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CN110078828A - 新型多价免疫球蛋白 - Google Patents

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CN110078828A
CN110078828A CN201811561771.2A CN201811561771A CN110078828A CN 110078828 A CN110078828 A CN 110078828A CN 201811561771 A CN201811561771 A CN 201811561771A CN 110078828 A CN110078828 A CN 110078828A
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F.鲁克
G.希姆勒
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STAR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHU
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Abstract

本发明提供与一个细胞的至少2个细胞表面分子特异性结合的多价免疫球蛋白或其部分、它们的用途和制备它们的方法，在所述免疫球蛋白的至少一个结构环区中至少一个修饰决定其与所述细胞表面分子的表位结合，其中未经修饰的免疫球蛋白不显著结合所述表位。

Description

新型多价免疫球蛋白
本申请是分案申请，其母案的中国申请号是200780032991.X，国际申请号是PCT/AT2007/000313，申请日是2007年6月26日。
技术领域
本发明提供与一个细胞的至少2个细胞表面分子特异性结合的多价免疫球蛋白或其部分、它们的用途和制备它们的方法，在所述免疫球蛋白的至少一个结构环区中至少一个修饰决定其与所述细胞表面分子的表位结合，其中未经修饰的免疫球蛋白不显著结合所述表位。
背景技术
在很多治疗性、诊断性和分析应用中业已发现单克隆抗体的用途。
基本的抗体结构在本文用完整的IgG1免疫球蛋白作为例子予以阐明。两条同样的重链(H)和两条同样的轻链(L)结合形成Y形抗体分子。每一条重链都有四个结构域。氨基端可变区(VH)位于Y的顶部。跟随着的是三个恒定区：CH1、CH2和羧基端CH3，CH3位于Y主干的底部。一段短的区段，即转换区，将重链的可变区和恒定区连接起来。铰链将CH2和CH3 (Fc片段)与抗体其余部分(Fab片段)连接起来。完整的抗体分子通过蛋白酶在铰链处切割可产生一个Fc片段和两个同样的Fab片段。轻链由可变区(VL)和恒定区(CL)这两个结构域构成，VL和CL通过转换区分隔开。
铰链区内的二硫键连接着两条重链。轻链通过另外的二硫键与重链偶联。Asn-连接的碳水化合物部分视免疫球蛋白类别连接在恒定区的不同位置。对于IgG1，在Cys235和Cys238对之间的铰链区内的两个二硫键连接两条重链。轻链由位于CH1结构域的Cys229s和CL结构域的Cys214s之间的另外的两个二硫键与重链偶联。碳水化合物部分连接到每个CH2的Asn306，在Y主干形成明显的突出部分。
这些特征具有意义深远的功能结果。重链和轻链两个的可变区(VH)和(VL)都位于Y的“顶部”，它们在那儿与抗原反应。分子的这一顶部是氨基酸序列N端所位于的一侧。Y主干以有效介导效应子功能的方式突出，例如补体活化和与Fc受体相互作用、或ADCC和ADCP。其CH2和CH3结构域突出以促进与效应蛋白的相互作用。氨基酸序列的C端位于顶部的相反一侧，可将其称为Y的“底部”。
在抗体中发现命名为λ (lambda)和κ (kappa)的两种类型的轻链。特定免疫球蛋白具有κ链或λ链，从来不会一样一条。在具有λ或κ轻链的抗体之间还没有发现功能上的差别。
抗体分子中的每个结构域都有一个相似的结构：两个β片层在挤压式反向平行β桶中彼此紧密堆叠在一起。这种保守结构称为免疫球蛋白折叠。免疫球蛋白恒定区折叠含有4股片层和3股片层，其中4股片层针对3股片层堆叠在一起。通过在各个片层β链之间的氢键结合、通过内部相对片层残基之间的疏水键结合和通过各片层之间的二硫键来稳定所述折叠。3股片层包含C、F和G链，4股片层有A、B、E和D链。字母A到G表示沿着免疫球蛋白折叠的氨基酸序列的β链的次序位置。
可变区折叠具有9个β链(beta strand)，排列在4股和5股的两个片层内。5股片层在结构上与恒定区的3股片层同源，但含有额外的C'和C''链。其余的链(A、B、C、D、E、F、G)在恒定区免疫球蛋白折叠中，与其配对物在拓扑学上相同，在结构上相似。二硫键将在相对片层中的B链和F链连接起来，如同在恒定区一样。
免疫球蛋白轻链和重链可变区都含有三个高变环，即互补决定区(CDR)。V区的三个CDR (CDR1、CDR2、CDR3)在β桶的一端串在一起。CDR为连接免疫球蛋白折叠的β链B-C、C'-C''和F-G的环。不同免疫球蛋白分子的CDR中的残基有变化，使得每种抗体对抗原具有特异性。
抗体分子顶部的VL和VH结构域紧密堆叠在一起，使得6个CDR (每一结构域有3个)协作构建抗原特异性结合表面(或空穴)。因此，抗体的天然抗原结合位点由连接轻链可变区的B-C、C'-C''和F-G链和重链可变区的B-C、C'-C''和F-G链的环组成。
在天然免疫球蛋白中不是CDR环的环，或并非由CDR环决定的抗原结合口袋部分的环，不具有抗原结合或表位结合特异性，但有助于整个免疫球蛋白分子和/或其效应物的正确折叠或其它功能，因此称为结构环，供本发明目的用。现有技术文献表明，为了改造现有抗原结合位点并藉此引入新的结合特性的目的，迄今一直采用免疫球蛋白样支架结构。然而，迄今为止，为了抗原结合只有CDR区业已进行工程改造，换言之，在免疫球蛋白折叠情况下，为了改变其结合亲和力或特异性，只对天然抗原结合位点进行了修饰。有大量的文献记载了这种改造免疫球蛋白的不同形式，它们经常以在噬菌体颗粒表面展示或在各种原核或真核表达系统中可溶性表达的单链Fv片段(scFv)或Fab片段的形式来表达。
PCT/EP2006/050059描述了工程改造免疫球蛋白的方法，包括在结构环区(structural loop region)内进行修饰以获得新的抗原结合位点。该方法广泛应用于免疫球蛋白，并可用于产生一系列靶向多种抗原的免疫球蛋白。但是，未明确描述细胞表面靶的多价结合物(binder)。
US2005/266000A1描述了包含变异重链可变构架区(variable frameworkdomain，VFR)的多肽。VFR为可与抗原接触的抗原结合口袋或沟(groove)部分。VFR为CDR环区部分，位于CDR环一侧的可变区以经由CDR环区支持抗原结合。除VFR以外的构架环尚不能发生突变以用于工程改造抗原结合位点的目的。
与人类癌症有关的细胞表面蛋白可能是单克隆治疗的有效靶标。抗体可通过调节细胞活化或通过补充免疫系统引起抗肿瘤反应。
某些mAb通过交联靶标来实现其部分作用效果，这可以将靶标聚起来并导致活化、抑制或放大细胞信号，最后以细胞靶标的细胞停滞和/或凋亡为结果。
业已证明，某些Mab (抗CD19、抗CD20、抗CD21和抗CD22)对淋巴瘤细胞系很少或没有先天抗生长活性，通过用它们作为四价同型二聚体而转化成为有效的抗肿瘤药。这些活性可通过募集效应细胞和/或补体在体内得到提高。用于治疗性mAb的另一策略是将细胞毒性药物与所述mAb偶联。这样的免疫毒素可结合细胞表面靶，接着内化，释放药物杀死该靶细胞。可能需要将靶标簇集作为内化的先决条件。
为了提高mAb通过靶标分子簇集而发挥其作用的功效，已经设计了多种形式的多价Ab。业已发明了形成四价Ab的共价连接的全长IgG，以及经由使用其分泌尾端而模拟聚合IgM和IgA的天然存在的IgM和IgG Ab。通过在全长IgG的每一H链的C端加上Fab设计出了另一种四价形式。
为了让肿瘤渗透得到改进，将使用单链Fv (scFv)2片段(每一Fv由通过肽接头连接的轻链可变区和重链可变区组成)的较小的构建体连接在一起形成多价复合体。这样的构建体半衰期可能相当短(与全长mAb半衰期比较)，因此，这一问题已经通过将这些scFv多聚体与IgG Fc片段连接而解决了。很难控制用scFv和相似形式形成精确的聚合度，即二聚体、三聚体、四聚体，视基础构建体和表达方法可以不同比率形成较大的复合体。
产生多价免疫球蛋白的任何已知形式在免疫原性、体内半衰期或生产问题等方面都具有某些缺点。
本发明的目的是提供模件系统(modular system)，该系统可根据各种需要设计靶向细胞的多价免疫球蛋白，从而解决了现有技术的这些问题。
发明内容
本发明提供经由经修饰的结构环提供与细胞表面分子的另外结合由此与细胞表面受体交联来结合细胞表面蛋白的免疫球蛋白结构域。
根据本发明，提供与一个细胞的至少2个细胞表面分子特异性结合的多价免疫球蛋白或其结合部分，在所述免疫球蛋白的至少一个结构环区中至少一个修饰决定其与所述细胞表面分子的表位(包括位于一个细胞上的或在同源细胞群内可得到的抗原特性结构)结合，其中未经修饰的免疫球蛋白不显著结合所述表位。
根据本发明，本发明的多价免疫球蛋白可进一步与一种或多种经修饰的免疫球蛋白或其部分或者与未经修饰的免疫球蛋白或其部分组合，以获得组合免疫球蛋白。
优选地，在核苷酸序列或氨基酸序列内结构环结构域的修饰为缺失、取代、插入或其组合。
本发明还提供编码本发明的免疫球蛋白或其部分的核酸，和用于工程改造本发明多价免疫球蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
- 提供编码包含至少一个结构环区(structural loop region)的免疫球蛋白的核酸，
- 修饰所述结构环区的至少一个核苷酸残基，
- 将所述经修饰的核酸转移至表达系统，
- 表达所述多价免疫球蛋白，
- 使表达的多价免疫球蛋白接触表位，和
- 测定所述多价免疫球蛋白是否结合所述表位。
另外，提供本发明多价免疫球蛋白在制备用于治疗用途例如用于肿瘤细胞治疗和感染病原体的细胞的药物中的用途。
发明详述
本发明经修饰的免疫球蛋白结构域可就其本身使用，或可掺入各种已知的抗体形式例如完全抗体、Fab、单链Fvs、Fab2、微抗体等等以提供另外的对细胞表面表位或受体的结合位点。
具体地说，本发明涉及用于工程改造特异性结合抗原表位的免疫球蛋白的方法。通过在结构环区进行修饰，可对免疫球蛋白进行工程改造以结合表位。在一个优选的实施方案中，免疫球蛋白特异性结合来源于或模拟同一抗原或不同抗原的至少两个彼此不同的表位。
例如，本发明方法涉及工程改造特异性结合至少一个第一表位的免疫球蛋白，并在所述免疫球蛋白的至少一个结构环区内包含至少一个修饰；然后测定所述至少一个环区与至少一个第二表位的特异性结合，其中未经修饰的结构环区(非CDR区)不能特异性结合所述至少一个第二表位，该方法包括下列步骤：
- 提供编码与至少一个第一表位特异性结合并包含至少一个结构环区的免疫球蛋白的核酸，
- 修饰由所述核酸编码的至少一个所述环区的至少一个核苷酸残基，
- 将所述经修饰的核酸转移至表达系统，
- 表达所述经修饰的免疫球蛋白，
- 使表达的经修饰免疫球蛋白接触所述至少一个第二表位，和
- 测定所述经修饰的免疫球蛋白是否特异性结合第二表位。
本发明方法优选涉及在所述免疫球蛋白的至少一个结构环区里的至少一个修饰，和测定所述至少一个环区与至少一个选自细胞表面抗原的分子的特异性结合，其中含有未经修饰的结构环区的免疫球蛋白不能特异性结合所述至少一个分子。
本文所用术语“免疫球蛋白”包括免疫球蛋白或免疫球蛋白的部分或片段或衍生物。因此，该术语包括根据本发明待修饰的“免疫球蛋白结构域肽”(本文所用术语免疫球蛋白和抗体可互换)，以及含有结构环或这类结构域(例如微结构域(minidomain))的结构环的免疫球蛋白结构域或其部分。免疫球蛋白可作为分离的肽或作为与其它肽的组合分子使用。在某些情况下，优选用所定义的经修饰的结构环或结构环区或其部分作为分离的分子用于结合或组合目的。本文所定义的“免疫球蛋白结构域”含有经修饰和工程改造后可具有特异性结合特征的免疫球蛋白结构域肽或多肽。该肽与免疫球蛋白结构域序列同源，优选长度为至少5个氨基酸，更优选长度为至少10或甚至至少50或100个氨基酸，构成至少部分结构环或结构环区或结构域的非CDR环区。优选地，该肽排除那些被认为是非功能氨基酸、杂合或嵌合CDR区或CDR样区和/或CDR区的正则结构的插入。结合特征是指特异性表位结合、亲和力(affinity)和亲合力(avidity)。
本发明免疫球蛋白的衍生物是一种或多种本发明免疫球蛋白和/或其中可在一种或多种其它蛋白质(例如其它免疫球蛋白、配体、支架蛋白、酶、毒素等等)的任何位置与本发明免疫球蛋白的任何结构域或微结构域融合的融合蛋白的任意组合。本发明免疫球蛋白的衍生物还可通过重组技术或通过各种化学技术(例如共价偶联、静电作用、二硫键等)结合其它物质而获得。
结合到免疫球蛋白的其它物质可为脂类、糖类、核酸、有机和无机分子或其任意组合(例如PEG、前药或药物)。衍生物还可为具有相同氨基酸序列但完全或部分从非天然或经化学修饰的氨基酸制备的免疫球蛋白。
本发明的工程分子将作为独立蛋白(stand-alone protein)以及融合蛋白或衍生物使用，最典型的融合方式是作为较大抗体结构或完全抗体分子或其部分(例如Fab片段、Fc片段、Fv片段等)的组成部分。使用工程蛋白来产生同时为双特异性、三特异性并且或许甚至同时具有更多特异性的分子是可行的，同时根据计划使用这样的分子的需求来同时控制和预选择结合效价也是可行的。
本发明另一方面涉及具有至少一个环区的免疫球蛋白，其特征在于：所述至少一个环区包含形成至少一个经修饰的环区的至少一个氨基酸修饰，其中所述至少一个经修饰的环区特异性结合抗原的至少一个表位。
优选在分子水平上结合至少一个经修饰的抗体结构域，该抗体结构域经由非可变序列或结构环结合具有至少一个其它结合分子的特异性配偶体，该其它结合分子可以是抗体、抗体片段、可溶性受体、配体或另外的修饰抗体结构域。
作为由本发明免疫球蛋白特异性识别的结合对部分起作用的分子优选选自蛋白质分子、核酸和糖类。
经修饰的免疫球蛋白的环区可特异性结合任何种类的结合分子或结构，特别是抗原、蛋白质分子、蛋白质、肽、多肽、核酸、多聚糖、碳水化合物、脂类、有机小分子、无机分子或其组合或融合物。当然，经修饰的免疫球蛋白可包含至少两个环或环区，由此每一个环或环区可特异性结合不同的分子或表位。
根据本发明，可将结合抗原或所有种类的细胞表面抗原的抗原结合位点的区域引入特定抗体结构的结构环内。
本发明术语“抗原”应指已知与或能够与免疫球蛋白的CDR环区相互作用的分子或结构。现有技术提及的天然抗体的结构环区不与抗原相互作用，但对整体结构有帮助和/或有助于结合效应分子。只有按照本发明进行工程改造后，结构环才可以形成抗原结合口袋而不涉及CDR环或CDR区。
本发明术语“细胞表面抗原”包括细胞表面上所有能够被抗体结构识别的抗原和这样的分子的片段。优选“细胞表面抗原”是已经被证明是抗原或能够在免疫学上或治疗上有关的那些抗原，尤其是那些已经测定其临床前或临床功效的抗原。这些细胞表面分子明确地和本发明目的有关，并介导杀细胞活性。一旦本发明免疫球蛋白与这些细胞表面分子中的至少两个结合后，免疫系统就提供细胞溶解或细胞死亡，由此提供攻击人体细胞的有效手段。
优选地，抗原选自细胞表面抗原，包括受体，特别是选自erbB受体酪氨酸激酶(例如EGFR、HER2、HER3和HER4，但不限于这些)、TNF-受体超家族分子(例如Apo-1受体、TNFR1、TNFR2)、神经生长因子受体NGFR、CD40、T-细胞表面分子、T-细胞受体、T-细胞抗原OX40、TACI-受体、BCMA、Apo-3、DR4、DR5、DR6、诱饵受体(例如DcR1、DcR2)、CAR1、HVEM、GITR、ZTNFR-5、NTR-1、TNFL1，但不限于这些分子；B-细胞表面抗原，例如CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、实体瘤或血癌细胞抗原或标记、淋巴瘤或白血病细胞、包括血小板在内的其它血液细胞，但不限于这些分子。
根据另一个优选实施方案，结合经修饰的结构环区的抗原或分子选自：肿瘤相关抗原(特别是EpCAM)、肿瘤相关糖蛋白-72 (TAG-72)、肿瘤相关抗原CA125、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)、表达与Lewis Y有关的糖类的肿瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、CEACAM5、HMFG PEM、粘蛋白MUC1、MUC18和细胞角蛋白肿瘤相关抗原、细菌抗原、病毒抗原、过敏原、变态反应相关分子IgE、cKIT和Fc-ε-受体I、IRp60、IL-5受体、CCR3、红细胞受体(CR1)、人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、新生儿Fc-γ-受体FcRn、Fc-γ-受体Fc-γ RI、Fc-γ-RII、Fc-γ RIII、Fc-α-受体、Fc-ε-受体、荧光素、溶菌酶、toll样受体9、促红细胞生成素、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD11、CD11a、CD14、CD16、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33 (p67蛋白)、CD38、CD40、CD40L、CD52、CD54、CD56、CD64、CD80、CD147、GD3、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、LIF、OSM、干扰素α、干扰素β、干扰素γ；TNF-α、TNFβ2、TNFα、TNFαβ、TNF-R1、TNF-RII、FasL、CD27L、CD30L、4-1BBL、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、LIGHT、VEG1、OX40L、TRAIL受体-1、A1腺苷受体、淋巴毒素β受体、TACI、BAFF-R、EPO；LFA-3、ICAM-1、ICAM-3、整联蛋白β1、整联蛋白β2、整联蛋白α4/β7、整联蛋白α2、整联蛋白α3、整联蛋白α4、整联蛋白α5、整联蛋白α6、整联蛋白αv、αVβ3整联蛋白、FGFR-3、角质形成细胞生长因子、GM-CSF、M-CSF、RANKL、VLA-1、VLA-4、L-选择蛋白、抗Id、E-选择蛋白、HLA、HLA-DR、CTLA-4、T细胞受体、B7-1、B7-2、VNR整联蛋白、TGFβ1、TGFβ2、嗜伊红粒细胞趋化蛋白1 (eotaxinl)、BLyS (B-淋巴细胞刺激因子)、补体C5、IgE、IgA、IgD、IgM、IgG、因子VII、CBL、NCA 90、EGFR (ErbB-1)、Her2/neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、Her4 (ErbB4)、组织因子、VEGF、VEGFR、内皮素受体、VLA-4、糖类(例如血型抗原和有关糖类)、糖基化Galili、胃泌激素、胃泌激素受体、肿瘤相关糖类、半抗原NP-cap或NIP-cap、T细胞受体α/β、E-选择蛋白、P-糖蛋白、MRP3、MRP5、谷胱甘肽-S-转移酶pi (多重抗药性蛋白)、α-颗粒膜蛋白(GMP)140、地高辛、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)和睾丸PLAP样碱性磷酸酶、转铁蛋白受体、乙酰肝素酶I、人心肌肌球蛋白、糖蛋白IIb/IIIa (GPIIb/IIIa)、人巨细胞病毒(HCMV) gH包膜糖蛋白、HIV gp120、HCMV、呼吸道合胞病毒RSV F、RSVF Fgp、VNR整联蛋白、Hep B gpl20、CMV、gpIIbIIIa、HIV IIIB gp120 V3环、呼吸道合胞病毒(RSV) Fgp、单纯疱疹病毒(HSV) gD糖蛋白、HSV gB糖蛋白、HCMV gB包膜糖蛋白、产气荚膜梭菌毒素及其片段。
只要抗原亚结构在免疫学上相关，即也被天然抗体或单克隆抗体识别，则通常将其称为“表位”(例如B-细胞表位、T-细胞表位)。本发明术语“表位”应指可完全构成本发明结合结构域或免疫球蛋白的特异性结合配偶体或作为特异性结合配偶体部分的分子结构。
表位在化学上可由糖类、肽、脂肪酸、无机物质或其衍生物及其任何组合组成。若表位为肽或多肽，则通常肽内将包括有至少3个氨基酸，优选8-50个氨基酸，更优选约10-20个氨基酸。肽的长度没有临界上限，可包含几乎全长的多肽序列。表位可为线性表位或构象表位。线性表位由多肽链的一级序列单区段组成。线性表位可连续或重叠。构象表位由通过多肽折叠形成四级结构聚到一起的氨基酸组成，这些氨基酸在线性序列中不必彼此相邻。
表位明确地为诊断有关的分子的至少一部分，即在样品中没有或存在表位与疾病或与健康状况或与制备中的过程状态或与环境和食物状况在性质上或数量上相关联。表位还可为治疗有关的分子的至少一部分，即该分子可由改变该疾病病程的特异性结合结构域靶向。
优选地，通过在免疫球蛋白序列(特别是核苷酸序列)中取代、缺失和/或插入一个或多个元件而在结构环中引入新的抗原结合位点。
根据本发明的其它优选实施方案，修饰至少一个核苷酸导致由所述核酸编码的免疫球蛋白的氨基酸序列的取代、缺失和/或插入。
修饰至少一个环区可导致取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸或氨基酸(优选点突变)或甚至交换整个环，更优选交换至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15直至30个氨基酸。因此，经修饰的序列包含在结构环的保守区中未包括的氨基酸，新引入的天然存在的但对修饰位点为外源的氨基酸，或天然存在氨基酸的取代物。当外源氨基酸选自一组特定氨基酸时，例如具有特定极性或疏水性的氨基酸，依照本发明可获得在随机位置富含该组特定氨基酸的文库(library)。这样的库也称作“融合”文库。
经随机修饰的核酸分子可包含本文鉴定的重复单位，这些重复单位编码所有的已知天然存在的氨基酸或其子集。将那些含有经修饰的序列(其中特殊的氨基酸子集用作修饰目的)的文库称作“融合”文库。这样的文库成员提高了这样子集的氨基酸在修饰位置的概率，比平常提高到至少2倍，优选到至少3倍或甚至高至少4倍。这样的文库也有文库成员数目限制或下限，以便实际的文库成员数目达到理论文库成员数目。在某些情况下，融合文库的文库成员数目不少于理论数目的103倍，优选不少于102倍，最优选不少于10倍。
本发明文库可设计为含有至少50%、优选至少60%、更优选至少70%、更优选至少80%、更优选至少90%的特殊模式的专一的文库，或主要由特异性抗体模式组成的文库。优选特异性抗体模式，以便本发明优选文库选自VH文库、VHH文库、Vκ文库、Vλ文库、Fab文库、CH1/CL文库和CH3文库。特别优选其特征在于：含有一个以上抗体结构域的复合分子内容的文库，例如IgG文库或Fc文库。其它优选文库为含有T-细胞受体、形成T-细胞受体的文库。另外的优选文库为表位文库，其中融合蛋白包含具有表位变体的分子，还使得能选择具有相似结合作用但功能性不同的竞争性分子。实例为TNFα文库，其中TNFα融合蛋白的三聚体由单遗传包装展示。
然而，插入免疫球蛋白环区的氨基酸的最大数目可优选最多不超过30、优选25、更优选20个氨基酸。通过本领域已知方法，用所有可能的氨基酸或选择优选用于随机化目的的氨基酸，优选随机或半随机发生氨基酸取代和插入，其如本专利申请所公开的。
修饰位点可处于特殊单结构环或结构环区。环区通常由彼此不相邻的至少2个、优选至少3个或至少4个环组成，这样可有助于通过形成抗原结合位点或抗原结合口袋来结合抗原。优选一个或多个修饰位点位于10个氨基酸范围内，更优选在20、30、40、50、60、70、80、90直至100个氨基酸内，特别是在结构区内，以形成表面或口袋，在此处抗原可在空间上接近环区。
优选通过随机、半随机或特别地通过定点随机诱变方法(尤其是缺失、交换或将随机产生的插入引入到结构环内)，使至少一个环区优选地突变或修饰产生文库。或者，优选应用组合方法。可采用任何已知的诱变方法，其中之一是盒诱变。这些方法可用于在本发明免疫球蛋白的所需位置产生氨基酸修饰。在某些情况下，例如用任何可能的氨基酸或选择的优选氨基酸随机选择位置，以使环序列随机化，或者用简单的规则进行氨基酸改变。例如，可优选使所有的残基突变为特定氨基酸例如丙氨酸，称为氨基酸扫描或丙氨酸扫描。可将这样的方法与更加复杂的工程方法结合起来，后者采用了选择方法筛选出较高水平的序列多样性。
本发明优选方法涉及编码免疫球蛋白、免疫球蛋白结构域或其部分的经随机修饰的核酸分子，这样的核酸分子在具有5'-NNS-3'、5'-NNN-3'、5'-NNB-3'或5'-NNK-3'序列的结构环编码区内包含至少一个核苷酸重复单位。在某些实施方案中，经修饰的核酸包含选自以下的核苷酸密码子：TMT、WMT、BMT、RMC、RMG、MRT、SRC、KMT、RST、YMT、MKC、RSA、RRC、NNK、NNN、NNS或其任意组合(编码遵照IUPAC)。
可通过将合成寡核苷酸引入到较大的核酸区段，或通过全程合成完全核酸分子来实施核酸分子修饰。若欲编码氨基酸子集，可用会减少无义序列组合数目的三核苷酸结构单元实施核酸合成(例如Yanez等，Nucleic Acids Res. (2004) 32: e158；Virnekas等，Nucleic Acids Res. (1994) 22: 5600-5607)。
经随机修饰的核酸分子可包含编码所有已知天然存在的氨基酸的上述经鉴别的重复单位。
如本领域所熟知，有多种用于鉴别和分离具有某些结合特征和亲和力的蛋白的可供选择的技术，包括例如展示技术，例如噬菌体展示、核糖体展示、细胞表面展示等等，其如下所述。用于生产和筛选抗体变体的一般方法为本领域所熟知。用于抗体分子生物学、表达、纯化和筛选的方法描述于Antibody Engineering (抗体工程学), 由Duebel和Kontermann编辑, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001；和Hayhurst和Georgiou, 2001,Curr Opin Chem Biol 5: 683-689；Maynard和Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng2: 339-76。
用以下方式理解本发明“结构环”或“非CDR环”：由具有所谓免疫球蛋白折叠的结构域构成的免疫球蛋白。大体上，通过环连接反向β片层以形成紧压的反平行β桶。在可变区内，某些结构域的环本质上决定抗体特异性，即通过抗体的天然结合位点结合抗原。这些环被称作CDR环。CDR环位于CDR环区内，在某些情况下也可位于与CDR环相邻的可变构架区(称为“VFR”)。已知VFR可帮助形成通常主要由CDR环决定的抗体的抗原结合口袋。因此，认为VFR为CDR环区的部分，并且不适合用于本发明目的。与CDR环区内的或位于最接近CDR环的VFR形成对照，可变区的其它VFR将特别适用于本发明。那些VFR是位于CDR环区对面的或在可变免疫球蛋白结构域C端一侧的VFR结构环。
抗体结构域的所有其它环对所述分子结构和/或效应功能相当有帮助。这些环在本文中定义为“结构环”或非CDR环，其还应排除在CDR环区内的任何VFR。
可将编码经修饰的免疫球蛋白(在以下整个说明书中免疫球蛋白总是包括：免疫球蛋白片段或衍生物)的核酸分子克隆到宿主细胞，进行表达并分析其结合特异性。用熟知的方法和在以下书籍中描述的可用于本发明的多种方法实施这些实践：MolecularCloning-A Laboratory Manual (分子克隆实验手册), 3.sup.rd Ed. (Maniatis, ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York, 2001)和Current Protocols inMolecular Biology (分子生物学通用方案) (John Wiley & Sons)。为了表达所述免疫球蛋白，可将编码本发明经修饰的免疫球蛋白的核酸掺入到表达载体。表达载体通常包含位于含操纵或调控序列、选择标记、任何融合配偶体和/或另外的元件的功能关系(functional relationship)中的可操作连接的免疫球蛋白。可通过在诱导或引起经修饰的免疫球蛋白表达的合适的条件下，培养用核酸(优选含有编码经修饰的免疫球蛋白的核酸的表达载体)转化的宿主细胞来产生本发明经修饰的免疫球蛋白。将外源核酸分子引入宿主的方法为本领域所熟知，并将视所用宿主而变化。当然，还可采用非细胞或无细胞表达系统来表达经修饰的免疫球蛋白。
本文所用术语“表达系统”指含有可操作连接的所需编码序列和调控序列的核酸分子，由此用这些序列转化或转染的宿主能够产生所编码的蛋白质。为了有效转化，载体上可包括表达系统；然而，除此外有关DNA也可整合到宿主染色体上。
根据本发明优选实施方案，表达系统包含载体。本领域所知的任何表达载体如合适可用于该目的。
经修饰的免疫球蛋白优选在宿主中表达，优选在细菌、酵母、植物细胞、在动物细胞或在植物或动物中表达。
多种合适的宿主细胞可用于表达经修饰的免疫球蛋白，包括但不限于哺乳动物细胞(动物细胞)或/和植物细胞、细菌(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli))、昆虫细胞和酵母(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。例如，可用于本发明的多种细胞系参见ATCC细胞系目录，可得自美国典型培养物保藏中心。此外，植物和动物也可用作表达本发明免疫球蛋白的宿主。可根据所用宿主选择表达载体或表达盒以及转染载体或转染盒。
当然，还可使用非细胞或无细胞蛋白质表达系统。产生足量蛋白质的体外转录/翻译蛋白质表达平台提供无细胞蛋白质表达的多个优点，排除了对通常与基于细胞的表达系统有关的费力的上游和下游步骤(例如宿主细胞转化，培养或裂解)的需要。
在本发明的一个优选实施方案中，经修饰的免疫球蛋白在表达后进行纯化或分离。可以多种本领域技术人员已知的方法分离或纯化经修饰的免疫球蛋白。标准纯化方法包括色谱技术(包括亲和色谱法、离子交换或疏水色谱法)、电泳技术、免疫技术、沉淀技术、透析技术、过滤技术、浓缩技术和色谱聚焦技术。通常通过特定融合配偶体实现纯化。例如，若采用GST融合，可用谷胱甘肽树脂纯化抗体；若采用His-标签，则用Ni+2亲和色谱法纯化；或若用flag-标签，则用固定化抗flag抗体纯化。对于合适纯化技术的一般指导方针，参见Antibody Purification：Principles and Practice (抗体纯化：原理与实践), 3. sup.rd Ed., Scopes, Springer - Verlag, NY, 1994。当然，还可能在宿主表面表达本发明经修饰的免疫球蛋白，特别是在细菌、昆虫或酵母细胞表面或在噬菌体或病毒表面。
可用多种方法筛选经修饰的免疫球蛋白，这些方法包括但不限于在体外测定、体内和基于细胞的测定中使用的方法和选择技术。在筛选程序中可使用自动化和高通量筛选技术。筛选可采用融合配偶体或标记应用，例如酶、免疫标记、同位素标记或小分子标记，例如荧光染料或比色染料或发光分子。
在一个优选实施方案中，在体外测定中筛选免疫球蛋白的功能特性和/或生物物理学特性。在一个优选实施方案中，筛选抗体的功能，例如其催化反应的能力或其对其靶标的结合亲和力。
测定可采用多种检测方法，包括但不限于发色标记、荧光标记、发光标记或同位素标记。
如本领域所知，筛选方法子集为那些用于选择有利文库成员的方法。本文中将这些方法称为“选择方法”，这些方法用于本发明筛选经修饰的免疫球蛋白。当用选择方法筛选免疫球蛋白库时，只增殖、分离和/或观测满足某些选择标准的有利的文库成员。如所理解的一样，因为仅观测最合适的变体，所以这样的方法能够筛选比通过个别地测定文库成员的适当性的方法可筛选的文库更大的文库。能够通过任何方法、技术或共价或非共价连接的融合配偶体、相应基因型的免疫球蛋白表型(其为具有编码该表型的核酸的抗体的功能)进行选择。例如，通过将文库成员与基因III蛋白融合，能够用噬菌体展示作为选择方法。在这种方法中，选择或分离满足某些标准(例如对免疫球蛋白的靶标的结合亲和力)的经修饰的免疫球蛋白，也选择或分离编码它们的核酸。一旦分离，然后就可扩增编码经修饰的免疫球蛋白的一种或多种基因。可重复称为淘选(panning)的分离和扩增的这一过程，以使有利的抗体变体富集在文库中。对连接的核酸的核酸序列测定最终使得可鉴定基因。
可在本发明中使用的用于筛选免疫球蛋白文库的多种选择方法为本领域已知。这些包括但不限于噬菌体展示(Phage display of peptides and antibodies：alaboratory manual (肽和抗体噬菌体展示：实验手册), Kay等, 1996, Academic Press,San Diego, Calif., 1996；Low-man等, 1991, Biochemistry 30: 10832-10838；Smith,1985, Science 228: 1315-1317)及其衍生技术，例如选择性噬菌体感染(Malmborg等,1997, J MoI Biol 273: 544-551)、选择性感染噬菌体(Krebber等, 1997, J MoI Biol268: 619-630)和延时感染性淘选(delayed infectivity panning) (Benhar等, 2000, JMoI Biol 301：893-904)；细胞表面展示(Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399)，例如在细菌中展示(Georgiou等, 1997, Nat Biotechnol 15: 29-34；Georgiou等, 1993, Trends Biotechnol 11: 6-10；Lee等, 2000, Nat Biotechnol 18: 645-648；Jun等, 1998, Nat Biotechnol 16：576-80)、酵母中展示(Boder和Wittrup, 2000,Methods Enzymol 328: 430-44；Boder和Wittrup, 1997, Nat Biotechnol 15: 553-557)和哺乳动物细胞中展示(Whitehorn等, 1995, Bio/technology 13: 1215-1219)；以及体外展示技术(Amstutz等, 2001, Curr Opin Biotechnol 12: 400-405)，例如多核糖体展示(Mattheakis等, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91: 9022-9026)、核糖体展示(Hanes等, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94: 4937-4942)、mRNA展示(Roberts和Szostak,1997, Proc Natl Acad Sci USA 94: 12297-12302；Nemoto等, 1997, FEBS Lett 414:405-408)和核糖体失活展示系统(Zhou等, 2002, J Am Chem Soc 124, 538-543)。
可用于本发明的其它选择方法包括不依赖展示的方法，例如体内方法，包括但不限于周质表达和细胞计量筛选(cytometric screening) (Chen等, 2001, NatBiotechnol 19: 537-542)、抗体片段补体测定(Johnsson和Varshavsky, 1994, ProcNatl Acad Sci USA 91: 10340-10344；Pelletier等, 1998, Proc Natl Acad Sci USA95: 12141-12146)和在选择模式(Visintin等, 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:11723-11728)中使用的酵母双杂交筛选(Fields和Song, 1989, Nature 340: 245-246)。在备选实施方案中，通过以下融合配偶体能够进行选择：结合表达载体上的特定序列的融合配偶体，由此使该融合配偶体和相关的Fc变体文库成员(具有编码它们的核酸)共价或非共价连接。
在备选实施方案中，若抗体表达给予细胞某些生长、繁殖或存活优势，则可进行体内选择。
称作“定向进化”方法的选择方法子集为包括那些在选择期间杂交或交配有利序列并有时掺入新的突变的方法。如本领域技术人员所理解，定向进化方法可促进对文库中最有利序列的鉴别，可增加筛选的序列的多样性。可用于本发明筛选抗体变体的多种定向进化方法为本领域已知，包括但不限于DNA改组(PCT WO 00/42561 A3；PCT WO 01/70947A3)、外显子改组(美国专利第6,365,377号；Kolkman和Stemmer, 2001, Nat Biotechnol19: 423-428)、家族改组(Crameri等, 1998, Nature 391: 288-291；美国专利第6,376,246号)、RACHITT. TM. (Coco等, 2001, Nat Bio-technol 19: 354-359；PCT WO 02/06469)、STEP和随机引发体外重组(Zhao等, 1998, Nat Biotechnol 16: 258-261；Shao等, 1998, Nucleic Acids Res 26: 681-683)、核酸外切酶介导的基因拼装(美国专利第6,352,842号；美国专利第6,361,974号)、基因位点饱和诱变.TM. (美国专利第6,358,709号)、基因重新拼装.TM. (美国专利第6,358,709号)、SCRATCHY (Lutz等, 2001, ProcNatl Acad Sci USA 98: 11248-11253)、DNA片段化方法(Kikuchi等, Gene 236: 159-167)、单链DNA改组(Kikuchi等, 2000, Gene 243: 133-137)和AME系统. TM.定向进化抗体工程技术(Applied Molecular Evolution) (美国专利第5,824,514号；美国专利第5,817,483号；美国专利第5,814,476号；美国专利第5,763,192号；美国专利第5,723,323号)。
根据本发明优选实施方案，通过选自以下的结合测定确定经修饰的免疫球蛋白与分子的特异性结合：免疫测定，优选酶联免疫吸附测定(ELISA)、表面等离子体共振测定、饱和转移差谱核磁共振波谱分析、转移NOE (trNOE)核磁共振波谱分析、竞争性测定、组织结合测定、活细胞结合测定和细胞提取物测定。
用多种本领域已知方法可进行结合测定，这些方法包括但不限于：FRET (荧光共振能量转移)和基于BRET (生物发光共振能量转移)的测定、ΑlphascreenTM (放大发光亲近均相测定)、闪烁亲近测定、ELISA (酶联免疫吸附测定)、SPR (表面等离子体共振，也称为BIACORETM)、等温滴定量热法、差示扫描量热法、凝胶电泳和包括凝胶过滤在内的色谱法。这些方法和其它方法均可利用某些融合配偶体或标记。
经修饰的免疫球蛋白优选与标记或报告分子缀合，标记或报告分子选自有机分子、酶标记、放射性标记、颜色标记、荧光标记、发色标记、发光标记、半抗原、地高辛配基、生物素、金属络合物、金属、胶体金及其混合物。缀合标记或报告分子的经修饰的免疫球蛋白可用于例如诊断方法中。
经修饰的免疫球蛋白可缀合使得可在例如结合测定(例如ELISA)和结合研究中简单检测所述缀合物的其它分子。
在一个优选实施方案中，用一种或多种基于细胞的测定或体内测定筛选抗体变体。对于这样的检测，通常外源地加入纯化或未纯化的经修饰的免疫球蛋白，以使细胞与属于文库(library)的各个免疫球蛋白或免疫球蛋白库(pool)接触。这些测定法通常但并不总是基于免疫球蛋白的功能；这些功能也就是抗体结合其靶标和介导某些生物化学事件(例如效应功能、配体/受体结合抑制、细胞凋亡等等)的能力。这样的测定法通常涉及监测细胞对抗体的应答，例如细胞存活、细胞死亡、细胞形态变化或转录活化(例如天然基因或报告基因的细胞表达)。例如，这样的检测可测量抗体变体引发ADCC、ADCP或CDC的能力。对于某些检测，可能需要加入另外的细胞或组分，也就是除靶细胞之外的细胞或组分，例如血清补体或效应细胞，例如外周血单核细胞(PBMC)、NK细胞、巨噬细胞等等。这样的另外的细胞可来自生物体，优选人类、小鼠、大鼠、兔和猴。免疫球蛋白可引起某些表达靶标的细胞系的细胞凋亡，或它们可通过已经加入到该检测中的免疫细胞介导攻击靶细胞。用于监测细胞死亡或生存能力的方法为本领域已知，包括应用染料、免疫化学、细胞化学和放射性试剂。例如，半胱天冬蛋白酶(caspase)染色检测可测量细胞凋亡，吸收或释放放射性底物或荧光染料例如阿尔玛蓝可监测细胞生长或活化。
在一个优选实施方案中，可使用基于DELFIART EuTDA的细胞毒性检测(PerkinElmer, MA)。或者，可通过测量释放的一种或多种天然细胞内组分例如乳酸脱氢酶，来监测死亡的或损伤的靶细胞。在基于细胞的测定中转录活化也可用作测定功能的方法。在这种情况下，可通过测定可被上调的天然基因或免疫球蛋白，例如释放某些可被测量的白介素，或作为选择可经由报告构建体读出，来监测响应。基于细胞的测定还可涉及测量作为存在经修饰的免疫球蛋白响应的细胞的形态学变化。用于这样的检测的细胞类型可为本领域已知，可采用的真核的或原核的和多种细胞系。或者，用已经用编码变体的核酸转化或转染的细胞实施基于细胞的筛选。更确切地说，不向细胞中外源地加入抗体变体。例如，在一个实施方案中，基于细胞的筛选利用细胞表面展示。可采用能够在细胞表面展示经修饰的免疫球蛋白的融合配偶体(Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12: 395-399)。
在一个优选实施方案中，可用一种或多种基于细胞的测定经过实验测定经修饰的免疫球蛋白的免疫原性。在一个优选实施方案中，离体T-细胞活化检测用于经过实验定量免疫原性。在该方法中，抗原呈递细胞和来自匹配供者的幼稚T细胞一次或多次受到目标肽或全抗体的刺激。然后，可用多种方法检测T细胞活化，例如通过监测细胞因子的产生或测量摄取的含氚胸苷。在最优选实施方案中，用Elispot测定来监测干扰素γ的产生(Schmittel等, 2000, J. Immunol. Meth., 24: 17-24)。
在细胞、组织和全生物体实验中，可离体表征本发明经修饰的免疫球蛋白的生物学特性。如本领域所知，为了测量药物用于治疗疾病或疾病模型的功效，或为了测量药物的药代动力学、药效学、毒性和其它性质，经常在动物体内测试药物，这些动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪和猴。可将动物作为疾病模型。经常在小鼠中测试治疗药，小鼠包括但不限于裸鼠、SCID小鼠、异种移植物小鼠和转基因小鼠(包括敲入小鼠和敲除小鼠)。这样的实验可提供有意义的数据，用于确定抗体用作具有合适半衰期、效应功能、细胞凋亡活性、细胞毒性或溶细胞性活性的治疗剂的潜力。任何生物体(优选哺乳动物)可用于测试。例如，因为灵长类猴和人类的遗传相似性而可作为合适的治疗模型，所以可用灵长类猴测试本发明经修饰的免疫球蛋白的功效、毒性、药代动力学、药效学、半衰期或其它特性。物质在人体内测试最终需要正式批准为药物，因此当然要提供这些实验。因此，可在人体内测试本发明经修饰的免疫球蛋白以确定其治疗功效、毒性、免疫原性、药代动力学和/或其它临床特性。尤其是那些通过至少两个表面抗原结合单个细胞(优选结合至少三个结构交联靶细胞)的本发明多价免疫球蛋白，将被认为是凋亡前的情况，并对靶向和交联细胞发挥细胞凋亡活性。多价结合为结合配偶体提供了相当大的联合，也被称为交联，它是细胞凋亡的必要条件。
可以多种抗体制品来使用本发明经修饰的免疫球蛋白。在一个实施方案中，将本发明抗体变体例如作为主动或被动免疫疗法用于治疗或预防，作为诊断试剂、商用化合物或研究试剂、优选治疗剂用于制备性、商业或分析应用。在单克隆或多克隆抗体组合物中可使用经修饰的免疫球蛋白或抗体变体。在一个优选实施方案中，本发明经修饰的免疫球蛋白用于捕获或杀死带有目标抗原的目标细胞，例如癌细胞。在备选实施方案中，本发明经修饰的免疫球蛋白用于例如通过拮抗细胞因子或细胞因子受体来封闭、拮抗或刺激目标抗原。
在备选优选实施方案中，本发明经修饰的免疫球蛋白用于封闭、拮抗或刺激生长因子或生长因子受体，藉此介导杀死带有或需要目标抗原的目标细胞。
在备选优选实施方案中，本发明经修饰的免疫球蛋白用于封闭、拮抗或刺激酶和酶底物。
本发明经修饰的免疫球蛋白可用于各种治疗目的，优选用于主动或被动免疫疗法。
具体地说，本发明免疫球蛋白或通过本发明方法可获得的免疫球蛋白可用于制备供主动免疫用的疫苗。据此免疫球蛋白用作抗原性药物物质以调配疫苗，或在疫苗制剂中使用用于在离体或体内钓取或捕获抗原结构。
在一个优选实施方案中，将包含经修饰的免疫球蛋白的抗体给予患者以治疗特定疾病。用于本发明目的的“患者”既包括人类又包括其它动物，优选哺乳动物，最优选人类。本文“特定疾病”是指可通过给予包含本发明经修饰的免疫球蛋白的药用组合物改善的疾病。
在一个实施方案中，本发明经修饰的免疫球蛋白是给予患者的唯一的治疗药物。或者，本发明经修饰的免疫球蛋白与一种或多种其它治疗药物联合给予，这些包括但不限于：细胞毒性药物、化疗药、细胞因子、生长抑制剂、抗激素药物、激酶抑制剂、抗血管生成药、保心药或其它治疗药物。可伴随一种或多种其它治疗方案给予经修饰的免疫球蛋白。例如，可将本发明抗体变体连同化学治疗、放射治疗或化学治疗和放射治疗二者给予患者。在一个实施方案中，可联合一个或多个可包含或可不包含本发明抗体变体的抗体给予本发明经修饰的免疫球蛋白。依照本发明的另一个实施方案，采用本发明经修饰的免疫球蛋白和一种或多种其它抗癌治疗来离体治疗癌症细胞。预期这样的离体治疗可用于骨髓移植，特别是自体骨髓移植。当然，预期可采用本发明抗体与外科手术等其它治疗技术合用。
多种其它治疗药物可用于与本发明经修饰的免疫球蛋白一起给予。在一个实施方案中，经修饰的免疫球蛋白与抗血管生成药一起给予，后者为阻断或某种程度上干扰血管发育的化合物。抗血管生成因子可例如为小分子或蛋白质，例如抗体、Fc融合分子或细胞因子，它们结合与促进血管生成有关的生长因子或生长因子受体。本文优选抗血管生成因子为结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体。在备选实施方案中，经修饰的免疫球蛋白与诱导或加强获得性免疫应答的治疗药物(例如靶向CTLA-4的抗体)一起给予。在备选实施方案中，经修饰的免疫球蛋白与酪氨酸激酶抑制剂一起给予，后者是在某种程度上抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的分子。在备选实施方案中，本发明经修饰的免疫球蛋白与细胞因子一起给予。本文所用“细胞因子”是指由一个细胞群释放的可作为细胞间介质(包括趋化因子)对另一细胞起作用的蛋白质的通称。
涵盖其中本发明经修饰的免疫球蛋白与一种或多种治疗活性剂调配在一起的药用组合物。通过将具有所需纯度的所述免疫球蛋白与任选药用载体、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences (雷明顿药物科学), 第16版, Osol, A.编辑,1980)混合，来制备呈冻干制剂或水性溶液剂形式的合适的本发明抗体变体的储存制剂。用于体内给药的制剂优选无菌。这一点易于通过经无菌过滤膜过滤或其它方法来完成。本文公开的经修饰免疫球蛋白和其它治疗活性剂还可调配为免疫脂质体和/或包裹在微胶囊中。
可用多种方法给予包含本发明经修饰的免疫球蛋白的药用组合物，优选药用组合物呈无菌水性溶液剂的形式，给予方法包括但不限于：经口、皮下、静脉内、鼻内、耳内、透皮、黏膜、局部(例如凝胶剂、药膏、洗剂、霜剂等)、腹膜内、肌内、肺内(例如可购自Aradigm的AERx™可吸入技术或购自Inhale Therapeutics的Inhance™肺递送系统)、阴道内、胃肠外、直肠或眼内。
本文所用术语“特异性结合”指在不同类的分子群中确定目标关联配体的结合反应。因此，在指定的条件(例如在免疫球蛋白情况下免疫测定条件)下，具体的抗体结合其特定“目标”，并不以显著量结合存在于样品中的其它分子。经修饰的结构环区可类比抗体CDR，为结合抗原-、结构-或分子的蛋白质部分，而其本身不是抗原。
本发明另一方面涉及用于制备在所述免疫球蛋白的结构环区中包含至少一个修饰的免疫球蛋白或其药用制品并测定所述免疫球蛋白与抗原表位结合的方法，其中未经修饰的免疫球蛋白不显著结合所述表位，该方法包括下列步骤：
- 提供编码包含至少一个环区的免疫球蛋白的核酸，
- 修饰至少一个所述环区的至少一个核苷酸残基，
- 将所述经修饰的核酸转移至表达系统，
- 表达所述经修饰的免疫球蛋白，
- 让表达的经修饰免疫球蛋白与表位接触，
- 测定所述经修饰的免疫球蛋白是否与所述表位结合，和
- 提供结合所述表位的经修饰免疫球蛋白和任选地将其制成药用制品。
在优选实施方案中，本发明免疫球蛋白为双特异性抗体或双特异性单链抗体。进一步优选免疫球蛋白包含双特异性结构域或其部分，包括微结构域。
具体地说，本发明涉及用于以下方面的方法：制备与至少一个第一分子特异性结合的多特异性免疫球蛋白或其药用制品，在所述免疫球蛋白至少一个结构环区包含至少一个修饰；并测定所述至少一个环区与至少一个第二分子的特异性结合，所述第二分子为抗原，例如选自过敏原、肿瘤相关抗原、自体抗原、酶、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原和病毒抗原，其中含有未经修饰的结构环区的免疫球蛋白不能特异性结合所述至少一个第二分子，该方法包括下列步骤：
- 提供编码包含至少一个结构环区、特异性结合至少一个第一分子的免疫球蛋白的核酸，
- 修饰由所述核酸编码的至少一个所述环区的至少一个核苷酸残基，
- 将所述经修饰的核酸转移至表达系统，
- 表达所述经修饰的免疫球蛋白，
- 让该表达的经修饰免疫球蛋白与所述至少一个第二分子接触，和
- 测定所述经修饰的免疫球蛋白是否特异性结合第二分子，和
- 提供与所述至少一个第二分子特异性结合的经修饰免疫球蛋白和任选地将其制成药用制品。
优选将不止一种特异性工程改造为特异性结合对成员(Kufer等(2004) Trendsin Biotechnology, 第22卷, 第238-244页)。
为了产生多特异性(例如双特异性、单克隆抗体或抗体片段)已经进行了无数尝试。在产生由两条不同的多肽链(重链和轻链)构成的双特异性抗体中的一个问题，是需要在一个细胞中表达四条不同的链(两条重链和两条轻链)，导致多种不同的分子组合，不得不在混合物中将其与所需的双特异性分子分开。由于它们的相似性，这些分子的分离很困难并花费多。已经采用了多种技术来使这种不想要的配对偶的出现最小化(Carter (2001)Journal of Immunological Methods, 第248卷, 第7-15页)。
对该问题的一个解决方法是制备具有两种特异性的一条多肽链，象例如彼此连接的两条scFv，或制备所谓的双抗体。这样的分子经证明远离天然分子折叠，非常难产生(Le-GaIl等(2004) Protein Engineering, Design & Selection, 第17卷, 第357-366页)。
目前设计双特异性抗体的另一个问题是这样一个事实：即使双亲抗体二价结合其各自的结合配偶体(例如IgG)，得到的双特异性抗体对各自结合配偶体的每一个也是单价的。
优选本发明多特异性分子解决了这些问题：将双特异性分子表达为一条多肽链成为可能(经修饰的Ig结构域具有两个结合特异性，参见实施例部分)，这比表达两条抗体多肽链更容易完成(Cabilly等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984))。
由于第二种特异性位于分子的非可变部分，不必有两条不同的重链或不同的轻链这一事实，其也可制备为象分子的抗体(即由两条多肽链构成，为同型二聚体或异型二聚体)。因此，不可能有两条链错误配对。
本发明抗体可由重链和轻链组成，它们一起形成通过第一种特异性来结合特异性结合配偶体的可变区。可通过重链或轻链任一种的任何结构环的经修饰的环形成第二种特异性。通过不止一个结构上相邻的非CDR环(在重链或在轻链上或在两种链上)也可形成结合位点。
经修饰的抗体或衍生物可为完全抗体或抗体片段(例如Fab、CH1-CH2、CH2-CH3、Fc，有或没有铰链区)。
可单价或多价结合相同或不同的结合配偶体，或甚至视设计而定对于不同的结合配偶体具有不同效价。
因为存在多种不同的环用于选择和设计在重链及轻链的非CDR区的特异性结合位点，所以设计具有甚至超过两种特异性而没有上述问题的抗体衍生物成为可能。
可用或不用肽接头来连接在一条多肽链内的特异性结合结构域。
所述发明的免疫球蛋白的经修饰的结构环区可在所述免疫球蛋白的恒定区和/或可变区内。万一经修饰的结构环在恒定区内，优选在CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C或其部分内。
根据本发明的一个优选实施方案，免疫球蛋白为人源或鼠源。
既然经修饰免疫球蛋白可用于各种目的，特别是用于药用组合物，那么免疫球蛋白优选为人源或鼠源。当然，经修饰的免疫球蛋白还可为人源化或嵌合免疫球蛋白。
根据本发明的另一个优选实施方案，人免疫球蛋白选自IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM。
鼠免疫球蛋白优选选自IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3和IgM。
经修饰的免疫球蛋白可源自上述经鉴别的免疫球蛋白类别之一并此后在结构上加以改变。
免疫球蛋白优选包含免疫球蛋白或其部分的重链和/或轻链。对于本发明目的，可优选提供异型二聚体或同型二聚体分子以及单体免疫球蛋白。
经修饰的免疫球蛋白可包含重链和/或轻链和至少一个可变区和/或恒定区。
本发明免疫球蛋白优选包含免疫球蛋白或其部分(包括微结构域)的至少一个恒定区和/或至少一个可变区。
恒定区为免疫球蛋白分子的不变部分的免疫球蛋白折叠单位，也称为恒定区结构域(例如CH1、CH2、CH3、CH4、Ck、C1)。
可变区为免疫球蛋白的可变部分的免疫球蛋白折叠单位，也称为可变区结构域(例如Vh、Vk、V1、Vd)。
优选本发明免疫球蛋白由选自CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C或其部分或组合的恒定区组成，恒定区包括微结构域，具有至少一个环区，该免疫球蛋白的特征为所述至少一个环区包含形成至少一个经修饰的环区的至少一个氨基酸修饰，其中所述至少一个经修饰的环区特异性结合抗原的至少一个表位。
本发明经修饰的免疫球蛋白可包含一个或多个恒定区(例如至少2个、3个、4个、5个、6个、10个结构域)。如果在经修饰的免疫球蛋白中存在不止一个结构域，则这些结构域可为相同类型或不同类型(例如CH1-CH1-CH2、CH3-CH3、Fc区、(CH2)2-(CH3)2)。当然，单个结构域的顺序也可为任何种类(例如CH1-CH3-CH2、CH4-CH1-CH3-CH2)。
根据本发明的另一个优选实施方案，经修饰的环区CH1、CH2、CH3和CH4包含第7-21位氨基酸、第25-39位氨基酸、第41-81位氨基酸、第83-85位氨基酸、第89-103位氨基酸和第106-117位氨基酸。
根据本发明的另一个优选实施方案，CH3的第15-17位、第29-34位、第85.4-85.3位、第92-94位、第97-98位和/或第108-110位的氨基酸残基经过修饰。
人源Igk-C和Igl-C的环区优选包含第8-18位氨基酸、第27-35位氨基酸、第42-78位氨基酸、第83-85位氨基酸、第92-100位氨基酸、第108-117位氨基酸和第123-126位氨基酸。
鼠源Igk-C和Igl-C的环区优选包含第8-20位氨基酸、第26-36位氨基酸、第43-79位氨基酸、第83-85位氨基酸、第90-101位氨基酸、第108-116位氨基酸和第122-125位氨基酸。
根据特定实施方案，本发明免疫球蛋白可在选自VH、Vκ、Vλ、VHH及其组合的可变区内含有修饰。更明确地，它们在第7-21位氨基酸、第25-39位氨基酸、第41-81位氨基酸、第83-85位氨基酸、第89-103位氨基酸或第106-117位氨基酸内包含至少一个修饰，其中在所述结构域内所述氨基酸位置的编号方式为IMGT编号。
本发明另一优选免疫球蛋白由重链或轻链或其部分(包括微结构域)的可变区与至少一个环区、优选结构环区组成，其特征在于：所述至少一个环区包含形成至少一个经修饰的环区的至少一个氨基酸修饰，其中所述至少一个经修饰的环区特异性结合抗原的至少一个表位。
在备选实施方案中，本发明免疫球蛋白的特征为人源VH或Vκ或Vλ环区在第8-20位氨基酸、第44-50位氨基酸、第67-76位氨基酸和第89-101位氨基酸、最优选第12-17位氨基酸、第45-50位氨基酸、第69-75位氨基酸和第93-98位氨基酸内包含至少一个修饰，其中在所述结构域内所述氨基酸位置的编号方式为IMGT编号。
如有可能，选择用于本发明修饰目的的人源免疫球蛋白可变区结构环区优选包含第8-20位氨基酸、第44-50位氨基酸、第67-76位氨基酸和第89-101位氨基酸。
根据本发明优选实施方案，如有可能，选择用于本发明修饰目的的鼠源免疫球蛋白可变区结构环区包含第6-20位氨基酸、第44-52位氨基酸、第67-76位氨基酸和第92-101位氨基酸。
本发明免疫球蛋白还优选为骆驼源。骆驼抗体仅包含一条重链，具有与由轻链和重链组成的正常抗体相同的抗原亲合力。因此，骆驼抗体比例如人抗体更小一些，这使得它们可渗透到致密组织到达抗原，而较大的蛋白质不能到达这里。此外，与常用抗体比较起来，简单、高亲合力和特异性和达到及与活性部位反应的潜力，骆驼重链抗体在设计、制备和应用临床上有价值的化合物等方面都表现出优势。
骆驼或骆驼源的免疫球蛋白优选包含至少选自CH1、CH2和CH3的一个恒定区。根据本发明优选实施方案，骆驼免疫球蛋白CH1、CH2和CH3的环区包含第8-20位氨基酸、第24-39位氨基酸、第 42-78位氨基酸、第82-85位氨基酸、第91-103位氨基酸和第108-117位氨基酸。
甚至更特别地，鼠源免疫球蛋白VH环区在第6-20位氨基酸、第44-52位氨基酸、第67-76位氨基酸和第92-101位氨基酸内包含至少一个修饰，其中在所述结构域内所述氨基酸位置的编号方式为IMGT编号。骆驼源VHH经修饰的环区优选在第7-18位氨基酸、第43-55位氨基酸、第68-75位氨基酸和第91-101位氨基酸内包含至少一个修饰，其中在所述结构域内所述氨基酸位置的编号方式为IMGT编号。
上述各个免疫球蛋白的经鉴别的氨基酸区为特定适于本发明修饰目的的环区。
本发明再一方面涉及用于特异性结合和/或检测分子的方法，该方法包括下列步骤：
(a) 让本发明经修饰的免疫球蛋白或通过本发明方法可获得的经修饰的免疫球蛋白与怀疑含有所述分子的试验样品接触，和
(b) 检测潜在的特异性免疫球蛋白/分子复合物的形成。
本发明另一方面涉及用于特异性分离分子的方法，该方法包括下列步骤：
(a) 让本发明经修饰的免疫球蛋白或通过本发明方法可获得的经修饰的免疫球蛋白与含有所述分子的样品接触，
(b) 分离所形成的特异性免疫球蛋白/分子复合物，和
(c) 任选地从所述复合物分离分子。
本发明免疫球蛋白可用于从样品特异性地分离分子。若使用多特异性免疫球蛋白，则从样品可分离不止一个分子。在这样的方法中用经修饰的免疫球蛋白尤其有利，因为其使得例如可产生具有固定在其上的限定量结合配偶体(即经修饰的免疫球蛋白)均质表面的介质，结合配偶体能够结合待分离的分子。与此相反，若用单特异性结合配偶体，不产生均质介质，因为单一结合配偶体不能以同样的效率结合介质。
本发明另一方面涉及用于让化合物靶向目标的方法，该方法包括下列步骤：
(a) 让本发明经修饰的免疫球蛋白或通过本发明方法可获得的经修饰的免疫球蛋白与能够特异性结合所述化合物接触，
(b) 将免疫球蛋白/化合物复合物递送到目标。
本发明经修饰的免疫球蛋白可用于将结合到CDR和/或经修饰的环区的至少一种化合物递送到目标。这样的免疫球蛋白可在疾病治疗过程中用于将治疗物质递送到优选作用位点。
本发明另一方面涉及本发明免疫球蛋白或通过本发明方法可获得的免疫球蛋白在制备免疫球蛋白的蛋白质文库中的用途。另外，本发明的文库不仅仅含有多种蛋白质或融合蛋白、遗传包装物，而且含有蛋白质前体、核酸、核糖体、细胞、病毒、噬菌体和表达编码蛋白质的信息和/或这样的蛋白质的其它展示系统。
本发明另一方面涉及包含本发明免疫球蛋白或通过本发明方法可获得的免疫球蛋白的蛋白质文库。
在上面和实施例中可发现用于构建所述文库的优选方法。本发明文库可用于鉴别结合独特分子的免疫球蛋白。
具体地说，本发明涉及包含本发明免疫球蛋白或通过本发明方法可获得的免疫球蛋白的蛋白质文库在设计免疫球蛋白衍生物中的用途。
可通过用以下蛋白质文库改变现有的免疫球蛋白以将抗原结合位点引入到任何结构域或微结构域：相应结构域的蛋白质文库具有至少10个、优选100个、更优选1000个、更优选10000个、更优选100000个、最优选超过1000000个变体结构域或微结构域，且具有至少一个经修饰的环，特别地为一个或多个结构环。文库成员的数目甚至可更高一些，在大部分情况下高达10e12，且某些展示系统例如核糖体展示，该数目可甚至更高。
然后筛选结合特定抗原的文库。在鉴别了分子所需的特性后，通过基因工程技术将所选择的结构域或微结构域克隆到最初的免疫球蛋白，以使其置换野生型区。或者，只有编码环或编码突变氨基酸的DNA可被交换以获得具有特定抗原的另外的结合位点的免疫球蛋白。
突变的抗原特异性结构环位点的选择视最初免疫球蛋白结构和另外的结合位点目的而定。例如，若最初分子为必须插入另外抗原结合位点而不干扰效应功能的完全免疫球蛋白，则待修饰的环将选自远离为Fc效应分子的天然结合配偶体的CH2和CH3的结构域。若最初免疫球蛋白为Fab片段，则在轻链或重链恒定区或各自的可变区内修饰环是可能的。为了产生文库，人们可制备突变原始分子(在一个或多个结构域的一个或多个结构环上具有突变)文库。选择完全突变的原始分子可具有某些优势，因为选择与经修饰的结构环结合的抗原将传递空间有利的修饰，若还对其它特性进行测定，则突变免疫球蛋白将显示出来。特别地优选Fc文库，例如在C端环区具有结合位点的文库。
突变结构域或微结构域或结构域融合分子的蛋白质文库的大小要求(即变体蛋白质数目)视任务而定。一般而言，重新产生抗原结合位点的文库需要比用于进一步修饰已经存在的由经修饰的结构环(例如用于提高对抗原的亲和力或改变微妙的特异性)构成的工程抗原结合位点的文库更大。
本发明还涉及免疫球蛋白文库或核酸文库，它们包含许多免疫球蛋白，例如恒定区或可变区、微结构域和/或包含在微结构域中的至少一个结构环区，或编码这一切的核酸分子。所述文库含有具有不同修饰的成员，其中多数由在至少一个结构环区的修饰来界定。核酸文库优选包括至少10个具有核苷酸序列差别以获得至少一个不同的氨基酸(导致一个氨基酸交换)的不同的成员，更优选包括至少100、更优选1000或10000个不同的成员(例如通过随机化策略或组合技术设计)。甚至还优选更多样性的单独成员数目，例如至少1000000或至少10000000个。
为了产生多特异性免疫球蛋白，本发明另一方面为选自至少2个本发明文库的2个不同的免疫球蛋白、结构域或微结构域的组合。这些经选择的特异性免疫球蛋白可彼此组合和与结构单元类似的其它分子组合，设计结构域或微结构域的最佳排列以获得所需要的性质。例如，具有抗原结合性质并基于Fc的分子可如此使用：作为用于其它结合模体的载体或作为构建具有恒定区或可变区的免疫球蛋白的结构单元，或另外仅与恒定区组合，例如多聚体Fc分子，优选具有2、3或4个抗原结合位点。
此外，可将一个或多个本发明经修饰的免疫球蛋白引入到蛋白质的各种和所有不同的位点，而不破坏该蛋白质的结构。所创造的这样的“结构域改组”技术新文库可再次用于选择所需要的性质。
优选地，本发明免疫球蛋白由至少两个免疫球蛋白结构域或其部分(包括微结构域)组成，每一个结构域都含有至少一个抗原结合位点。
也优选包含免疫球蛋白或其部分(包括微结构域)的至少恒定区的一个结构域和/或至少可变区的一个结构域的本发明免疫球蛋白。因此，例如在C端区修饰的可变区，或连接经修饰的CH1区(例如经修饰的CH1微结构域)的可变区，为优选实施方案之一。
优选文库含有选自免疫球蛋白结构域、微结构域或其衍生物的本发明免疫球蛋白。
本发明优选实施方案为用于抗原结合的分子(抗原结合分子)，其包含按照本发明修饰的至少一个免疫球蛋白结构域和结构环区以结合该抗原，其中所述结合分子不包含抗体可变区。它可包含对抗体活性有用的其它部分(例如天然的或经修饰的效应区(序列))；然而，在其天然存在的位置其缺乏抗体的“天然”结合区，即可变区或CDR环，包括CDR区内的VFR环。本发明的这些抗原结合分子具有上面对本发明分子所描述的优点，但没有由CDR环介导的抗体特异性结合活性；然而，在结构环区具有新近引入的特异性结合活性。
优选地，本发明这些抗原结合分子包含CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C及其组合；所述组合包含至少2个、优选至少4个、尤其至少6个恒定区和至少一个按照本发明修饰的结构环或环区。优选这些结构环区经由根据本发明修饰的结构环区或在这样两个恒定区之间天然存在的结构环连接。本发明这些抗原结合分子的实施方案由根据本发明在结构环中具有至少一个修饰的抗体Fc区组成。用于本发明的抗原结合分子也优选结构环中新的抗原结合位点通过随机技术引入，即通过随机技术交换环的一个或多个氨基酸残基，或通过随机产生的引入插入到这样的结构环中。可供选择的优选是使用组合方法。优选在经修饰的结构环中抗原结合位点选自合适文库。
本发明其它方面涉及具有抗原结合位点的经修饰的免疫球蛋白，以提供与未经修饰的免疫球蛋白无关的特异性并掺入到一个或多个结构环中。本文所用术语“无关”是指抗原不能由特异性CDR结合区或免疫球蛋白的其它天然或内在结合区所识别。免疫球蛋白的外源结合配偶体但并非天然结合配偶体由此可通过新近形成的结构环的抗原结合位点结合。这意味着不认为天然结合配偶体(例如Fc-受体或免疫系统效应器)通过不适合于未经修饰的免疫球蛋白的抗原结合位点来结合。
优选本发明免疫球蛋白包含至少2个抗原结合位点，第一位点结合第一表位，第二位点结合第二表位。
根据优选实施方案，本发明免疫球蛋白包含至少2个环区，第一环区结合第一表位，第二环区结合第二表位。至少第一或至少第二环区或二者都可含有结构环。本发明免疫球蛋白包括本领域已知的其含有本发明必需要素的功能性片段：根据本发明修饰的结构环或环区。
优选本发明免疫球蛋白包含具有与未经修饰的结构域至少50%同源性的结构域。
术语“同源性”表示多肽在其一级、二级或三级结构的相应位置具有相同或保守的残基。该术语还延伸到编码同源多肽的2个或更多个核苷酸序列。
“同源免疫球蛋白结构域”，是指就全长天然序列免疫球蛋白结构域序列或本文公开的全长免疫球蛋白结构域序列的任何其它片段而论，具有至少约50%氨基酸序列同一性的本发明免疫球蛋白结构域。优选地，同源免疫球蛋白结构域将具有与天然免疫球蛋白结构域序列或本文公开的全长免疫球蛋白结构域序列的任何其它明确限定的片段至少约50%氨基酸序列同一性，优选至少约55%氨基酸序列同一性，更优选至少约60%氨基酸序列同一性，更优选至少约65%氨基酸序列同一性，更优选至少约70%氨基酸序列同一性，更优选至少约75%氨基酸序列同一性，更优选至少约80%氨基酸序列同一性，更优选至少约85%氨基酸序列同一性，更优选至少约90%氨基酸序列同一性，更优选至少约95%氨基酸序列同一性。
就本文所鉴定的免疫球蛋白结构域序列的“氨基酸序列同一性百分比(%)”而言，定义为在比对序列和必要时引入空位(gap)以达到最大序列同一性百分比并且不考虑任何作为序列同一性部分的保守取代后，候选系列中的氨基酸残基与特定免疫球蛋白结构域序列中的氨基酸残基相同的百分比。可用本领域技术内的各种方法完成用于测定氨基酸序列同一性百分比目的的比对，例如用公众可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的合适参数，包括完成贯穿待比较的序列的全长的最高比对所需要的任何算法。
通过用WU-BLAST-2计算机程序(Altschul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996))，可如下所述获得氨基酸序列同一性百分比(%)值。将大部分WU-BLAST-2检索参数设为默认值。将那些不设定为默认值的(即可调参数)设定为以下值：重叠跨距(overlap span) = 1，重叠分数= 0.125，字串阈值(word threshold) (T) = 11，打分矩阵= BLOSUM62。当采用WU-BLAST-2时，用(a)除以(b)来求出氨基酸序列同一性%值：(a)在具有源自天然免疫球蛋白结构域序列的目标免疫球蛋白结构域的氨基酸序列和由WU-BLAST-2决定的比较目标氨基酸序列(即目标免疫球蛋白结构域与其比较的序列，其可能是未经修饰的免疫球蛋白结构域)之间匹配相同的氨基酸残基数目；(b)目标免疫球蛋白结构域的非随机部分的氨基酸残基总数目。例如，在“包含具有与氨基酸序列B至少80%氨基酸序列同一性的氨基酸序列A的多肽”表述中，氨基酸序列A是比较目标氨基酸序列，氨基酸序列B是目标免疫球蛋白结构域的氨基酸序列。
本发明另一方面涉及含有以下成分的结合配偶体试剂盒：
(a) 具有与掺入一个或多个结构环的免疫球蛋白无关的抗原结合位点的经修饰的免疫球蛋白，和
(b) 含有所述抗原表位的结合分子。
根据本发明，该试剂盒的这样的结合分子可作为捕获剂用于鉴别本发明经修饰的免疫球蛋白的结合特异性。通过使用本发明该试剂盒的结合分子，可测定本发明经修饰的免疫球蛋白的功效。
本文所定义的功效是经修饰的分子对其抗原的结合特性。可在特异性和/或亲和力和/或亲合力方面定量和/或定性测定结合，其用于质量控制目的。
修饰后所获得的本发明分子的结合特性可进一步通过标准技术例如亲和力成熟来达到要求。藉此为调整结合特性进一步交换在抗原结合位点内或其周围的核苷酸序列。
此外，本发明试剂盒的结合分子可用于在由至少10、优选至少100、更优选至少1000、更优选至少10000、尤其是至少100000个在结构环中具有不同经修饰的免疫球蛋白组成的文库中选择具有本发明适当功效的经修饰的免疫球蛋白。
实施例表明主要特征之一是工程改造那些通常不涉及所需的抗体固有功能例如抗原结合的免疫球蛋白结构域或区域。因此，除抗体CDR区之外的区域(包括邻近CDR环的环)的修饰将保持其抗原结合功能。观察到免疫球蛋白结构域的特定折叠使得在结构上与CDR相似但位置和序列不同的区域内可引入随机突变。通过本发明鉴定的区域有例如CDR、连接免疫球蛋白β链折叠的环区。
更特别地，本文描述了通过引入突变，例如在连接人IgG1 CH3结构域的A-B和E-Fβ链的环中的随机突变，选择特异性结合Toll样受体9-肽(TLR-9)或鸡蛋溶菌酶的突变的CH3结构域，Toll样受体9-肽(TLR-9)或鸡蛋溶菌酶分别是通常不能被人IgG1的CH3结构域识别和结合的肽和蛋白质。我们所引入的突变包括在野生型序列中选择的氨基酸残基被随机选择的残基取代的突变，它们也包括在上述环中插入额外的氨基酸残基。
用类推的方法，来自任何类别的免疫球蛋白和来自任何物种的免疫球蛋白的免疫球蛋白结构域都适合这种类型的工程改造。此外，不仅可操作本发明目标中的特定环，而且可以同样方式操作在免疫球蛋白结构域中连接β链的任何环。
根据本发明，可制备来自任何生物体和来自任何免疫球蛋白类别的工程免疫球蛋白结构域，它们可保留原样(作为单一结构域)或作为较大分子的组成部分。例如，它们可作为完整免疫球蛋白的组成部分，因此，具有由6个CDR形成的其“正常”抗原结合区和新的工程抗原结合区。同样如此，可产生多特异性(例如双特异性)免疫球蛋白。工程免疫球蛋白结构域还可为任何融合蛋白的组成部分。这些工程免疫球蛋白结构域的用途都落入免疫球蛋白用途的通用领域内。
除非另有说明，否则免疫球蛋白所有的氨基酸序列编号都遵照IMGT编号方案(IMGT, the international ImMunoGeneTics information system@imgt.cines.fr；http：//imgt.cines.fr；Lefranc等, 1999, Nucleic Acids Res. 27: 209-212；Ruiz等,2000 Nucleic Acids Res. 28: 219-221；Lefranc等, 2001, Nucleic Acids Res. 29:207-209；Lefranc等, 2003, Nucleic Acids Res. 31: 307-310；Lefranc等, 2005, DevComp Immunol 29: 185-203)。
具体实施方式
实施例1：CH3文库的构建和噬菌体表面展示
利用Brookhaven Database as entry lOQO.pdb中公布的IgG1 Fc片段的晶体结构辅助设计突变型CH3结构域。
SEQ ID No. 1中给出用作构建CH3文库基础的序列。在该序列中，第一个氨基酸对应于Brookhaven database entry loqo.pdb中A链的第343位脯氨酸。loqo.pdb中含有的最后一个残基是SEQ ID No. 1中的第102位丝氨酸。在详细分析loqo.pdb的结构并通过肉眼检查形成连接β链的环的残基后，决定使第17、18和19位残基(其为连接A-B β链的环的组成部分)以及第71、72、73、76和77位残基(其为连接SEQ ID No. 1中的E-F β链的环的组成部分)随机化。通过一系列PCR反应接着连接得到的PCR产物产生工程基因。为了促进连接，修饰编码SEQ ID No. 1的核苷酸序列某些密码子以产生限制酶切位点而不改变氨基酸序列(沉默突变)。为了插入到具有pelB分泌信号读框的克隆载体pHEN1 (Nucleic Acids Res.1991 Aug 11；19(15): 4133-7. Multi-subunit proteins on the surface offilamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy andlight chains (丝状噬菌体表面的多亚基蛋白：展示抗体(Fab)重链和轻链的方法).Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G.)内，将编码Met-Ala的额外的核苷酸残基连接到序列的5'端以创造NcoI限制酶切位点。对于随机化的残基，选择编码所有20种天然存在的氨基酸的密码子NNS (IUPAC密码，此处S表示C或G)，但避免3个终止密码子中的2个。工程序列作为核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，作为氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。SEQ ID No. 3中的字母X表示随机化的氨基酸残基。用于装配突变CH3结构域的PCR引物序列如SEQ ID No. 4到9所示。
将人单克隆抗体3D6重链cDNA (Felgenhauer M, Kohl J, Rüker F. Nucleotidesequences of the cDNAs encoding the V-regions of H- and L-chains of a humanmono-lonal antibody specific to HIV-1-gp41 (编码对HIV-1-gp41特异性的人单克隆抗体H链和L链V区的cDNA核苷酸序列). Nucleic Acids Res. 1990 Aug 25；18(16):4927.)用作PCR反应模板。用SacI和/或HindIII分别消化三个PCR产物并连接在一起。用NcoI和NotI进一步消化连接产物，并连接到先前已用NcoI和NotI消化的表面展示噬菌粒(phagemid)载体pHen1上。通过限制酶分析和通过DNA测序来支配大量被选择的克隆，发现含有计划中的插入，包括正确地插入的随机化序列。对于以下噬菌体制备步骤，采用标准方案。简而言之，通过电穿孔将连接混合物转化到大肠杆菌TG1细胞。随后，用辅助噬菌体M13-KO7从大肠杆菌TG1细胞拯救噬菌体颗粒。然后以2步用PEG/NaCl从培养物上清液沉淀出噬菌体颗粒，溶解于水，用于通过淘选进行选择，或者，储存在-80℃。
实施例2：CH3+3文库的构建
本文库按照与CH3文库同样的方式构建和克隆。构建体的氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示，相应的核苷酸序列如SEQ ID No. 11所示，用于构建的引物为SEQ ID No. 4-7、SEQID No. 9和SEQ ID No. 12。
实施例3：CH3+5文库的构建
本文库按照与CH3文库同样的方式构建和克隆。构建体的氨基酸序列如SEQ ID No. 13所示，相应的核苷酸序列如SEQ ID No. 14所示，用于构建的引物为SEQ ID No. 4-7、SEQID No. 9和SEQ ID No. 15。
实施例4：CH1文库的构建
在人IgG1 CH1文库中，使Ser93、Ser94、Ser95、Gly98、Thr99和Gln100随机化，用定点随机诱变另外插入3个随机残基。Leu96不突变。在另一个人IgG1 CH1文库中，使Pro92、Ser93、Ser94、Ser95、Leu96、Thr101、Gly98、Thr99和Gln100随机化，用定点随机诱变另外插入3个随机残基。用噬菌粒载体pHEN1的限制酶切位点NcoI和NotI，将编码文库的基因克隆到在N端具有pelB引导区的读框中和在C端具有来自fd噬菌体的蛋白III的读框中。用标准方法实施噬菌体颗粒的制备、特异性结合克隆的淘选和选择。
文库序列：
第一个CH1文库的核苷酸序列：
第一个CH1文库的氨基酸序列：
第二个CH1文库的核苷酸序列：
第二个CH1文库的氨基酸序列：
实施例4：CL文库的构建
在人IgG1 CL文库中，使Ser92、Lys93、Ala94、Asp95、Glu97、Lys98和His99随机化，并用定点随机诱变在Ser16和Gly17之间另外插入3个随机残基。用噬菌粒载体pHEN1的限制酶切位点NcoI和NotI，将编码文库的基因克隆到在N端具有pelB引导区的读框中和在C端具有来自fd噬菌体的蛋白III的读框中。用标准方法实施噬菌体颗粒的制备、特异性结合克隆的淘选和选择。
CL文库的核苷酸序列：
CL文库的氨基酸序列：
实施例5：在Rp10-L肽上淘选CH3 -噬菌体文库
实施3轮淘选。用代表B-细胞分子标记CD20的模拟表位的合成肽Rp10-L包被马来酰亚胺活化板(Pierce) (Perosa等, Ann N Y Acad Sci. (2005) 51: 672-83)。其推断的氨基酸序列如下：ITPWPHWLERSS。每孔加入200 μl以下溶液：PBS，pH=7.2，含有以下浓度的溶解的肽：
- 第1轮淘选：100 μg/ml
- 第2轮淘选：100 μg/ml
- 第3轮淘选：50 μg/ml。
在4℃孵育过夜，接着用10 μg/ml半胱氨酸-HCl的PBS溶液室温封闭2小时(每孔200 μl)。
然后，使含有来自文库CH3、CH3+3、CH3+5和CH3+7的同样浓度的噬菌体的表面展示噬菌体文库与结合肽反应，即通过加入噬菌体悬液和2% BSA-PBS到200 μl，接着在室温下震荡孵育45分钟，不震荡孵育90分钟。
未结合的噬菌体颗粒如下洗掉：
- 第1轮淘选后：15×200 μl T-PBS，5×200 μl T- PBS
- 第1轮淘选后：15×200 μl T-PBS，10×200 μl T- PBS
- 第1轮淘选后：20×200 μl T-PBS，20×200 μl T- PBS。
通过每孔加入200 μl的0.1 M甘氨酸(pH=2.2)并在室温震荡孵育30分钟，实施结合颗粒的洗脱。随后，通过加入60 μl 2M Tris-碱中和噬菌体悬液，接着通过让10 ml指数生长期的培养物与0.5 ml洗脱的噬菌体混合并在37℃孵育30分钟，来感染大肠杆菌TG1细胞。最后，将感染的细菌接种到含有1%葡萄糖和100 μg/ml氨苄青霉素的TYE培养基并在30℃培养过夜。
CH3噬菌体文库在Rp10-L肽上的淘选结果
噬菌体滴度
淘选轮次 浓度 Rp10-L 投入(噬菌体/ml) 产出(噬菌体/ml)
第1轮 100 μg/ml 2×10<sup>14</sup> 2×10<sup>10</sup>
第2轮 100 μg/ml 3×10<sup>17</sup> 3×10<sup>10</sup>
第3轮 50 μg/ml 6.02×10<sup>14</sup> 1.5×10<sup>10</sup>
实施例6：所选用于可溶性表达的克隆的克隆化
用PCR分批扩增洗脱的噬菌体颗粒中含有的已改变的编码CH3结构域的序列。在用NcoI和NotI限制酶切后，将它们插入到pNOTBAD (Invitrogen载体pBAD，含有后来插入的NotI位点)。在转化到大肠杆菌E104后，于30℃在含有1%葡萄糖和100 μg/ml氨苄青霉素的TYE培养基上选择细胞。
所选克隆的可溶性表达和筛选
将4×96个氨苄青霉素抗性菌落在200 μl含有氨苄青霉素的2xYT培养基(在微量滴定板上)中在摇床上于30℃培养过夜。然后用加到终浓度为0.1%的L-阿拉伯糖诱导它们。在再次过夜孵育后，在室温下，通过2000 rpm离心15分钟收集细胞，通过重新悬浮于100 μl硼酸钠缓冲液(160 mM硼酸钠、200 mM NaCl，pH=8.0)并孵育至少6小时释放出周质蛋白质。
为了筛选，用50 μg/ml肽Rp10-L溶解于PBS (pH=7.2)的100 μg/ml溶液将4块马来酰亚胺板于4℃包被过夜。然后，各块板用10μg/ml半胱氨酸-HCl的PBS溶液在室温下封闭2小时(每孔200 μl)。
然后，通过加入50 μl裂解物(lysate)和50 μl 2% BSA- PBS，接着在室温下过夜孵育，使释放的周质蛋白质与结合肽反应。
带有his标签的蛋白的结合如下显示：与每孔100 μl抗四组氨酸(tetra-his)抗体(QIAgen)溶液(用1% BSA-PBS按1:1000稀释)孵育90分钟，并与每孔100 μl用HRP标记的山羊抗小鼠抗体(Sigma)的溶液(用1% BSA-PBS按1:1000稀释)孵育90分钟。在加入底物OPD(3 mg/ml)的柠檬酸钠/磷酸盐缓冲液(pH=4.5)和0.4 μl/ml H2O2后，观察到信号。通过加入100 μl 1.25 M H2SO4来终止反应。
在每一克隆单孔中Rp10-L结合的筛选结果
克隆 A21 A57 B63 B78 C50 C55 D5 D37 D39 D80 D83 D91
A<sub>492/620</sub> 0.395 0.039 0.063 0.075 0.190 0.045 0.644 0.071 0.448 0.077 0.426 0.142
本底反应
板 A<sub>492/620</sub>
A 0.027
B 0.035
C 0.037
D 0.035
将显示阳性信号的克隆在20ml含有氨苄青霉素的2xYT中于30℃培养过夜。然后将它们按1:20接种到新鲜培养基中，30℃3小时后，用终浓度为0.1%的L-阿拉伯糖进行诱导，使其在16℃过夜表达重组CH3-结构域。然后表达细胞的周质在1 ml硼酸钠缓冲液(pH=8.0)中最少裂解6小时。使周质提取物与Rp10-L肽反应，如上所述准确显示了结合。
Rp10-L结合的筛选结果
所选在pET27b中可溶性表达的克隆的克隆化
用PCR扩增在结合Rp10-L时产生显著信号的克隆中含有的已改变的编码CH3结构域的序列。在用NcoI和NotI限制酶切后，将它们插入到pET27b (Novagen)。在转化到大肠杆菌BL21 (DE3)后，于30℃在含有1%葡萄糖和50 μg/ml卡那霉素(kanamycin)的TYE培养基上选择转化的细胞。
将显示阳性信号的克隆在20ml含有2%葡萄糖和卡那霉素的M9ZB中于30℃培养过夜。然后将它们按1:20接种到新鲜培养基中，30℃3小时后，用含有1%甘油(代替葡萄糖、卡那霉素)和1mM IPTG的培养基进行诱导，使其在16℃过夜表达重组CH3-结构域。然后表达细胞的周质在1 ml硼酸钠缓冲液(pH=8.0)中最少裂解6小时。用蛋白质印迹并用抗四组氨酸(tetra-his)抗体(QIAgen)检测来分析周质提取物中是否存在重组蛋白。
结合CD-20克隆的核苷酸序列和推断的蛋白质序列
克隆 第1组 第2组 第3组 源文库
A21 VDG PWGPRD WP CH3+3
C50* LTH ALCRWF VQ CH3+3
D5 ALR FCGGVV GL CH3+3
D39 GWW QQKPEA TD CH3+3
D83 APP DLVHVA MV CH3+3
*在第二组突变残基中插入2个核苷酸导致在分开第二组和第三组突变残基的另外的恒定残基R和W之间插入G。
CD20特异性CH3+3文库克隆D83的蛋白质序列(IMGT编号)
用FACS分析在细胞上表达的CD-20的结合
大约105个Daudi细胞用PBS洗涤(800 rpm, 5分钟, 室温)，使在1% BSA-PBS中的重组CH3结构域在冰上结合2小时。细胞用PBS再次洗涤，使其与在1% BSA-PBS中稀释的2 μg/ml抗五组氨酸(penta His)-Alexa fluor 488抗体(QIAgen)在冰上反应30分钟。洗涤后，细胞用FACS进行分析。用未标记的细胞、野生型CH3结构域和K562细胞系作为对照。
实施例7：结合CD20抗原的突变蛋白CH1的分离
实施3轮淘选。用代表B-细胞分子标记CD20的模拟表位的合成肽包被马来酰亚胺活化板(Pierce)。每孔加入200 μl以下溶液：PBS，pH=7.2，含有以下浓度的溶解的肽：
- 第1轮淘选：100 μg/ml
- 第2轮淘选：100 μg/ml
- 第3轮淘选：50 μg/ml。
在4℃孵育过夜，接着用10 μg/ml半胱氨酸-HCl的PBS溶液室温封闭2小时(每孔200 μl)。
然后，使展示突变CH1结构域的表面展示噬菌体文库与结合肽反应，即通过加入噬菌体悬液和2% BSA-PBS到200 μl，接着在室温下震荡孵育45分钟，不震荡孵育90分钟。
未结合的噬菌体颗粒如下洗掉：
- 第1轮淘选后：10×200 μl T-PBS，5×200 μl T- PBS
- 第1轮淘选后：15×200 μl T-PBS，10×200 μl T- PBS
- 第1轮淘选后：20×200 μl T-PBS，20×200 μl T- PBS。
通过每孔加入200 μl的0.1 M甘氨酸(pH=2.2)并在室温震荡孵育30分钟，实施结合颗粒的洗脱。随后，通过加入60 μl 2M Tris-碱中和噬菌体悬液，接着通过让10 ml指数生长期的培养物与0.5 ml洗脱的噬菌体混合并在37℃孵育30分钟，来感染大肠杆菌TG1细胞。最后，将感染的细菌接种到含有1%葡萄糖和100 μg/ml氨苄青霉素的TYE培养基并在30℃培养过夜。
CH1噬菌体文库在Rp10-L肽上的淘选结果
噬菌体滴度
淘选轮次 浓度 Rp10-L 投入(噬菌体/ml) 产出(噬菌体/ml)
第1轮 100 μg/ml 5.6×10<sup>13</sup> 1.6×10<sup>10</sup>
第2轮 100 μg/ml 4.04×10<sup>14</sup> 8.55×10<sup>8</sup>
第3轮 50 μg/ml 3.53×10<sup>14</sup> 1.19×10<sup>12</sup>
所选用于可溶性表达的克隆的克隆化
用PCR分批扩增洗脱的噬菌体颗粒中含有的已改变的编码CH1结构域的序列。在用NcoI和NotI限制酶切后，将它们插入到pNOTBAD (Invitrogen载体pBAD，含有后来插入的NotI位点)。在转化到大肠杆菌E104后，于30℃在含有1%葡萄糖和100 μg/ml氨苄青霉素的TYE培养基上选择细胞。
所选克隆的可溶性表达和筛选
将4×96个氨苄青霉素抗性菌落在200 μl含有氨苄青霉素的2xYT培养基(在微量滴定板上)中在摇床上于30℃培养过夜。然后用加到终浓度为0.1%的L-阿拉伯糖诱导它们。在再次过夜孵育后，在室温下，通过2000 rpm离心15分钟收集细胞，通过重新悬浮于100 μl硼酸钠缓冲液(160 mM硼酸钠、200 mM NaCl，pH=8.0)并孵育至少6小时释放出周质蛋白质。
为了筛选，用50 μg/ml肽Rp10-L溶解于PBS (pH=7.2)的100 μg/ml溶液将4块马来酰亚胺板于4℃包被过夜。然后，各块板用10μg/ml半胱氨酸-HCl的PBS溶液在室温下封闭2小时(每孔200 μl)。
然后，通过加入50 μl裂解物(lysate)和50 μl 2% BSA- PBS，接着在室温下过夜孵育，使释放的周质蛋白质与结合肽反应。
带有his标签的蛋白的结合如下显示：与每孔100 μl抗四组氨酸(tetra-his)抗体(QIAgen)溶液(用1% BSA-PBS按1:1000稀释)孵育90分钟，并与每孔100 μl的用HRP标记的山羊抗小鼠抗体(Sigma)的溶液(用1% BSA-PBS按1:1000稀释)孵育90分钟。在加入底物OPD(3 mg/ml)的柠檬酸钠/磷酸盐缓冲液(pH=4.5)和0.4 μl/ml H2O2后，观察到信号。通过加入100 μl 1.25 M H2SO4来终止反应。
在每一克隆单孔中Rp10-L结合的筛选结果
克隆 A13 A79 A96 B6 B17 B19 B21 B23
A<sub>492/620</sub> 0.027 0.353 0.023 0.038 0.036 0.037 0.032 0.035
克隆 C14 C45 C49 C68 C79 C81 D36 D82
A<sub>492/620</sub> 0.025 0.021 0.044 0.025 0.051 0.021 0.027 0.086
本底反应
板 A<sub>492/620</sub>
A 0.008
B 0.012
C 0.015
D 0.015
将显示阳性信号的克隆在20ml含有氨苄青霉素的2xYT中于30℃培养过夜。然后将它们按1:20接种到新鲜培养基中，30℃3小时后，用终浓度为0.1%的L-阿拉伯糖进行诱导，使其在16℃过夜表达重组CH1-结构域。然后表达细胞的周质在1 ml硼酸钠缓冲液(pH=8.0)中最少裂解6小时。使周质提取物与Rp10-L肽反应，如上所述准确显示了结合。
Rp10-L结合的筛选结果
所选在pET27b中可溶性表达的克隆的克隆化
用PCR扩增在结合Rp10-L时产生显著信号的克隆中含有的已改变的编码CH1结构域的序列。在用NcoI和NotI限制酶切后，将它们插入到pET27b (Novagen)。在转化到大肠杆菌BL21 (DE3)后，于30℃在含有1%葡萄糖和50 μg/ml氨苄青霉素的TYE培养基上选择转化的细胞。
将显示阳性信号的克隆在20ml含有2%葡萄糖和卡那霉素的M9ZB培养基中于30℃培养过夜。然后将它们按1:20接种到新鲜培养基中，30℃3小时后，用含有1%甘油(代替葡萄糖、卡那霉素)和1mM IPTG的培养基进行诱导，使其在16℃过夜表达重组CH1-结构域。然后表达细胞的周质在1 ml硼酸钠缓冲液(pH=8.0)中最少裂解6小时。用蛋白质印迹并用抗四组氨酸(tetra-his)抗体(QIAgen)检测来分析周质提取物中是否存在重组蛋白。
CD20特异性CH1 SMID (克隆C45)的序列
用FACS分析在细胞上表达的CD-20的结合
大约105个Daudi细胞用PBS洗涤(800 rpm, 5分钟, 室温)，使在1% BSA-PBS中的重组CH3结构域在冰上结合2小时。细胞用PBS再次洗涤，使其与在1% BSA-PBS中稀释的2 μg/ml抗五组氨酸(penta His)-Alexa fluor 488抗体(QIAgen)在冰上反应30分钟。洗涤后，细胞用FACS进行分析。用未标记的细胞、野生型CH1结构域和K562细胞系作为对照。
实施例8：结合CD20抗原的CL突变蛋白的分离
实施3轮淘选。用代表B-细胞分子标记CD20的模拟表位的合成肽包被马来酰亚胺活化板(Pierce)。每孔加入200 μl以下溶液：PBS，pH=7.2，含有以下浓度的溶解的肽：
- 第1轮淘选：100 μg/ml
- 第2轮淘选：100 μg/ml
- 第3轮淘选：50 μg/ml。
在4℃孵育过夜，接着用10 μg/ml半胱氨酸-HCl的PBS溶液室温封闭2小时(每孔200 μl)。
然后，使展示突变的CL结构域的表面展示噬菌体文库与结合肽反应，即通过加入噬菌体悬液和2% BSA-PBS到200 μl，接着在室温下震荡孵育45分钟，不震荡孵育90分钟。
未结合噬菌体颗粒如下洗涤；
- 第1轮淘选后：10×200 μl T-PBS，5×200 μl T- PBS
- 第1轮淘选后：15×200 μl T-PBS，10×200 μl T- PBS
- 第1轮淘选后：20×200 μl T-PBS，20×200 μl T- PBS。
通过每孔加入200 μl的0.1 M甘氨酸(pH=2.2)并在室温震荡孵育30分钟，实施结合颗粒的洗脱。随后，通过加入60 μl 2M Tris-碱中和噬菌体悬液，接着通过让10 ml指数生长期的培养物与0.5 ml洗脱的噬菌体混合并在37℃孵育30分钟，来感染大肠杆菌TG1细胞。最后，将感染的细菌接种到含有1%葡萄糖和100 μg/ml氨苄青霉素的TYE培养基并在30℃培养过夜。
CL噬菌体文库在Rp10-L肽上的淘选结果
噬菌体滴度
淘选轮次 浓度 Rp10-L 投入(噬菌体/ml) 产出(噬菌体/ml)
第1轮 100 μg/ml 2.8×10<sup>13</sup> 3.6×10<sup>7</sup>
第2轮 100 μg/ml 4.29×10<sup>14</sup> 6.88×10<sup>9</sup>
第3轮 50 μg/ml 1×10<sup>15</sup> 6.54×10<sup>11</sup>
所选用于可溶性表达的克隆的克隆化
用PCR分批扩增洗脱的噬菌体颗粒中含有的已改变的编码CL结构域的序列。在用NcoI和NotI限制酶切后，将它们插入到pNOTBAD (Invitrogen载体pBAD，含有后来插入的NotI位点)。在转化到大肠杆菌E104后，于30℃在含有1%葡萄糖和100 μg/ml氨苄青霉素的TYE培养基上选择细胞。
所选克隆的可溶性表达和筛选
将4×96个氨苄青霉素抗性菌落在200 μl含有氨苄青霉素的2xYT培养基(在微量滴定板上)中在摇床上于30℃培养过夜。然后用加到终浓度为0.1%的L-阿拉伯糖诱导它们。在再次过夜孵育后，在室温下，通过2000 rpm离心15分钟收集细胞，通过重新悬浮于100 μl硼酸钠缓冲液(160 mM硼酸钠、200 mM NaCl，pH=8.0)并孵育至少6小时释放出周质蛋白质。
为了筛选，用50 μg/ml肽Rp10-L溶解于PBS (pH=7.2)的100 μg/ml溶液将4块马来酰亚胺板于4℃包被过夜。然后，各块板用10μg/ml半胱氨酸-HCl的PBS溶液在室温下封闭2小时(每孔200 μl)。
然后，通过加入50 μl裂解物(lysate)和50 μl 2% BSA- PBS，接着在室温下过夜孵育，使释放的周质蛋白质与结合肽反应。
带有his标签的蛋白的结合如下显示：与每孔100 μl抗四组氨酸(tetra-his)抗体(QIAgen)溶液(用1% BSA-PBS按1:1000稀释)孵育90分钟，并与每孔100 μl用HRP标记的山羊抗小鼠抗体(Sigma)的溶液(用1% BSA-PBS按1:1000稀释)孵育90分钟。在加入底物OPD(3 mg/ml)的柠檬酸钠/磷酸盐缓冲液(pH=4.5)和0.4 μl/ml H2O2后，观察到信号。通过加入100 μl 1.25 M H2SO4来终止反应。
在每一克隆单孔中Rp10-L结合的筛选结果
克隆 A2 A51 A57 A64 B21 B23 B44 B92
A<sub>492/620</sub> 0.048 0.083 0.035 0.032 0.037 0.036 0.041 0.154
克隆 C18 C19 C28 C56 C76 D2 D51 D82
A<sub>492/620</sub> 0.153 0.033 0.042 0.062 0.030 0.016 0.033 0.046
本底反应
板 A<sub>492/620</sub>
A 0.016
B 0.016
C 0.012
D 0.014
将显示阳性信号的克隆在20ml含有氨苄青霉素的2xYT中于30℃培养过夜。然后将它们按1:20接种到新鲜培养基中，30℃3小时后，用终浓度为0.1%的L-阿拉伯糖进行诱导，使其在16℃过夜表达重组CL结构域。然后表达细胞的周质在1 ml硼酸钠缓冲液(pH=8.0)中最少裂解6小时。使周质提取物与Rp10-L肽反应，如上所述准确显示了结合。
Rp10-L结合的筛选结果
所选在pET27b中可溶性表达的克隆的克隆化
用PCR扩增在结合Rp10-L时产生显著信号的克隆中含有的已改变的编码CL结构域的序列。在用NcoI和NotI限制酶切后，将它们插入到pET27b (Novagen)。在转化到大肠杆菌BL21(DE3)后，于30℃在含有1%葡萄糖和50 μg/ml卡那霉素的TYE培养基上选择转化的细胞。
将显示阳性信号的克隆在20ml含有2%葡萄糖和卡那霉素的M9ZB培养基中于30℃培养过夜。然后将它们按1:20接种到新鲜培养基中，30℃3小时后，用含有1%甘油(代替葡萄糖、卡那霉素)和1mM IPTG的培养基进行诱导，使其在16℃过夜表达重组CL结构域。然后表达细胞的周质在1 ml硼酸钠缓冲液(pH=8.0)中最少裂解6小时。用蛋白质印迹并用抗四组氨酸(tetra-his)抗体(QIAgen)检测来分析周质提取物中是否存在重组蛋白。
实施例9：结合整联蛋白的Fcab的克隆、表达和鉴别
按照Koivunen等(1993) (J. Biol. Chem. 1993 Sep 25；268(27): 20205-10)的方法，从在丝状噬菌体上表达的6个氨基酸的肽文库最初分离出潜在的环肽CRGDCL，经证明其抑制表达RGD的噬菌体与αvβ1整联蛋白的结合，或抑制表达αvβ1的细胞与纤连蛋白的连接。该肽还抑制由αvβ1、αvβ3和αvβ5整联蛋白介导的细胞连接。
我们将序列GCRGDCL插入到人IgG1的CH3结构域的结构环(“EF”环)中。为此目的，用标准克隆技术使残基Asp92和Lys 93 (IMGT编号)分别突变为Gly和Leu，并在这些突变的残基92和93之间插入5个残基CRGDC，以创造具有结合整联蛋白的RGD模体的环。在插入的C端，序列融合在含有载体多克隆位点的读框中，以使HSV-标签和His-标签连接重组蛋白的C端。将该重组蛋白命名为Fcab-RGD4，或简称为RGD4。编码Fcab-RGD4的DNA序列和翻译的氨基酸序列如下所示。
通过常规克隆技术将编码Fcab-RGD4和Fcab-wt的序列分别引入到哺乳动物表达载体pCEP4中。用这些表达质粒瞬时转染HEK 293细胞，在3天和1周后收获含有Fcab的培养基。经由蛋白质A柱和从该柱酸洗脱纯化Fcab，接着立即中和。用PBS对Fcab透析，在ELISA中检测其对人αvβ3整联蛋白(Chemicon)的结合。
为了进行整联蛋白ELISA，将溶于PBS的1μg/ml人αvβ3整联蛋白过夜包被在Maxisorp板上，并用含有1 mM Ca2+的溶于PBS的BSA封闭1小时。让Fcab-RGD4和Fcab-wt分别从10 μg/ml纯化的蛋白质起以各种稀释度结合1小时。通过HRP标记的蛋白A和作为底物的TMB检测结合的Fcab。RGD4与整联蛋白的结合(红线)从10 μg/ml蛋白降至0.16μg/ml产生显著信号。作为阴性对照，在缺乏整联蛋白时RGD4不与板结合(灰线)，Fcab-wt也不结合整联蛋白包被的板(绿线)。将市售小鼠抗人αvβ3整联蛋白mAb LM609 (Chemicon)的结合(蓝线)当作阳性对照。
表：ELISA数据表明RGD4和LM609与人αvβ3整联蛋白的结合。测定了如第一栏所示的各种浓度的蛋白质，在450 nm产生的信号见各自相应的行。第二栏为HEK产生的和蛋白A纯化的Fcab-RGD4与整联蛋白结合的数值，第三栏为Fcab-wt阴性对照，第四栏为Fcab-RGD4包被空白对照。最后一栏为小鼠抗αvβ3整联蛋白mAb LM609的结合值。

Claims (19)

1.与一个细胞的至少2个细胞表面分子特异性结合的多价免疫球蛋白或其部分，在所述免疫球蛋白的至少一个结构环区中至少一个修饰决定其与所述细胞表面分子的表位结合，其中未经修饰的免疫球蛋白不显著结合所述表位。
2.权利要求1的免疫球蛋白，其中经修饰的结构环区位于所述免疫球蛋白或其部分的恒定区内，优选位于CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C内。
3.权利要求2的免疫球蛋白，其特征在于：所述经修饰的结构环区包含至少6个氨基酸修饰。
4.权利要求1-3中任一项的免疫球蛋白，其特征在于：人源或鼠源的CH1、CH2、CH3或CH4的经修饰的环区在第7-21位氨基酸、第25-39位氨基酸、第41-81位氨基酸、第83-85位氨基酸、第89-103位氨基酸或第106-117位氨基酸内包含至少一个修饰。
5.权利要求1-3中任一项的免疫球蛋白，其特征在于：人源Igk-C或Igl-C的环区在第8-18位氨基酸、第27-35位氨基酸、第 42-78位氨基酸、第83-85位氨基酸、第92-100位氨基酸、第108-117位氨基酸或第123-126位氨基酸内包含至少一个修饰。
6.权利要求1-3中任一项的免疫球蛋白，其特征在于：鼠源Igk-C或Igl-C的环区在第8-20位氨基酸、第26-36位氨基酸、第43-79位氨基酸、第83-85位氨基酸、第90-101位氨基酸、第108-116位氨基酸或第122-125位氨基酸内包含至少一个修饰。
7.权利要求1-3中任一项的免疫球蛋白，其特征在于：所述免疫球蛋白恒定区为骆驼源的。
8.权利要求7的免疫球蛋白，其特征在于：所述免疫球蛋白包含选自CH1、CH2和CH3的至少一个经修饰的恒定区。
9.权利要求8的免疫球蛋白，其特征在于：CH1、CH2和/或CH3的经修饰的环区在第8-20位氨基酸、第24-39位氨基酸、第 42-78位氨基酸、第82-85位氨基酸、第91-103位氨基酸或第108-117位氨基酸内包含至少一个修饰。
10.权利要求1的免疫球蛋白，其特征在于：所述可变区选自VH、Vκ、Vλ、VHH及其组合。
11.权利要求1-10中任一项的免疫球蛋白，其特征在于：VH、Vκ、Vλ或VHH的经修饰的环区在第7-21位氨基酸、第25-39位氨基酸、第41-81位氨基酸、第83-85位氨基酸、第89-103位氨基酸或第106-117位氨基酸内包含至少一个修饰，其中在所述结构域内所述氨基酸位置的编号方式为IMGT编号。
12.权利要求1-10中任一项的免疫球蛋白，其特征在于：人源VH或Vκ或Vλ的环区在第8-20位氨基酸、第44-50位氨基酸、第67-76位氨基酸和第89-101位氨基酸内、最优选在第12-17位氨基酸、第45-50位氨基酸、第69-75位氨基酸和第93-98位氨基酸内包含至少一个修饰，其中在所述结构域内所述氨基酸位置的编号方式为IMGT编号。
13.权利要求1-10中任一项的免疫球蛋白，其特征在于：鼠源VH的环区在第6-20位氨基酸、第44-52位氨基酸、第67-76位氨基酸和第92-101位氨基酸内包含至少一个修饰，其中在所述结构域内所述氨基酸位置的编号方式为IMGT编号。
14.权利要求1-10中任一项的免疫球蛋白，其特征在于：骆驼源VHH的经修饰的环区在第7-18位氨基酸、第43-55位氨基酸、第68-75位氨基酸和第91-101位氨基酸内包含至少一个修饰，其中在所述结构域内所述氨基酸位置的编号方式为IMGT编号。
15.权利要求1-10中任一项的免疫球蛋白，其特征在于：所述经修饰的免疫球蛋白进一步与一种或多种经修饰的免疫球蛋白或其部分或者与未经修饰的免疫球蛋白或其部分组合，以获得组合免疫球蛋白。
16.权利要求1-15中任一项的免疫球蛋白，其特征在于：所述修饰为缺失、取代、插入或其组合。
17.编码权利要求1-14中任一项的免疫球蛋白或其部分的核酸。
18.用于工程改造权利要求1-16中任一项的多价免疫球蛋白的方法，该方法包括下列步骤：
- 提供编码包含至少一个结构环区的免疫球蛋白的核酸，
- 修饰所述结构环区的至少一个核苷酸残基，
- 将所述经修饰的核酸转移至表达系统，
- 表达所述多价免疫球蛋白，
- 使表达的多价免疫球蛋白接触表位，和
- 测定所述多价免疫球蛋白是否结合所述表位。
19.权利要求1-16中任一项的多价免疫球蛋白在制备药物中的用途。
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