PL239847B1

PL239847B1 - 2’-Chloro-7-O-β-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon i sposób wytwarzania 2’-chloro-7-O-β-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)- flawonu

Info

Publication number: PL239847B1
Application number: PL431175A
Authority: PL
Inventors: Agnieszka Krawczyk-Łebek; Edyta Kostrzewa-Susłow; Edyta Kostrzewasusłow; Monika Dymarska; Tomasz Janeczko
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2019-09-16
Filing date: 2019-09-16
Publication date: 2022-01-17
Also published as: PL431175A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest związek o nazwie 2'-chloro-7-O-ß-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2. Zgłoszenie obejmuje także sposób wytwarzania 2'-chloro-7-O-ß-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu charakteryzujący się tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCH J1.5, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 2'-chloroflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 2'-chloro-7-O-ß-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2 znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w trzecim paśmie od linii startu.

Description

PL 239 847 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest 2’-chloro-7-O-β-D-(4-O -metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2 przedstawionym na rysunku.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania 2’-chloro-7-O-β-D-(4”-O -metyloglukopiranozylo)-flawonu.

2’-chloro-7-O-β-D-(4”- O-metyloglukopiranozylo)-flawon może znaleźć zastosowanie jako związek przeciwutleniający i przeciwzapalny w preparatach farmaceutycznych i kosmetycznych oraz produktach spożywczych.

Neutrofile w trakcie procesu zapalnego produkują kwas chlorowy(l) w odpowiedzi immunologicznej na czynniki uznane za patogenne. Jego nadprodukcja może wywoływać oksydację/chlorowanie tkanek w miejscu zapalenia i je uszkadzać. Badania in vitro wykazały, że flawonoidy unieszkodliwiają kwas chlorowy(l) same ulegając mono- i dichlorowaniu. Niektóre powstające w ten sposób chlorowane flawonoidy zachowują, a nawet wzmacniają swój potencjał przeciwutleniający. Zsyntezowane chlorowane flawonoidy takie jak: 8-chloro-3',4’,5,7-tetrahydroksyflawon, 6,8-dichloro-3’,4’,5,7-tetrahydroksyflawon, 3-chloro-3',4’,5,7-tetrahydroksy-flawon, 3,8-dichloro-3',4',5,7-tetrahydroksyflawon, a także chlorowane naturalne flawonoidy: luteolina, rutyna i kwercetyna (po chlorowaniu kwasem chlorowym(l)) są bardziej efektywne w regulacji żywotności neutrofili i uwalniania przez nie reaktywnych form tlenu, niż ich niechlorowane odpowiedniki (Krych-Madej, J.; Stawowska, K.; Gębicka, L. Oxidation of flavonoids by hypochlorous acid: reaction kinetics and antioxidant studies. Free Radical Research, 2016, 50(8), 898-908, Freitas, M.; Ribeiro, D.; Tome, S. M.; Silva, A. M. S.; Fernandes, E. Synthesis of chlorinated flavonoids with anti-inflammatory and proapoptotic acitivities in human neutrophils. European Journal of Medicinal Chemistry, 2014, 86, 153-164).

Podobnie 6-chloro-3',4',5,7-tetrahydroksyflawon zmniejsza produkcję reaktywnych form tlenu, nawet w warunkach hipertermicznych, a także moduluje produkcję cytokin: IL-1e, IL-6, TNF oraz chemokiny IL-8 (Proenęa, C.; Ribeiro, D.; Soares, T.; Tome, S. M.; Silva, A. M. S.; Lima, J. L. F. C.; Fernandes, E.; Freitas, M. Chlorinated flavonoids modulate the inflammatory process in human blood. Inflammation, 2017, 40(4), 1155-1165).

Chloroflawonina - naturalny chlorowany związek flawonoidowy izolowany z endofitycznych grzybów strzępkowych z gatunku Mucor irregularis wykazuje silną aktywność bakteriostatyczną in vitro przeciwko Mycobaterium tuberculosis. Nie powoduje przy tym efektu cytotoksycznego w stężeniu do 100 μM na ludzkich liniach komórkowych: MRC-5 (linia komórek fibroblastów pochodząca z tkanki płuc męskiego zarodka ludzkiego) i THP-1 (linia komórek monocytarno-makrofagowych pochodzących od człowieka chorego na ostrą białaczkę monocytową) (Rehberg, N.; Akone, H. S.; loerger, T. R.; Erlenkamp, G.; Daletos, G.; Gohlke, H.; Proksch, P.; Kalscheuer, R. Chloroflavonin targets acetohydroxyacid synthase catalytic subunit llvB1 for synergistic killing of Mycobacterium tuberculosis. ACS Infectious Diseases. 2017, 4(2), 123-134).

Większość flawonoidów, poza katechinami, jest obecna w roślinach w połączeniu z cukrami, jako β-glikozydy. Glikozylacja skutkuje: wzrostem rozpuszczalności w wodzie i stabilności cząsteczki flawonoidu oraz przyswaja Iności przyjmowanych z pokarmem związków flawonoidowych. Zasadniczo glukozydy są jedynymi glikozydami, które mogą być absorbowane w jelicie cienkim. Natomiast flawonoidy niezaabsorbowane w jelicie cienkim oraz zaabsorbowane flawonoidy wydzielone z żółcią ulegają degradacji wraz z rozerwaniem struktury pierścieniowej przez mikroorganizmy (Hollman, P. C. Absorption, bioavailability, and metabolism of flavonoids. Pharmaceutical Biology, 2004, 42, 74-83, Plaza, M.; Pozzo, T; Liu, J.; Gulshan Ara, K. Z.; Turner, C.; Nordberg Karlsson, E. Substituent effects on in vitro antioxidizing properties, stability, and solubility in flavonoids. Journal of Agricultural Food Chemistry, 2014, 62, 3321-3333).

Hollman I in., wykazali, że cząsteczka glukozy przyłączona w pozycji 3 kwercetyny (3,3’,4’,5,7-pentahydroksyflawon) zwiększa absorpcję tego związku w jelicie cienkim do 52%, w porównaniu z 24% absorpcją aglikonu kwercetyny i 17% rutynozydu kwercetyny (Hollman, P. C.; Bijsman, M. N. C. P.; van Gameren, Y; Cnossen, E. P. J.; de Vries, J. H.; Katan, M. B. The sugar moiety is a major determinant of the absorption of dietary flavonoid glycosides in man. Free Radical Research, 1999, 31, 569-573).

Znany jest szczep Beauveria bassiana KCH J1.5 ujawniony w literaturze (Kozłowska E., Urbaniak M., Hoc N., Grzeszczuk J., Dymarska M., Stępień Ł., Pląskowska E., Kostrzewa-Susłow E., Janeczko T. Cascade biotransformation of dehydroepiandrosterone (DHEA) by Beauveria species. Scientific Reports, 2018, 8:13449).

PL 239 847 B1

W ostatnich latach, w leczeniu różnych chorób i ich zapobieganiu, coraz większe znaczenie zyskują związki pochodzenia naturalnego oraz ich odpowiedniki uznawane za naturalne, które uzyskano na drodze przekształceń mikrobiologicznych. Dlatego istotne jest opracowywanie nowych metod wytwarzania związków aktywnych biologicznie na drodze biotransformacji, użytecznych dla przemysłu farmaceutycznego, kosmetycznego i spożywczego.

W dostępnej literaturze brak jest informacji na temat otrzymywania 2’-chloro-7-O-^-D-(4”-O -metyloglukopiranozylo)-flawonu.

Istotą wynalazku jest 2’-chloro-7-O-βΌ-(4”-O -metyloglukopiranozylo)-flawon.

Istota sposobu polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCH J1.5. Po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 2’-chloroflawon, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, przez co najmniej 96 godzin. Następnie produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą oraz oczyszcza chromatograficznie. 2'-Chloro-7-O-e-D-(4”-O -metyloglukopiranozylo)-flawon znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w trzecim paśmie od linii startu.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg : 1 cm³.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 10 dni.

Korzystnie również jest, gdy oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię preparatywną w układzie eluującym z chloroformem i metanolem w stosunku objętościowym 9 : 1.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Beauveria bassiana KCH J1.5, następuje hydroksylacja i przyłączenie 4-metoksy-eD-glukozy przy C-7. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 2'-chloro-7-O-e-D-(4-O -metyloglukopiranozylo)flawonu w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu oraz wykorzystując mikroorganizm niebędący patogenem ludzkim.

Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umożliwia, w sposób przyjazny dla środowiska, uzyskanie związków o większej biodostępności i aktywności biologicznej, niż użyte substraty.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

P r z y k ł a d

Do kolby stożkowej o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 10 g aminobaku i 30 g glukozy, wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCH J1.5. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 50 mg 2’-chloroflawonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ tetrahydrofuranu. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 10 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się dwukrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie z zastosowaniem jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku objętościowym 9 : 1. Produkt znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w trzecim paśmie od linii startu.

Na tej drodze otrzymuje się 8,8 mg 2’-chloro-7-O-e-D-(4”-O -metyloglukopiranozylo)-flawonu (wydajność 10%). Stopień konwersji substratu według HPLC >99%.

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi.

Claims

PL 239 847 BI

Opis sygnałów pochodzących z widma ¹H NMR (601 MHz, Aceton-de)

Sygnały pochodzące od szkieletu flawonoidowego Sygnały pochodzące od jednostki cukrowej δ [ppm] J [Hz] H δ [ppm] J [Hz] H

6,54 (s) 3 5,13 (d) 7,8 1”

7,77 (d) 8,6 5 3,52 (t) 8.2’ 2”

7,22 (dd) 8,6; 2,4 6 3,67 (m) 3

7,31 (d) 2,5 8 3,24 (m) 4”

7,62 (d) 7,6 3’ 3,59 (d) 5,0; 2,1 5”

7,82 (ddd) 8,7; 7,1; 1,7 4’ 3,87 (d) 3,71 (dd) 11,8 10,9; 3,7 6”

7,51 (ddd) 8,0; 7,3; 1,0 5’ 3,57 (s) C4”- OCH₃

8,14 (dd) 8,0; 1,7 6’

Zastrzeżenia patentowe

1. 2’-Chloro-7-O-/?-D-(4-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2.
2. Sposób wytwarzania 2’-chloro-7-O-/?-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu, znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCH J1.5, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 2’-chloroflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 2’-chloro-7-O-/?-D-(4”-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2 znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w trzecim paśmie od linii startu.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg : 1 cm³.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 10 dni.
6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię preparatywną w układzie eluującym chloroform : metanol w stosunku objętościowym 9:1.