PT1625852E - Vacinas quiméricas de flavivírus - Google Patents

Description

ΕΡ 1 625 852/ΡΤ DESCRIÇÃO "Vacinas quiméricas de flavivírus"

Antecedentes da invenção A presente invenção refere-se a composições de vacinas compreendendo vírus atenuados, infecciosos, conforme reivindicado. Vários membros da família dos flavivírus representam uma ameaça efectiva ou potencial para a saúde pública global. Por exemplo, a encefalite japonesa é um problema de saúde pública significativo que envolve milhões de indivíduos em risco no Extremo Oriente. 0 vírus de dengue, que tem uma incidência anual estimada em 100 milhões de casos de febre de dengue primária e mais de 450.000 casos de febre de dengue hemorrágica em todo o mundo, emergiu como a doença humana transmitida por artrópodes mais importante. Outros flavivírus continuam a provocar doenças endémicas de natureza variada e têm o potencial de emergir em novas áreas como resultado de alterações no clima, populações vector e distúrbios no meio ambiente causados pela actividade humana. Estes flavivírus incluem, por exemplo, o vírus de encefalite de St. Louis, que provoca doença aguda, esporádica mas grave no Centro-Oeste, Sudeste e Oeste dos Estados Unidos; o vírus West Nile, que provoca doença febril ocasionalmente complicada por encefalite aguda e que está amplamente distribuído em toda a África, Médio Oriente, antiga União Soviética e partes da Europa; o vírus de encefalite do Murray Valley, que provoca uma doença do sistema nervoso endémica na Austrália; o vírus de encefalite transmitido por carraças, que está distribuído ao longo da antiga União Soviética e Europa Oriental, onde o seu vector, a carraça ixodídeo, é prevalecente e responsável por uma forma grave de encefalite nessas regiões. O vírus de hepatite C (HCV) é outro membro da família dos flavivírus com uma de organização do genoma e estratégia de replicação semelhante, mas não idêntica, à dos flavivírus mencionados acima. O HCV é transmitido essencialmente por exposição parentérica, está associado com hepatite crónica que pode progredir para cirrose e carcinoma hepatocelular, e é a 2 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ causa principal de doença de figado com necessidade de transplante orototópico nos Estados Unidos. A família Flaviviridae é distinta dos alfavírus (e.g. WEE, VEE, EEE, SFV, etc.) e actualmente contém três géneros, os flavivírus, os pestivírus e os vírus de hepatite C. Os viriões dos flavivírus maduros, totalmente processados, contêm três proteínas estruturais, proteína de envelope (E), de cápside (C) e de membrana (M) e sete proteínas não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) . Os flaviviriões imaturos encontrados em células infectadas contêm proteína de pré-membrana (prM) que é o precursor da proteína M.

Após ligação dos viriões a receptores da célula hospedeira a proteína E sofre uma alteração conformacional irreversível por exposição ao pH ácido dos endossomas, provocando a fusão entre as bicamadas do envelope dos viriões e as vesículas endocíticas, libertando assim o genoma virai para o citosol do hospedeiro. Os vírus de encefalite transmitida por carraças (TBE), contendo PrM são incompetentes para a fusão, o que indica que o processamento proteolítico da prM é necessário para a produção de viriões competentes para a fusão e totalmente infecciosos (Guirakhoo et ai., J. Gen. Virol. 72(Pt. 2):333-338, 1991). Utilizando cloreto de amónio numa fase tardia do ciclo de replicação do vírus, produziram-se vírus de encefalite de Murray Valley (MVE contendo prM e verificou-se que estes eram incompetentes para a fusão. Utilizando péptidos específicos da sequência e anticorpos monoclonais, demonstrou-se que a prM interage com os aminoácidos 200-327 da proteína E. Esta interacção é necessária para proteger a proteína E das alterações conformacionais irreversíveis provocadas pela maturação nas vesículas ácidas da via exocítica (Guirakhoo et al., Virology 191:921-931, 1992) . A clivagem de prM na proteína M ocorre pouco tempo antes da libertação dos viriões por meio de uma protease celular do tipo furina (Stadler et ai., J. Virol. 71:8475-8481, 1997) que é necessária para activar a actividade de hemaglutinação, actividade fusogénica e infecciosidade dos viriões. A proteína M é clivada da sua proteína precursora (prM) após a sequência 3 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ de consenso R-X-R/K-R (X é variável) e é incorporada no envelope lípido do virus, juntamente com a proteína E.

As sequências de clivagem têm sido conservadas, não só nos flavivírus, mas também em proteínas de outros vírus não relacionados, tais como PE2 de coronavírus de murídeo, PE2 de alfavírus, HA de vírus de influenza e pl60 de retrovírus. A clivagem da proteína precursora é essencial para a inf ecciosidade do vírus, mas não para a formação de partículas. Verificou-se que, no caso de uma quimera TBE-dengue 4, uma alteração no local de clivagem de prM resultou numa menor neurovirulência desta quimera (Pletnev et al., J. Virol. 67:4956-4963, 1993) consistente com a observação prévia de que é necessário um processamento eficaz da prM para uma infecciosidade total (Guirakhoo et al., 1991, supra, 1992, supra; Heinz et al., Virology 198:109-117, 1994). Os anticorpos contra a proteína prM podem mediar a imunidade protectora, aparentemente devido a neutralização dos viriões libertados que contêm alguma prM não clivada. O local de clivagem proteolítica da PE2 de VEE (4 aminoácidos) foi eliminado por mutagénese dirigida para o local, do clone infeccioso (Smith et al., ASTMH meeting; 7-11 Dezembro, 1997). Os mutantes de deleção replicaram-se com uma eficácia elevada e as proteínas PE2 foram incorporadas em partículas. Este mutante foi avaliado em primatas não humanos e verificou-se que causa uma seroconversão de 100% e que protegeu todos os macacos imunizados contra um desafio letal.

Flavivírus quiméricos e/ou de crescimento restringido, para utilização numa preparação de vacina, foram descritos em WO 93/06214.

Sumário da invenção A invenção refere-se a composições de vacinas compreendendo vírus atenuados, infecciosos, vivos, quiméricos que são, cada um, compostos por: (a) um primeiro vírus da febre amarela {e.g. estirpe 17D) representando um vírus de vacina atenuado, vivo, em que a sequência de nucleótidos para uma proteína prM-E ou está eliminada, truncada ou mutada, de modo que a proteína prM-E funcional do primeiro flavivírus não é expressa, e 4 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ (b) integrada no genoma do primeiro flavivirus, uma sequência de nucleótidos que codifica para o envelope virai (proteínas prM-E) de um segundo flavivirus diferente, de modo que a proteína prM-E do segundo flavivirus é expressa a partir do genoma alterado do primeiro flavivirus, em que a sequência de sinal na junção C/prM do referido vírus da febre amarela é mantida. 0 vírus quimérico é assim composto por genes e produtos de gene responsáveis pela replicação intracelular pertencente ao primeiro flavivirus e os genes e produtos de genes do envelope do segundo flavivirus. Uma vez que o envelope virai contém todos os determinantes antigénicos responsáveis pela indução de anticorpos neutralizantes, o resultado da infecção com o vírus quimérico é que estes anticorpos são produzidos apenas contra o segundo flavivirus. 0 vírus para utilização como primeiro flavivirus nos vírus quiméricos utilizado na composição de vacina da invenção é o vírus da febre amarela. Pelo menos uma vacina já utilizou este vírus atenuado, vivo; a vacina é conhecida como YF17D e tem sido utilizada para imunização humana desde há mais de 50 anos. A vacina YF17D é descrita em várias publicações, incluindo publicações por Smithburn et al. ("Yellow Fever Vaccination", Organização Mundial de Saúde, p. 238, 1956) e

Freestone (em Plotkin et al. (Eds.), Vaccines, 2a edição, W.B.

Saunders, Filadélfia, 1995). Além disso, o vírus da febre amarela foi estudado ao nível genético (Rice et al., Science 229:726-733, 1985) e obteve-se informação que correlaciona o genótipo e o fenótipo (Marchevsky et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 52:75-80, 1995).

Os flavivirus preferidos para utilização como segundo flavivirus nos vírus quiméricos utilizados na composição de vacina da invenção e portanto como fontes de antigénio imunizante, incluem vírus de encefalite japonesa (JE), dengue (DEN, e.g., qualquer dos tipos 1-4 de dengue), encefalite de Murray Valley (MVE), encefalite de St. Louis (SLE), encefalite transmitida por carraças (TBE) e hepatite C (HCV). Outros flavivirus para utilização como segundo flavivirus incluem vírus Kunjin, vírus de encefalite da Europa Central, vírus de encefalite de Primavera-Verão russo, vírus de Powassan, vírus 5 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ da doença da floresta de Kyasanur e vírus de febre hemorrágica de Omsk. Num vírus quimérico preferido utilizado na composição de vacina da invenção, a sequência codificante da proteína prM-E do segundo flavivírus é substituída na sequência codificante da proteína prM-E do vírus da febre amarela vivo. Num vírus quimérico preferido, a sequência codificante da proteína prM-E é derivada de uma estirpe de vírus atenuada, tal como uma estirpe de vacina. Além disso, como descrito mais à frente, a porção de prM da proteína pode conter uma mutação que impede a clivagem para produzir a proteína de membrana madura. A invenção proporciona várias vantagens. Por exemplo, por serem vivos e se replicarem, os vírus quiméricos utilizados na composição de vacina da invenção podem ser utilizados para produzir imunidade protectora de longa duração. Uma vez que os vírus têm os genes de replicação de um vírus atenuado (e.g. febre amarela 17D), o vírus quimérico resultante é atenuado a um grau que o torna seguro para utilização em humanos.

Outros aspectos e vantagens serão evidentes a partir da descrição detalhada que se segue, das figuras e das reivindicações.

Descrição sumária das Figuras A Fig. 1 é uma representação esquemática dos passos de manipulação genética que foram realizados de modo a construir um vírus quimérico de febre amarela/encefalite japonesa (YF/JE) utilizado na composição de vacina da invenção. A Fig. 2 é um conjunto de curvas de crescimento para vírus YF/JE quiméricos utilizados na composição de vacina da invenção em culturas de células aceitáveis para preparação de uma vacina humana. A Fig. 3 é um gráfico que mostra uma comparação de crescimento entre RMS (Research Master Seed, YF/JE SAi4-14-2) e YF-Vax, em células MRC-5. A Fig. 4 é um gráfico e uma tabela que mostram os resultados de uma análise de neurovirulência de ratinho 6 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ realizada com um vírus YF/JE quimérico utilizado na composição de vacina da invenção. A Fig. 5 é uma representação esquemática de um sistema de dois plasmídeos para produzir o vírus YF/DEN-2 quimérico. A estratégia é essencialmente como descrito para o vírus YF/JE quimérico. A Fig. 6 é uma representação esquemática da estrutura de clones YF modificados concebidos para eliminar porções da proteína NS1 e/ou expressar proteínas estranhas sob o controlo de um local interno de entrada de ribossoma (IRES). A figura mostra apenas a região E/NS1 do genoma virai. Introduz-se um codão de stop da tradução no terminal carboxilo da proteína de envelope (E) . A tradução a jusante é iniciada num enquadramento de leitura aberta (ORF) intergénico por IRES-1, que dirige a expressão de proteínas estranhas (e.g. proteínas El e/ou E2 de HCV) . 0 segundo IRES (IRES-2) controla a iniciação da tradução da região não estrutural de YF em que são expressas proteínas NS1 truncadas, nested (e.g., NSldel-1, NSldel-2 ou NSldel-3). 0 tamanho da deleção de NS1 é inversamente proporcional ao da ORF ligada ao IREs-1. A Fig. 7 é um gráfico que mostra a resposta de anticorpos neutralizantes de ratinhos imunizados com uma vacina quimérica YF/JE SA14-14-2 .

Descrição detalhada A invenção proporciona uma composição de vacina compreendendo um flavivírus quimérico que pode ser utilizada em métodos de vacinação contra a infecção por flavivírus. A construção e análise de flavivírus quiméricos utilizados na composição de vacina, tais como quimeras do vírus da febre amarela e vírus de encefalite japonesa (JE), dengue tipos 1-4 (DEN 1-4), encefalite do Murray Valley (MVE), encefalite de St. Louis (SLE), Oeste do Nilo (WN), encefalite transmitida por carraças (TBE) e hepatite C (HCV) são descritas como se segue.

As proteínas de flavivírus são produzidas por tradução de um único enquadramento de leitura aberta longo (que codifica, 7 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ i.a. as proteínas estruturais, da cápside (C) , de pré-membrana (prM) e de envelope (E), bem como proteínas não estruturais) e uma série complexa de clivagens proteolíticas pós-tradução. Os flavivírus quiméricos utilizados na composição de vacina da invenção, tal como discutido acima, incluem aqueles em que as proteínas prM e E de um flavivírus foram substituídas pelas proteínas prM e E de outro flavivírus. Assim, a criação destes flavivírus quiméricos envolve a produção de novas junções entre as proteínas da cápside e de pré-membrana e a proteína de envelope e a região não estrutural (NS1) de dois flavivírus diferentes. A clivagem entre cada um destes conjuntos de proteínas (C e prM e E e NS1) ocorre durante o processamento proteolítico natural de proteínas de flavivírus e requer a presença de sequências de sinal que flanqueiam as junções dos locais de clivagem.

Nos flavivírus quiméricos utilizados na composição de vacina da invenção as sequências de sinal dos vírus da febre amarela que constituem as quimeras são mantidas, de modo a que a clivagem adequada possa ocorrer de um modo eficaz entre as proteínas C e prM e E e NS1. Uma sequência de sinal pode incluir como seu último resíduo um aminoácido com uma cadeia lateral não carregada, pequena, tal como alanina, glicina, serina, cisteina, treonina ou glutamina.

Construção de modelos de ADNc para a produção de vírus quiméricos YF/JE A derivação de modelos de ADNc de comprimento total para quimeras YF/JE utilizadas na composição de vacina e descritas a seguir, utilizou uma estratégia semelhante à que investigadores anteriores utilizaram para regenerar YF17D a partir do ADNc para análise de genética molecular da replicação de YF. A estratégia é descrita, e.g. por Nestorowicz et al. (Virology 199: 114-123, 1994).

Em resumo, a derivação de uma quimera YF/JE utilizada na composição de vacina envolve o seguinte. As sequências genómicas de YF são propagadas em dois plasmídeos (YF5'3'IV e YFM5.2) que codificam para as sequências de YF dos nucleótidos 1-2.276 e 8.279-10.861 (YF5'3'IV) e de 1.373-8.704 (YFM5.2) (Rice et al., The New Biologist 1:285-296, 1989). Os modelos 8 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ de ADNc de comprimento total são produzidos por ligação de fragmentos de restrição adequados derivados destes plasmideos. Este método tem sido o mais fiável para assegurar a expressão estável de seguências de YF e a produção de moléculas transcritas de ARN com uma infecciosidade especifica elevada. A nossa estratégia para a construção de guimeras envolve a substituição de seguências de YF nos plasmideos YF5'3TV e YFM5.2 pelas seguências JE correspondentes, desde o inicio da proteína prM (nucleótido 478, aminoácido 128) até ao local de clivagem E/NS1 (nucleótido 2452, aminoácido 817). Além da clonagem do ADNc de JE, foram necessários vários passos para introduzir ou eliminar locais de restrição em ambas as sequências de YF e JE para permitir a ligação in vitro. A estrutura do modelo para a regeneração de vírus quiméricos YF(C)/JE(prM-E) é apresentada na Fig. 1. Uma segunda quimera que codifica para toda a região estrutural de JE (C-prM-E) foi manipulada utilizando uma estratégia semelhante.

Clonagem molecular da região estrutural do vírus JE

Produziram-se clones dos genes da proteína estrutural de JE autêntica a partir da estirpe SAi4-14-12 de JE (estirpe de vacina atenuada viva, de JE) uma vez que as propriedades biológicas e caracterização molecular desta estirpe estão bem documentadas (veja-se, e.g., Vaccine 6-513-518, 1988; o vírus JE SAi4-14-12 está disponível nos Centers for Disease Control, Fort Collins, Colorado e na Yale Arbovirus Research Unit, Yale University, New Haven, Connecticut, que são centros de referência para Arbovirus nos Estados Unidos designados pela Organização Mundial de Saúde). Obteve-se o vírus JE SA14-14-2 a um nível de passagem PDK-5 e este foi passado em células LLC-MK2 para se obterem quantidades suficientes de vírus para clonagem de ADNc. A estratégia que utilizámos envolveu a clonagem da região estrutural em dois pedaços que se sobrepõem num local de NheI (nucleótido 1.125 de JE) que pode então ser utilizado para ligação in vitro.

0 ARN foi extraído de monocamadas de células LLC-MK2 infectadas e fez-se a síntese da primeira cadeia de ADNc de sentido negativo, utilizando transcriptase inversa com um iniciador de sentido negativo (sequência de nucleótidos de JE 9 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ 2.456-71) contendo locais de restrição de Xbal e NarI nested, para clonagem inicialmente em pBluescript II KS(+) e subsequentemente em YFM5.2 {NarI), respectivamente. A síntese da primeira cadeia de ADNc foi seguida de amplificação por PCR da sequência de JE a partir dos nucleótidos 1108-2471, utilizando o mesmo iniciador de sentido negativo e um iniciador de sentido positivo (sequência de nucleótidos de JE 1108-1130) contendo locais de restrição de Xbal e NstI nested, para clonagem em pBluesript e YFM5.2 (NarI), respectivamente. As sequências de JE foram verificadas por digestão com enzimas de restrição e sequenciação de nucleótidos. A sequência de nucleótidos de JE desde os nucleótidos 1 a 1130 foi derivada por amplificação por PCR de ADNc de JE de cadeia negativa, utilizando um iniciador de sentido negativo correspondendo aos nucleótidos de JE 1116 a 1130 e um iniciador de sentido positivo correspondendo aos nucleótidos de JE 1 a 18, ambos contendo um local de restrição de FcoRI. Os fragmentos de PCR foram clonados em pBluescript e as sequências de JE foram verificadas por sequenciação de nucleótidos. Em conjunto, isto representa a clonagem da sequência de JE a partir dos nucleótidos 1-2.471 (aminoácidos 1-792).

Construção de derivados YF5'3'IV/JE e YFM5.2/JE

Para inserir o terminal C da proteína de envelope de JE no local de clivagem E/NS1 de YF, introduziu-se um único local de restrição de NarI no plasmídeo YFM5.2 por mutagénese dirigida por oligonucleótidos da sequência de sinalase no local de clivagem de E/NS1 (nucleótidos de YF 2447-2452, aminoácidos 816-817) para criar YFM5.2(NarI). As moléculas transcritas derivadas de modelos que incorporam esta alteração foram analisadas quanto à infecciosidade e originaram uma infecciosidade específica semelhante à dos modelos originais (aproximadamente 100 unidades formadoras de placas/ 250 nanogramas de molécula transcrita). A sequência de JE dos nucleótidos 1108 a 2471 foi subclonada a partir de vários clones independentes derivados por PCR de pBluescript/JE em YFM5.2 (NarI), utilizando os locais de restrição únicos NsiI e A7arl. Os clones YF5'3'IV/JE contendo a região não traduzida 5' de YF (nucleótidos 1-118) adjacente à região prM-E de JE foram derivados por amplificação por PCR. 10 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ

Para derivar sequências contendo a junção da cápside de YF e o prM de JE, utilizou-se um iniciador quimérico de sentido negativo que abrange esta região, com um iniciador de sentido positivo correspondente aos nucleótidos de YF5'3'IV 6625-6639 para produzir fragmentos de PCR que foram então utilizados como iniciadores de PCR de sentido negativo, em conjunção com um iniciador de sentido positivo complementar à sequência vector de pBluescript a montante do local de EcoRI, para amplificar a sequência de JE (codificada na orientação inversa no vector pBluesript) desde o nucleótido 477 (terminal N da proteína prM) até ao local de NheI no nucleótido 1125. Os fragmentos de PCR resultantes foram inseridos no plasmídeo YF5'3'IV utilizando os locais de restrição de NotI e EcoRI. Esta construção contém o promotor SP6 que precede a região não traduzida a 5' de YF, seguido da sequência: YF(C) JE (prM-E) e contém o local de Nhe I (nucleótido 1125 de JE) necessário para a ligação in vitro.

Manipulação de YFM5.2 e YF5'3'IV para conter locais de restrição para ligação in vitro

De modo a utilizar o local de Nhe I na sequência de envelope de JE como um local de ligação in vitro 5', eliminou-se um local NheI redundante no plasmídeo YFM5.2 (nucleótido 5459). Isto foi conseguido por mutação silenciosa da sequência YF no nucleótido 5461 (1—>C; alanina, aminoácido 1820). Este local foi incorporado em YFM5.2 por ligação dos fragmentos de restrição adequados e introduzido em YFM5.2(NarI)/JE por troca de um fragmento Nsil/NarI que codifica para a sequência YF/JE quimérica.

Para criar um local de restrição 3' único para ligação in vitro, manipulou-se um local de BspEI a jusante do local de Aatll normalmente utilizado para criar modelos de comprimento total de YF5'3'IV e YFM5.2 (estão presentes múltiplos locais de Aatll na sequência estrutural de JE, impedindo a utilização deste local para ligação in vitro). O local de BspEI foi criado por mutação silenciosa do nucleótido 8581 de YF (A—>C; serina, aminoácido 2860) e foi introduzido em YFM5.2 por troca dos fragmentos de restrição adequados. O local único foi incorporado em YFM5.2/JE por troca do fragmento Xbal/Sphl e nos plasmídeos YF5'3'IV/JE(prM-E) por ligação de três porções 11 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ dos fragmentos de restrição adequados destes plasmídeos progenitores e de um derivado de YFM5.2 (BspEI), eliminando a sequência de YF entre os locais de EcoRI nos nucleótidos 1 e 6912.

Troca do ADNc de JE Nakayama nos plasmídeo quiméricos YF/JE

Devido à incerteza acerca da capacidade da região estrutural de JE SAi4-14-2 derivada por PCR funcionar de forma adequada no contexto do virus quimérico, utilizámos ADNc de um clone da estirpe Nakayama de JE que foi extensivamente caracterizado em experiências de expressão e quanto à sua capacidade para induzir imunidade protectora (veja-se e.g., Mclda et al. , Virology 158:348-360, 1987; a estirpe Nakayama de JE está disponível nos Centers for Disease Control, Fort Collins, Colorado e na Yale Arbovirus Research Unit, Yale University, New Haven, Connecticut). Inseriu-se o ADNc de Nakayama nos plasmídeos quiméricos YF/JE, utilizando locais de restrição disponíveis (HindIII a PvuII e Bpml a Muni) para substituir toda a região prM-E no sistema de dois plasmídeos, excepto para um único aminoácido, serina, na posição 49, que foi deixado intacto de modo a utilizar o local de NheI para ligação in vitro. Toda a região JE no clone Nakayama foi sequenciada para verificar que o ADN substituído era autêntico (Tabela 2).

Produção de modelos de ADNc de comprimento total, transfecção de ARN e recuperação de vírus infecciosos

Os procedimentos para produzir modelos de ADNc de comprimento total são essencialmente como descrito em Rice et al. (The New Biologist 1:285-96, 1989) (veja-se Fig. 1). No caso de modelos quiméricos, os plasmídeos YF5'3'IV/JE(prM-E) e YFM5.2/JE são digeridos com Nhel/BspEI e faz-se a ligação in vitro utilizando 50 nanogramas de fragmentos purificados na presença de ADN-ligase de T4. Os produtos de ligação são linearizados com XhoI para permitir uma transcrição run-off. As moléculas transcritas de SP6 são sintetizadas utilizando 50 nanogramas de modelo purificado, quantificadas por incorporação de 3H-UTP e a integridade do ARN é verificada por electroforese em gel de agarose não desnaturante. Os rendimentos variam de 5 a 10 microgramas de ARN por reacção, 12 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ utilizando este procedimento, estando a maioria presentes como moléculas transcritas de comprimento total. A transfecção de moléculas transcritas de ARN na presença de lipossomas catiónicos é realizada como descrito por Rice et al. (supra) para YF17D. Em experiências iniciais, utilizaram-se células LLC-MK2 para transfecção e quantificação do virus, uma vez que determinámos a permissividade para replicação e a formação de placas das estirpes progenitoras de YF e JE. A tabela 1 ilustra os resultados típicos de experiências de transfecção utilizando Lipofectina (GIBCO/BRL) como um veículo de transfecção. As linhas celulares Vero também foram utilizadas rotineiramente para a preparação de estoques de vírus infecciosos, caracterização de proteínas marcadas e testes de neutralização.

Sequenciação de nucleótidos de modelos de ADNc quiméricos

Os plasmídeos que contêm o ADNc de YF/JE quimérico foram submetidos a análise de sequência da porção JE dos clones, para identificar as sequências correctas da proteína de envelope de SAi4-14-2 e Nakayama. As diferenças de sequência de nucleótidos entre estas construções em comparação com as sequências descritas (McAda et al., supra) são apresentadas na Tabela 2.

Caracterização estrutural e biológica de vírus YF/JE quiméricos

A estrutura genómica de vírus YF/JE quiméricos recuperados de experiências de transfecção foi verificada por análise baseada em RT/PCR do ARN virai recolhido de monocamadas de células infectadas. Estas experiências são realizadas de modo a eliminar a possibilidade de os estoques de vírus serem contaminados durante os procedimentos de transfecção. Para estas experiências, utilizou-se um vírus de primeira passagem para iniciar um ciclo de infecção, de modo a eliminar quaisquer artefactos possíveis produzidos pela presença de ARN virai transfectado, residual. Submeteram-se extractos de ARN total de células infectadas ou com a quimera YF/JE(prM-E)-SA14-14-2 ou YF/JE (prM-E)-Nakayama a RT/PCR, utilizando iniciadores específicos de YF e JE, que permitiram recuperar toda a região estrutural como dois produtos de PCR 13 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ com aproximadamente 1 quilobase de tamanho. Estes produtos foram então analisados por digestão com enzimas de restrição, utilizando os locais previstos nas sequências de JE SAi4-14-2 e Nakayama que permitem diferenciar estes vírus. Utilizando esta abordagem, demonstrou-se que o ARN virai era quimérico e verificou-se que os vírus recuperados têm locais de restrição adequados. Verificou-se então que a fronteira efectiva C-prM estava intacta ao nível da sequência, por análise de sequência de ciclo ao longo da junção C-prM de YF/JE quimérico. A presença da proteína de envelope de JE nas duas quimeras foi verificada quer por imunoprecipitação com anti-soros específicos de JE, quer por teste de neutralização de redução de placas utilizando anti-soros específicos de YF e JE. A imunoprecipitação de extractos de células LLC-MK2 marcados com 35S, infectadas com as quimeras utilizando um anticorpo monoclonal contra a proteína E de JE mostrou que a proteína de envelope de JE pode ser recuperada como uma proteína de 55 kD, enquanto que os mesmos anti-soros não imunoprecipitaram uma proteína de células infectadas com YF. Ambos os soros hiper-imunes de JE e YF demonstraram uma reactividade cruzada para as duas proteínas de envelope, mas a diferença de tamanho entre as proteínas (YF= 53 kD, não glicosilada; JE= 55 kD, glicosilada) pôde ser observada de forma reprodutível. A utilização de anticorpos monoclonais de YF não era satisfatória nas condições de imunoprecipitação, pelo que a especificidade era dependente dos anticorpos monoclonais de JE nesta análise. Fez-se um teste de neutralização da redução de placas (PRNT) nos vírus quiméricos e nos vírus YF e JE SA14-14-2, utilizando fluido ascítico (ATCC) hiper-imune específico de YF e JE e IgG purificada específica de YF (anticorpo monoclonal 2E10). Observaram-se diferenças significativas no título de 50% de redução de placas destes anti-soros para as quimeras, quando comparado com os vírus de controlo nestas experiências (Tabela 3). Deste modo, os epítopos necessários para neutralização são expressos nos vírus TF/JE quiméricos, infecciosos.

Propriedades de crescimento em cultura de células A capacidade de crescimento das quimeras foi analisada de forma quantitativa em linhas celulares originárias de primata e mosquito. A Fig. 2 ilustra as curvas de crescimento 14 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ cumulativo das quimeras em células LLC-MK2 após infecção de baixa multiplicidade (0,5 unidades formadoras de placas/ célula). Nesta experiência, utilizaram-se os vírus YF5.2iv (derivado clonado) e JE SA14-14-2 (não clonado) , para comparação. Ambos os vírus quiméricos atingiram um rendimento em vírus máximo, de aproximadamente uma unidade log mais elevada do que qualquer dos vírus progenitores. No caso da quimera YF/JE SAi4-14-2, o pico de produção de vírus ocorreu 12 horas mais tarde do que para a quimera YF/JE Nakayama (50 horas vs 38 horas). A quimera YF/JE Nakayama exibiu consideravelmente mais efeitos citopáticos do que a quimera YF/JE SAi4-14-2, nesta linha celular. Fez-se uma experiência semelhante em células C6/36 após uma infecção de multiplicidade baixa (0,5 unidades formadoras de placas/ célula). A Fig. 2 também ilustra a cinética de crescimento dos vírus nesta linha celular de invertebrado. Obtiveram-se rendimentos de vírus semelhantes em todos os pontos utilizados para a recolha de vírus nesta experiência, o que substancia ainda mais a noção de que os vírus quiméricos não são deficientes na eficácia de replicação.

Comparação das cinéticas de crescimento do RMS (YF/JE SA14-14-2) com a vacina YF 17D em células MRC-5

Fez-se uma experiência para determinar a capacidade do candidato a vacina se propagar numa linha celular aceitável para vacinas humanas. A vacina de febre amarela 17D comercial (YF-Vax®) foi obtida da Connaught Laboratories, Swiftwater, PA, as MRC-5 (células de pulmão embrionário humano diplóides) foram adquiridas da ATCC (171-CCL, lote#F-l4308, passagem 18) e crescidas em EMEM, L-Gln 2 mM, BSS de Earle ajustado para conter bicarbonato de sódio 1,5 g/1, aminoácidos não essenciais 0,1 mM e FBS a 10%. a

Para comparar as cinéticas de crescimento de RMS (Research Master Seed, YF/JE SA14-14-2) com YF-Vax®, as células foram crescidas até uma confluência de 90% e infectadas com RMS ou YF-Vax® a uma MOI de 0,1 pfu. Uma vez que as células MRC-5 crescem geralmente devagar, estas células foram mantidas durante 10 dias após a inoculação. As amostras foram congeladas diariamente durante 7-10 dias e 15 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ infecciosidade foi determinada pelo teste de placas em células Vero.

As quimeras YF-Vax® e YF/JE cresceram a títulos moderados em células MRC-5 (Fig.3) . 0 título de pico era de ~4, 71ogio pfu para YF-Vax®, o qual se obteve no segundo dia e era ligeiramente inferior, de 4,5 logio pfu para o RMS após 6 dias.

Teste de neurovirulência em ratinhos adultos normais

As propriedades de virulência da quimera YF/JE SA14-14-2 foram analisadas em ratinhos adultos jovens por inoculação intracerebral. Inocularam-se grupos de 10 ratinhos (ratinhos ICR macho e fêmea de 4 semanas de idade, 5 cada por grupo) com 10 000 unidades formadoras de placas da quimera YF/JE SAi4-14-2, YF5.2iv ou JE SAi4-14-2 e observaram-se diariamente durante 3 semanas. Os resultados destas experiências estão ilustrados na Fig. 4. Os ratinhos que recebem o YF5.2iv progenitor sucumbiram aproximadamente uma semana após a inoculação. Não se observou nenhuma mortalidade ou doença entre os ratinhos que receberam ou o JE SAi4-14-2 progenitor, ou a quimera. Os inóculos utilizados para as experiências foram titulados na altura da injecção e testou-se um subgrupo dos ratinhos sobreviventes quanto à presença de anticorpos neutralizantes, para confirmar que a infecção tinha ocorrido. De entre os animais testados, os títulos contra o vírus JE SAi4-14-2 eram semelhantes para animais que recebem quer esta estirpe, quer a quimera.

Os resultados de experiências adicionais em que se analisou a neurovirulência da quimera YF/JE SAi4-14-2 em ratinhos estão ilustrados na tabela 4. Nestas experiências, todos os ratinhos inoculados com YF5.2iv morreram em 7-8 dias. Pelo contrário, nenhum dos ratinhos inoculados com YF/JE SAi4-14-2 morreu durante duas semanas de observação após inoculação.

Os resultados de experiências em que se analisou a neuroinvasão e patogenicidade das quimeras YF/JE estão ilustrados na Tabela 5. Nestas experiências, os vírus quiméricos foram inoculados em ratinhos de 3 semanas de idade, a doses que variam entre 10 000 e 1 milhão de unidades 16 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ formadoras de placas, através da via intraperitoneal. Nenhum destes ratinhos inoculados com YF/JE Nakayama ou YF/JE SAi4-14-2 morreu durante três semanas de observação após inoculação, indicando que o vírus era incapaz de provocar doença após inoculação periférica. Os ratinhos inoculados com YF/JE SAi4-14-2 desenvolveram anticorpos neutralizantes contra o vírus JE (Fig. 7).

Construção de modelos de ADNc para a produção de vírus quiméricos de febre amarela/dengue (YF/DEN) A derivação de vírus quiméricos de febre amarela/dengue (YF/DEN) está descrita como se segue, o que em princípio é realizado do mesmo modo que a construção da quimera YF/JE descrita acima. Podem-se manipular outras quimeras de flavivírus com uma estratégia semelhante, utilizando locais de restrição naturais ou manipulados e, por exemplo, iniciadores de oligonucleótidos, como se mostra na tabela 6.

Construção de vírus quiméricos YF/DEN

Embora se tenham desenvolvido vários clones moleculares para vírus de dengue, têm-se encontrado vários problemas em relação à estabilidade do ADNc virai em sistemas de plasmídeo e com a eficácia de replicação do vírus recuperado. Escolhemos utilizar um clone de DEN-2 desenvolvido pelo Dr. Peter Wright, Dept. of Microbiology, Monash University, Clayton, Austrália, uma vez que este sistema é relativamente eficaz para regenerar vírus e utiliza um sistema de dois plasmídeos, semelhante à nossa própria metodologia. A sequência completa deste clone de DEN-2 está disponível e facilitou a construção de modelos de YF/DEN quiméricos, pois apenas são necessárias poucas modificações do clone YF. Os passos relevantes são descritos a seguir. À semelhança do sistema de dois plasmídeos para os vírus YF5.2iv e YF/JE, o sistema YF/DEN utiliza um local de restrição único dentro da proteína de envelope (E) de DEN-2 como ponto de quebra para propagar a região estrutural (prM-E) nos dois plasmídeos, daqui para a frente designados por YFS'3'IV/DEN (prM-E') e YFM5.2/DEN (E'-E) (veja-se Fig. 5). Os dois locais de restrição para ligação in vitro do modelo quimérico são Aatll e Sphl. 0 plasmídeo receptor para a 17 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ porção 3' da sequência da proteína E de DEN é YFM5.2{NarI[+]Sphl[-]). Este plasmídeo contém o local NarI na junção E/NSI que foi utilizada para inserção do terminal carboxilo da proteína E de JE. Esta foi pósteriormente modificada por deleção de um local Sphl extra na região da proteína NS5 por mutagénese silenciosa dirigida para o local. Isto permitiu a inserção da sequência de DEN-2 desde o local de Sphl único até ao local de NarI, por clonagem direccional simples. 0 fragmento adequado de ADNc de DEN-2 foi derivado por PCR a partir do clone de DEN-2 MON310 fornecido pelo Dr. Wright. Os iniciadores de PCR incluíam um iniciador 5' a flanquear o local de Sphl e um iniciador 3' homólogo aos nucleótidos de DEN-2, imediatamente a montante do local de sinalase na junção E/NSI e substituindo o local de sinalase por substituições que criam um local novo, mas também introduzem um local de NarI. 0 fragmento de PCR de 1.170 pares de bases resultante foi então introduzido em YFM5.2 (NarI [ + ] Sphl [-] ) . A porção 5' do clone de DEN-2 incluindo o prM e a porção de terminal amino da proteína E foi manipulada no plasmídeo YF5'3'IV utilizando um iniciador de PCR quimérico. O iniciador quimérico que incorpora a extremidade 3' da proteína C de YF de sentido negativo e a extremidade 5' da proteína prM de DEN-2 foi utilizado com um iniciador de sentido positivo que flanqueia o promotor SP6 do plasmídeo YF5'3'IV, para produzir um produto de PCR com 771 pares de bases, com uma extensão de 20 bases representando a sequência de prM de DEN-2. Este produto de PCR foi então utilizado como iniciador do plasmídeo DEN-2 em conjunção com um iniciador 3' representando a sequência de DEN-2 1501-1522 e flanqueando o Sphl, para produzir um produto de PCR final com 1.800 pares de bases,

incluindo a sequência de YF desde o local de Notl até ao promotor SP6, região não traduzida 5' de YF e proteína C de YF

contígua com a sequência prM-E1522 de DEN-2. O produto de PCR foi ligado em YF5'3' IV utilizando locais de Notl e Sphl para se obter o plasmídeo YF5'3'IV/DEN(prM-E).

Construção de modelos quiméricos para outros flavivirus

Os procedimentos para a produção de modelos de ADNc de comprimento total que codificam para os vírus quiméricos YF/MVE, YF/SLE, YF/WN, YF/TBE são semelhantes aos descritos 18 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ acima para ο sistema YF/DEN-2. A Tabela 6 ilustra as características da estratégia para produzir vírus quiméricos baseados em YF17D. Os locais de restrição únicos utilizados para ligação in vitro e os iniciadores quiméricos para manipulação das junções C/prM e E/NSI também são apresentados. As fontes de ADNc para estes flavivírus heterólogos podem ser facilmente obtidas (MVE: Dalgarno et al., J. Mol. Biol. 187:309-323, 1986; SLE: Trent et al., Virology 156:293-304, 1987; TBE: Mandl et al., Virology 166:197-205, 1988; Dengue 1: Mason et al., Virology 161:262-267, 1987; Dengue 2: Deubel et al., Virology 155:365-377, 1986; Dengue 3: Hahn et al.,

Virology 162:167-180, 1988; Dengue 4: Zhao et al., Virology 155-77-88, 1986) .

Uma abordagem alternativa para manipular outros vírus quiméricos é criar a junção C/prM por ligação de extremidades rombas de fragmentos de restrição derivados por PCR com extremidades que se encontram nesta junção e terminais 5' e 3' que flanqueiam locais de restrição adequados para introdução em YF5'3'IV, ou um plasmídeo intermediário, tal como pBS-KS(+). A opção de utilizar um oligonucleótido quimérico ou uma ligação de extremidades rombas irá variar, dependendo da disponibilidade de locais de restrição únicos na região codificante da proteína de envelope do vírus em questão.

Construção de vírus YF que codificam para antigénios de HCV

Uma vez que as proteínas estruturais EI e E2 de HCV não são homólogas às proteínas estruturais dos flavivírus descritos acima, a estratégia para expressão destas proteínas envolve a inserção numa região não essencial do genoma, de modo a que todas estas proteínas sejam então co-expressas com as proteínas de febre amarela durante a replicação virai em células infectadas. A região alvo para inserção das proteínas é a porção de terminal N da proteína NS1, uma vez que não é necessária toda a proteína NS1 para a replicação virai. Devido aos problemas potenciais com a estabilidade do genoma de YF na presença de sequências heterólogas que excedam o tamanho normal do genoma (aproximadamente 10 000 nucleótidos), pode-se utilizar a estratégia de detecção descrita a seguir. Adicionalmente, a deleção de NS1 pode ser vantajosa nos sistemas quiméricos YF/Flavivírus acima descritos, dado que a deleção parcial desta proteína pode anular a imunidade contra 19 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ YF associada com anticorpos contra NS1, evitando assim problemas com a imunidade do vector quando for necessário mais do que uma vacina quimérica para um determinado receptor, ou quando a vacina YF foi anteriormente administrada, ou é necessária num tempo futuro. A estratégia envolve criar uma série de deleções in-frame dentro da região codificante de NS1 do plasmideo YFM5.2, em conjunção com a manipulação de um codão de terminação da tradução na extremidade de E e uma série de dois IRES (locais internos de entrada de ribossoma). Um IRES situa-se imediatamente a jusante do codão de terminação e permite a expressão de um enquadramento de leitura aberta na região entre E e NS1. 0 segundo IRES inicia a tradução de proteínas NS1 truncadas, proporcionando a expressão do remanescente da poliproteína não estrutural YF. Estes derivados são testados para a recuperação de vírus infecciosos e a construção com a maior deleção é utilizada para inserção de sequências estranhas (e.g., proteínas de HCV) no primeiro IRES. Esta construção particular também pode servir como uma base para determinar se a deleção de NS1 irá afectar a imunidade específica do vector no contexto de vírus quiméricos YF/Flavivírus que expressam prM-E, como descrito acima.

A inserção de nucleótidos que codificam para as proteínas de HCV El, E2 e/ou EI mais E2 é limitada pelo tamanho da deleção tolerada na proteína NS1. Por este motivo, podem-se utilizar proteínas de HCV truncadas para aumentar a estabilidade no clone YF modificado. As proteínas de HCV são manipuladas com uma sequência de sinal de terminal N imediatamente a seguir ao IRES e um codão de terminação no terminal C. Esta construção irá dirigir as proteínas de HCV para o retículo endoplasmático, para secreção a partir da célula. A estratégia para esta construção é apresentada esquematicamente na Fig. 6. Os plasmídeos que codificam para proteínas de HCV do genótipo I podem ser utilizados para estas construções, por exemplo, os plasmídeos de HCV obtidos do Dr. Charles Rice da Washington University (Grakoui et al., J. Virology 67:1385-1395, 1993) que expressaram esta região do vírus em sistemas de processamento e no clone de HCV de comprimento total de replicação-complemento. 20 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ

Mutantes de deleção de clivagem de prM como candidatos de vacina atenuada para flavivírus Vírus quiméricos adicionais utilizados na composição de vacina contêm mutações que impedem a clivagem de prM, tais como mutações no local de clivagem de prM. Por exemplo, o local de clivagem de prM nos clones infecciosos de flavivírus de interesse, tais como o dengue, TBE, SLE e outros, podem ser mutados por mutagénese dirigida para o local. Qualquer um ou todos os aminoácidos no local de clivagem, como descrito acima, podem ser eliminados ou substituídos. Um fragmento de ácido nucleico contendo os genes prM-E mutados pode ser inserido num vector do vírus da febre amarela utilizando os métodos descritos acima. A deleção de prM pode ser utilizada com ou sem outras mutações atenuantes, por exemplo, mutações na proteína E, a ser inseridas no vírus da febre amarela.

Estes mutantes têm vantagens em relação a mutantes de substituição simples como candidatos de vacinas, pois é praticamente impossível reverter a sequência eliminada e recuperar a virulência.

Os flavivírus quiméricos seguintes utilizados na composição de vacina foram depositados na American Type Culture Collection (ATCC) em Rockville, Maryland, USA, nos termos do tratado de Budapeste e foi-lhes concedida uma data de depósito de 6 de Janeiro de 1998: vírus quimérico de febre amarela 17D/dengue tipo 2 (YD/DEN-2; ATCC número de concessão ATCC VR-2593) e vírus quimérico de febre amarela 17D/encefalite japonesa SAi4-14-2 (YF/JEA1.3; ATCC número de concessão ATCC VR-2594).

Tabela l

Caracterização de quimeras YF/JE Clone Rendi mento (pg) Placas de infecciosidade / 100 ng LLC-MK2 PBS log título VERO ARNase log título VERO ADNase log título VERO YF 5.21v 5,5 15 7,2 0 7 YF/JE-S 7,6 50 6,2 0 6,2 YF/JE-N 7 60 5 0 5,4 21 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ

Tabela 2

Comparação da sequência de estirpes de JE e quimeras YF/JE Vírus E E E E E E E E 107 138 176 177 227 243 244 279 JE SA14-14-2 F K V T S K G M YF/JE Sal4-14-2 F K V A S E G M YF/JE NAK LE I T P E E K JE NAK LE I T P E E K JE SAI 4 LE I T s E G K

Tabela 3 Títulos de neutralização de redução de placas em quimeras YF/JE Vírus Fluido Fluido Fluido IgG IgG de ascítico ascítico ascítico não YF não imune de YF de JE imune YF5.2iv <1,3 3,7 <1,3 <2,2 >4,3 JE SA 14-14-2 <1,3 <1,3 3,4 <2,2 <2,2 YF/JE SAI4-14-2 <1,3 <1,3 3,1 <2,2 <1,9 YF/JE Nakayama <1,3 <1,3 3,4 <2,2 <2,2

Tabela 4

Neurovirulência da quimera YF/JE SA14-14-2 em ratinhos ICR macho de 3 semanas de idade Log dose I.C. % mortalidade YF5.2iv 4 100 (7/7) JE SA 14-14-2 4 0 (0/7) JE SA 14-14-2 5 0 (0/7) JE SA 14-14-2 6 0 (0/8)

Tabela 5

Neurovirulência da quimera YF/JE em ratinhos ICR macho de 3 semanas de idade Log dose (intraperitoneal) % mortalidade YF/JE Nakayama 4 0 (0/5) YF/JE Nakayama 5 0 (0/4) YF/JE Nakayama 6 0 (0/4) JE SA 14-14-2 4 0 (0/5) JE SA 14-14-2 5 0 (0/4) JE SA 14-14-2 6 0 (0/4) 22 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ

Tabela 6

Manipulação de quimeras YF/flavivírus Vírus Junção1 C/prM quimérica Junção2 E/NS1 quimérica Ligação 5'3 T.igaçan 3'4 Locais eliminados ou (criados) 5 YF/WN X-cactgggagagcttsaaggtc (SEQIO NG:|) ffi^aqitÍjcagccgeggtitaa {3EQÍDNO-.2) Aolll Nsit YF/0EN-S X-aaggtagaetggígggctcec (SEQIO NO:3) saimeaaiaccaaccgcgtrmaa (SEQ ÍD NO:4) Aatil Sph\ SpJiie- DEN YP/DEN-2 X-aaggíagattggtgtgc&ttg (SEQ SD NG:5) MÍmcamccassegcGgmaa (SEQ 1DN0;«) Aati\ SpM YF/DEN-3 X-aaggtgaatfgaagtgcteta ÍSEQJD NO:7) 3CftegeaacaccacccgcgjÍ«ta« (S£Q ÍD NO:8) Aat II Sphí Xhol 1· DEN (Spkl e^DEN) YF/DEN-4 X · assâggaaeagttgttcteta (SEQIDNOíO) acccsaasistcaacceceeftiaa Aatii Atol (SEQ m NO: 10) YF/SLE X aacgfgaatagsgattagtc (SEQIDNCMI) â£.ÇgS££!SS£âSccgcggRiaa (SEQ 10 NO: 12) Aatil Am» $££· YF/MVE X-aattiCEaaaggrggaaggtc (SEQÍDNOtB) (SEQIO NO: 14) ÂatU Agel {Agel‘ YF) YF/TBE X-tactgcgaacgacgttgccac (SEQ ÍD NO: IS) as$gggsiSBES£i»gcggttt8a (SEQ IO NO: 16) AatU Agcl (Xgel YF) 1,2: A coluna ilustra o oligonucleótido utilizado para produzir os iniciadores quiméricos de YF/flavivirus correspondentes à junção C/prM ou E/NS1 (veja-se texto). X = sequência que codifica para o terminal carboxilo da cápside de YF. A região sublinhada corresponde à sequência heteróloga alvo imediatamente a montante do local NarI (sentido inverso - ccgcgg). Este local permite a inserção de produtos de PCR no plasmídeo Yfm5.2 (NarI), necessários para produzir modelos de ADNc de comprimento total. Outros nucleótidos são específicos para o virus heterólogo. Os iniciadores de oligonucleótidos estão enumerados de 5' para 3'. 3,4: São enumerados os locais de restrição únicos utilizados para criar fragmentos de restrição que podem ser isolados e ligados in vitro para produzir modelos de ADNc quimérico de comprimento total. Uma vez que algumas sequências não contêm locais adequados, é necessária a manipulação de locais adequados, nalguns casos (nota de rodapé 5). 5: entre parêntesis estão os locais de enzimas de restrição que têm que ser criados ou no esqueleto de YF, ou no vírus heterólogo, para permitir uma ligação in vitro eficaz. Os locais que não estão entre parêntesis devem ser eliminados. Todas estas modificações são realizadas por mutagénese silenciosa do ADNc para o clone respectivo. Os espaços em branco indicam que não é necessária qualquer modificação dos clones de ADNc.

Outros Exemplos

Outros exemplos estão no âmbito das reivindicações que se seguem. Por exemplo, os genes da proteína prM-E de outros flavivírus de importância médica podem ser inseridos no esqueleto do vírus da vacina de febre amarela, para produzir vacinas contra outros flavivírus de importância médica (veja-se e.g., Monath et al., "Flaviviruses", In Virology, Fields (ed.), Raven-Lippincott, Nova Iorque, 1995, Volume 1, 961-1034). 23 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ

Exemplos de outros flavivírus a partir dos quais se podem obter genes a ser inseridos nos vectores quiméricos incluem, e.g., virus Kunjin, encefalite da Europa Central, encefalite de Primavera-Verão russa, de Powassan, da doença da floresta de Kyasanur e de febre hemorrágica de Omsk. Além disso, podem-se inserir na vacina de febre amarela genes de virus ainda mais distantemente relacionados, para construir vacinas novas.

Produção e utilização de vacinas

As vacinas são administradas em quantidades e utilizando métodos que podem ser facilmente determinados pelos peritos na arte. As vacinas podem ser administradas e formuladas, por exemplo, do mesmo modo que a vacina de febre amarela 17D, e.g. como uma suspensão límpida de tecido de embrião de galinha infectado, ou um fluido recolhido de culturas de células infectadas com o vírus quimérico de febre amarela. Assim, o vírus quimérico atenuado, vivo, é formulado como uma solução aquosa estéril contendo entre 100 e 1 000 000 unidades infecciosas (e.g. unidades formadoras de placas ou doses infecciosas de cultura de tecido) num volume de dose de 0,1 a 1,0 ml a ser administrados, por exemplo, pela via intramuscular, subcutânea ou intradérmica. Adicionalmente, uma vez que os flavivírus são capazes de infectar o hospedeiro humano através das vias mucosas, tal como a via oral (Gresikova et al., "Tick-borne Encephalitis", In The Arboviruses Ecology and Epidemiology, Monath (ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1988, Volume IV, 177-203), o vírus de vacina pode ser administrado por uma via mucosa para se obter uma resposta imunitária protectora. A vacina pode ser administrada como um agente profilático primário, em adultos ou crianças em risco de infecção por flavivírus. As vacinas também podem ser utilizadas como agentes secundários, para o tratamento de pacientes infectados com flavivírus, estimulando uma resposta imunitária contra flavivírus.

Poderá ser desejável utilizar o sistema vector de vacina de febre amarela para imunizar um hospedeiro contra um vírus (por exemplo, o vírus de encefalite Japonesa) e re-imunizar mais tarde o mesmo indivíduo contra um segundo ou terceiro vírus, utilizando uma construção quimérica diferente. Uma vantagem significativa do sistema quimérico de febre amarela é 24 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ que ο vector não irá desencadear uma imunidade forte contra ele próprio. Nem uma imunidade anterior contra o vírus da febre amarela irá impedir a utilização da vacina quimérica como um vector para a expressão de gene heterólogo. Estas vantagens resultam da remoção da porção do gene E da vacina de febre amarela que codifica para antigénios neutralizantes (protectores) da febre amarela e substituição com outro gene heterólogo, que não proporciona uma protecção cruzada contra a febre amarela. Embora as proteínas não estruturais do vírus YF17D possam desempenhar um papel na protecção, por exemplo, produzindo anticorpos contra NS1 que está envolvido na lise de células infectadas mediada por anticorpos dependentes do complemento (Schlesinger et al. , J. Immunology 135:2805-2809, 1985) ou induzindo respostas de células T citotóxicas contra NS3 ou outras proteínas do vírus, é pouco provável que estas respostas anulem a capacidade de uma vacina de vírus vivo estimular anticorpos neutralizantes. Isto é suportado pelos factos de (1) indivíduos que foram anteriormente infectados com o vírus JE responderem a vacinação com YF17D de um modo semelhante ao de pessoas sem infecção prévia com JE e (2) indivíduos que receberam anteriormente a vacina YF17D respondem a nova vacinação com um aumento nos títulos de anticorpos neutralizantes (Sweet et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 11:562-569, 1962). Deste modo, o vector quimérico pode ser utilizado em populações que são imunes à febre amarela devido a uma infecção natural anterior ou vacinação e pode ser utilizado repetidamente, ou para imunizar em simultâneo ou sequencialmente com várias construções diferentes, incluindo quimeras de febre amarela com inserções de, por exemplo, vírus de encefalite japonesa, encefalite de St. Louis ou vírus West Nile.

Para aplicações de vacina, podem-se utilizar adjuvantes conhecidos dos peritos na arte. Os adjuvantes que podem ser utilizados para melhorar a imunogenicidade das vacinas quiméricas incluem, por exemplo, formulações lipossómicas, adjuvantes sintéticos, tais como saponinas (e.g. QS21), dipéptido de muramilo, monofosforil-lípido A ou polifosfazina. Embora estes adjuvantes sejam tipicamente utilizados para aumentar as respostas imunitárias contra vacinas inactivadas, eles também podem ser utilizados com vacinas vivas. No caso de uma vacina quimérica fornecida pela via mucosa, por exemplo, 25 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ oralmente, os adjuvantes mucosos, tais como a toxina de E. coli lábil ao calor (LT) ou derivações mutantes de LT são adjuvantes úteis. Assim, os genes que codificam para citóquinas, tais como GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-13 ou IL-15 podem ser inseridos juntamente com genes de flavivirus heterólogos, para produzir uma vacina que resulte em respostas imunitárias aumentadas, ou para modular a imunidade dirigida mais especificamente contra respostas celulares, humorais ou mucosa.

Outra vantagem do sistema vector de febre amarela é que os flavivirus se replicam no citoplasma de células, de modo que a estratégia de replicação do vírus não envolve a integração do genoma virai na célula hospedeira (Chambers et al. (1990) "Flavivirus Genome Organization, Expression and

Replication" in Annual Review of Microbiology 44:649-688), proporcionando uma medida de segurança importante.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: Acambis, Inc. et al.

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: VACINAS QUIMÉRICAS DE FLAVIVIRUS (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 16

(iv) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA (A) DESTINATÁRIO: Dr. Volker Vossius (B) RUA: Geibelstrasse 6 (C) CIDADE: Munchen (D) ESTADO: Bavaria (E) PAÍS: Alemanha (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 81679 (v) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: DOS (D) SOFTWARE: FastSEQ for Windows versão 2.0 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 02-MAR-98 (C) CLASSIFICAÇÃO: 26 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 08/807445 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 28-FEV-1997 (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 09/007664 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 15-JAN-98 (ix) DADOS DE PEDIDO EQUIVALENTE: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 98910103.5 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 02-MAR-98 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1: CACTGGGAGA GCTTGAAGGT C 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: 25 21

AAAGCCAGTT GCAGCCGCGG TTTAA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3:

AAGGTAGACT GGTGGGCTCC C 27 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4: 26 21

oatcctcagt accmccsco crrTAA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5:

AAGGTAGATT GGTGTGCATT G (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6: AACCCTCAGT ACCACCCQCG GTTTAA 26 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 28 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7: AÂGOTGAÁTT GAAGTGCTCT A 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8: ACCCCCAGCA CCACCCGCGG ΤΓΤΆΑ 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9: AAAAGGAACA GTTGTTCTCT A 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10: ACCCGAAGTG TCAACCGCGG ΤΤΤΆΑ 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 29 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:11: AACGTGAATA GTTGGATAGT C 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12: 25 ACCGTTGGTC GCACCCGCGG ΤΤ7ΑΑ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:13: AATTTCGAAA GGTGGÃAG-GT C 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:14: 2β

GACCCGTGTT TACAGCCGCG GTTTAA 30 ΕΡ 1 625 852/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:15: TACTGCGAAC GACGTTGCCA C 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 16

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:16: ACTGGGAACC, TCACCCGCGG TTTAA 25

Lisboa, 2010-08-20

Claims (13)

1. ΕΡ 1 625 852/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Composição de vacina compreendendo um virus atenuado, infeccioso, vivo, quimérico, compreendendo: um virus da febre amarela em que a sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína prM-E está eliminada, truncada ou mutada de modo que não é expressa uma proteína prM-E do vírus da febre amarela funcional e, integrada no genoma do referido vírus da febre amarela, uma sequência de nucleótidos que codifica para uma proteína prM-E de um segundo flavivírus diferente, de modo que a referida proteína prM-E do referido segundo flavivírus é expressa, em que é mantida a sequência de sinal na junção C/prM do referido vírus da febre amarela.
2. 2. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de nucleótidos que codifica para a proteína prM-E do referido segundo flavivírus diferente, substitui a sequência de nucleótidos que codifica para a proteína prM-E do referido vírus da febre amarela.
3. 3. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o referido vírus da febre amarela é a estirpe YF17D.
4. 4. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o referido segundo flavivírus é um vírus de encefalite japonesa (JE).
5. 5. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o referido segundo flavivírus é um vírus de dengue.
6. 6. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 5, em que o referido vírus de dengue é seleccionado do grupo constituído por dengue dos tipos 1-4.
7. 7. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o referido segundo flavivírus é seleccionado do grupo constituído por um vírus de encefalite do Murray Valley, um vírus de encefalite de St. Louis, um ΕΡ 1 625 852/ΡΤ 2/2 vírus West Nile, um vírus de encefalite transmitida por carraças, um vírus de hepatite C, um vírus Kunjin, um vírus de encefalite da Europa Central, um vírus de encefalite de Primavera-Verão russa, um vírus de Powassan, um vírus da doença da floresta de Kyasanur e um vírus de febre hemorrágica de Omsk.
8. 8. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a referida sequência de nucleótidos que codifica para a referida proteína prM-E do referido segundo flavivírus diferente, compreende uma mutação que impede a clivagem de prM para produzir a proteína M.
9. 9. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que as sequências de sinal nas junções C/prM e E/NS1 do referido vírus da febre amarela são mantidas na construção do referido flavivírus quimérico.
10. 10. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 que é formulada na forma de uma solução aquosa estéril contendo entre 100 e 1 000 000 unidades infecciosas do vírus quimérico num volume de dose de 0,1 a 1,0 ml.
11. 11. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 que é formulada para administração pela via intramuscular, subcutânea, intradérmica ou mucosa.
12. 12. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 que é formulada para administração oral.
13. 13. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 que compreende adicionalmente um adjuvante. Lisboa, 2010-08-20