PL239847B1

PL239847B1 - 2'-Chloro-7-O-β-D-(4"-O-methylglucopyranosyl)-flavone and method of producing 2'-chloro-7-O-β-D-(4"-O-methylglucopyranosyl)-flavone

Info

Publication number: PL239847B1
Application number: PL431175A
Authority: PL
Inventors: Agnieszka Krawczyk-Łebek; Edyta Kostrzewa-Susłow; Edyta Kostrzewasusłow; Monika Dymarska; Tomasz Janeczko
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2019-09-16
Filing date: 2019-09-16
Publication date: 2022-01-17
Also published as: PL431175A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest związek o nazwie 2'-chloro-7-O-ß-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2. Zgłoszenie obejmuje także sposób wytwarzania 2'-chloro-7-O-ß-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-flawonu charakteryzujący się tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCH J1.5, następnie po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 2'-chloroflawon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 2'-chloro-7-O-ß-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2 znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w trzecim paśmie od linii startu.The subject of the application is a compound called 2'-chloro-7-O-ß-D-(4"-O-methylglucopyranosyl)-flavone of formula 2. The application also includes a method for producing 2'-chloro-7-O-ß-D -(4"-O-methylglucopyranosyl)-flavone, characterized by the introduction of the Beauveria bassiana KCH J1.5 strain into a medium suitable for filamentous fungi, then after at least 72 hours, the substrate, which is 2'- chloroflavone of formula 1, dissolved in an organic solvent miscible with water, the transformation is carried out at a temperature of 20 to 30 degrees Celsius, with constant shaking, for at least 96 hours, after which the product is extracted with an organic solvent immiscible with water and purified by chromatography, wherein 2'-chloro-7-O-ß-D-(4"-O-methylglucopyranosyl)-flavone of formula 2 is located in the fraction of intermediate polarity, in the third band from the starting line.

Description

PL 239 847 B1PL 239 847 B1

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest 2’-chloro-7-O-β-D-(4-O -metyloglukopiranozylo)-flawon o wzorze 2 przedstawionym na rysunku.The present invention relates to 2'-chloro-7-O-β-D- (4-O-methylglucopyranosyl) -flavone of the formula 2 shown in the drawing.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania 2’-chloro-7-O-β-D-(4”-O -metyloglukopiranozylo)-flawonu.The invention also relates to a process for the preparation of 2'-chloro-7-O-β-D- (4 "-O-methylglucopyranosyl) -flavone.

2’-chloro-7-O-β-D-(4”- O-metyloglukopiranozylo)-flawon może znaleźć zastosowanie jako związek przeciwutleniający i przeciwzapalny w preparatach farmaceutycznych i kosmetycznych oraz produktach spożywczych.2'-chloro-7-O-β-D- (4 "- O-methylglucopyranosyl) -flavone can be used as an antioxidant and anti-inflammatory compound in pharmaceutical and cosmetic preparations and food products.

Neutrofile w trakcie procesu zapalnego produkują kwas chlorowy(l) w odpowiedzi immunologicznej na czynniki uznane za patogenne. Jego nadprodukcja może wywoływać oksydację/chlorowanie tkanek w miejscu zapalenia i je uszkadzać. Badania in vitro wykazały, że flawonoidy unieszkodliwiają kwas chlorowy(l) same ulegając mono- i dichlorowaniu. Niektóre powstające w ten sposób chlorowane flawonoidy zachowują, a nawet wzmacniają swój potencjał przeciwutleniający. Zsyntezowane chlorowane flawonoidy takie jak: 8-chloro-3',4’,5,7-tetrahydroksyflawon, 6,8-dichloro-3’,4’,5,7-tetrahydroksyflawon, 3-chloro-3',4’,5,7-tetrahydroksy-flawon, 3,8-dichloro-3',4',5,7-tetrahydroksyflawon, a także chlorowane naturalne flawonoidy: luteolina, rutyna i kwercetyna (po chlorowaniu kwasem chlorowym(l)) są bardziej efektywne w regulacji żywotności neutrofili i uwalniania przez nie reaktywnych form tlenu, niż ich niechlorowane odpowiedniki (Krych-Madej, J.; Stawowska, K.; Gębicka, L. Oxidation of flavonoids by hypochlorous acid: reaction kinetics and antioxidant studies. Free Radical Research, 2016, 50(8), 898-908, Freitas, M.; Ribeiro, D.; Tome, S. M.; Silva, A. M. S.; Fernandes, E. Synthesis of chlorinated flavonoids with anti-inflammatory and proapoptotic acitivities in human neutrophils. European Journal of Medicinal Chemistry, 2014, 86, 153-164).During the inflammatory process, neutrophils produce chloric (I) acid in an immune response to pathogenic factors. Its overproduction may cause oxidation / chlorination of tissues at the site of inflammation and damage them. In vitro studies have shown that the flavonoids render chloric acid harmless by being mono- and dichlorinated by themselves. Some of the resulting chlorinated flavonoids retain and even enhance their antioxidant potential. Synthesized chlorinated flavonoids such as: 8-chloro-3 ', 4', 5,7-tetrahydroxy flavone, 6,8-dichloro-3 ', 4', 5,7-tetrahydroxy flavonoids, 3-chloro-3 ', 4', 5,7-tetrahydroxy-flavone, 3,8-dichloro-3 ', 4', 5,7-tetrahydroxy flavone, as well as chlorinated natural flavonoids: luteolin, rutin and quercetin (after chlorination with chloric acid (l)) are more effective in regulating the viability of neutrophils and their release of reactive oxygen species than their non-chlorinated counterparts (Krych-Madej, J .; Stawowska, K .; Gębicka, L. Oxidation of flavonoids by hypochlorous acid: reaction kinetics and antioxidant studies. Free Radical Research, 2016 , 50 (8), 898-908, Freitas, M .; Ribeiro, D .; Tome, S. M .; Silva, A. M. S .; Fernandes, E. Synthesis of chlorinated flavonoids with anti-inflammatory and proapoptotic acitivities in human neutrophils. European Journal of Medicinal Chemistry, 2014, 86, 153-164).

Podobnie 6-chloro-3',4',5,7-tetrahydroksyflawon zmniejsza produkcję reaktywnych form tlenu, nawet w warunkach hipertermicznych, a także moduluje produkcję cytokin: IL-1e, IL-6, TNF oraz chemokiny IL-8 (Proenęa, C.; Ribeiro, D.; Soares, T.; Tome, S. M.; Silva, A. M. S.; Lima, J. L. F. C.; Fernandes, E.; Freitas, M. Chlorinated flavonoids modulate the inflammatory process in human blood. Inflammation, 2017, 40(4), 1155-1165).Similarly, 6-chloro-3 ', 4', 5,7-tetrahydroxy flavone reduces the production of reactive oxygen species, even under hyperthermic conditions, and also modulates the production of cytokines: IL-1e, IL-6, TNF and the chemokine IL-8 (Proenaa, C .; Ribeiro, D .; Soares, T .; Tome, S. M .; Silva, A. M. S .; Lima, J. L. F. C .; Fernandes, E .; Freitas, M. Chlorinated flavonoids modulate the inflammatory process in human blood. Inflammation, 2017, 40 ( 4), 1155-1165).

Chloroflawonina - naturalny chlorowany związek flawonoidowy izolowany z endofitycznych grzybów strzępkowych z gatunku Mucor irregularis wykazuje silną aktywność bakteriostatyczną in vitro przeciwko Mycobaterium tuberculosis. Nie powoduje przy tym efektu cytotoksycznego w stężeniu do 100 μM na ludzkich liniach komórkowych: MRC-5 (linia komórek fibroblastów pochodząca z tkanki płuc męskiego zarodka ludzkiego) i THP-1 (linia komórek monocytarno-makrofagowych pochodzących od człowieka chorego na ostrą białaczkę monocytową) (Rehberg, N.; Akone, H. S.; loerger, T. R.; Erlenkamp, G.; Daletos, G.; Gohlke, H.; Proksch, P.; Kalscheuer, R. Chloroflavonin targets acetohydroxyacid synthase catalytic subunit llvB1 for synergistic killing of Mycobacterium tuberculosis. ACS Infectious Diseases. 2017, 4(2), 123-134).Chloroflavonin - a natural chlorinated flavonoid compound isolated from endophytic filamentous fungi of the species Mucor irregularis shows strong bacteriostatic activity in vitro against Mycobaterium tuberculosis. At the same time, it does not cause a cytotoxic effect at a concentration of up to 100 μM on human cell lines: MRC-5 (fibroblast cell line derived from human human embryo lung tissue) and THP-1 (monocytic-macrophage cell line derived from a human patient with acute monocytic leukemia) (Rehberg, N .; Akone, H. S .; loerger, T. R .; Erlenkamp, G .; Daletos, G .; Gohlke, H .; Proksch, P .; Kalscheuer, R. Chloroflavonin targets acetohydroxyacid synthase catalytic subunit llvB1 for synergistic killing of Mycobacterium tuberculosis. ACS Infectious Diseases. 2017, 4 (2), 123-134).

Większość flawonoidów, poza katechinami, jest obecna w roślinach w połączeniu z cukrami, jako β-glikozydy. Glikozylacja skutkuje: wzrostem rozpuszczalności w wodzie i stabilności cząsteczki flawonoidu oraz przyswaja Iności przyjmowanych z pokarmem związków flawonoidowych. Zasadniczo glukozydy są jedynymi glikozydami, które mogą być absorbowane w jelicie cienkim. Natomiast flawonoidy niezaabsorbowane w jelicie cienkim oraz zaabsorbowane flawonoidy wydzielone z żółcią ulegają degradacji wraz z rozerwaniem struktury pierścieniowej przez mikroorganizmy (Hollman, P. C. Absorption, bioavailability, and metabolism of flavonoids. Pharmaceutical Biology, 2004, 42, 74-83, Plaza, M.; Pozzo, T; Liu, J.; Gulshan Ara, K. Z.; Turner, C.; Nordberg Karlsson, E. Substituent effects on in vitro antioxidizing properties, stability, and solubility in flavonoids. Journal of Agricultural Food Chemistry, 2014, 62, 3321-3333).Most of the flavonoids, except catechins, are present in plants in combination with sugars as β-glycosides. Glycosylation results in: an increase in water solubility and stability of the flavonoid molecule and assimilation of other flavonoid compounds taken with food. Basically, glucosides are the only glycosides that can be absorbed in the small intestine. In contrast, flavonoids not absorbed in the small intestine and absorbed flavonoids secreted in bile are degraded as the ring structure is disrupted by microorganisms (Hollman, P. C. Absorption, bioavailability, and metabolism of flavonoids. Pharmaceutical Biology, 2004, 42, 74-83, Plaza, M .; Pozzo, T; Liu, J .; Gulshan Ara, K. Z .; Turner, C .; Nordberg Karlsson, E. Substituent effects on in vitro antioxidizing properties, stability, and solubility in flavonoids. Journal of Agricultural Food Chemistry, 2014, 62, 3321 -3333).

Hollman I in., wykazali, że cząsteczka glukozy przyłączona w pozycji 3 kwercetyny (3,3’,4’,5,7-pentahydroksyflawon) zwiększa absorpcję tego związku w jelicie cienkim do 52%, w porównaniu z 24% absorpcją aglikonu kwercetyny i 17% rutynozydu kwercetyny (Hollman, P. C.; Bijsman, M. N. C. P.; van Gameren, Y; Cnossen, E. P. J.; de Vries, J. H.; Katan, M. B. The sugar moiety is a major determinant of the absorption of dietary flavonoid glycosides in man. Free Radical Research, 1999, 31, 569-573).Hollman et al., Showed that a glucose molecule attached at position 3 of quercetin (3,3 ', 4', 5,7-pentahydroxyflavone) increases the absorption of this compound in the small intestine to 52%, compared with 24% absorption of the quercetin aglycone and 17% quercetin rutinoside (Hollman, P. C .; Bijsman, M. N. C. P .; van Gameren, Y; Cnossen, E. P. J .; de Vries, J. H .; Katan, M. B. The sugar moiety is a major determinant of the absorption of dietary flavonoid glycosides in man. Free Radical Research , 1999, 31, 569-573).

Znany jest szczep Beauveria bassiana KCH J1.5 ujawniony w literaturze (Kozłowska E., Urbaniak M., Hoc N., Grzeszczuk J., Dymarska M., Stępień Ł., Pląskowska E., Kostrzewa-Susłow E., Janeczko T. Cascade biotransformation of dehydroepiandrosterone (DHEA) by Beauveria species. Scientific Reports, 2018, 8:13449).The strain of Beauveria bassiana KCH J1.5 disclosed in the literature is known (Kozłowska E., Urbaniak M., Hoc N., Grzeszczuk J., Dymarska M., Stępień Ł., Pląskowska E., Kostrzewa-Susłow E., Janeczko T. Cascade biotransformation of dehydroepiandrosterone (DHEA) by Beauveria species. Scientific Reports, 2018, 8: 13449).

PL 239 847 B1PL 239 847 B1

W ostatnich latach, w leczeniu różnych chorób i ich zapobieganiu, coraz większe znaczenie zyskują związki pochodzenia naturalnego oraz ich odpowiedniki uznawane za naturalne, które uzyskano na drodze przekształceń mikrobiologicznych. Dlatego istotne jest opracowywanie nowych metod wytwarzania związków aktywnych biologicznie na drodze biotransformacji, użytecznych dla przemysłu farmaceutycznego, kosmetycznego i spożywczego.In recent years, in the treatment and prevention of various diseases, compounds of natural origin and their equivalents recognized as natural, obtained through microbiological transformations, have become more and more important. Therefore, it is important to develop new methods of producing biologically active compounds by biotransformation, useful for the pharmaceutical, cosmetic and food industries.

W dostępnej literaturze brak jest informacji na temat otrzymywania 2’-chloro-7-O-^-D-(4”-O -metyloglukopiranozylo)-flawonu.There is no information in the available literature on the preparation of 2'-chloro-7-O - ^ - D- (4 "-O-methylglucopyranosyl) -flavone.

Istotą wynalazku jest 2’-chloro-7-O-βΌ-(4”-O -metyloglukopiranozylo)-flawon.The essence of the invention is 2'-chloro-7-O-βΌ- (4 "-O-methylglucopyranosyl) -flavone.

Istota sposobu polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCH J1.5. Po upływie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 2’-chloroflawon, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, przez co najmniej 96 godzin. Następnie produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą oraz oczyszcza chromatograficznie. 2'-Chloro-7-O-e-D-(4”-O -metyloglukopiranozylo)-flawon znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w trzecim paśmie od linii startu.The essence of the method consists in introducing the Beauveria bassiana KCH J1.5 strain into a medium suitable for filamentous fungi. After at least 72 hours, a substrate, which is 2'-chloroflavone, dissolved in a water-miscible organic solvent, is introduced into the culture. The transformation is carried out at a temperature of 20 to 30 degrees Celsius with continuous shaking for at least 96 hours. The product is then extracted with a water-immiscible organic solvent and purified by chromatography. 2'-Chloro-7-O-e-D- (4 "-O-methylglucopyranosyl) -flavone is found in the intermediate polarity fraction in the third band from the starting line.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg : 1 cm³.Preferably, the ratio of the weight of the substrate added to the culture volume is 0.1 mg: 1 cm ³ .

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.It is also preferred that the process is carried out at a temperature of 25 degrees Celsius.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 10 dni.Additionally, it is preferred that the transformation is carried out for 10 days.

Korzystnie również jest, gdy oczyszczanie prowadzi się wykorzystując cienkowarstwową chromatografię preparatywną w układzie eluującym z chloroformem i metanolem w stosunku objętościowym 9 : 1.It is also preferred that the purification is carried out using preparative thin-layer chromatography in an eluting system with chloroform and methanol in a 9: 1 volume ratio.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Beauveria bassiana KCH J1.5, następuje hydroksylacja i przyłączenie 4-metoksy-eD-glukozy przy C-7. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (octan etylu).In accordance with the invention, as a result of the action of the enzyme system contained in the cells of the strain Beauveria bassiana KCH J1.5, hydroxylation and attachment of 4-methoxy-eD-glucose at C-7 takes place. The product obtained in this way is separated from the aqueous culture of the microorganism by a known method by extraction with a water-immiscible organic solvent (ethyl acetate).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 2'-chloro-7-O-e-D-(4-O -metyloglukopiranozylo)flawonu w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu oraz wykorzystując mikroorganizm niebędący patogenem ludzkim.The main advantage of the invention is the preparation of 2'-chloro-7-O-e-D- (4-O-methylglucopyranosyl) flavone at room temperature and at the pH natural for the strain and using a microorganism that is not a human pathogen.

Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umożliwia, w sposób przyjazny dla środowiska, uzyskanie związków o większej biodostępności i aktywności biologicznej, niż użyte substraty.The use of biotransformation, instead of chemical synthesis, makes it possible, in an environmentally friendly manner, to obtain compounds with greater bioavailability and biological activity than the substrates used.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.The invention is explained in more detail using an exemplary embodiment.

P r z y k ł a dExample

Do kolby stożkowej o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 10 g aminobaku i 30 g glukozy, wprowadza się szczep Beauveria bassiana KCH J1.5. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 50 mg 2’-chloroflawonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ tetrahydrofuranu. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 10 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się dwukrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie z zastosowaniem jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku objętościowym 9 : 1. Produkt znajduje się we frakcji o pośredniej polarności, w trzecim paśmie od linii startu.Beauveria bassiana KCH J1.5 strain is introduced into a 2000 cm ³ conical flask containing 500 cm ³ of a sterile medium containing 10 g of aminobac and 30 g of glucose. After 72 hours of growth, 50 mg of 2'-chloroflavone I, dissolved in 1 cm ³ of tetrahydrofuran, are added. The transformation is carried out at 25 degrees Celsius with continuous shaking for 10 days. Then, the reaction mixture was extracted twice with ethyl acetate, dried with anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was evaporated. The extract obtained is purified by chromatography using a 9: 1 v / v mixture of chloroform and methanol as eluent. The product is in the intermediate polarity fraction in the third band from the starting line.

Na tej drodze otrzymuje się 8,8 mg 2’-chloro-7-O-e-D-(4”-O -metyloglukopiranozylo)-flawonu (wydajność 10%). Stopień konwersji substratu według HPLC >99%.In this way, 8.8 mg of 2'-chloro-7-O-e-D- (4 "-O-methylglucopyranosyl) -flavone (10% yield) are obtained. Substrate conversion by HPLC> 99%.

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi.The obtained product is characterized by the following spectral data.

Claims

PL 239 847 BI

Description of signals from the ^1H NMR spectrum (601 MHz, acetone)

Signals from the flavonoid backbone Signals from the sugar unit δ [ppm] J [Hz] H. δ [ppm] J [Hz] H.

6.54 (s) 3 5.13 (d) 7.8 1 "

7.77 (d) 8.6 5 3.52 (t) 8.2 ' 2 "

7.22 (dd) 8.6; 2.4 6 3.67 (m) 3

7.31 (d) 2.5 8 3.24 (m) 4 "

7.62 (d) 7.6 3 ' 3.59 (d) 5.0; 2.1 5 "

7.82 (ddd) 8.7; 7.1; 1.7 4 ' 3.87 (d) 3.71 (dd) 11.8 10.9; 3.7 6 "

7.51 (ddd) 8.0; 7.3; 1.0 5 '3.57 (s) C4 "- OCH ₃

8.14 (dd) 8.0; 1.7 6 '

Patent claims

1. 2'-Chloro-7-O - /? - D- (4-O-methylglucopyranosyl) -flavone of formula 2.

2. Method for the production of 2'-chloro-7-O - /? - D- (4 "-O-methylglucopyranosyl) -flavone, characterized in that the Beauveria bassiana KCH J1.5 strain is introduced into a medium suitable for filamentous fungi, then after at least 72 hours, the substrate is introduced into the culture, which is 2'-chloroflavone of formula 1, dissolved in a water-miscible organic solvent, the transformation is carried out at a temperature of 20 to 30 degrees Celsius, with continuous shaking, at least 96 hours, then the product is extracted with a water-immiscible organic solvent and purified by chromatography, where the 2'-chloro-7-O - /? - D- (4 "-O-methylglucopyranosyl) -flavone of formula 2 is in the fraction intermediate polarity, in the third band from the starting line.

3. The method according to p. The method of claim 2, wherein the ratio of the weight of the substrate added to the culture volume is 0.1 mg: 1 cm ³ .

4. The method according to p. The process of claim 2, characterized in that the temperature of the process is 25 degrees Celsius.

5. The method according to p. The process of claim 2, characterized in that the transformation is carried out for 10 days.

6. The method according to p. The method of claim 2, wherein the purification is carried out using preparative thin-layer chromatography in a 9: 1 volumetric chloroform: methanol elution system.