JP5743370B2

JP5743370B2 - 改善されたフォールディングの空気ガス処理によってインスリンを抽出する方法

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Publication number: JP5743370B2
Application number: JP2007505426A
Authority: JP
Inventors: フランツ−ヨーゼフ・ルブレーダー; ラインホルト・ケラー; ハイケ・ヘルベルト
Original assignee: サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date: 2004-04-01
Filing date: 2005-03-17
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2025-03-17
Also published as: ES2527693T3; DK1735343T3; WO2005097827A1; EP1735343B1; SI1735343T1; PT1735343E; PL1735343T3; US7659363B2; CY1115923T1; US20070106063A1; DE102004015965A1; EP1735343A1; JP2008502594A

Description

本発明は、システインまたは塩酸システインとカオトロピック補助剤の存在下で、正しく結合したシスチン架橋を有するインスリンまたはインスリン誘導体を得るための改善された方法に関し、本方法において、フォールディングは反応混合物中で行われ、反応混合物の表面に対する容積の比率は１より大きく、および／または、酸素濃度は１〜１５ｍｇ／ｌである。

ヒトインスリンは、連結された５１個のアミノ酸残基からなる２つのアミノ酸鎖を有するタンパク質である。この２つのアミノ酸鎖は６個のシステイン残基を含み、いずれの場合も２つのシステイン残基は、ジスルフィド架橋を介して互いに連結している。生物学的に活性なヒトインスリンにおいて、Ａ鎖とＢ鎖とは、２つのシスチン架橋を介して互いに連結しており、さらなるシスチン架橋が、Ａ鎖に存在している。統計学的に、１個のヒトインスリン分子内に、１５個のジスルフィド架橋が形成される可能性がある。これらの１５個の可能性のある形成のうち１つが、生物学的に活性なヒトインスリン中に生じる。ヒトインスリンにおいて、以下のシステイン残基が互いに連結している：
Ａ６−Ａ１１
Ａ７−Ｂ７
Ａ２０−Ｂ１９。

文字ＡおよびＢは、それぞれのインスリンアミノ酸鎖を示し、数字は、特定のアミノ酸鎖のアミノ末端からカルボキシル末端へ向かってカウントされたアミノ酸残基の位置を示す。また、ジスルフィド架橋は、２個のヒトインスリン分子間でも形成される場合があり、大量の様々なジスルフィド架橋が容易に生産可能である。

既知のヒトインスリン製造方法は、ヒトプロインスリンの使用に基づく。ヒトプロインスリンは、８６個のアミノ酸残基からなる直鎖状アミノ酸鎖を有するタンパク質であり、ヒトインスリンＢ鎖およびＡ鎖は、３５個のアミノ酸残基を含むＣペプチドを介して互いに連結している。ヒトインスリンに存在するジスルフィド架橋は、例えばＳ−スルホン酸基（−Ｓ−ＳＯ₃ ^-）のような硫黄保護基を有するヒトインスリンのシステイン残基を有する中間体を介して形成される（ＥＰ００３７２５５）。その他の既知の方法は、正しく結合したシスチン架橋を有するプロインスリンを得る方法であり（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６０，（１９６８），６２２〜６２９頁）、この方法は、ブタ膵臓から得られたプロインスリン（システイン残基がチオール残基（−ＳＨ）として存在する）から開始される。用語「正しく結合したシスチン架橋」は、生物学的に活性な哺乳動物インスリン中に存在するジスルフィド架橋を意味する。

遺伝子工学的な方法により、アミノ酸配列および／またはアミノ酸の鎖長がヒトインスリンとは異なるインスリンまたはインスリン誘導体の前駆体、特にヒトプロインスリンまたはプロインスリンを微生物中で製造することができる。遺伝学的に改変されたエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞によって生産されたプロインスリンは、正しく結合したシスチン架橋をまったく有さない。Ｅ．コリを用いることによってヒトインスリンを得る方法の１つ（ＥＰ００５５９４５）は、以下の工程に基づく：
微生物培養−細胞の破壊−融合タンパク質の単離−融合タンパク質のハロゲン化シアンの切断−プロインスリン配列を有する切断産物の単離−Ｓ−スルホン酸基によるプロインスリンのシステイン残基の保護−Ｓ−スルホン酸のクロマトグラフィー精製−正しく結合したシスチン架橋の形成−プロインスリンの脱塩−正しく結合したシスチン架橋を有するプロインスリンのクロマトグラフィー精製−プロインスリン溶液の濃縮−濃縮されたプロインスリン溶液のクロマトグラフィー精製−ヒトインスリンを得るためのプロインスリンの酵素的な切断−得られたヒトインスリンのクロマトグラフィー精製。

この方法の欠点は、工程数と精製工程の際の損失であり、低いインスリン収率しか得られない。多段階による方法経路のため、顕著な損失は許容しなければならない。プロインスリンのハロゲン化シアンの切断、亜硫酸分解および精製によって単離された融合タンパク質の段階で、最大４０％のプロインスリンの損失が想定される（ＥＰ００５５９４５）。同様の規模の損失が、それに続く最終産物までの精製工程の際に起こり得る。

必要な工程数を実質的に減少させることができるならば、ヒトインスリンのまたはインスリン誘導体の遺伝子操作された生産の収率を増加させることができる。

ＥＰ０６００３７２Ａ１（またはＵＳ５,４７３,０４９）、および、ＥＰ０６６８２９２Ａ２は、それに対応して改善されたインスリンおよびインスリン誘導体を得る方法を開示しており、本方法は、メルカプタン（例えばシステイン）、および、少なくとも１種のカオトロピック補助剤（例えば尿素または塩酸グアニジン）の存在下で、シスチン架橋が正しく連結されていないインスリン前駆体またはインスリン誘導体前駆体を、正しく結合したシスチン架橋を有するインスリン前駆体またはインスリン誘導体前駆体に変換することを含む。開示された方法は、まず、前記タンパク質を、極めて低濃度で、カオトロピック補助剤、または、様々なカオトロピック補助剤の混合物の水溶液に溶解させることを含む。次に、このタンパク質混合物を、メルカプタン水溶液と混合する。

驚くべきことに、我々は、第一工程で前駆体をカオトロピック補助剤によって溶解させることによってではなく、まず、メルカプタン（すなわちシステインまたは塩酸システイン）を、上記前駆体の水性懸濁液に導入し、さらに、それに続く工程においてのみ、カオトロピック補助剤の水溶液に上記前駆体を導入して溶解させ、最終的に、上記混合物を好ましいシステインまたは塩酸システイン濃度に希釈すること、前記混合物を適切な量の水に導入することによって、前記前駆体を正しくフォールディングさせることによって、正しくフォールディングされたインスリンまたはインスリン誘導体の前駆体の収率を増加させることが可能であり、さらに、フォールディングプロセスに関する反応時間を減少させることができることを発見した。

従って、本発明は、システインまたは塩酸システインとカオトロピック補助剤の存在下で、正しく結合したシスチン架橋を有するインスリンまたはインスリン誘導体の前駆体を得る方法に関し、本方法は、以下の工程：
（ａ）インスリンまたはインスリン誘導体の前駆体の水性懸濁液に、前記前駆体のシステイン残基１個あたりシステインまたは塩酸システインのＳＨラジカルが１〜１５個となる量のシステインまたは塩酸システインを加える工程、
（ｂ）前記前駆体のシステインまたは塩酸システインを含む懸濁液を、４〜９モル濃度のカオトロピック補助剤を含む溶液に、約８〜約１１.５のｐＨおよび約１５〜約５５℃
の温度で導入し、得られた混合物をこの温度で約１０〜６０分間維持する工程、そして、
（ｃ）前記混合物を、約８〜約１１.５のｐＨおよび約５〜約３０℃の温度で、前記混
合物中の前記システインまたは塩酸システインの濃度が約１〜５ｍＭに希釈され、かつ、前記カオトロピック補助剤の濃度が０.２〜１.０Ｍに希釈される量の水に導入する工程、を引き続いて行うことを含み、ここで、工程（ｃ）における混合物は、容器中で、懸濁液中の酸素濃度が１〜１５ｍｇ／ｌになるようにガス処理され、前記混合物の表面に対する容積の比率は、１Ｌ／ｃｍ ²より大きく、特に２Ｌ／ｃｍ ²より大きい、特に３Ｌ／ｃｍ ²より大きく、さらに、前記混合物中の酸素濃度は、好ましくは２〜１０ｍｇ／ｌであるとするものである。

好ましくは、本方法はまた、
工程（ａ）において、前記システインまたは塩酸システインの量は、前記前駆体のシステイン残基１個あたり前記システインまたは塩酸システインのＳＨラジカルが１〜６個となる量に相当しており、
工程（ｂ）において、前記前駆体のシステインまたは塩酸システインを含む懸濁液は、前記４〜９モル濃度のカオトロピック補助剤を含む溶液に、ｐＨ８〜１１および温度３０〜４５℃で導入され、得られた混合物は、この温度で２０〜４０分間維持し、そして、
工程（ｃ）において、前記混合物は、ｐＨ８〜１１および温度１５〜２０℃で、前記混合物中の前記システインまたは塩酸システインの濃度が約１〜５ｍＭに希釈され、かつ、前記カオトロピック補助剤の濃度が０.２〜１.０Ｍに希釈される量の水に導入される方法でもある。

カオトロピック補助剤は、水溶液中で水素結合を壊す化合物であり、例えば硫酸アンモニウム、塩酸グアニジン、エチレンカーボネート、チオシアネート、ジメチルスルホキシド、および、尿素である。

本発明の方法で用いられるカオトロピック補助剤は、好ましくはグアニジン、塩酸グアニジンであり、または、特に好ましくは尿素である。

本発明の方法の工程（ｂ）におけるカオトロピック補助剤の濃度は、好ましくは７.０〜９.０Ｍであり、工程（ｂ）における温度は、好ましくは４０℃であり、工程（ｂ）におけるｐＨは、好ましくは１０〜１１である。

本発明の方法の工程（ｃ）におけるｐＨは、好ましくは１０〜１１である。本発明の方法の工程（ｃ）において、混合物が導入される水の量は、好ましくは、混合物中のシステインまたは塩酸システインの濃度が、２.５〜３.０ｍＭに希釈され、かつ、カオトロピック補助剤の濃度が０.５Ｍになるように選択される。

本発明の方法において特に好ましくは、工程（ｂ）においてカオトロピック補助剤の濃度は約８Ｍであり、工程（ｂ）において温度は約４０℃であり、工程（ｂ）においてｐＨは約１０.２であり、工程（ｃ）においてｐＨは約１０.６であり、工程（ｃ）において水の量は、混合物中のシステインまたは塩酸システインの濃度が約２.５〜３.０ｍＭに希釈され、かつ、カオトロピック補助剤の濃度が０.５Ｍになるような量である。

本発明の方法の生成物は、システイン架橋が正しく連結されたインスリンまたはインスリン誘導体の前駆体、特にプロインスリンである。

インスリン誘導体は、天然に存在するインスリン、すなわちヒトインスリン（配列番号１＝ヒトインスリンＡ鎖を参照；配列番号２＝ヒトインスリンＢ鎖、配列表を参照）、または、動物インスリンの誘導体であり、これらは、少なくとも１つの天然に存在するアミノ酸残基の置換、および／または、少なくとも１つのアミノ酸残基および／または有機残基の付加によって、その他の点で同一な対応する天然に存在するインスリンとは異なっている。

最終的に、ＥＰ０６００３７２Ａ１（またはＵＳ５,４７３,０４９）またはＥＰ０６６８２９２Ａ２で説明されている方法によって、トリプシンまたはトリプシン様酵素（必要に応じてさらにカルボキシペプチダーゼＢ）を用いた酵素的な切断、それに続く吸着性樹脂での精製によって、本発明の方法を用いて得られたインスリン前駆体またはインスリン誘導体前駆体から、正しく結合したシスチン架橋を有するインスリンまたはインスリン誘導体を製造することもできる。

上記前駆体から製造可能なインスリンまたはインスリン誘導体は、好ましくは、式Ｉで示すことができる：

式中、
Ｙは、遺伝子的にコード可能なアミノ酸残基であり、
Ｚは、
ａ）Ｈｉｓ、Ａｒｇ、または、Ｌｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基、
ｂ）２または３個のアミノアミノ残基を有するペプチド（前記ペプチドのカルボキシル末端にアミノ酸残基ＡｒｇまたはＬｙｓを含む）、
ｃ）１〜５個のヒスチジン残基を含む、２〜３５個の遺伝子的にコード可能なアミノ酸を有するペプチド、または、
ｄ）ＯＨであり、
Ｒ¹は、フェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）、または、共有結合であり、
Ｒ³は、遺伝学的にコード可能なアミノ酸残基であり、
ここにおいて、ヒトインスリン、動物インスリンまたはインスリン誘導体のＡ鎖のアミノ酸配列に対応する残基Ａ２〜Ａ２０は式Ｉを簡易化するために示しておらず、さらに、ヒトインスリン、動物インスリンまたはインスリン誘導体のＢ鎖のアミノ酸配列に対応する残基Ｂ２〜Ｂ２９は式Ｉを簡易化するために示していない。

上記ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸鎖のＮ末端から開始されるように示されている。式Ｉ中の括弧内の情報、例えばＡ６、Ａ２０、Ｂ１、Ｂ７またはＢ１９は、インスリンＡ鎖およびＢ鎖におけるアミノ酸残基の位置に相当する。

用語「遺伝子的にコード可能なアミノ酸残基」は、アミノ酸Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、および、セレノシステインで示される。

動物インスリンの「残基Ａ２〜Ａ２０」、および、「残基Ｂ２〜Ｂ２９」という用語は、例えば、ウシ、ブタ、または、ニワトリインスリンのアミノ酸配列を意味する。インスリン誘導体の「残基Ａ２〜Ａ２０」、および、「Ｂ２〜Ｂ２９」という用語は、アミノ酸を他の遺伝子的にコード可能なアミノ酸で置換することによって形成されるヒトインスリンの対応するアミノ酸配列を意味する。

ヒトインスリンＡ鎖は、例えば、以下の配列（配列番号１）を有する：
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn。

ヒトインスリンＢ鎖は、以下の配列（配列番号２）を有する：
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr。

本明細書において、式Ｉ中のＲ³はアスパラギン（Ａｓｎ）であり、Ｒ¹はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり、Ｙはスレオニン（Ｔｈｒ）であり、ＺはＯＨである。

従って、本発明の方法は、一般式IIで示され、シスチン架橋（式IIに示さず）が正しくフォールディングされたインスリンまたはインスリン誘導体の前駆体を得るのに特に適している：
Ｒ²−Ｒ¹−(Ｂ２〜Ｂ２９)−Ｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−(Ａ２〜Ａ２０)−Ｒ³ (II)
式中、
Ｒ²は、
ａ）水素、
ｂ）リシン（Ｌｙｓ）、および、アルギニン（Ａｒｇ）からなる群より選択されるアミノ酸残基、または
ｃ）２〜４５個のアミノ酸残基を有するペプチド（前記ペプチドのカルボキシル末端にアミノ酸残基リシン（Ｌｙｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）を含む）
であり、
Ｒ¹は、フェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）、または、共有結合であり、
（Ｂ２〜Ｂ２９）は、ヒトインスリン、動物インスリン、または、インスリン誘導体Ｂ鎖のＢ２〜Ｂ２９の位置におけるアミノ酸残基（前記位置の１またはそれ以上において改変されたものであってよい）であり、
Ｙは、遺伝子的にコード可能なアミノ酸残基であり、
Ｘは、
ａ）リシン（Ｌｙｓ）、および、アルギニン（Ａｒｇ）からなる群より選択されるアミノ酸残基、
ｂ）２〜３５個のアミノ酸残基を有するペプチド（前記ペプチドのＮ末端とカルボキシル末端に、アミノ酸残基リシン（Ｌｙｓ）若しくはアルギニン（Ａｒｇ）を含む）、または、
ｃ）１〜５個のヒスチジン残基を含む、２〜３５個の遺伝子的にコード可能なアミノ酸を有するペプチドであり、
（Ａ２〜Ａ２０）は、ヒトインスリン、動物インスリン、または、インスリン誘導体Ａ鎖のＡ２〜Ａ２０の位置におけるアミノ酸残基（前記位置の１またはそれ以上において改変されたものであってよい）であり、そして、
Ｒ³は、遺伝子的にコード可能なアミノ酸残基である。

１．好ましくは、式IIにおいて：
Ｒ²は、
ａ）水素、または、
ｂ）２〜２５個のアミノ酸残基を有するペプチド（前記ペプチドのカルボキシル末端にアミノ酸残基アルギニン（Ａｒｇ）を含む）であり、
Ｒ¹は、フェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）であり、
（Ｂ２〜Ｂ２９）は、ヒトインスリンＢ鎖のＢ２〜Ｂ２９位におけるアミノ酸残基であり、
Ｙは、アラニン（Ａｌａ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、および、セリン（Ｓｅｒ）からなる群より選択されるアミノ酸残基である、
Ｘは、アミノ酸残基アルギニン（Ａｒｇ）であるか、または、ヒトインスリンＣ鎖のアミノ酸配列を有するペプチドであり、
（Ａ２〜Ａ２０）は、ヒトインスリンＡ鎖のＡ２〜Ａ２０位におけるアミノ酸残基であり、および、
Ｒ³は、アスパラギン（Ａｓｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、および、グリシン（Ｇｌｙ）からなる群より選択されるアミノ酸残基である。

ヒトインスリンＣ鎖は、以下の配列（配列番号３）を有する：
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg。

２．好ましくは、式ＩＩにおいて：
Ｒ²は、
ａ）水素、または、
ｂ）カルボキシル末端にアルギニン残基（Ａｒｇ）を含む２〜１５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｒ¹は、フェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）であり、
（Ｂ２〜Ｂ２９）は、ヒトインスリンＢ鎖のＢ２〜Ｂ２９位におけるアミノ酸残基であり、
Ｙは、スレオニン残基（Ｔｈｒ）であり、
Ｘは、アミノ酸残基アルギニン（Ａｒｇ）であるか、または、始点および終点に、２つの塩基性アミノ酸残基、特にアルギニン（Ａｒｇ）および／若しくはリシン（Ｌｙｓ）を含む２〜３５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
（Ａ２〜Ａ２０）は、ヒトインスリンＡ鎖のＡ２〜Ａ２０位におけるアミノ酸残基であり、および、
Ｒ³は、アミノ酸残基アスパラギン（Ａｓｎ）、または、グリシン（Ｇｌｙ）である。

式Ｉで示されるインスリンまたはインスリン誘導体の残基Ｚは、通常、式ＩＩで示される前駆体のＸのアミノ酸配列の一部であり、これは、トリプシン、トリプシン様酵素またはカルボキシペプチダーゼＢのようなプロテアーゼの活性によって形成される。残基Ｒ³は、インスリンＡ鎖のＡ２１位にあるアミノ酸残基である。残基Ｙは、インスリンＢ鎖のＢ３０位にあるアミノ酸残基である。

トリプシンまたはトリプシン様酵素は、アルギニンまたはリシン残基でアミノ酸鎖を切断するプロテアーゼである。

カルボキシペプチダーゼＢは、アミノ酸鎖のカルボキシ末端に位置するＡｒｇまたはＬｙｓのような塩基性アミノ酸残基を除去するエキソプロテアーゼである（Ｋｅｍｍｌｅｒ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６，６７８６〜６７９１頁）。

例えば、正しく結合したシスチン架橋を有する式Ｉで示されるインスリンまたはインスリン誘導体を、上記１で述べられた前駆体（Ｙ、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ａ２〜Ａ２０およびＢ２〜Ｂ２９は１で定義された通りであり、Ｚはアルギニン残基（Ａｒｇ）、ペプチド残基Ａｒｇ〜Ａｒｇ、または、−ＯＨである）から得ることが可能である。

例えば、正しく結合したシスチン架橋を有する式Ｉで示されるインスリンまたはインスリン誘導体を、２で述べられた前駆体（Ｙ、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ａ２〜Ａ２０およびＢ２〜Ｂ２９は２で定義された通りであり、Ｚはアルギニン残基（Ａｒｇ）、ペプチド残基Ａｒｇ−ＡｒｇもしくはＬｙｓ−Ｌｙｓ、または、−ＯＨである）から得ることが可能である。

式IIで示される前駆体は、微生物中で多数の遺伝子操作されたコンストラクトを用いて生産してもよい（ＥＰ０４８９７８０、ＥＰ０３４７７８１、ＥＰ０４５３９６９）。前記遺伝子操作されたコンストラクトは、発酵中に、エシェリキア・コリ、または、ストレプトミセテス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）のような微生物中で発現される。生産されたタンパク質は、微生物の内部に保存されるか（ＥＰ０４８９７８０）、または、発酵溶液に分泌される。

本発明の方法に、細胞が破壊した直後に、発酵溶液または微生物由来の大量のタンパク質が混在したままの式IIで示されるインスリンまたはインスリン誘導体の前駆体を使用することが可能である。しかしながら、式IIで示される前駆体はまた、予め精製した状態で、例えば沈殿またはクロマトグラフィー精製の後で用いてもよい。

以下、実施例によって本発明を説明するが、これらに限定されない。

実施例１（比較例、従来技術）
遺伝子操作されたエシェリキア・コリ細胞（ＥＰ０４８９７８０）を培養して、以下のアミノ酸配列を有する融合タンパク質を生産した。

プロインスリン配列１（配列番号４）：
Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His
Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu
Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu
Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu
Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu
Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys
Asn。

プロインスリン配列１は、式IIに相当し、ここにおいて、
Ｘは、ヒトインスリンのＣペプチドであり、
Ｙは、Ｔｈｒ（Ｂ３０）であり、
Ｒ¹は、Ｐｈｅ（Ｂ１）であり、
Ｒ²は、１１個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｒ³は、Ｇｌｙ（Ａ２１）であり、および
Ａ２〜Ａ２０は、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり、Ｂ２〜Ｂ２９は、ヒトインスリンＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。

発現されたプロインスリン配列１を含む融合タンパク質は、Ｅ．コリ細胞内に蓄積され、封入体を形成した。培養が完了した後、遠心分離で細胞を除去し、一般的な高圧の均質化により破壊した。放出された融合タンパク質の封入体を遠心分離で単離した。

融合タンパク質４０ｋｇ（アリコートの凍結乾燥によって測定された）を含む融合タンパク質の水性懸濁液を、塩酸システイン水和物５ｋｇと混合した。

この懸濁液（インスリンを含む融合タンパク質の比率は、ＨＰＬＣを用いて測定され、５０％であった）を、ｐＨ１０.２および４０℃で８Ｍ尿素溶液５５０Ｌに溶解させた。この透明な溶液を、ｐＨ１０.６、および、温度１６℃で水９０００Ｌに撹拌した。撹拌しながら４時間たった後に、反応混合物中の正しく結合したシスチン架橋を有するプロインスリン配列Ｉの含量（５ｋｇ）を分析ＨＰＬＣを用いて測定したところ、２５％の変換に相当した。

この溶液９５００Ｌを、１ＮのＨＣｌでｐＨ５.０に調節し、分離した。次に、この溶液を、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ９に調節した。この溶液に、トリプシン１０ｇを導入した。ＨＰＬＣで測定したところ約２.２ｋｇのインスリン前駆体２が生産された。

インスリン２は、式Ｉに相当し、式中、
Ｙは、Ｔｈｒ（Ｂ３０）であり、
Ｚは、Ａｒｇ−Ａｒｇであり、
Ｒ¹は、Ｐｈｅ（Ｂ１）であり、
Ｒ³は、Ｇｌｙ（Ａ２１）であり、および
Ａ２〜Ａ２０は、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり、Ｂ２〜Ｂ２９は、ヒトインスリンＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。

インスリン２は、
以下の配列を有するＡ鎖：
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly（配列番号５）、および、
以下の配列を有するＢ鎖：
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg（配列番号６）
からなり、これらは、正しく結合したシスチン架橋を介して互いに連結している。

この溶液を濃縮し、吸着性樹脂によって精製した。

インスリン２を含む溶出液を、水で希釈し、ｐＨを調節し、その後、さらなるクロマトグラフィーカラムで即座に精製してもよい。

実施例２（本発明の方法）
アミノ酸配列プロインスリン配列１（配列番号４）を有する融合タンパク質を、遺伝子操作されたエシェリキア・コリ細胞の培養（ＥＰ０４８９７８０）によって生産した。
発現されたプロインスリン配列１を含む融合タンパク質は、Ｅ．コリ細胞内に蓄積され、封入体を形成した。培養が完了した後、遠心分離で細胞を除去し、一般的な高圧の均質化により破壊した。放出された融合タンパク質の封入体を遠心分離で単離した。
融合タンパク質４０ｋｇ（アリコートの凍結乾燥によって測定された）を含む融合タンパク質の水性懸濁液を、塩酸システイン水和物５ｋｇと混合した。

この懸濁液（インスリンを含む融合タンパク質の比率は、ＨＰＬＣを用いて測定され、５０％であった）を、ｐＨ１０.２および４０℃で８Ｍ尿素溶液５５０Ｌに溶解させた。この透明な溶液を、ｐＨ１０.６、および、温度１５℃で水９０００Ｌに撹拌した。ここでは、反応時間全体にわたって速度４ｍ³／ｈで撹拌される混合物上に空気を通気させて、容器のガス空間をガス処理することが行なわれた。容積１００００Ｌ、直径２０００ｍｍであり、円柱形の断面上に２つの隔壁を有する容器中で、３工程の台形の撹拌器（直径１１００ｍｍの撹拌素子を有し、電力は２ｋＷ）で、内容物にガスが隅々まで混合されるようにフォールディング用溶液９５００ｌを循環させた。反応混合物の表面に対する容積の比率は、１：３.１４であった。酸素含量は、撹拌およびガス処理により８ｍｇ／ｌに維持した。

４時間たってフォールディング反応が完了した後、反応混合物中で、正しく結合したシスチン架橋を有するプロインスリン配列Ｉの含量１０.０ｋｇは、分析ＨＰＬＣを用いて、５０％変換に相当することが測定された。

この溶液９５００ｌを、１ＮのＨＣｌでｐＨ５.０に調節し、分離した。次に、この溶液を、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ９に調節した。この溶液に、トリプシン１０ｇを導入した。ＨＰＬＣで測定したところ４.５ｋｇのインスリン２が生産された。

この溶液を濃縮し、吸着性樹脂によって精製した。

Claims

インスリンまたはインスリン誘導体の前駆体から、正しく結合したシステイン架橋を有するインスリンまたはインスリン誘導体を製造する方法であって、
上記前駆体を、システインまたは塩酸システインとカオトロピック補助剤の存在下にフォールディングプロセスに付し、続いてトリプシンまたはトリプシン様酵素（必要に応じてさらにカルボキシペプチダーゼＢ）を用いた酵素による切断、続いて吸着性樹脂での精製により、正しく結合したシステイン架橋を有するインスリンまたはインスリン誘導体を得るもので、この方法は上記フォールディングプロセスを、
（ａ）インスリンまたはインスリン誘導体の前駆体の水性懸濁液に、該前駆体のシステイン残基１個あたりシステインまたは塩酸システインのＳＨラジカルが１〜１５個となる量のシステインまたは塩酸システインを加える工程、
（ｂ）上記前駆体のシステインまたは塩酸システインを含む懸濁液を、４〜９モル濃度のカオトロピック補助剤を含む溶液に、８〜１１.５のｐＨおよび１５〜５５℃の温度で導入し、得られた混合物をこの温度で１０〜６０分間維持する工程、並びに、
（ｃ）混合物を、８〜１１.５のｐＨおよび５〜３０℃の温度で、該混合物中のシステインまたは塩酸システインの濃度が１〜５ｍＭに希釈され、かつ、カオトロピック補助剤の濃度が０.２〜１.０Ｍに希釈される量の水に導入する工程、
を引き続いて行うことによって実施することを含み、ここで、工程（ｃ）における混合物は、容器中で、懸濁液中の酸素濃度が１〜１５ｍｇ／Ｌになるようにガス処理され、前記混合物の表面に対する容積の比率は、２Ｌ／ｃｍ ²より大きい、上記方法。
混合物中の酸素濃度は、２〜１０ｍｇ／Ｌである、請求項１に記載の方法。
工程（ａ）において、システインまたは塩酸システインの量は、前駆体のシステイン残基１個あたり該システインまたは塩酸システインのＳＨラジカルが１〜６個となる量に相当しており、
工程（ｂ）において、前駆体のシステインまたは塩酸システインを含む懸濁液は、４〜９モル濃度のカオトロピック補助剤を含む溶液に、ｐＨ８〜１１および温度３０〜４５℃
で導入され、得られた混合物は、この温度で２０〜４０分間維持し、そして、
工程（ｃ）において、混合物は、ｐＨ８〜１１および温度１５〜２０℃で、該混合物中のシステインまたは塩酸システインの濃度が１〜５ｍＭに希釈され、かつ、カオトロピック補助剤の濃度が０.２〜１.０Ｍに希釈される量の水に導入される、
請求項１または２に記載の方法。
カオトロピック補助剤は、グアニジン、塩酸グアニジン、または、尿素である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
工程（ｂ）におけるカオトロピック補助剤の濃度は、７.０〜９Ｍである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
工程（ｂ）における温度は、４０℃である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
工程（ｂ）におけるｐＨは、１０〜１１である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
工程（ｃ）におけるｐＨは、１０〜１１である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
工程（ｃ）において、水の量は、混合物中のシステインまたは塩酸システイン濃度が、２.５〜３.０ｍＭに希釈され、かつ、カオトロピック補助剤の濃度が０.５Ｍに希釈される量である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
工程（ｂ）におけるカオトロピック補助剤の濃度は８Ｍであり、工程（ｂ）における温度は、４０℃であり、工程（ｂ）におけるｐＨは、１０.２であり、工程（ｃ）におけるｐＨは、１０.６であり、そして、工程（ｃ）における水の量は、混合物中のシステインまたは塩酸システインの濃度が２.５〜３.０ｍＭに希釈され、かつ、カオトロピック補助剤の濃度が０.５Ｍに希釈される量である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
インスリンまたはインスリン誘導体の前駆体は、一般式II；
Ｒ²−Ｒ¹−(Ｂ２〜Ｂ２９)−Ｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−(Ａ２〜Ａ２０)−Ｒ³ (II)
［式中、
Ｒ²は、
ａ）水素、
ｂ）リシン（Ｌｙｓ）、および、アルギニン（Ａｒｇ）からなる群より選択されるアミノ酸残基、または、
ｃ）２〜４５個のアミノ酸残基を有するペプチド（該ペプチドのカルボキシル末端にアミノ酸残基リシン（Ｌｙｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）を含む）
であり、
Ｒ¹は、フェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）、または、共有結合であり、
（Ｂ２〜Ｂ２９）は、ヒトインスリン、動物インスリン、または、インスリン誘導体Ｂ鎖のＢ２〜Ｂ２９の位置におけるアミノ酸残基（該位置の１またはそれ以上において改変されたものであってよい）であり、
Ｙは、遺伝子的にコード可能なアミノ酸残基であり、
Ｘは、
ａ）ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リシン（Ｌｙｓ）、および、アルギニン（Ａｒｇ）からなる群より選択されるアミノ酸残基、または、
ｂ）２〜３５個のアミノ酸残基を有するペプチド（該ペプチドのＮ末端とカルボキシル
末端に、アミノ酸残基リシン（Ｌｙｓ）若しくはアルギニン（Ａｒｇ）を含む）、または、
ｃ）１〜５個のヒスチジン残基を含む、２〜３５個の遺伝子的にコード可能なアミノ酸を有するペプチドであり、
（Ａ２〜Ａ２０）は、ヒトインスリン、動物インスリン、または、インスリン誘導体Ａ鎖のＡ２〜Ａ２０の位置におけるアミノ酸残基（該位置の１またはそれ以上において改変されたものであってよい）であり、そして、
Ｒ³は、遺伝子的にコード可能なアミノ酸残基である］
の配列を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
式IIにおいて、
Ｒ²は、
ａ）水素、または、
ｂ）２〜２５個のアミノ酸残基を有するペプチド（該ペプチドのカルボキシル末端にアミノ酸残基アルギニン（Ａｒｇ）を含む）であり、
Ｒ¹は、フェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）であり、
（Ｂ２〜Ｂ２９）は、ヒトインスリンＢ鎖のＢ２〜Ｂ２９位におけるアミノ酸残基であり、
Ｙは、アラニン（Ａｌａ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、および、セリン（Ｓｅｒ）からなる群より選択されるアミノ酸残基であり、
Ｘは、アミノ酸残基アルギニン（Ａｒｇ）であるか、または、ヒトインスリンＣ鎖のアミノ酸配列を有するペプチドであり、
（Ａ２〜Ａ２０）は、ヒトインスリンＡ鎖のＡ２〜Ａ２０位におけるアミノ酸残基であり、そして、
Ｒ³は、アスパラギン（Ａｓｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、および、グリシン（Ｇｌｙ）からなる群より選択されるアミノ酸残基である、
請求項１１に記載の方法。
式IIにおいて、
Ｒ²は、
ａ）水素、または、
ｂ）カルボキシル末端にアルギニン残基（Ａｒｇ）を含む２〜１５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｒ¹は、フェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）であり、
（Ｂ２〜Ｂ２９）は、ヒトインスリンＢ鎖のＢ２〜Ｂ２９位におけるアミノ酸残基であり、
Ｙは、スレオニン残基（Ｔｈｒ）であり、
Ｘは、アミノ酸残基アルギニン（Ａｒｇ）であるか、または、始点および終点に、２つの塩基性アミノ酸残基、特にアルギニン（Ａｒｇ）および／またはリシン（Ｌｙｓ）を含む２〜３５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
（Ａ２〜Ａ２０）は、ヒトインスリンＡ鎖のＡ２〜Ａ２０位におけるアミノ酸残基であり、そして、
Ｒ³は、アミノ酸残基アスパラギン（Ａｓｎ）、または、グリシン（Ｇｌｙ）である、
請求項１１に記載の方法。