΐΤρ ~<Γ~~νt e~~v 1ΓΊΓ~α *k~ ϊ κ*~ΓΚ

201 GGTdACATGC GTGÇTGGTGG ÃCGTGAGCCA CGAASACcCT GAGGTCAAGT tCAACTGCrtA CS7GGAGGGC GTGtíAGGTGC ATAATGCÇAA GACAA/kÇCCG

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301 CÒGGAOGAGC^AGTACAACAG CÃCGTACCGT GTGGTCAGCC TCCTCACCGT CCTDCACCAfi GACTGGCTGA ATG5CAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA

GCCCTCCTCB TCATGITGTÇ GTGCAlGCCA CACCAGTCGC AGGAGTGGCA GGACfitfiGTC CTGACCCACT TACCGTTCC7 CAtGTfCACG TTCCAGAGGT +3 * '''jrjrT'' ""f κ· οΤ.^ΤΓρ-, .a· g: -'e.

401 ACAÁAGCCCT CCCAGCCCCC ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AGCCAAAGGG CAGGCCCGAG AACCAGAGGT- GTACACCCTG CCCCCATCCC GGGATGAGCT

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101 Gli^CGTCTf ^CTCATGCTCC GTCATGCATfi AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACSCAGAAGÃ GCCTCTCCCT ffTCtCCÕGGT ÁÀAGCGGCCp dACTCCAGAT cerracACAA gagtacgacg cactacgtac tccgagacgt isttggtgatg tscgtcttct cggagaggga cagagbccca Trrcdccccc gtgaggtcta

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As sequências que codificam Fcab-RGD4 e Fcab-wt, respectivamente, foram introduzidas no vector de expressão mamífera pCEP4 através de técnicas de clonagem convencionais. As células HEK 293 foram transientemente transfectadas com estes plasmídeos de expressão e 0 Fcab que contém o meio de cultura colhido após 3 dias e após uma semana. Os Fcabs foram purificados via uma coluna de Proteína A e eluição acídica da coluna, seguidos por uma neutralização imediata. Os Fcabs foram dialisados contra PBS e testados em ELISA para ligação à integrina ανβ3 humana (Chemicon).

Para a integrina ELISA, 1 yg/ml ανβ3 humana, integrina em PBS foi revestida durante a noite em placas Maxisorp e bloqueada durante 1 h com BSA em PBS contendo 1 mM Ca2+. Fcab-RGD4 e Fcab-wt, respectivamente, foram deixados a ligar durante 1 h em várias diluições começando em 10 yg/ml de proteína purificada. Foram detectados Fcabs ligados por proteína A marcada com HRP e TMB como um substrato. A ligação de RGD4 à integrina (linha vermelha) resultou em sinais significativos de 10 yg/ml de proteína até 0,16 yg/ml. Como controlos negativos, RGD4 não ligou à placa na ausência da integrina (linha cinzenta), nem o Fcab-wt ligou à placa revestida de integrina (linha verde). A ligação da integrina mAb LM609 ανβ3 anti-humana do camundongo comercial (Chemicon; linha azul) serviu como um controlo positivo. 76/112 concentração de proteína Fcab-RGD 4 Fcab-wt revestimento BLK Fcab-RGD4 LM609 (mAB anti-integrina) (yg/ml) (OD 450) (OD 450) (OD 450) (OD 450) 10 3,4513 0,0485 0,0152 0,6475 2,500 1,7446 0,0338 0,0127 0,6443 0,625 0,7068 0,0337 0,0125 0,6570 0,156 0,2384 0,0327 0,0123 0,6257 0, 039 0,0829 0,0295 0,0127 0,3907 0,010 0,0388 0,0276 0,0103 0,1567 0, 002 0,0303 0,0273 0,0112 0,0770

Tabela: Dados do ELISA demonstrando a ligação de RGD4 e LM609 a integrina ανβ3 humana. As várias proteínas foram testadas em concentrações como indicado na primeira coluna que resulta em sinais em 450 nm nas filas respectivas. Valores para HEK produzido e proteína A purificada Fcab-RGD4 que liga à integrina são mostrados na segunda coluna, o controlo negativo Fcab-wt na terceira, e controlo em branco de revestimento Fcab-RGD4 na quarta coluna. Os valores para ligação de integrina anti ανβ3 mAb LM609 de camundongo são mostrados na última coluna. 77/112

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H.

Ruker, Florian Wozniak-Knopp Gordana Himmler, Gottfried <120> Novas imunoglobulinas polivalentes <130> F 10615 <140> PCT/AT20071000313 <141> 2007-06-26 <150> AT AI147/2006 <151> 2006-07-05 <160> 26 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 108

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 78/112

Pro Arg Glu pro Gin Val Tyr Thr Leu ΡΓΟ pro Ser Arg ASp Glu Leu 1 5 10 15 Thr Lys Asn Gin 20 val ser Leu Thr cys 25 Leu val Lys Gly Phe 30 Tyr Pro ser Asp ile Ala vai Glu Trp Glu ser Asn Gly Gin pro Glu Asn Asn 35 40 45 Tyr Lys Thr Thr pro ΡΓΟ Val Leu ASp ser Asp Gly ser Phe Phe Leu 50 55 60 Tyr 65 Ser Lys Leu Thr val 70 ASP Lys Ser Arg Trp 75 Gin Gin Gly Α5Π val 80 Phe Ser cys Ser Val Met HÍS Glu Ala Leu HÍS Asn HÍS Tyr Thr Gin 85 90 95

Lys ser Leu ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Ala Ala 100 105

<210> 2 <211> 332 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> gene criado que codifica a construção de biblioteca CH3 <220> <221> misc_feature <222> (57) .. (58) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (60) .. (61) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (63) .. (64) 79/112 <223> η é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (219) .. (220) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (222) .. (223) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (225) .. (226) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (234) .. (235) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (237) .. (238) <223> n é a, c, g, ou t <400> 2 80/112 ccatggcccc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atceegtgae gagctcnnsn 60 nsnnscaagt cagectgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg 120 agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact 180 ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc ttacegtgnn snnsnrtsagg tggnnsnnsg 240 ggaacgcctt ctcatgetcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga 300 gcctctccct gtctccgggt aaagcggccg ca 332

<210> 3 <211> 110 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> construção de biblioteca CH3 <220> <221> misc_feature <222> (19) .. (21) <223> xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente <220> <221> misc_feature <222> (73) .. (75) <223> xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente <220> <221> misc_feature <222> (78) .. (79) <223> xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente <400> 3 81/112

Leu Pro pro Ser Arg ASP 15 cys Leu vai Lys 30 dy Phe ser Asn Gly Gin ΡΓΟ Glu 45 Asp ser 60 Asp Gly Ser Phe xaa Arg Trp xaa Xaa Çiy 75 80 Ala Leu HÍS Asn His Tyr 95 Lys Ala Ala Ala 110

Met Ala Pro Arg Glu Pro Gin vai Tyr Thr 1 5 10

Glu Leu xaa xaa xaa Gin vai ser Leu Thr 20 25

Tvr Pro ser Asp lie Ala vai Glu Trp Glu 7 35 40

Asn aso Tyr Lys Thr Thr pro pro vai Leu 50 55 phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr vai xaa xaa 65 70

Asn vai Phe ser cys Ser vai Met His Glu 85 90

Thr Gin Lys ser Leu Ser Leu ser Pro Gly 100 105

<210> 4 <211> 33 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador PCR usado para montagem de domínio CH3 mutado <400> 4 cttgccatgg ccccccgaga accacaggtg tac 33

<210> 5 <211> 30 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador PCR usado para montagem de domínio CH3 mutado <400> 5 agtcgagctc gtcacgggat gggggcaggg 30 82/112 <210> 6 <211> 41 <212> ADN <213> seguência artificial <220> <223> iniciador PCR usado para montagem de domínio CH3 mutado <220> <221> mi sc _f eature <222> (11) .. (12) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> mi sc _f eature <222> (14) .. (15) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc _f eature <222> (17) .. (18) <223> n é a, c, g, ou t <400> 6 gtacgagctc nnsnnsnnsc aagtcagcct gacctgcctg g 41

<210> 7 <211> 32 <212> ADN <213> seguência artificial <220> <223> iniciador PCR usado para montagem de domínio CH3 mutado 83/112 <400> 7 tgccaagctt gctgtagagg aagaaggagc cg 32

<210> 8 <211> 59 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador PCR usado para montagem de domínio CH3 mutado <220> <221> misc_feature <222> (17) .. (18) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (20) .. (21) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (23) .. (24) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (32) .. (33) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (35) .. (36) 84/112 <223> η é a, c, g, ou t <400> 8 tgccaagctt accgtgnnsn nsnnsaggtg gnnsnnsggg aacgtcttct catgctccg 59

<210> 9 <211> 33 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador PCR usado para montagem de domínio CH3 mutado <400> 9 agttgcggcc gctttacccg gagacaggga gag 33

<210> 10 <211> 113 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> construção de biblioteca CH3+3 <220> <221> misc_feature <222> (19) .. (21) <223> xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente <220> <221> misc_feature <222> (73) .. (78) <223> xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente 85/112 <220> <221> misc_feature <222> (81) .. (82) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente <400> 10

Met Ala pro Arg 6lu Pro Gin vai Tyr Thr Leu ppo ργο ser Arg Asp 15 10 IS

Glu Leu xaa Xaa xaa Gin vai Ser Leu Thr Cys Leu vai Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr pro Ser A5p 11 e Ala vai Glu Trp Glu ser Asn Gly Gin Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro vai Leu A$p ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr vai Xaa xaa xaa xaa Xaa xaa Arg Trp 65 70 75 80 xaa xaa Gly Asn vai Phe ser Cys ser vai Met His Glu Ala Leu His 85 90 9S Asn HlS Tyr Thr 100 Gin Lys Ser Leu ser 105 Leu Ser Pro Gly S Ala Ala

Ala

<210> 11 <211> 341 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> gene criado que codifica a construção de biblioteca CH3+3 <220> <221> misc_feature <222> (57) .. (58) <223> n é a, c, g, ou t 86/112 <220> <221> misc_feature <222> (60) .. (61) <223> η é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (63) .. (64) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (219) .. (220) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (222) .. (223) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (225) .. (226) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (228) .. (229) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (231) .. (232) <223> n é a, c, g, ou t 87/112 <220> <221> misc_feature <222> (234) .. (235) <223> η é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (243) .. (244) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (246) .. (247) <223> n é a, c, g, ou t <400> 11 ccatggcccc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgtgac gagctcnnsn 60 nsnnscaagt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg 120 agtgggagag caatgggeag ccggagaaca actacaagac eacgcciccc gtgctggacc 180 tegacggctc cttcttcctc tacagcaagc ttaccgrgnn snnsnnsnns nnsnnsaggt 240 ggnnsnrsgg gaacgtcrcc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca 300 cacagaagag cctctccctg tctccgggta aagcggccgc a 341

<210> 12 <211> 68 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador PCR usado para construção de biblioteca CH3+3 <220> <221> misc_feature <222> (17) .. (18) 88/112 <223> η é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (20) .. (21) <223> n é a, c, g, <220> <221> misc_feature <222> (23) .. (24) <223> n é a, c, g, <220> <221> misc_feature <222> (26) .. (27) <223> n é a, c, g, <220> <221> misc_feature <222> (29) .. (30) <223> n é a, c, g, <220> <221> misc_feature <222> (32) .. (33) <223> n é a, c, g, <220> <221> misc_feature <222> (41) .. (42) <223> n é a, c, g, <220> <221> misc_feature ou t ou t ou t ou t ou t ou t 89/112 <222> (44) .. (45) <223> η é a, c, g, ou t <400> 12 tgccaagctt accgtgnnsn nsrinsnnsnn snnsaggtgg nnsnnsggga acgtcttctc 60 atgctccg 68

<210> 13 <211> 115 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> construção de biblioteca CH3 + 5 <220> <221> misc_feature <222> (19) .. (21) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente <220> <221> misc_feature <222> (73) .. (80) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente <220> <221> misc_feature <222> (83) .. (84) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente <400> 13 90/112

Met 1 Ala Pro Arg GlU 5 Pro Gin vai Tyr Thr 10 Leu Pro Pro Ser Arg 15 ASp Glu Leu Xaa xaa xaa Gin vai Ser Leu Thr cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser ASp ile Ala vai Glu Trp Glu ser Asn Gly Gin Pro Glu 55 40 45 Asn Asn 50 Tyr Lys Thr Thr pro 55 Pro val Leu A5P Ser 60 ASp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr Val Xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa 65 70 75 80 Arg Trp Xaa xaa Gly 85 Asn vai Ptíe Ser cys 90 Ser val Mec Hi s Glu 95 Ala Leu Hl$ Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser lbu Ser Pro Gly Lys 100 105 110

Ala Ala Ala 115

<210> 14 <211> 347 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> gene criado que codifica a construção de biblioteca CH3 + 5 <220> <221> misc_feature <222> (57) .. (58) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (60) .. (61) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (63) .. (64) 91/112 <223> η é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (219) .. (220) <223> n é a, e, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (222) .. (223) <223> n é a, e, g, ou t <220> <221> misc_feature <2 2 2> (225) .. (226) <223> n é a, e, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (228) .. (229) <223> n é a, e, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (231) .. (232) <223> n é a, e, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (234) .. (235) <223> n é a, e, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (237) .. (238) 92/112 <223> η é a, e, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (240) .. (241) <223> n é a, e, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (249) .. (250) <223> n é a, e, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (252) .. (253) <223> n é a, e, g, ou t <400> 14 ccatggcccc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgtgac gagcccnnsn 60 nsnnscaagt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg 120 agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actaeaagac cacgcctccc gtgctggact 180 ecgacggctc cttcttcctc tacagcaagc uaccgxgnn srmsnnsnns nnsnnsnnsn 240 nsaggtggnn snnsgggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc 300 actacacaca gaagagcccc tccctgtctc cgggtaaagc ggccgca 347

<210> 15 <211> 74 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador PCR usado para construção de biblioteca CH3+5 <220> <221> misc_feature <222> (17) .. (18) 93/112 <223> η é a, c, g, <220> <221> misc_feature <222> (20) .. (21) <223> n é a, c, g, <22 0> <221> misc_feature <222> (23) .. (24) <223> n é a, c, g, <220> <221> misc_feature <222> (26) .. (27) <223> n é a, c, g, <220> <221> misc_feature <222> (29) .. (30) <223> n é a, c, g, <220> <221> misc-feature <222> (32) .. (33) <223> n é a, c, g, <220> <221> misc_feature <222> (35) .. (36) <223> n é a, c, g, <220> <221> misc_feature <222> (38) .. (39) ou t ou t ou t ou t ou t ou t ou t 94/112 <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (47) .. (48) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (50) .. (51) <223> n é d, c, g, ou t <400> 15 tgccaagctt acegtgnnsn nsnnsnnsnn snnsnnsnns aggtggnnsn nsgggaacgt 60 cttctcatgc tccg 74 <210> 16 <211> 324 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> gene criado que codifica a construção da primeira biblioteca CH 1 <220> <221> misc_feature <222> (217) .. (218) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (220) .. (221) 95/112 <223> η é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (223) .. (224) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (229) .. (230) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (232) .. (233) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (235) .. (236) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (238) .. (239) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (241) .. (242) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (244) .. (245) 96/112 <223> η é a, c, g, ou t <400> 16 60 120 180 240 300 324 gcctccacca agggeecatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcaeagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccccgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactcuct ccctcagcag cgtggtgacc gtgcccnnsn nsnnsttgnn snnsnnsnns nnsnnsacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatctgcggc cgca

<210> 17 <211> 130 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> construção da primeira biblioteca CHI <220> <221> misc_feature <222> (95) .. (97) <223> xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente <220> <221> misc_feature <222> (99) .. (104) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente <400> 17 97/112

Met 1 Lys Tyr Leu Leu S Pro Thr Ala Ala Ala 10 Gly Leu Leu Leu Leu 15 Ala Ala Gin pro Ala Met Ala Ala ser Thr Lys Gly Pro Ser val Phe Pro 20 25 30 leu Ala ΡΓΟ Ser ser Lys ser Thr ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 35 40 45 Cys i_eu vai Lys A5P Tyr phe Pro Glu pro val Thr val ser Trp Asn 50 55 60 Ser Gly Ala Leu Thr ser Gly val HlS Thr Phe pro Ala val Leu Gin 65 70 75 80 ser Ser Gly Leu Tyr ser Leu ser Ser val val Thr val Pro xaa xaa 85 90 95 Xaa Leu xaa Xaa Xaa Xaa xaa Xaa Thr Tyr Xle cys Asn val Asn Mis 100 105 110 Lys Pro ser Asn Thr Lys vai ASD Lys Lys val Glu Pro Lys ser Ala 115 120 125 Ala Ala 130

<210> 18 <211> 324 <212> ADN <213> sequência artificial <220>

<223> gene criado que codifica a construção da segunda biblioteca CHI <220> <221> misc_feature <222> (214) .. (215) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (217) .. (218) <223> n é a, c, g, ou t 98/112 <220> <221> misc_feature <222> (220) .. (221) <223> η é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (223) .. (224) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (226) .. (227) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (229) .. (230) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (232) .. (233) <223> n é a, c, g, ou t <2 2 0> <221> misc_feature <222> (235) .. (236) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (238) .. (239) <223> n é a, c, g, ou t 99/112 <220> <221> misc_feature <222> (241) .. (242) <223> η é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (244) .. (245) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc-feature <222> (247) .. (248) <223> n é a, c, g, ou t <400> 18 gcctccacca agggcccate ggtcttcccc gçcacagcag ccctgggctg cctggtcaag tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg ggactctacc ccctcagcag cgtggtgacc nnsnnsnnst acatctgcaa cgtgaaccac gttgagccca aatctgcggc cgct ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 cacaccttcc cggctgtcct gcagtcctca 180 gtgnnsnnsn nsnnsnnsnn snnsnnsnns 240 aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 300 324 <210> 19 <211> 108 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> construção da segunda <220> <221> misc_feature <222> (72) .. (83)

biblioteca CHI 100/112 <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente <400> 19

Ala Ser Thr Lys Gly ΡΓΟ Ser val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 ser Thr ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly cys Leu val Lys ASp Tyr 20 25 30 Phe pro Glu Pro val Thr val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly vai HÍ5 Thr Phe Pro Ala val Leu Gin ser Ser Gly Leu Tyr ser 50 55 60 L6U ser ser vai val Thr val xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 65 70 75 80 xaa xaa xaa Tyr lie cys Asn val Α5Π HlS Lys Pro ser Asn Thr Lys 85 90 95 vai ASp LyS Lys val Glu Pro Lys Ser Ala Ala Ala 100 105

<210> 20 <211> 321 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> gene criado que codifica a construção da biblioteca CL <220> <221> misc_feature <222> (55) .. (56) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (58) .. (59) <223> n é a, c, g, ou t 101/112 <220> <221> misc_feature <222> (61) .. (62) <223> η é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (226) .. (227) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (229) .. (230) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (232) .. (233) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (235) .. (236) <223> n é a, c, g, ou t <2 2 0> <221> misc_feature <222> (241) .. (242) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> misc_feature <222> (244) .. (245) <223> n é a, c, g, ou t 102/112 <220> <221> misc_feature <222> (247) .. (248) <223> η é a, c, g, ou t <400> 20 gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctnnsnns 60 nnsggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataaettct atcccagaga ggccaaagta 120 eagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag 180 gacagcaagg acagcaceta cagcctcagg tcgaccctga cgctgnnsnn snnsnnstac 240 nnsrmsnnsa aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca 300 aagagcttca acaggggaga g 321

<210> 21 <211> 107 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> construção de biblioteca CL <220> <221> misc_feature <222> (19) .. (21) <223> xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente <220> <221> misc_feature <222> (76) .. (79) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente <220> <221> misc_feature <222> (81) .. (83) 103/112 <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente <400> 21 val Ala Ala Pro ser val phe ile Phe Pro Pro ser ASP GlU Gin Leu 1 5 10 15 Lys Ser Xaa xaa 20 xaa Gly Thr Ala ser 25 val val cys Leu Leu 30 Α5Π Asn Phe Tyr pro 35 Arg Glu Ala Lys val 40 Gin Trp Lys val ASp 45 Asn Ala Leu Gin Ser SO Gly Asn Ser Gin Glu 55 ser val Thr GlU Gin 60 ASp Ser Lys Asp Ser 65 Thr Tyr ser Leu Arg 70 Ser Thr Leu Thr Leu 75 xaa Xaa xaa xaa Tyr 80 xaa xaa xaa Lys val 85 Tyr Ala cys GlU val 90 Thr Hts Gin Gly Leu 95 ser ser pro val Thr Lys ser phe Asn Arg Gly Glu 100 105

<210> 22 <211> 113 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> clone D83 de biblioteca CH3+3 especifica CD20 <400> 22

Met Ala pro Arg Glu Pra Gin vai Typ Thr Leu pro pro 5er ^ Asp 15 10 15

Glu Leu Ala ppo Pro Gin vai ser Leu Thr Cys Leu vai Lys Gly Phe 20 25 30

Tyr pro ser Asp He Ala vai Glu Trp Glu ser Asn dy Gin Glu 104/112 35 40

4S

Asn Agn Tyr Lys Thr Phe Leu Tyr ser Lys 65 H« vai Gly Asn vai 85 Asn His Tyr Thr Gin 100 Ala <210> 23 <211> 324 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> gene que codifica SMID CHI especifico CD20 clone C45 <400> 23

Thr pro Pro vai Leu Asp ser Asp Gly ser Phe 55 60

Leu Thr vai Asp Leu vai His vai Ala Arg Trp 70 r 75 80

Phe Ser cys ser vai Met His Glu Ala Leu His 90 95

Lys Ser Leu Ser Leu ser Pro Gly Lys Ala Ala 10S 110 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct ggeacagcag ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc tggaactcag gcgccetgae cagcggcgtg cacaccttcc ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtggcccctc gtcctgcact acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca gttgagccca aatctgcggc cgct <210> 24 <211> 108 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> SMID CHI especifico CD20 clone C45 <400> 24 cctccaagag cacctctggg 60 ccgaaecggt gaeggtgteg 120 cggctgtcct gcagtcctca 180 tgggtgttgg tgggcatctc 240 acaccaaggt ggacaagaaa 300 324 105/112

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser vai Phe Pro Leu Ala pro Ser Ser Lys 15 10 15 ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly cys Leu vai Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly vai hís Thr Phe pro Ala vai Leu Gin ser ser Gly Leu Tyr ser 50 55 60

Leu ser ser vai Vai Thr Vai Ala Pro Leu Gly vai Gly Gly Hís Leu 65 70 75 80 val Leu hís Tyr He cys Asn vai Asn His Lys pro ser Asn Thr Lys 85 90 95 val Asp Lys Lys vai Glu Pro Lys ser Ala Ala Ala 100 105

<210> 25 <211> 290 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> proteína recombinante Fcab-RG04 <400> 25 106/112

Met Lys Tyr Leu Leu pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gin Pro Ala Met Ala wet Ala Glu Pro Lys Ser cys Asp Lys Thr 20 25 30 Hl 5 Thr Cys 35 Pro ΡΓΟ cys pro Ala 40 Pro Glu Leu Leu Gly 45 Gly Pro ser vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He ser Arg 50 55 60 Thr Pro Glu val Thr cys val val val ASp val Ser His GlU Asp Pro 65 70 75 80 Glu vai Lys Phe Asn Trp Tyr val Asp Gly val Glu val His Asn Ala 85 90 95 Lys Thr Lys pro Arg Glu Glu Gin ryr Asn Ser Thr Tyr Arg val val 100 105 110 Ser vai Leu Thr val Leu n1s Gin ASP Trp Leu Asn Gly Lys GlU Tyr US 120 125 Lys cys Lys val ser ASO Lys Ala Leu pro Ala pro 11 e Glu Lys Thr 130 135 140 ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu pro Gin val Tyr Thr Leu 145 150 155 160 Pro pro ser Arg ASp 165 Glu Leu Thr Lys Asn 170 Gin val ser Leu Thr 175 cys

Leu Val Lys Gly Phe ryr Pro ser ASp lie Ala val Glu Trp Glu ser 180 185 190 Α$Π Gly Gin Pro Glu Α5Π Asn TVr Lys Thr Thr pro Pro val Leu Asp 195 200 205 ser Asp Gly ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val Gly Cys Arg 210 215 220 Gly 225 Asp cys Leu ser $3? Trp Gin Gin Gly aso 235 val Phe ser cy* ser 240 Val Met HiS Glu Ala 245 Leu Mis Asn His Tyr 250 Thr Gin Lys ser Leu 255 ser Leu Ser Pro Gly 260 Lys Ala Ala Ala Leu 265 Glu Π e Lys Arg Ala 270 ser Gin pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp pro Glu ASP val Glu His His His His 275 280 285 Hl 5 His 290 107/112

<210> 26 <211> 870 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> sequência de ADN que codifica Fcab-RGD4 <400> 26 atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgcggc ccagccggcg 60 atggccatgg ccgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccaec gtgcccagca 120 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 180 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 240 gaggtcaagt tcaactggta cgtggacgge gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 300 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 360 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccecc 420 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 480 cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc rgacctgcct ggtcaaaggc 540 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccggâ gaacaactac 600 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagcttacc 660

Otgggttgcc gcggtgattg tctgagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcC 720 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 780 aaagcggccg cactcgagat eaaacgggct agccagccag aactegcecc ggaagacccc 840 gaggatgtcg agcaccacca ccaccaccac 870

Lisboa, 3 de Abril de 2012 108/112

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo Titular tem como único objectivo ajudar o leitor e não forma parte do documento de patente europeia. Ainda que na sua elaboração se tenha tido o máximo cuidado, não se podem excluir erros ou omissões e o EPO não assume qualquer responsabilidade a este respeito.

Documentos de patente citados na descrição

EP 2006050059W US 6361974 B US 2005266000A1 US 6358709 B WO 2006036834 A US 5824514 A WO 0183525 A US 5817483 A WO 0232925 A US 5814476 A WO 0042561 A3 US 5763192 A WO 0170947 A3 US 5723323 A US 6365377 B AT 2007000313 W US 6376246 B AT 11472006 A WO 0206469 A US 6352842 B

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Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Uma imunoglobulina polivalente que liga especificamente a, pelo menos, duas moléculas de superfície celular de uma única célula, em que a imunoglobulina liga especificamente a, pelo menos, um primeiro epítopo e é compreendida por, pelo menos, uma modificação em, pelo menos, uma região de alça estrutural CH3 da dita imunoglobulina que resulta numa substituição, eliminação e/ou inserção de um ou mais nucleótidos ou aminoácidos para introduzir um novo local de ligação de antígeno que liga a uma molécula de superfície celular.
2. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 1, em que a região de alça estrutural modificada está dentro do domínio constante CH3 da dita imunoglobulina, ou uma parte da mesma.
3. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo facto de que a região de alça estrutural modificada compreende, pelo menos, 6 modificações de aminoácidos.
4. Imunoglobulina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de que a região de alça modificada de um CH3 de origem humana compreende, pelo menos, uma modificação dentro dos aminoácidos 7 a 21, aminoácidos 25 a 39, aminoácidos 41 a 81, aminoácidos 83 a 85, aminoácidos 89 a 103 ou aminoácidos 106 a 117, onde a numeração da posição do aminoácido dos domínios é aquela da IMGT. 1/3
5. Imunoglobulina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo facto de que a imunoglobulina modificada é ainda combinada com uma ou mais imunoglobulinas ou com imunoglobulinas não modificadas, ou partes da mesma, para obter uma imunoglobulina de combinação.
6. Imunoglobulina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, que é uma molécula de anticorpo completa, Fc ou uma parte da mesma.
7. Imunoglobulina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, que é ligada especificamente a, pelo menos, dois epitopos que diferem um do outro.
8. Ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina de acordo com qualquer uma das revindicações 1 a 7.
9. Método para conceber uma imunoglobulina polivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, que compreende os passos de: Providenciar um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina que liga especificamente ao, pelo menos, um primeiro epitopo e que compreende, pelo menos, uma região de alça estrutural CH3, Modificar, pelo menos, um resíduo nucleótido de, pelo menos, uma das ditas regiões de alça estrutural CH3 codificadas pelo dito ácido nucleico, Transferir o dito ácido nucleico modificado num sistema de expressão, Expressar a dita imunoglobulina modificada, 2/3 Contactar a imunoglobulina modificada expressa com um segundo epítopo de um antigeno de superfície celular, e Determinar se a dita imunoglobulina modificada liga especificamente ao segundo epítopo.
10. Uma imunoglobulina polivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, para usar como medicamento. Lisboa, 4 de Abril de 2012 3/3