PL246798B1

PL246798B1 - Sposób wytwarzania 2-metylo-4-O-β-D-(4’-O-metyloglukopiranozylo)- kwasu benzoesowego

Info

Publication number: PL246798B1
Application number: PL438638A
Authority: PL
Inventors: Agnieszka Krawczyk-Łebek; Edyta Kostrzewa-Susłow; Monika Dymarska; Tomasz Janeczko
Original assignee: Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Priority date: 2021-07-30
Filing date: 2021-07-30
Publication date: 2025-03-10
Also published as: PL438638A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest 2-metylo-4-O-β-D-(4'-O-metyloglukopiranozylo)-kwas benzoesowy o wzorze 2. Zgłoszenie obejmuje także sposób wytwarzania 2-metylo-4-O-β-D-(4'-O-metyloglukopiranozylo)-kwasu benzoesowego charakteryzuje się tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 2'-metyloflawanon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 2-metylo-4-O-β-D-(4'-O-metyloglukopiranozylo)-kwas benzoesowy o wzorze 2 znajduje się we frakcji o dużej polarności, w piątym paśmie od linii startu.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 2-metylo-4-O-β-β-(4’-O-metyloglukopiranozylo)-kwasu benzoesowego.

Wynalazek może znaleźć zastosowanie do wytwarzania związku konserwującego w preparatach farmaceutycznych i kosmetycznych oraz produktach spożywczych.

Wiele naturalnych związków chemicznych występuje w postaci zmetylowanej lub glikozylowanej, o poprawionej stabilności, rozpuszczalności w wodzie i aktywności. Metylacja i glikozylacja są powszechne wśród związków flawonoidowych, a obecność grupy metylowej powoduje ogromną poprawę ich właściwości biologicznych takich jak aktywność przeciwdrobnoustrojowa czy przeciwutleniająca (Brito-Arias. M. Synthesis and Characterization of Glycosides. Springer 2007; M., Koirala, N.; Thuan, N.H.; Ghimire, G.P.; Thang, D.V.; Sohng, J.K. Methylation of flavonoids: Chemical structures, bioactivities, progress and perspectives for biotechnological production. Enzyme and Microbial Technology 2016, 86, 103-116).

Kwas benzoesowy został dopuszczony jako substancja dodatkowa w żywności zgodnie z Rozporządzeniem Ministra Zdrowia z dnia 18.09.2008 r., a Rozporządzenie Komisji UE nr 231/2012 ustanawia jego specyfikację jako dodatku w żywności. Znajduje się również w wykazie substancji uniemożliwiających rozwój i przetrwanie mikroorganizmów w czasie przechowywania produktu, dozwolonych w produktach kosmetycznych (załącznik V do Rozporządzenia Parlamentu i Rady (WE) nr 1223/2009.

Pochodna kwasu benzoesowego będąca przedmiotem wynalazku, dzięki przyłączonej grupie metylowej i 4’-O-metyloglukozie, wykazuje potencjał do zastosowania jako konserwant o poprawionej rozpuszczalności oraz zwiększonej aktywności przeciwdrobnoustrojowej.

Znany jest szczep Isaria fumosorosea KCH J2 ujawniony w zgłoszeniu patentowym o numerze P.416996.

W ostatnich latach, w leczeniu różnych chorób i ich zapobieganiu, coraz większe znaczenie zyskują związki pochodzenia naturalnego oraz ich odpowiedniki uznawane za naturalne, które uzyskano na drodze przekształceń mikrobiologicznych. Dlatego istotne jest opracowywanie nowych metod wytwarzania związków aktywnych biologicznie na drodze biotransformacji, użytecznych dla przemysłu farmaceutycznego, kosmetycznego i spożywczego.

W dostępnej literaturze brak jest informacji na temat otrzymywania 2-metylo-4-O -fi-D-(4'-O-metyloglukopiranozylo)-kwasu benzoesowego.

Istota sposobu według wynalazku polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2. Po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 2'-metyloflawanon, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, przez co najmniej 96 godzin. Następnie produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą oraz oczyszcza chromatograficznie. 2-metylo-4-O -e-D-(4'-O -metyloglukopiranozylo)-kwas benzoesowy znajduje się we frakcji o dużej polarności, w piątym paśmie od linii startu.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg:1 cm³.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 9 dni.

Korzystnie również jest, gdy oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię preparatywną w układzie eluującym z chloroformem i metanolem w stosunku objętościowym 9:1.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Isaria fumosorosea KCH J2, następuje rozszczepienie pierścienia C układu flawanonu oraz hydroksylacja i przyłączenie 4-metoksy-e-D-glukozy przy C-4 w nowopowstałej cząsteczce kwasu o-metylobenzoesowego.

Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 2-metylo-4-O-fi-D-(4'-O-metyloglukopiranozylo)kwasu benzoesowego w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu oraz wykorzystując mikroorganizm niebędący patogenem ludzkim.

PL 246798 BI

Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umożliwia, w sposób przyjazny dla środowiska, uzyskanie związków o większej biodostępności i aktywności biologicznej, niż użyte substraty. Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

Przykład. Do kolby stożkowej o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 10 g aminobaku i 30 g glukozy, wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 50 mg 2’-metyloflawanonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³dimetylosulfotlenku. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 9 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się dwukrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie z zastosowaniem jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku objętościowym 9:1. Produkt znajduje się we frakcji o dużej polarności, w piątym paśmie od linii startu.

Na tej drodze otrzymuje się 4,7 mg 2-metylo-4-O-/?-D-(4’-O-metyloglukopiranozylo)-kwasu benzoesowego (wydajność 6,8%). Stopień konwersji substratu według HPLC >99%.

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi.

Opis sygnałów pochodzących z widma ¹H NMR (601 MHz, Aceton-ds).

Sygnały pochodzące od protonów szkieletu flawonoidowego	Sygnały pochodzące od protonów jednostki cukrowej
δ [ppm]	J[Hz]	H	δ [ppm]	J[Hz]	H
6,86 (d)	9,0	3	4,86(d)	7,8	1’
7,29 (dd)	9,0; 3,0	5	3,45 (tt)	5,3; 3,6	2’
7,62 (d)	2,9	6	3,61 (m)		3’
2,65 (s)		2-CH3	3,15 (m)		4’
11,92 (s)		COOH	3,50 (ddd)	9,6; 5,7; 1,7	5’
			3,87 (m) 3,68 (m)		6’
			3,55 (s)		C4’-OCH3
			4,64 (d)	3,6	C2-OH
			4,41 (d)	4,0	C3-OH

Claims

1. Sposób wytwarzania 2-metylo-4-O-/?-D-(4’-O-metyloglukopiranozylo)-kwasu benzoesowego, znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCH J2, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 2’-metyloflawanon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 2-metylo-4-O-/?-D-(4’-O-metyloglukopiranozylo)-kwas benzoesowy o wzorze 2 znajduje się we frakcji o dużej polarności, w piątym paśmie od linii startu.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg:1 cm³.

PL 246798 BI

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 9 dni.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię preparatywną w układzie eluującym chloroform : metanol w stosunku objętościowym 9:1.