PT1735343E

PT1735343E - Processo para a obtenção de insulinas através de gaseificação com ar melhorada do enrolamento

Info

Publication number: PT1735343E
Application number: PT57161499T
Authority: PT
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland
Priority date: 2004-04-01
Filing date: 2005-03-17
Publication date: 2015-01-14
Also published as: ES2527693T3; DK1735343T3; WO2005097827A1; EP1735343B1; SI1735343T1; PL1735343T3; US7659363B2; CY1115923T1; US20070106063A1; JP5743370B2; DE102004015965A1; EP1735343A1; JP2008502594A

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE INSULINAS ATRAVÉS DE GASEIFICAÇÃO COM AR MELHORADA DO ENROLAMENTO" A presente invenção refere-se a um processo melhorado para a obtenção de insulinas ou derivados de insulina com pontes de cistina correctamente ligadas, na presença de cisteina ou cloridrato de cisteina e de uma substância auxiliar caotrópica, em que o enrolamento se efectua numa mistura de reacção em que a razão de volume relativamente à superfície é maior do que 1 e/ou a concentração de oxigénio é 1 - 15 mg/L. A insulina humana é uma proteína com duas cadeias de aminoácidos com 51 resíduos de aminoácidos em conjunto. Em ambas as cadeias de aminoácidos estão presentes 6 resíduos de cisteina, em que cada dois resíduos de cisteina estão ligados entre si através de uma ponte dissulfureto. Em insulina humana biologicamente activa, as cadeias A e B estão ligadas uma à outra através de duas pontes de cistina, e na cadeia A está presente uma ponte de cistina adicional. No interior de uma molécula de insulina humana existem em termos estatísticos 15 possibilidades para a formação de pontes dissulfureto. Em insulina humana biologicamente activa apenas está presente uma das 15 possibilidades. Os resíduos de cisteina seguintes estão ligados entre si na insulina humana: A 6 - A 11 A 7 - B 7 A 20 - B 19

As letras A e B representam a respectiva cadeia de aminoácidos de insulina, o número representa a posição do resíduo de aminoácido, que é contado da extremidade amino para a extremidade carboxilo da respectiva cadeia de aminoácidos. As pontes dissulfureto também podem ser formadas entre duas moléculas de insulina humana, de modo que podem formar-se facilmente, em vasto número, muitas pontes dissulfureto diferentes.

Um processo conhecido para a preparação de insulina humana baseia-se na utilização de proinsulina humana. A proinsulina humana é uma proteína com uma cadeia de aminoácidos linear de 86 resíduos de aminoácidos, em que as cadeias A e B da insulina humana estão ligadas entre si através de um péptido C com 35 resíduos de aminoácidos. A formação das pontes dissulfureto presentes em insulina humana efectua-se através de um produto intermediário, em que os resíduos de cisteína da insulina humana estão providos com um grupo de protecção de enxofre, p. ex. um grupo S-sulfonato (-S-SO3-) (documento EP 0037255). Além disso, é conhecido um processo para a obtenção de proinsulina com pontes de cistina correctamente ligadas (Biochemistry, 60, (1968), páginas 622 até 629), que parte de proinsulina obtida a partir de pâncreas de porco, em que os resíduos de cisteína estão presentes como resíduos tiole (-SH). Sob o termo "pontes de cistina correctamente ligadas" entendem-se as pontes dissulfureto que ocorrem em insulina biologicamente activa de mamíferos.

Os processos de tecnologia genética permitem preparar, em microrganismos, percursores de insulina ou derivados de insulina, em particular proinsulina humana ou proinsulina, que tem uma sequência de aminoácidos e/ou comprimento de cadeia de aminoácidos divergente da insulina humana. As proinsulina preparadas de células de Escherichia coli alteradas por tecnologia genética não têm pontes de cistina correctamente ligadas. Um processo para a obtenção de insulina humana com E. coli (documento EP 0055945) baseia-se nos seguintes passos de processo:

Fermentação dos microrganismos - Ruptura das células Isolamento da proteína de fusão - Cisão da proteína de fusão por haleto de cianogénio - Isolamento do produto de cisão com a sequência de proinsulina - Protecção dos resíduos de cisteína de proinsulina através de grupos S-sulfonato - Purificação cromatográfica do S-sulfonato - Formação das pontes de cistina correctamente ligadas - Dessalinização da proinsulina Purificação cromatográfica da proinsulina com pontes de cistina correctamente ligadas - Concentração da solução de proinsulina -Purificação cromatográfica da solução de proinsulina concentrada - Cisão enzimática da proinsulina para a obtenção de insulina humana - Purificação cromatográfica da insulina humana originada.

As desvantagens deste processo são o número de passos de processo e as perdas nos passos de purificação, que conduzem a um rendimento baixo em insulina. Devido ao procedimento em várias etapas têm que ser aceites perdas elevadas. A partir da etapa da proteína de fusão isolada através de cisão por haleto de cianogénio, lise do sulfito e purificação da proinsulina, tem que se contabilizar uma perda de proinsulina de até 40% (documento EP 0055945). Podem ocorrer perdas elevadas semelhantes no decurso dos passos de purificação subsequentes até ao produto final. Podem então alcançar-se aumentos de rendimento no caso da preparação de insulina humana ou derivados de insulina por tecnologia genética, quando o número de passos do processo necessários possa ser claramente reduzido. A partir do documento EP 0600372 AI (ou documento US 5.473.049) e do documento EP 0688292 A2 é conhecido um processo melhorado correspondente para a obtenção de insulinas ou derivados de insulina, em que o percursor de insulina ou percursor do derivado de insulina, cujas pontes de cistina não estão presentes correctamente ligadas, na presença de um mercaptano, por exemplo cisteina, e de no mínimo uma substância auxiliar caotrópica, por exemplo ureia ou cloridrato de guanidina, é convertido a um percursor de insulina ou percursor do derivado de insulina com pontes de cisteina correctamente ligadas. No caso do processo conhecido, estas proteínas são em primeiro lugar dissolvidas em concentrações muito baixas em soluções aquosas de um agente auxiliar caotrópico ou de misturas de diferentes agentes auxiliares caotrópicos. Em seguida a mistura de proteínas é misturada com uma solução aquosa de mercaptano.

De um modo surpreendente foi agora verificado que os rendimentos em percursores de insulinas ou derivados de insulina correctamente enrolados podem ser aumentados e os tempos de reacção para o processo de enrolamento podem ser diminuídos por, num primeiro passo, não colocar o percursor em solução por meio da substância auxiliar caotrópica, mas em vez disso por se introduzir em primeiro lugar mercaptano, nomeadamente cisteina ou cloridrato de cisteina, na suspensão aquosa do percursor e só num passo subsequente proceder à dissolução do percursor por introdução numa solução aquosa da substância auxiliar caotrópica, e finalmente proceder ao correcto enrolamento do percursor por diluição da mistura para uma concentração preferida de cisteína ou cloridrato de cisteína, por introdução da mistura numa quantidade correspondente de água.

De acordo com isto, a presente invenção refere-se a um processo para a obtenção de um percursor de insulinas ou derivados de insulina com pontes de cistina correctamente ligadas, na presença de cisteína ou cloridrato de cisteína e de uma substância auxiliar caotrópica, caracterizado por se realizarem sucessivamente os seguintes passos: (a) Mistura de uma suspensão aquosa do percursor de insulinas ou derivados de insulina com uma quantidade de cisteína ou de cloridrato de cisteína, que produza 1 até 15 resíduos -SH da cisteína ou do cloridrato de cisteína por resíduo de cisteína do percursor, (b) Introdução da suspensão do percursor contendo cisteína ou cloridrato de cisteína numa solução 4 até 9 molar da substância auxiliar caotrópica, a um valor de pH de 8 até 11,5 e uma temperatura de 15 até 55 2C, manutenção da mistura obtida durante aproximadamente 10 até 60 minutos a esta temperatura, e (c) Introdução da mistura a um valor de pH de 8 até 11,5 e uma temperatura de 5 até 30 2C numa quantidade de água que produza uma diluição da concentração da cisteína ou do cloridrato de cisteína na mistura para aproximadamente 1 até 5 mM e da substância auxiliar caotrópica para 0,2 até 1,0 M, em que a mistura no passo (c) é gaseificada num recipiente, de modo a que a concentração de oxigénio na mistura seja de 1 até 15 mg/L, em que a razão de volume relativamente à superfície da mistura é maior do que 1 m, em particular maior do que 2 m, em particular maior do que 3 m, e a concentração de oxigénio na mistura perfaz de um modo preferido 2 até 10 mg/L.

De um modo preferido, o processo também é caracterizado por no passo (a) a quantidade em cisteína ou cloridrato de cisteína corresponder a uma quantidade que origine 1 até 6 resíduos -SH da cisteína ou do cloridrato de cisteína por resíduo de cisteína do percursor, no passo (b) efectuar-se a introdução da suspensão do percursor contendo cisteína ou cloridrato de cisteína numa solução 4 até 9 molar da substância auxiliar caotrópica, a um valor de pH de 8 até 11 e uma temperatura de 30 até 45 2C, efectuar-se a manutenção da mistura obtida durante 20 até 40 minutos a esta temperatura, e no passo (c) efectuar-se a introdução da mistura a um valor de pH de 8 até 11 e a uma temperatura de 15 até 20 2C numa quantidade de água que produza uma diluição da concentração da cisteína ou do cloridrato de cisteína na mistura para aproximadamente 1 até 5 mM e uma concentração da substância auxiliar caotrópica de 0,2 até 1,0 M.

As substâncias auxiliares caotrópicas são compostos que quebram ligações por pontes de hidrogénio em solução aquosa, por exemplo sulfato de amónio, cloridrato de guanidina, carbonato de etileno, tiocianato, dimetilsulfóxido e ureia.

No caso do processo de acordo com a presente invenção é utilizada como substância auxiliar caotrópica, de um modo preferido, guanidina, cloridrato de guanidina ou, de um modo preferido em particular, ureia. A concentração da substância auxiliar caotrópica perfaz no passo (b) do processo de acordo com a invenção de um modo preferido 7,0 até 9,0 M, a temperatura no passo (b) perfaz de um modo preferido 40 2C e o valor de pH no passo (b) perfaz de um modo preferido 10 até 11.

No caso do processo de acordo com a invenção, o valor de pH no passo (c) perfaz de um modo preferido 10 até 11. No passo (c) do processo de acordo com a presente invenção, a quantidade de água em que a mistura é introduzida é seleccionada de um modo preferido de forma a que esta produza uma diluição da concentração da cisteina ou do cloridrato de cisteina na mistura para 2,5 até 3,0 mM e uma concentração da substância auxiliar caotrópica de 0,5 M.

De um modo preferido em particular, o processo de acordo com a invenção é caracterizado por a concentração da substância auxiliar caotrópica no passo (b) perfazer aproximadamente 8 M, a temperatura no passo (b) perfazer aproximadamente 40 2C, o valor de pH no passo (b) perfazer aproximadamente 10,2, o valor de pH no passo (c) perfazer aproximadamente 10,6, e no passo (c) a quantidade de água produzir uma diluição da concentração da cisteina ou do cloridrato de cisteina na mistura para aproximadamente 2,5 até 3,0 mM e uma concentração da substância auxiliar caotrópica de 0,5 M. O resultado do processo de acordo com a presente invenção é um percursor de insulinas ou derivados de insulina, em particular uma proinsulina, cujas pontes de cisteina estão correctamente ligadas.

Os derivados de insulina são derivados de insulinas de ocorrência natural, nomeadamente insulina humana (ver SEQ ID N2. 1 = cadeia A de insulina humana; ver SEQ ID N2. 2 = cadeia B de insulina humana, protocolo da sequência) ou insulinas animais, que se diferenciam da insulina de ocorrência natural correspondente, de outro modo sendo igual, pela substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido de ocorrência natural e/ou a adição de pelo menos um resíduo de aminoácido e/ou resíduo orgânico. A partir do percursor das insulinas ou derivados de insulina obtido com o auxílio do processo de acordo com a presente invenção, com pontes de cistina correctamente ligadas, pode finalmente ser preparada uma insulina ou um derivado de insulina com pontes de cistina correctamente ligadas, de acordo com o processo descrito no documento EP 0600372 AI (ou documento US 5.473.049) ou no documento EP 0668292 A2, por cisão enzimática por meio de tripsina ou de uma enzima semelhante a tripsina e eventualmente adicionalmente por meio de carboxipeptidase B e subsequente purificação numa resina de adsorção.

A insulina ou o derivado de insulina que podem ser preparados a partir do percursor podem descrever-se, de um modo preferido, através da fórmula I

em que significam Y um resíduo de aminoácido geneticamente codificável, Z a) um resíduo de aminoácido do grupo His, Arg ou Lys, b) um péptido com 2 ou 3 resíduos de aminoácidos, contendo o resíduo de aminoácido Arg ou Lys na extremidade carboxilo do péptido, c) um péptido com 2-35 aminoácidos geneticamente codificáveis, contendo 1 até 5 resíduos de histidina, ou d) OH, R1 um resíduo de fenilalanina (Phe) ou uma ligação covalente, R3 um resíduo de aminoácido geneticamente codificável, em que, para a simplificação da fórmula I, os resíduos A2 -A20 não mostrados correspondem à sequência de aminoácidos da cadeia A de insulina humana, insulina animal ou de um derivado de insulina, e para a simplificação da fórmula I, os resíduos B2 - Β29 não mostrados correspondem à sequência de aminoácidos da cadeia B de insulina humana, insulina animal ou de um derivado de insulina. A sequência de aminoácidos de péptidos e proteínas é caracterizada pela extremidade N-terminal da cadeia de aminoácidos. As informações na fórmula I colocadas entre parêntesis, p. ex. A6, A20, Bl, B7 ou B19, correspondem à posição de resíduos de aminoácidos nas cadeias A ou B da insulina.

Pelo termo "resíduo de aminoácido geneticamente codificável" são representados os aminoácidos Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, lie, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro e selenocisteína.

Pelo termo "resíduos A2 - A20" e "resíduos B2 - B29" de insulina animal entendem-se por exemplo as sequências de aminoácidos de insulina de bovino, suíno ou avino. 0 termo "resíduos A2 - A20" e "B2 - B29" de derivados de insulina representa as sequências de aminoácidos correspondentes de insulina humana, que são formadas pela substituição de aminoácidos por outros aminoácidos geneticamente codificáveis. A cadeia A de insulina humana tem, por exemplo, a sequência seguinte (SEQ IDN2.: 1):

Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu

Glu Asn Tyr Cys Asn.

A cadeia B de insulina humana tem a sequência seguinte (SEQ ID N2.: 2):

Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr.

Neste caso, na fórmula I, R3 é asparagina (Asn), R1 é fenilalanina (Phe), Y é treonina (Thr) e Z é OH. 0 processo de acordo com a presente invenção é, de forma correspondente, particularmente adequado para a obtenção de um percursor de insulinas ou derivados de insulina com a fórmula geral II, cujas pontes de cistina (não mostradas na fórmula II) estão correctamente enroladas, R2-R3- (B2-B29)-Y-X-Gly-(A2-A20)-R3 (II) , em que significam R2 a) um átomo de hidrogénio, b) um resíduo de aminoácido do grupo lisina (Lys) ou arginina (Arg), ou c) um péptido com 2 até 45 resíduos de aminoácidos, contendo o resíduo de aminoácido lisina (Lys) ou arginina (Arg) na extremidade carboxilo do péptido R1 um resíduo de fenilalanina (Phe) ou uma ligação covalente, (B2-B29) os resíduos de aminoácidos nas posições B2 até B29 da cadeia B de insulina humana, insulina animal ou de um derivado de insulina a variar eventualmente numa ou várias dessas posições, Y um resíduo de aminoácido geneticamente codificável, X a) um resíduo de aminoácido do grupo lisina (Lys) ou arginina (Arg), b) um péptido com 2 até 35 resíduos de aminoácidos, contendo o resíduo de aminoácido lisina (Lys) ou arginina (Arg) na extremidade N-terminal e na extremidade carboxilo do péptido, ou c) um péptido com 2 até 35 aminoácidos geneticamente codificáveis, contendo 1 até 5 resíduos de histidina, (A2-A20) os resíduos de aminoácidos nas posições A2 até A20 da cadeia B de insulina humana, insulina animal ou de um derivado de insulina a variar eventualmente numa ou várias dessas posições, e R3 um resíduo de aminoácido geneticamente codificável. 1. De um modo preferido significam na fórmula II: R2 a) um átomo de hidrogénio, ou b) um péptido com 2 até 25 resíduos de aminoácidos, contendo o resíduo de aminoácido arginina (Arg) na extremidade carboxilo do péptido, R1 um resíduo de fenilalanina (Phe), (B2-B29) os resíduos de aminoácidos nas posições B2 até B29 da cadeia B de insulina humana, Y um resíduo de aminoácido do grupo alanina (Ala), treonina (Thr) ou serina (Ser), X o resíduo de aminoácido arginina (Arg) ou um péptido com uma sequência de aminoácidos da cadeia C de insulina humana, (A2-A20) os resíduos de aminoácidos nas posições A2 até A20 da cadeia B de insulina humana, e R3 um resíduo de aminoácido do grupo asparagina (Asn), serina (Ser) ou glicina (Gly). A cadeia C de insulina humana tem a sequência seguinte (SEQ ID N2.: 3):

Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg. 2. De um modo preferido, significam na fórmula II: R2 a) um átomo de hidrogénio, ou b) um péptido com 2 até 15 resíduos de aminoácidos, em cuja extremidade carboxilo se encontra um resíduo de arginina (Arg), R1 um resíduo de fenilalanina (Phe), (B2-B29) os resíduos de aminoácidos nas posições B2 até B29 da cadeia B de insulina humana, Y um resíduo de treonina (Thr), X o resíduo de aminoácido arginina (Arg) ou um péptido com 2 até 35 resíduos de aminoácidos, em que no início e no final do péptido estão dois resíduos de aminoácidos básicos, em particular arginina (Arg) e/ou lisina (Lys), (A2-A20) os resíduos de aminoácidos nas posições A2 até A20 da cadeia B de insulina humana, e R3 o resíduo de aminoácido asparagina (Asn) ou glicina (Gly) . 0 resíduo Z da insulina ou do derivado de insulina da fórmula I é em regra parte da sequência de aminoácidos de X do percursor da fórmula II e forma-se pela actividade das proteases, como tripsina, enzima semelhante a tripsina ou carboxipeptidase B. 0 resíduo R3 é o resíduo de aminoácido que está na posição A21 da cadeia A de insulina. 0 resíduo Y é o resíduo de aminoácido que está na posição B30 da cadeia B de insulina. A tripsina ou as enzimas semelhantes a tripsina são proteases que cindem as cadeias de aminoácidos no resíduo de arginina ou lisina. A carboxipeptidase B é uma exoprotease que cinde resíduos de aminoácidos básicos como Arg ou Lys, que estejam na extremidade carboxilo terminal de cadeias de aminoácidos (Kemmler et al., J. Biol. Chem. 246, páginas 6786 - 6791). A partir do percursor indicado sob 1 podem obter-se, por exemplo, uma insulina ou derivado de insulina da fórmula I com pontes de cistina correctamente ligadas, em que Y, R1, R2, R3, A2-A20 e B2-B29 têm o significado indicado sob 1 e Z significa um resíduo de arginina (Arg), um resíduo peptídico Arg-Arg ou -OH. A partir do percursor indicado sob 2 podem obter-se, por exemplo, uma insulina ou derivado de insulina da fórmula I com pontes de cistina correctamente ligadas, em que Y, R1, R2, R3, A2-A20 e B2-B29 têm o significado indicado sob 2 e Z significa um resíduo de arginina (Arg), um resíduo peptídico Arg-Arg ou Lys-Lys ou -OH. 0 percursor da fórmula II pode ser formado em microrganismos com o auxílio de uma multiplicidade de construções de tecnologia genética (documentos EP 0489780, EP 0347781, EP 0453969). As construções de tecnologia genética são expressas em microrganismos, como Escherichia coli ou streptomicetes durante a fermentação. As proteínas formadas são armazenadas no interior dos microrganismos (documento EP 0489780) ou são excretadas para a solução de fermentação.

Para o processo de acordo com a invenção podem ser empregues percursores de insulinas ou de derivados de insulina da fórmula II que, directamente após a ruptura das células, ainda estão contaminados com uma multiplicidade de proteínas que derivam da solução de fermentação e dos microrganismos. Os percursores da fórmula II podem no entanto também ser empregues na forma pré-purifiçada, por exemplo após uma precipitação ou uma purificação cromatográfica. A invenção é elucidada em seguida através de exemplos, sem se limitar a isso.

Exemplo 1 (Exemplo de comparação, estado da técnica)

Por fermentação de células de Escherichia coli modificadas geneticamente (documento EP 0 489 780) é produzida uma proteína de fusão com a seguinte sequência de aminoácidos.

Sequência de proinsulina 1 (Seq Id N2. 4):

Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly lie Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn A sequência de proinsulina 1 corresponde à fórmula II, neste caso é X péptido C de insulina humana, Y Thr (B30), R1 Phe (Bl) , R2 um péptido com 11 resíduos de aminoácidos, R3 Gly (A21) e A2 - A20 a sequência de aminoácidos da cadeia A de insulina humana (resíduos de aminoácidos 2 até 20) e B2 - B29 da sequência de aminoácidos da cadeia B de insulina humana (resíduos de aminoácidos 2 até 29).

Nas células de E. coli acumula-se a proteína de fusão expressa com a sequência de proinsulina 1 e forma corpos de inclusão. Após terminar a fermentação, as células são separadas por centrifugação e são rebentadas por homogeneização a alta pressão convencional. Os corpos de inclusão de proteína de fusão libertados são isolados por centrifugação. À suspensão aquosa de proteína de fusão, que contém 40 kg de proteína de fusão (determinado por liofilização de uma alíquota), são adicionados 5 kg de hidrato de cloridrato de cisteína. A suspensão é dissolvida (a parte da proteína de fusão contendo insulina é determinada com auxílio de HPLC. Ela perfaz 50%) com a sequência de proinsulina 1 em 550 L de uma solução de ureia 8 M a pH 10,2, a 40 2C. A solução límpida é agitada em 9000 L de água a um valor de pH de 10,6 e uma temperatura de 16 2C. Após 4 horas sob agitação, com auxílio de HPLC analítico, é determinado o teor de 5,0 kg em sequência de proinsulina 1 com pontes de cistina correctamente ligadas na mistura de reacção, correspondendo a uma conversão de 25%. A solução de 9500 L é ajustada para um pH de 5,0 com HC1 IN e é separada. Depois efectua-se o ajuste de pH 9 através da adição de hidróxido de sódio IN. São adicionados 10 g de tripsina na solução. Produzem-se cerca de 2,2 kg de percursor de insulina 2 de acordo com medição de HPLC. A insulina 2 corresponde à fórmula I, neste caso é Y Thr (B30), Z Arg-Arg, R1 Phe (Bi) , R3 Gly (A21) e A2 - A20 a sequência de aminoácidos da cadeia A de insulina humana (resíduos de aminoácidos 2 até 20) e B2 - B29 da sequência de aminoácidos da cadeia B de insulina humana (resíduos de aminoácidos 2 até 29). A insulina 2 consiste na cadeia A com a sequência

Gly lie Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly (SEQ ID N2.: 5) e uma cadeia B da sequência

Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg (seq id n2. 6) que estão ligadas entre si através de pontes de cistina correctamente ligadas. A solução é concentrada e purificada por meio de resina de adsorção. 0 eluato, que contém insulina 2, pode ser adicionalmente purificado imediatamente após diluição com água e ajuste de pH numa coluna de cromatografia.

Exemplo 2 (Processo de acordo com a presente invenção)

Por fermentação de células de Escherichia coli modificadas geneticamente (documento EP 0489780) é preparada uma proteina de fusão com a sequência de aminoácidos da sequência de proinsulina 1 (SEQ ID N2. 4).

Nas células de E. coli acumula-se a proteina de fusão expressa com a sequência de proinsulina 1 e forma corpos de inclusão. Após terminar a fermentação, as células são separadas por centrifugação e são rebentadas por homogeneização a alta pressão convencional. Os corpos de inclusão de proteina de fusão libertados são isolados por centrifugação. À suspensão aquosa de proteina de fusão, que contém 40 kg de proteina de fusão (determinado por liofilização de uma aliquota), são adicionados 5 kg de hidrato de cloridrato de cisteina. A suspensão é dissolvida (a parte da proteina de fusão contendo insulina é determinada com auxilio de HPLC. Ela perfaz 50%) com a sequência de proinsulina 1 em 550 L de uma solução de ureia 8 M a pH 10,2, a 40 2C. A solução límpida é agitada em 9000 L de água a um valor de pH de 10,6 e uma temperatura de 15 2C. O espaço de gás do recipiente é gaseificado neste caso com uma quantidade de ar aplicada de 4 m3/h durante a totalidade do tempo de reacção, sob agitação da preparação. No recipiente contendo 10000 L, de 2000 mm de diâmetro e duas anteparas sobre a área cilíndrica, são feitos circular os 9500 L da solução de enrolamento por um agitador de trapézio de três degraus com um diâmetro do elemento de agitação de 1100 mm e uma potência eléctrica de propulsão de 2 kW, de um modo tal que seja assegurada uma mistura do conteúdo com gás em circulação em direcção ao fundo. A razão volume/superficie da mistura de reacção perfaz 1:3,14. O teor de oxigénio foi mantido em 8 mg/L por agitação e gaseificação.

Após a conclusão da reacção de enrolamento após 4 horas, com auxílio de HPLC analítico, é determinado o teor de 10,0 kg em sequência de proinsulina 1 com pontes de cistina correctamente ligadas na mistura de reacção, correspondendo a uma conversão de 50%. A solução de 9500 L é ajustada para um pH de 5,0 com HC1 IN e é separada. Depois efectua-se o ajuste de pH 9 através da adição de hidróxido de sódio IN. São adicionados 10 g de tripsina na solução. Produzem-se 4,5 kg de insulina 2 de acordo com medição de HPLC. A solução é concentrada e purificada por meio de resina de adsorção. O eluato, que contém insulina 2, pode ser adicionalmente purificado imediatamente após diluição com água e ajuste de pH numa coluna de cromatografia.

Lisboa, 31 de Dezembro de 2014

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para a preparação de insulinas ou de um derivado de insulina com pontes de cisteina correctamente ligadas a partir de um percursor da insulina ou do derivado de insulina, em que o percursor é sujeito a um processo de enrolamento na presença de cisteina ou cloridrato de cisteina e de uma substância auxiliar caotrópica, depois do que, a partir do percursor, é obtida uma insulina ou um derivado de insulina com pontes de cisteina correctamente ligadas por cisão enzimática por meio de tripsina ou de uma enzima semelhante a tripsina e eventualmente adicionalmente por meio de carboxipeptidase B e subsequente purificação numa resina adsorvente, caracterizado por se realizarem sucessivamente os seguintes passos para a concretização do processo de enrolamento: (a) Mistura de uma suspensão aquosa do percursor de insulinas ou derivados de insulina com uma quantidade de cisteina ou cloridrato de cisteina, que origine 1 até 15 resíduos -SH da cisteina ou do cloridrato de cisteina por resíduo de cisteina do percursor, (b) Introdução da suspensão do percursor contendo cisteina ou cloridrato de cisteina numa solução 4 até 9 molar da substância auxiliar caotrópica, a um valor de pH de 8 até 11,5 e uma temperatura de 15 até 55 2C, manutenção da mistura obtida durante aproximadamente 10 até 60 minutos a esta temperatura, e (c) Introdução da mistura a um valor de pH de 8 até 11,5 e uma temperatura de 5 até 30 2C numa quantidade de água que produza uma diluição da concentração da cisteina ou do cloridrato de cisteina na mistura para aproximadamente 1 até 5 mM e da substância auxiliar caotrópica para 0,2 até 1,0 M, em que a mistura no passo (c) é gaseificada num recipiente, de modo a que a concentração de oxigénio na suspensão seja de 1 até 15 mg/L.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a razão de volume relativamente à superfície da mistura no passo (c) é maior do que 1.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que a razão de volume relativamente à superfície da mistura no passo (c) é maior do que 2.
4. Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 3, em que a concentração de oxigénio na mistura perfaz 2 até 10 mg/L.
5. Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 4, caracterizado por no passo (a) a quantidade em cisteina ou cloridrato de cisteina corresponder a uma quantidade que origine 1 até 6 resíduos -SH da cisteina ou do cloridrato de cisteina por resíduo de cisteina do percursor, no passo (b) efectuar-se a introdução da suspensão do percursor contendo cisteina ou cloridrato de cisteina numa solução 4 até 9 molar da substância auxiliar caotrópica, a um valor de pH de 8 até 11 e uma temperatura de 30 até 45 2C, efectuar-se a manutenção da mistura obtida a esta temperatura durante 20 até 40 minutos, e no passo (c) efectuar-se a introdução da mistura a um valor de pH de 8 até 11 e a uma temperatura de 15 até 20 2C numa quantidade de água que produza uma diluição da concentração da cisteína ou do cloridrato de cisteína na mistura para aproximadamente 1 até 5 mM e uma concentração da substância auxiliar caotrópica de 0,2 até 1,0 M.
6. Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a substância auxiliar caotrópica ser guanidina, cloridrato de guanidina ou ureia.
7. Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 6, caracterizado por a concentração da substância auxiliar caotrópica no passo (b) perfazer 7,0 até 9 M.
8. Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 7, caracterizado por a temperatura no passo (b) perfazer 40 2C.
9. Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 8, caracterizado por o valor de pH no passo (b) perfazer 10 até 11.
10. Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 9, caracterizado por o valor de pH no passo (c) perfazer 10 até 11.
11. Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 10, caracterizado por no passo (c) a quantidade de água produzir uma diluição da concentração da cisteina ou do cloridrato de cisteina na mistura para 2,5 até 3,0 mM e uma concentração da substância auxiliar caotrópica para 0,5 M.
12. Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 11, caracterizado por a concentração da substância auxiliar caotrópica no passo (b) perfazer aproximadamente 8 M, a temperatura no passo (b) perfazer aproximadamente 40 2C, o valor de pH no passo (b) perfazer aproximadamente 10,2, o valor de pH no passo (c) perfazer aproximadamente 10,6 e no passo (c) a quantidade de água produzir uma diluição da concentração da cisteina ou do cloridrato de cisteina na mistura para aproximadamente 2,5 até 3,0 mM e uma concentração da substância auxiliar caotrópica de 0,5 M.
13. Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 12, caracterizado por o percursor da insulina ou do derivado de insulina apresentar a sequência de acordo com a fórmula geral II R2-R1- (B2-B29)-Y-X-Gly-(A2-A20)-R3 (II) , em que significam R2 a) um átomo de hidrogénio, b) um resíduo de aminoácido do grupo lisina (Lys) ou arginina (Arg), ou c) um péptido com 2 até 45 resíduos de aminoácidos, contendo o resíduo de aminoácido lisina (Lys) ou arginina (Arg) na extremidade carboxilo do péptido R1 um resíduo de fenilalanina (Phe) ou uma ligação covalente, (B2-B29) os resíduos de aminoácidos nas posições B2 até B29 da cadeia B de insulina humana, insulina animal ou de um derivado de insulina a variar eventualmente numa ou várias dessas posições, Y um resíduo de aminoácido geneticamente codificável, X a) um resíduo de aminoácido do grupo histidina (His), lisina (Lys) ou arginina (Arg), ou b) um péptido com 2 até 35 resíduos de aminoácidos, contendo o resíduo de aminoácido lisina (Lys) ou arginina (Arg) na extremidade N-terminal e na extremidade carboxilo do péptido, ou c) um péptido com 2 até 35 aminoácidos geneticamente codificáveis, contendo 1 até 5 resíduos de histidina, (A2-A20) os resíduos de aminoácidos nas posições A2 até A20 da cadeia B de insulina humana, insulina animal ou de um derivado de insulina a variar eventualmente numa ou várias dessas posições, e R3 um resíduo de aminoácido geneticamente codificável.
14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por, na fórmula II, significarem R2 a) um átomo de hidrogénio, ou b) um péptido com 2 até 25 resíduos de aminoácidos, contendo o resíduo de aminoácido arginina (Arg) na extremidade carboxilo do péptido, R1 um resíduo de fenilalanina (Phe), (B2-B29) os resíduos de aminoácidos nas posições B2 até B29 da cadeia B de insulina humana, Y um resíduo de aminoácido do grupo alanina (Ala), treonina (Thr) ou serina (Ser), X o resíduo de aminoácido arginina (Arg) ou um péptido com a sequência de aminoácidos da cadeia C de insulina humana, (A2-A20) os resíduos de aminoácidos nas posições A2 até A20 da cadeia B de insulina humana, e R3 um resíduo de aminoácido do grupo asparagina (Asn), serina (Ser) ou glicina (Gly).
15. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por, na fórmula II, significarem R2 a) um átomo de hidrogénio, ou b) um péptido com 2 até 15 resíduos de aminoácidos, em cuja extremidade carboxilo se encontra um resíduo de arginina (Arg), R1 um resíduo de fenilalanina (Phe), (B2-B29) os resíduos de aminoácidos nas posições B2 até B29 da cadeia B de insulina humana, Y um resíduo de treonina (Thr), X o resíduo de aminoácido arginina (Arg) ou um péptido com 2 até 35 resíduos de aminoácidos, em que no início e no final do péptido estão dois resíduos de aminoácidos básicos, em particular arginina (Arg) e/ou lisina (Lys), (A2-A20) os resíduos de aminoácidos nas posições A2 até A20 da cadeia B de insulina humana, e R3 o resíduo de aminoácido asparagina (Asn) ou glicina (Gly) . Lisboa, 31 de Dezembro de 2014