JP2006506092A - ウエストナイルウイルス・ワクチン - Google Patents
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Abstract
本発明は、ウエストナイルウイルスに対するキメラ・フラビウイルス・ワクチン、およびこれらのワクチンをウエストナイルウイルス感染を予防または治療するために用いる方法を提供する。
Description
ウエストナイルウイルス・ワクチン
本発明は、ウエストナイルウイルスに対するワクチンに関する。
本発明は、ウエストナイルウイルスに対するワクチンに関する。
発明の背景
北半球における最初の発見以来、ウエストナイル（WN）ウイルスは、北アメリカ中に急速に広がり続けている。最初の症例は、1999年にニューヨーク地域において診断されたが、2002年までには死亡数が増大して150症例を越え、ウイルスの拡散は続いてカリフォルニアにまで達した。感染／死亡した鳥類の出現から、発生の地理的地域において、感染した蚊の大きなプールが存在することが示唆される。現在まで、ウエストナイルウイルスに対する効果的な薬物療法は存在せず、調査と予防（surveillance and prevention）の方法は、ヒト感染の症例の件数に顕著には影響を与えていない。従って、ウイルスが南アメリカ大陸に拡散する危険も、低開発国における病気の流行の危険も、極めて高い。
北半球における最初の発見以来、ウエストナイル（WN）ウイルスは、北アメリカ中に急速に広がり続けている。最初の症例は、1999年にニューヨーク地域において診断されたが、2002年までには死亡数が増大して150症例を越え、ウイルスの拡散は続いてカリフォルニアにまで達した。感染／死亡した鳥類の出現から、発生の地理的地域において、感染した蚊の大きなプールが存在することが示唆される。現在まで、ウエストナイルウイルスに対する効果的な薬物療法は存在せず、調査と予防（surveillance and prevention）の方法は、ヒト感染の症例の件数に顕著には影響を与えていない。従って、ウイルスが南アメリカ大陸に拡散する危険も、低開発国における病気の流行の危険も、極めて高い。
ウエストナイルウイルスは、フラビウイルス科の一員である。これらのウイルスは、世界中の多くの医学的および獣医学的環境において関心を持たれている、小型の、エンベロープに包まれた、プラス鎖RNAウイルスである。ウエストナイルウイルスの他に、フラビウイルスの例として、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、およびデングウイルスが挙げられる。
フラビウイルスのタンパク質は、ポリタンパク質を産生する単一の長いオープンリーディングフレームの翻訳によって産生され、それが宿主およびウイルスのプロテアーゼの組合せによって複雑な一連の翻訳後タンパク質分解切断を受けて、成熟したウイルスタンパク質を産生する（Ambergら、 J. Virol. 73: 8083-8094, 1999； Rice、「フラボウイルス科」In Virology, Fields編, Raven-Lippincott, New York, 1995, I巻, p.937）。ウイルス構造タンパク質は、ポリタンパク質においてC-prM-Eの順番に配置されているが、そこでは「C」がキャプシド、「prM」（つまり「プレメンブラン（pre-membrane）」）がウイルス・エンベロープ結合M（膜）タンパク質の前駆体、「E」がエンベロープ・タンパク質である。これらのタンパク質は、ポリタンパク質のN末端領域中に存在し、一方で非構造タンパク質（NS1、 NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、およびNS5）は、ポリタンパク質のC末端領域中に位置する。
発明の概要
本発明は、ウエストナイルウイルスのプレメンブランおよびエンベロープ・タンパク質、ならびに黄熱病ウイルスのキャプシドおよび非構造タンパク質をコードする配列を含む核酸分子を提供する。これらのキメラのウエストナイルウイルス・プレメンブランまたはエンベロープ・タンパク質には、一つまたは複数の弱毒化変異が含まれ、それは、例えばエンベロープ・タンパク質の第107、316、および／または440位のアミノ酸置換であり得る。特定の例として、第107位のアミノ酸置換は、ロイシンからフェニルアラニン（またはその同類アミノ酸）であり得、第316位のアミノ酸置換は、アラニンからバリン（またはその同類アミノ酸）であり得、また、第440位のアミノ酸置換は、リジンからアルギニン（またはその同類アミノ酸）であり得る。
本発明は、ウエストナイルウイルスのプレメンブランおよびエンベロープ・タンパク質、ならびに黄熱病ウイルスのキャプシドおよび非構造タンパク質をコードする配列を含む核酸分子を提供する。これらのキメラのウエストナイルウイルス・プレメンブランまたはエンベロープ・タンパク質には、一つまたは複数の弱毒化変異が含まれ、それは、例えばエンベロープ・タンパク質の第107、316、および／または440位のアミノ酸置換であり得る。特定の例として、第107位のアミノ酸置換は、ロイシンからフェニルアラニン（またはその同類アミノ酸）であり得、第316位のアミノ酸置換は、アラニンからバリン（またはその同類アミノ酸）であり得、また、第440位のアミノ酸置換は、リジンからアルギニン（またはその同類アミノ酸）であり得る。
本発明は、本明細書に記載されている核酸分子によってコードされるキメラ・フラビウイルス、およびそのようなキメラ・フラビウイルスの投与によって対象においてウエストナイルウイルスへの免疫反応を誘発する方法をもまた含む。さらに本発明は、ワクチン接種法におけるそのようなキメラ・フラビウイルスの使用、およびそのような方法における使用のための薬剤を調製するための方法におけるそれらの使用を含む。本明細書に記載されている方法は、ウエストナイルウイルス感染は有しないが、それを患う危険がある対象において、およびウエストナイルウイルスに感染している対象において、実施することができる。本発明は、本明細書に記載されているキメラ・フラビウイルスを作製する方法をもまた提供する。
本発明は、いくつかの優位性を提供する。例えば、下記でより詳細に議論されているように、本発明のウイルスの弱毒化変異によって、神経毒性の低下がもたらされるが、にもかかわらず、効果的な免疫反応を誘発するウイルスの能力には悪影響が及ばない。従って、本発明のウイルスは、ウエストナイルウイルス感染を予防および治療することに対する効果的で安全なアプローチを提供する。
本発明のその他の特徴および優位性は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。
詳細な説明
本発明は、ウエストナイル（WN）ウイルス感染の予防および治療において使用するためのワクチンおよび方法を提供する。本発明の方法には、プレメンブランおよびエンベロープ・タンパク質がウエストナイルウイルスのそれらと置換されている黄熱病ウイルスからなる生の弱毒化したキメラ・フラビウイルスによる、対象のワクチン接種が含まれる。本発明のキメラのウエストナイルウイルス・タンパク質には、下記にさらに説明されるように、一つまたは複数の弱毒化変異が含まれる。
本発明は、ウエストナイル（WN）ウイルス感染の予防および治療において使用するためのワクチンおよび方法を提供する。本発明の方法には、プレメンブランおよびエンベロープ・タンパク質がウエストナイルウイルスのそれらと置換されている黄熱病ウイルスからなる生の弱毒化したキメラ・フラビウイルスによる、対象のワクチン接種が含まれる。本発明のキメラのウエストナイルウイルス・タンパク質には、下記にさらに説明されるように、一つまたは複数の弱毒化変異が含まれる。
本発明において用いることができる、キメラ・フラビウイルスを構築または投与するための一般的方法は、例えば米国特許出願出願番号第09/007,664号、 第09/121,587号、および第09/452,638号；国際出願PCT/US98/03894 (WO 98/37911) およびPCT/USOO/32821 (WO 01/39802)；ならびに Chambers ら、J. Virol. 73: 3095-3101,1999に詳細に記載されており、それらは各々それらの全体において参照として本明細書に組み入れられる。下記にさらに議論されるように、これらの方法は、挿入したウエストナイルウイルス配列中に一つまたは複数の弱毒化変異を導入するステップを加えることによって、本発明における使用のための変更が加えられている。本発明におけるウイルスを産生するために用いることができる方法は、PCT/US03/01319 (WO 03/060088 A2)にもまた記載されていて、それもまた参照として本明細書に組み入れられる。
本発明のキメラウイルスの一例では、弱毒化変異は、ウエストナイルウイルスのエンベロープ・タンパク質の第107、316、または440位（またはそれらの組み合わせ）の領域中にある。従って変異は、例えば、ウエストナイルウイルスのエンベロープ・タンパク質の102-112、311-321、および／または435-445番目のアミノ酸のうち1つまたは複数の中にある可能性がある。特定の例として、ウエストナイルウイルス株NY99-flamingo 382-99 (GenBankアクセッション番号 AF196835)の配列を参照として用い、第107位のリジンをフェニルアラニンで置換することができ、第316位のアラニンをバリンで置換することができ、および／または第440位のリジンをアルギニンで置換することができる。上記に示したアミノ酸に加え、その他のアミノ酸、例えば上記に示したものからの保存的な交換になるようなアミノ酸、で置換を行うことができる。保存的置換には、一般に以下の群の中での置換が含まれる：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミン；セリンおよびスレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。特定の例において、本発明のキメラには、上記に示した特異的な置換の各々が含まれる。さらに、下記にさらに議論されるように、本発明のキメラウイルスにおいて、その他の残基（例えば、138、176、および／または280番目）を変更することもできる。
本発明のワクチンは、当業者によって容易に求めることができる量において、およびそのような方法を用いることによって、投与することができる。ワクチンは、例えば、キメラウイルスで感染した細胞培養から回収した液体として、投与および処方することができる。生の弱毒化したキメラウイルスは、102〜108、例えば106〜107感染単位（例えばプラーク形成単位（pfu）または組織培養感染用量）を、0.1から1.0mlの投与容量において含む、無菌の水溶液として処方でき、例えば、皮下、筋肉内、または皮内経路によって投与される。加えて、粘膜経路、例えば経口経路、を選択することができる。投与すべきキメラの適切な量の選択は、当業者によって求めることができ、この量は、多数の要素、例えばキメラが投与されるべき対象の大きさおよび身体全体の健康、によって異なり得る。対象には、単回でワクチン接種ができ、または必要に応じて、フォローアップの免疫を行うことができる。
上記に示されているように、ワクチンは、ウエストナイルウイルス感染の危険がある対象に、一次予防薬(primary prophylactic agent)として投与することができる。ワクチンは、感染したウイルスに対する免疫反応を誘発することによって、ウエストナイルウイルスに感染した対象を治療するための二次的作用薬（secondary agent）としてもまた用いることができる。また、必須ではないにしても、キメラ・ウエストナイルウイルス・ワクチンの免疫原性を増強するために、アジュバントを用いることができる。適切なアジュバントの選択は、当業者が容易に行うことができる。
本発明は、部分的に、以下の実験結果に基づいている。
実験結果
ウエストナイル／黄熱病キメラワクチンの安全特性を増大させるために、本発明者らは、エンベロープ・タンパク質における弱毒化点変異が神経毒性を減じるのかどうかを検討した。下記に詳細に説明されているように、発明者らは、ウエストナイルウイルスのマウス神経侵襲性を欠き、マウスおよびサルの両方のモデルにおいて黄熱病ワクチン株YF17Dより神経毒性がより少ない、YF/WNキメラを構築した。以下は、エンベロープ・タンパク質突然変異誘発の説明、および本ウイルスおよび関連ウイルスのマウスおよびアカゲザルモデルにおける安全性、免疫原性、および有効性の評価である。
ウエストナイル／黄熱病キメラワクチンの安全特性を増大させるために、本発明者らは、エンベロープ・タンパク質における弱毒化点変異が神経毒性を減じるのかどうかを検討した。下記に詳細に説明されているように、発明者らは、ウエストナイルウイルスのマウス神経侵襲性を欠き、マウスおよびサルの両方のモデルにおいて黄熱病ワクチン株YF17Dより神経毒性がより少ない、YF/WNキメラを構築した。以下は、エンベロープ・タンパク質突然変異誘発の説明、および本ウイルスおよび関連ウイルスのマウスおよびアカゲザルモデルにおける安全性、免疫原性、および有効性の評価である。
材料および方法
YF/WNキメラ構築物および分子的手順
キメラ・フラビウイルスは、既に記載されたツー・プラスミド・システム(two-plasmid system)の使用を伴うChimeriVax（商標）技術を用いて構築した（例えば、米国特許出願出願番号第09/007,664号、第 09/121,587号、および 第09/452,638号；国際出願 PCT/US98/03894 (WO 98/37911)および PCT/US00/32821 (WO 01/39802) ; および Chambersら、 J. Virol. 73: 3095-3101, 1999を参照のこと）。ツー・プラスミド・システムは、E. coli におけるプラスミドの安定性、およびクローン化された黄熱病（YF）のバックボーンを操作するのに適した方法を提供し、YF prMおよびE遺伝子の、標的フラビウイルスのそれらとの置換を容易にする。 使用したウエストナイル（WN）ウイルスprMおよびE遺伝子は、WNV flamingo分離株383-99、配列のGenBank アクセッション番号 AF196835、からクローン化した。ウイルスprME cDNA は、 RT-PCR（XL-PCR Kit、Perkin Elmer）によって得た。WN prM遺伝子の5'末端は、Pwo polymerase（Roche）を用いた重複伸長PCRによって、YF 17Dキャプシド遺伝子の3'末端に正確にクローン化した。このクローン化ステップは、YFキャプシド遺伝子の3'末端にコードされている切断／プロセシング・シグナルの整合性を維持する。E遺伝子の3'末端も、重複伸長PCRによって、YF NS1コード配列の5'末端に正確にクローン化した。YF 17DバックボーンへのウエストナイルウイルスのprME領域のクローン化におけるこの two-plasmidシステムの使用については、既に記載されている（Arroyoら、 Trends in Molecular Medicine 7 (8): 350-354, 2001）。 prMおよびEの配列中にサイレント変異を導入し、ユニーク制限酵素部位、Bsp EIおよび Eag Iを作製した。これらの酵素によるその2つのプラスミドの消化によって、DNA断片が産生され、それをゲル精製し、インビトロで連結して、完全長キメラcDNAを産生した。cDNAはXhoIによって直線化し、SP6 ポリメラーゼ（Epicentre）によるインビトロ転写を行われやすくした。RNA産物はウイルスRNAの翻訳およびウイルスの複製に許容性な真核生物細胞株に導入した。
YF/WNキメラ構築物および分子的手順
キメラ・フラビウイルスは、既に記載されたツー・プラスミド・システム(two-plasmid system)の使用を伴うChimeriVax（商標）技術を用いて構築した（例えば、米国特許出願出願番号第09/007,664号、第 09/121,587号、および 第09/452,638号；国際出願 PCT/US98/03894 (WO 98/37911)および PCT/US00/32821 (WO 01/39802) ; および Chambersら、 J. Virol. 73: 3095-3101, 1999を参照のこと）。ツー・プラスミド・システムは、E. coli におけるプラスミドの安定性、およびクローン化された黄熱病（YF）のバックボーンを操作するのに適した方法を提供し、YF prMおよびE遺伝子の、標的フラビウイルスのそれらとの置換を容易にする。 使用したウエストナイル（WN）ウイルスprMおよびE遺伝子は、WNV flamingo分離株383-99、配列のGenBank アクセッション番号 AF196835、からクローン化した。ウイルスprME cDNA は、 RT-PCR（XL-PCR Kit、Perkin Elmer）によって得た。WN prM遺伝子の5'末端は、Pwo polymerase（Roche）を用いた重複伸長PCRによって、YF 17Dキャプシド遺伝子の3'末端に正確にクローン化した。このクローン化ステップは、YFキャプシド遺伝子の3'末端にコードされている切断／プロセシング・シグナルの整合性を維持する。E遺伝子の3'末端も、重複伸長PCRによって、YF NS1コード配列の5'末端に正確にクローン化した。YF 17DバックボーンへのウエストナイルウイルスのprME領域のクローン化におけるこの two-plasmidシステムの使用については、既に記載されている（Arroyoら、 Trends in Molecular Medicine 7 (8): 350-354, 2001）。 prMおよびEの配列中にサイレント変異を導入し、ユニーク制限酵素部位、Bsp EIおよび Eag Iを作製した。これらの酵素によるその2つのプラスミドの消化によって、DNA断片が産生され、それをゲル精製し、インビトロで連結して、完全長キメラcDNAを産生した。cDNAはXhoIによって直線化し、SP6 ポリメラーゼ（Epicentre）によるインビトロ転写を行われやすくした。RNA産物はウイルスRNAの翻訳およびウイルスの複製に許容性な真核生物細胞株に導入した。
様々なE遺伝子コドンに点変異を導入して、野生型WN prMEをコードする、オリジナルなキメラの変異体を作製した。表1は、変異標的部位、および以下に記載されているYF/WNキメラを作り出すために使用したオリゴヌクレオチド配列を示す。部位変異は、結果としてもたらされたウイルスのエンベロープ・タンパク質（prME領域）の配列決定により確認した。配列決定のためのウイルスcDNA テンプレートは、ウイルス上清から抽出(Trizol LS, Invitrogen)したRNAに由来し、続けてRT-PCR（XL-PCRキット、Perkin Elmer）、ならびに合成プライマー（Invitrogen）およびCEQ 2000シーケンサ（Beckman）を用いて配列決定を行った。
ウイルスおよび細胞株
キメラYF/WN（すなわち、ChimeriVax（商標）-West Nile）ウイルスは、Vero E6細胞株（ATCC、CIDVR UMASS Medical Center Worcester、マサチューセッツ州）へのRNAトランスフェクション（1回継代ウイルス、P1）によって調製した。研究用マスターシード（RMS）は、Vero E6細胞における追加的な増幅（MOI 0.001で2回かまたは3回継代）によって調製した。Vero E6細胞は、MEM（Invitrogen）、10％ FBS（Hyclone）中で維持した。ワクチンを製造するためのプレ・マスターシード（PMS）の調製は、無血清Vero（SF-Vero）細胞株（ATCC、Baxter/Immuno Orth、オーストリア）へのRNAトランスフェクションにより開始し、続いて同じSF-Vero細胞株において増幅継代を行い、P2 PMSすなわちプレ・マスターシード(preMaster Seed)を作製した。SF-Vero細胞株は、無血清、無蛋白の培地配合のVT培地（Baxter/Immuno、オーストリア）中で増殖および維持した。使用した野生型WNウイルスは、マスターウイルス・バンクを作製するためのVero E6細胞における2回の追加的継代の状態で、CDC、Fort Collins、コロラド州より入手したNY-99株（NY99-35262-11 flamingo分離株）（CDC ストックの呼称はB82332W）である。YF 17Dは市販のワクチン（YF-VAX（商標）、Aventis Pasteur、Swiftwater、ペンシルバニア州）で、凍結乾燥製品の再構成の後、またはVero E6細胞（ATCC、 Acambis Inc.、 Cambridge、マサチューセッツ州）における1回継代の後、ここで用いた。
キメラYF/WN（すなわち、ChimeriVax（商標）-West Nile）ウイルスは、Vero E6細胞株（ATCC、CIDVR UMASS Medical Center Worcester、マサチューセッツ州）へのRNAトランスフェクション（1回継代ウイルス、P1）によって調製した。研究用マスターシード（RMS）は、Vero E6細胞における追加的な増幅（MOI 0.001で2回かまたは3回継代）によって調製した。Vero E6細胞は、MEM（Invitrogen）、10％ FBS（Hyclone）中で維持した。ワクチンを製造するためのプレ・マスターシード（PMS）の調製は、無血清Vero（SF-Vero）細胞株（ATCC、Baxter/Immuno Orth、オーストリア）へのRNAトランスフェクションにより開始し、続いて同じSF-Vero細胞株において増幅継代を行い、P2 PMSすなわちプレ・マスターシード(preMaster Seed)を作製した。SF-Vero細胞株は、無血清、無蛋白の培地配合のVT培地（Baxter/Immuno、オーストリア）中で増殖および維持した。使用した野生型WNウイルスは、マスターウイルス・バンクを作製するためのVero E6細胞における2回の追加的継代の状態で、CDC、Fort Collins、コロラド州より入手したNY-99株（NY99-35262-11 flamingo分離株）（CDC ストックの呼称はB82332W）である。YF 17Dは市販のワクチン（YF-VAX（商標）、Aventis Pasteur、Swiftwater、ペンシルバニア州）で、凍結乾燥製品の再構成の後、またはVero E6細胞（ATCC、 Acambis Inc.、 Cambridge、マサチューセッツ州）における1回継代の後、ここで用いた。
成熟および乳のみマウスにおけるマウス神経侵襲性および神経毒性；免疫原性および攻撃力価検出法（接種手順、プラーク検定、PRNT）
マウスには、神経侵襲性試験のため、または野生型WNウイルスによる攻撃(challenge)の間、腹膜内（IP）接種をした。IP接種容量は100〜200μlで、25Gシリンジにより投与した。成熟および乳のみマウスは、神経毒性試験のために、脳内接種（IC）をした。20μlの接種容量をIC投与のために用い、脳の前頭葉の右側に投与した。ウイルスは、別途指摘のある場合を除き、HEPES緩衝液（Invitrogen）および20％FBS（Hyclone）を含むM199に希釈した。ウイルス接種の力価を検証するため、Vero細胞におけるプラーク検定を行った（Monath ら、J. Virol. 74(4):1742-1751, 2000）。
マウスには、神経侵襲性試験のため、または野生型WNウイルスによる攻撃(challenge)の間、腹膜内（IP）接種をした。IP接種容量は100〜200μlで、25Gシリンジにより投与した。成熟および乳のみマウスは、神経毒性試験のために、脳内接種（IC）をした。20μlの接種容量をIC投与のために用い、脳の前頭葉の右側に投与した。ウイルスは、別途指摘のある場合を除き、HEPES緩衝液（Invitrogen）および20％FBS（Hyclone）を含むM199に希釈した。ウイルス接種の力価を検証するため、Vero細胞におけるプラーク検定を行った（Monath ら、J. Virol. 74(4):1742-1751, 2000）。
ウエストナイルウイルスの攻撃後、神経侵襲性、神経毒性、または生存について判定するため、マウスを21日間にわたって観察をした。罹病率および死亡率を観察／記録し、生存動物は安楽死させた。
中和抗体価を求めるため、マウスを後眼窩経路により出血させ、血清を遠心分離法により分離した。血清中の中和抗体の力価を測定するために、プラーク減少中和検定（PRNT）を用いた。
アカゲザル神経毒性調査
WHOガイドラインに記載されているような、アカゲザルにおいて黄熱病（YF）ワクチンの神経毒性を求める試験を用いて、YF/WNキメラの安全性を求めた（Monathら、J. Virol. 74(4): 1742-1751, 2000）。動物にIC接種をしてから、血液試料を毎日取得し、プラーク検定技術を用いてウイルス血症レベルを測定した。動物は、例えば発熱または振戦のような、疾病に関連した症状の徴候を毎日観察した。動物を感染後30日で安楽死させ、次に脳および脊髄組織を組織病理のために取り除いた。WHOにより定義されたシステムに従って神経病理の記録をし、その価を、YF 17D標準ワクチンにおけるそれらとの比較において解析した。
WHOガイドラインに記載されているような、アカゲザルにおいて黄熱病（YF）ワクチンの神経毒性を求める試験を用いて、YF/WNキメラの安全性を求めた（Monathら、J. Virol. 74(4): 1742-1751, 2000）。動物にIC接種をしてから、血液試料を毎日取得し、プラーク検定技術を用いてウイルス血症レベルを測定した。動物は、例えば発熱または振戦のような、疾病に関連した症状の徴候を毎日観察した。動物を感染後30日で安楽死させ、次に脳および脊髄組織を組織病理のために取り除いた。WHOにより定義されたシステムに従って神経病理の記録をし、その価を、YF 17D標準ワクチンにおけるそれらとの比較において解析した。
アカゲザルの免疫原性および攻撃
アカゲザルは、名目上4 log10 PFUを含む単回の0.5ml用量のワクチンの皮下投与によってワクチン接種した。ウイルス血症は、0〜10日目に毎日採取した血清試料を用い、Vero細胞における希釈血清のプラーク検定によって測定した（Monathら、J. Virol. 74(4): 1742-1751, 2000）。中和抗体レベルは、プラーク減少中和力価検定（plaque reduction neutralization titer assays）（PRNT）によって測定した（Monathら、J. Virol. 74(4): 1742-1751, 2000）。動物を、ワクチン接種後64日で、野生型WNウイルスNY99によって攻撃(challenge)した。
アカゲザルは、名目上4 log10 PFUを含む単回の0.5ml用量のワクチンの皮下投与によってワクチン接種した。ウイルス血症は、0〜10日目に毎日採取した血清試料を用い、Vero細胞における希釈血清のプラーク検定によって測定した（Monathら、J. Virol. 74(4): 1742-1751, 2000）。中和抗体レベルは、プラーク減少中和力価検定（plaque reduction neutralization titer assays）（PRNT）によって測定した（Monathら、J. Virol. 74(4): 1742-1751, 2000）。動物を、ワクチン接種後64日で、野生型WNウイルスNY99によって攻撃(challenge)した。
遺伝子安定性（インビトロおよびインビボ継代）および配列決定
Eタンパク質中に弱毒化変異を持たないYF/WN野生型（すなわち、ChimeriVax（商標）-WN01）構築物をVero E6細胞において6回継代し、続けて乳のみマウスにおいてIC経路により6回継代した。Eタンパク質中に3つの弱毒化変異が導入されたYF/WNFVR（すなわち、ChimeriVax（商標）-WN02）のプレ・マスターシードおよび研究用マスターシード構築物を、無血清、無蛋白のSF-Vero細胞培地において、それぞれ12および10回継代した。全ての継代は、初回のMOI 0.01に続く第3日目の回収で行い、ウイルス力価を測定するために、滴定なしに継続した。各々の継代で用いたウイルス力価は、その後プラーク検定によって計算した。継代されたウイルスの神経毒性を、IC接種した成熟および乳のみマウスによって測定した。ウイルスRNAは次に配列決定を行った。
Eタンパク質中に弱毒化変異を持たないYF/WN野生型（すなわち、ChimeriVax（商標）-WN01）構築物をVero E6細胞において6回継代し、続けて乳のみマウスにおいてIC経路により6回継代した。Eタンパク質中に3つの弱毒化変異が導入されたYF/WNFVR（すなわち、ChimeriVax（商標）-WN02）のプレ・マスターシードおよび研究用マスターシード構築物を、無血清、無蛋白のSF-Vero細胞培地において、それぞれ12および10回継代した。全ての継代は、初回のMOI 0.01に続く第3日目の回収で行い、ウイルス力価を測定するために、滴定なしに継続した。各々の継代で用いたウイルス力価は、その後プラーク検定によって計算した。継代されたウイルスの神経毒性を、IC接種した成熟および乳のみマウスによって測定した。ウイルスRNAは次に配列決定を行った。
結果
YF 17D（YF-VAX（登録商標））と比べたYF/WN野生型の毒性表現型
最初のウエストナイルウイルス・キメラは、WN NY99野生型株（すなわち、YF/WN野生型またはChimeriVax（商標）-WN01）のエンベロープおよびプレメンブラン・タンパク質遺伝子をコードしていた。このキメラウイルスは、106 pfu用量でのIP接種後、ICRマウスにおいて脳炎を生じさせる能力を欠いている（表2）。脳炎は、麻痺および死につながる運動行動の変化を毎日観察することにより評価した。成熟マウスにおける神経侵襲性を欠くYF/WN野生型は、他のグループでYF 17Dワクチンを接種したマウスにおいて観察されている（Rymanら、Virology 230(2): 376-380, 1997）。対照的に、WN NY99野生株ウイルスは、IP経路でわずか1〜4 pfuを接種したとき、マウスに致死的であった（Beasleyら、Virology 296: 17-23, 2002）。YF/WN野生型のIC LD50は、ここでは103〜105 pfuと概算された。YF/WN野生型の神経毒性表現型はYF 17Dウイルスのそれより低く、後者ではICRマウスIC LD50が101〜102 pfuである。しかしながら、YF/WN野生型ウイルスは、21日齢マウスにおいて明らかなエンドポイントを示さなかった（表3）。
YF 17D（YF-VAX（登録商標））と比べたYF/WN野生型の毒性表現型
最初のウエストナイルウイルス・キメラは、WN NY99野生型株（すなわち、YF/WN野生型またはChimeriVax（商標）-WN01）のエンベロープおよびプレメンブラン・タンパク質遺伝子をコードしていた。このキメラウイルスは、106 pfu用量でのIP接種後、ICRマウスにおいて脳炎を生じさせる能力を欠いている（表2）。脳炎は、麻痺および死につながる運動行動の変化を毎日観察することにより評価した。成熟マウスにおける神経侵襲性を欠くYF/WN野生型は、他のグループでYF 17Dワクチンを接種したマウスにおいて観察されている（Rymanら、Virology 230(2): 376-380, 1997）。対照的に、WN NY99野生株ウイルスは、IP経路でわずか1〜4 pfuを接種したとき、マウスに致死的であった（Beasleyら、Virology 296: 17-23, 2002）。YF/WN野生型のIC LD50は、ここでは103〜105 pfuと概算された。YF/WN野生型の神経毒性表現型はYF 17Dウイルスのそれより低く、後者ではICRマウスIC LD50が101〜102 pfuである。しかしながら、YF/WN野生型ウイルスは、21日齢マウスにおいて明らかなエンドポイントを示さなかった（表3）。
多部位変異誘発アプローチ
エンベロープ・タンパク質におけるアミノ酸を改変し、これらの改変がYF/WNキメラの毒性を減ずるかどうかを決定した。毒性の変化は、マウスモデルにおいて評価し、オリジナルのキメラであるYF/WN野生型の神経毒性と比較した。YF/WN野生型エンベロープ（E）遺伝子の第107、138、176、および280位に位置づけられるアミノ酸残基は、全て単一の構築物において、それぞれアミノ酸残基F、K、V、Mをコードするように変異させた。新しいキメラウイルスは、YF/WNFKVMとされた。次に、FKVM群のうちの各々のアミノ酸残基が単一に変異を受けたキメラを構築し、神経毒性におけるその個々の役割を評価した（表4）。加えて、アミノ酸残基316および440における変異を、それらの領域に位置づけられたEタンパク質の変異がEタンパク質の3番目のドメインの生物学に作用する可能性があることを示唆する以前のデータに基づき、各々VおよびRに変異させた（Reyら、 Nature 375 (6529): 291-298, 1995 ; Allisonら、J. Virol. 75(9): 4268-4275, 2001）。Eタンパク質中に改変されたアミノ酸を有するキメラの神経毒性についての発明者らの知見は、残基107、316および440が、WNウイルスの神経毒性の原因になっている最も重要なアミノ酸であることを示唆した。この情報に基づき、多部位YF/WNFVR構築物を構築し、発明者らのワクチン候補として選び出した。全ての多部位キメラは、無血清SF Vero細胞において107 pfu/mLの力価まで増殖させた。
エンベロープ・タンパク質におけるアミノ酸を改変し、これらの改変がYF/WNキメラの毒性を減ずるかどうかを決定した。毒性の変化は、マウスモデルにおいて評価し、オリジナルのキメラであるYF/WN野生型の神経毒性と比較した。YF/WN野生型エンベロープ（E）遺伝子の第107、138、176、および280位に位置づけられるアミノ酸残基は、全て単一の構築物において、それぞれアミノ酸残基F、K、V、Mをコードするように変異させた。新しいキメラウイルスは、YF/WNFKVMとされた。次に、FKVM群のうちの各々のアミノ酸残基が単一に変異を受けたキメラを構築し、神経毒性におけるその個々の役割を評価した（表4）。加えて、アミノ酸残基316および440における変異を、それらの領域に位置づけられたEタンパク質の変異がEタンパク質の3番目のドメインの生物学に作用する可能性があることを示唆する以前のデータに基づき、各々VおよびRに変異させた（Reyら、 Nature 375 (6529): 291-298, 1995 ; Allisonら、J. Virol. 75(9): 4268-4275, 2001）。Eタンパク質中に改変されたアミノ酸を有するキメラの神経毒性についての発明者らの知見は、残基107、316および440が、WNウイルスの神経毒性の原因になっている最も重要なアミノ酸であることを示唆した。この情報に基づき、多部位YF/WNFVR構築物を構築し、発明者らのワクチン候補として選び出した。全ての多部位キメラは、無血清SF Vero細胞において107 pfu/mLの力価まで増殖させた。
マウスおよびアカゲザルにおける神経毒性調査
YF/WN野生型のエンベロープ・タンパク質遺伝子中に単一または多部位変異を有するウイルスのマウス神経毒性を、104〜105 pfuのウイルス用量をIC経路によって接種した21日齢マウスにおいて測定した。この評価によって、残基107および280（表4）ならびに316/440の組み合わせ（表5）が、マウスの致死率および相対的平均生存時間（AST）による測定で、より優性の弱毒化変異として同定された。発明者らのワクチン候補として選択された、それぞれ残基107、316、および440におけるF、V、およびR変異の組み合わせを有するキメラは、成熟マウスにおいて無毒性であった（表6）。しかしながら、ヒトに安全なChimeriVax（商標）-JEワクチン（Monath ら、Vaccine 20: 1004-1018, 2002）と同様に、2日齢の乳のみマウスにおいて多少の神経毒性が観察された。
YF/WN野生型のエンベロープ・タンパク質遺伝子中に単一または多部位変異を有するウイルスのマウス神経毒性を、104〜105 pfuのウイルス用量をIC経路によって接種した21日齢マウスにおいて測定した。この評価によって、残基107および280（表4）ならびに316/440の組み合わせ（表5）が、マウスの致死率および相対的平均生存時間（AST）による測定で、より優性の弱毒化変異として同定された。発明者らのワクチン候補として選択された、それぞれ残基107、316、および440におけるF、V、およびR変異の組み合わせを有するキメラは、成熟マウスにおいて無毒性であった（表6）。しかしながら、ヒトに安全なChimeriVax（商標）-JEワクチン（Monath ら、Vaccine 20: 1004-1018, 2002）と同様に、2日齢の乳のみマウスにおいて多少の神経毒性が観察された。
ウエストナイル・キメラのアカゲザル神経毒性表現型は、YF/WN野生型構築物で測定し、YF 17Dワクチンのそれと比較した。アカゲザルは、YF/WN野生型をIC経路によって接種し、YF 17Dワクチン接種のものと比較した。キメラは、YF 17Dワクチンと同様なウイルス血症力価および持続時間を生じた。このウイルスが、YFワクチンより多く神経毒性であるということはなく、YF/WNキメラがYF 17Dワクチン同様に安全であることが示された。
マウスおよびアカゲザルにおける免疫原性調査
発明者らは、YF/WN野生型キメラ、およびエンベロープ残基107、316、440に変異を有するYF/WNFVR構築物の免疫原性を比較した。マウスは、2〜5 log10 pfuの範囲のワクチン用量で、皮下（SC）経路により接種をした。血清は、免疫化後4週間で回収し、中和抗体の滴定をした。図1のデータは、YF/WN野生型構築物の部位標的弱毒化により、より低い免疫原性のウイルスが生じることを示す。免疫化マウスの野生型WN NY99ウイルスによる腹膜内攻撃によって、構築物についてワクチンの効力対有効性の関係が明らかにされた。YF/WNキメラのうち何れかの105 pfu/ml用量で免疫化した全てのマウスは、毒性ウイルス攻撃から防御された。
発明者らは、YF/WN野生型キメラ、およびエンベロープ残基107、316、440に変異を有するYF/WNFVR構築物の免疫原性を比較した。マウスは、2〜5 log10 pfuの範囲のワクチン用量で、皮下（SC）経路により接種をした。血清は、免疫化後4週間で回収し、中和抗体の滴定をした。図1のデータは、YF/WN野生型構築物の部位標的弱毒化により、より低い免疫原性のウイルスが生じることを示す。免疫化マウスの野生型WN NY99ウイルスによる腹膜内攻撃によって、構築物についてワクチンの効力対有効性の関係が明らかにされた。YF/WNキメラのうち何れかの105 pfu/ml用量で免疫化した全てのマウスは、毒性ウイルス攻撃から防御された。
アカゲザルにおいて、1つ、2つ、または3つの弱毒化変異、YF/WN107F、YF/WN316V440RまたはYF/WNFVRを有するワクチン候補の免疫原性は、同等であった。動物に104 pfuのワクチン用量を受けさせたとき、それぞれの抗体価に有意な差は存在しなかった。野生型WN NY99ウイルスによる免疫化後攻撃により求めた有効性調査によって、アカゲザルモデルにおいて試験をしたWNワクチン候補は対照動物と比べて100％有効であることが示された（表7）。
アカゲザルにおけるワクチン接種後ウイルス血症は、YF 17Dワクチンによって誘発されるそれと比べ同じような持続期間であったが、規模は小さく、キメラにおける固有の弱毒化変異の数に対して線形相関を示した（表8）。それにもかかわらず、内臓向性（またはワクチン接種後ウイルス血症）に基づく安全性の評価によって、アカゲザルモデルにおいて試験をしたワクチン候補のうちいかなるものもYF17Dより安全であることが示された。
5.38 log10 pfuのWN NY99による免疫化アカゲザルのIC攻撃の後、検知可能なウイルス血症はもたらされず、またYF/WN構築物によりワクチン接種した動物において、疾患の臨床的症状または死亡は何ら観察されなかった。YF17Dワクチンにおいて、WNV複製による顕著なウイルス血症が検出された。この群において動物で検出されたウイルス血症レベルは、平均log10 pfu力価が2.25±0.62で、平均の持続期間が3.5日であった。これらのウイルス血症レベルは、非ワクチン接種対照群（n=2）において観察されたものと同様であり、平均log10 pfu力価が2.33±0.47であり、4.5日の平均持続期間であった。YF17D をワクチン接種した4匹中2匹のアカゲザルが、WN NY99株によるIC攻撃で生存した。生存動物は食欲を失い、攻撃後の体温上昇を伴う嗜眠の症状を示した。WNV NY99株攻撃後安楽死させた動物は、発熱および振戦を含む症状を呈した。
遺伝的安定性
静置培養で培養した場合の構築物の遺伝的安定性を決定するため、YF/WN野生型またはYF/WNFVRキメラを使ったインビトロおよびインビボ培養基継代調査を行った。YF/WN野生型の、6回のインビトロVero E6細胞継代に続く6回のインビボICR成熟マウス脳継代の後、発明者らは、このキメラのエンベロープ遺伝子（prM、E）領域において、好ましくない変異を何ら見出さなかった。Eタンパク質におけるE336位の、結果としてシステインがセリンになる異型接合変異が、Vero E6細胞におけるYF/WNFVRウイルスの10回インビトロ継代後に確認された。別個の調査において、YF/WNFVRウイルスのSF-Vero細胞のインビトロ継代は、E313位の変異の選択をもたらし、それによってこの位置のアミノ酸がグリシンからアルギニンに代わった。Vero細胞におけるウイルスの全ての連続継代の間、ウイルスの神経毒性に関与する標的残基107F、316V、または440Rにおいて、復帰変異／変異は何ら検出されなかった。
（表１）部位変異誘発に用いたスイッチ・オリゴヌクレオチド
変異弱毒化黄熱病／ウエストナイルウイルスを作製するための部位特異的変異誘発のプライマー。新しいアミノ酸を導入するヌクレオチドの交換は、太字で示されている。導入したサイレント制限酵素部位には下線が引かれている。*（アスタリスク）で示されたプライマーは、断片をサブクローニングするために用いたクローニング・プライマーである。一方はヌクレオチド交換を組み入れるが、他方は組み入れない。
（表２）YF 17Dと比べたYF/WN野生型（ChimeriVax（商標）-West Nile 01）の神経侵襲性、ICRマウスにおける用量反応1
1Harlan-Sprague ICR株3〜4週齢メスマウスを使用した。
2AST=平均生存期間
YF/WN野生型P2とは、Vero細胞における第二世代継代ウイルスを示す。ウエストナイルウイルス株はIP接種後概して神経侵襲性である。
（表３）YF 17Dと比べたYF/WN野生型（ChimeriVax（商標）-West Nile 01）の神経毒性、用量反応（Harlan-Sprague ICR株3〜4週齢メスマウス）
1脳内（IC）に送達された実際の用量は、示されている逆滴定計算のために20μlと仮定された。
（表４）成熟マウス1において試験されたChimeriVax（商標）-WN 01のEタンパク質残基107、138、176、および280における部位特異的変異誘発変異体の神経毒性
1IC接種したマウスは、Taconic ICRの 3〜4週齢メスであった。P2およびP3は、それぞれVero細胞における第二および第三世代ウイルス継代を示す。
（表５）成熟マウス1において試験されたChimeriVax（商標）-WN 01のEタンパク質残基316、および440における部位特異的変異誘発変異体の神経毒性
1IC接種したマウスは、Taconic ICRの3〜4週齢メスであった。3つの独立した実験の結果が示されている。
（表６）YF/WN野生型1と比べた、成熟マウスに対するChimeriVax（商標）-WN 02（YF/WN107F316V440R）の神経毒性
1IC接種したマウスは、Taconic ICR株の3〜4週齢メスであった。
（表７）YF/WN野生型ウイルスに対する逆数中和抗体価（PRNT50）。アカゲザルは、記されているようなYF 17DまたはYF/WNワクチン候補で皮下経路による接種を行った。
a GMT、幾何平均力価；そこでは終末点を求めず、計算において検定限界力価を用いた（例えば、>640を640とし、<40を40とした）；b NT=試験を行っていない；c 動物は、ウエストナイルウイルス感染関連症状の発症後安楽死させた。
（表８）ワクチン後ウイルス血症（log10 pfu）；アカゲザルは、記されているとおりのYF 17DまたはYF/WNワクチン候補で皮下経路による接種を行った。
*0日（接種前）の検定においてウイルスは何も検出されなかった。
a検定下限値
静置培養で培養した場合の構築物の遺伝的安定性を決定するため、YF/WN野生型またはYF/WNFVRキメラを使ったインビトロおよびインビボ培養基継代調査を行った。YF/WN野生型の、6回のインビトロVero E6細胞継代に続く6回のインビボICR成熟マウス脳継代の後、発明者らは、このキメラのエンベロープ遺伝子（prM、E）領域において、好ましくない変異を何ら見出さなかった。Eタンパク質におけるE336位の、結果としてシステインがセリンになる異型接合変異が、Vero E6細胞におけるYF/WNFVRウイルスの10回インビトロ継代後に確認された。別個の調査において、YF/WNFVRウイルスのSF-Vero細胞のインビトロ継代は、E313位の変異の選択をもたらし、それによってこの位置のアミノ酸がグリシンからアルギニンに代わった。Vero細胞におけるウイルスの全ての連続継代の間、ウイルスの神経毒性に関与する標的残基107F、316V、または440Rにおいて、復帰変異／変異は何ら検出されなかった。
（表１）部位変異誘発に用いたスイッチ・オリゴヌクレオチド
（表２）YF 17Dと比べたYF/WN野生型（ChimeriVax（商標）-West Nile 01）の神経侵襲性、ICRマウスにおける用量反応1
2AST=平均生存期間
YF/WN野生型P2とは、Vero細胞における第二世代継代ウイルスを示す。ウエストナイルウイルス株はIP接種後概して神経侵襲性である。
（表３）YF 17Dと比べたYF/WN野生型（ChimeriVax（商標）-West Nile 01）の神経毒性、用量反応（Harlan-Sprague ICR株3〜4週齢メスマウス）
（表４）成熟マウス1において試験されたChimeriVax（商標）-WN 01のEタンパク質残基107、138、176、および280における部位特異的変異誘発変異体の神経毒性
（表５）成熟マウス1において試験されたChimeriVax（商標）-WN 01のEタンパク質残基316、および440における部位特異的変異誘発変異体の神経毒性
（表６）YF/WN野生型1と比べた、成熟マウスに対するChimeriVax（商標）-WN 02（YF/WN107F316V440R）の神経毒性
（表７）YF/WN野生型ウイルスに対する逆数中和抗体価（PRNT50）。アカゲザルは、記されているようなYF 17DまたはYF/WNワクチン候補で皮下経路による接種を行った。
（表８）ワクチン後ウイルス血症（log10 pfu）；アカゲザルは、記されているとおりのYF 17DまたはYF/WNワクチン候補で皮下経路による接種を行った。
a検定下限値
Claims (14)
- ウエストナイルウイルスのプレメンブランおよびエンベロープ・タンパク質、ならびに黄熱病ウイルスのキャプシドおよび非構造タンパク質をコードする配列を含む核酸分子であって、該プレメンブランまたはエンベロープ・タンパク質が弱毒化変異を含む核酸分子。
- 弱毒化変異が、エンベロープ・タンパク質の第107、316、および440位からなる群から選択される位置におけるアミノ酸置換を含む、請求項1に記載の核酸分子。
- アミノ酸置換が第107位にある、請求項2に記載の核酸分子。
- アミノ酸置換が第316位および第440位にある、請求項2に記載の核酸分子。
- アミノ酸置換が第107、316および440位アミノ酸にある、請求項2に記載の核酸分子。
- 第107位のアミノ酸置換がロイシンからフェニルアラニンもしくはその同類アミノ酸である、請求項2に記載の核酸分子。
- 第316位のアミノ酸置換がアラニンからバリンもしくはその同類アミノ酸である、請求項2に記載の核酸分子。
- 第440位のアミノ酸置換がリジンからアルギニンもしくはその同類アミノ酸である、請求項2に記載の核酸分子。
- 請求項1に記載の核酸分子によりコードされているキメラ・フラビウイルス。
- 対象においてウエストナイルウイルスへの免疫反応を誘発する方法であって、該方法が請求項9に記載のキメラ・フラビウイルスを対象に投与する段階を含む方法。
- 対象が、ウエストナイルウイルス感染は有しないが、それを患う危険にある、請求項10に記載の方法。
- 対象がウエストナイルウイルスに感染している、請求項10に記載の方法。
- 細胞に請求項1に記載の核酸分子を導入する段階を含む、キメラ・フラビウイルス・ワクチンを作製する方法。
- ウエストナイルウイルスに対するワクチン接種における、請求項9に記載のキメラ・フラビウイルスの使用。
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