PL215285B1 - Wyizolowana, skrócona ssacza urykaza, obejmujacy ja koniugat glikol polietylenowy-urykaza, sposób jej wytwarzania, zawierajaca ja kompozycja farmaceutyczna i jej zastosowanie oraz kodujacy urykaze wyizolowany kwas nukleinowy, jego wektor i obejmujaca go komórka gospodarza - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanej, skróconej ssaczej urykazy, obejmującego ją koniugatu glikol polietylenowy-urykaza, sposobu jej wytwarzania, zawierającej ją kompozycji farmaceutycznej i jej zastosowania oraz kodującego urykazę wyizolowanego kwasu nukleinowego, jego wektora i obejmującej go komórki gospodarza.

Termin oksydaza moczanowa i urykaza są stosowane w niniejszym opisie wymiennie. Oksydazy moczanowe (urykazy E.C. 1.7.3.3) są enzymami, które katalizują utlenianie kwasu moczowego do bardziej rozpuszczalnego produktu, alantoiny, metabolitu puryny, który jest łatwiej wydalany z organizmu. Na skutek kilku mutacji w genie, nabytych w trakcie ewolucji wyższych naczelnych ludzie nie wytwarzają enzymatycznie aktywnej urykazy. (Patrz Wu, X, i wsp., (1992) J Mol Evol 34:78-84, które wlacza sie w całości do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy). W konsekwencji, u wrażliwych osobników, nadmierne steżenia kwasu moczowego we krwi (hiperurykemia) może prowadzić do bolesnego zapalenia stawów (dna), zniekształcających złogów moczanu (guzki dnawe) i niewydolności nerek. Użyteczne do stosowania u niektórych dotkniętych zaburzeniami osobników dostępne leki, takie jak allopurinol (inhibitor syntezy kwasu moczowego), okazują się posiadać istotne ograniczenia takie jak ograniczenie czasu leczenia czy efekty uboczne i nie łagodzą one w odpowiednim stopniu tych stanów. Patrz przykładowo Hande, KR, i wsp., (1984) Am J Med 76:47-56; Fam, AG, (1990) Bailliere's Clin Rheumatol 4:177-192, które włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe. Zastrzyki z urykazy mogą zmniejszyć hiperurykemię i hiperurykozurię co najmniej przejściowo. Ponieważ urykaza jest dla ludzi obcym białkiem, nawet pierwsze wstrzykniecie niezmodyfikowanego białka z Aspergillus flavus indukuje reakcje anafilaktyczne u kilku procent leczonych pacjentów (Pui, C-H, i wsp., (1997) Leukemia 11:1813-1816, które włącza sie w całości do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy) i odpowiedzi immunologiczne ograniczają jej przydatność do leczenia długotrwałego lub przerywanego. Patrz przykładowo Donadio, D, i wsp., (1981) Nouv Presse Med 10:711-712; Leaustic, M, i wsp., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50:553-554, które włacza się w całości do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe.

Suboptymalny charakter dostępnych sposobów leczenia hiperurykemii jest znany od kilku dekad. Patrz przykładowo Kissel, P, i wsp., (1968) Nature 217:72-74, które włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy. Podobnie jest znana specjalistom od wielu lat możliwość, że pewne grupy pacjentów z poważną dną mogą odnieść korzyść z bezpiecznej i skutecznej postaci wstrzykiwanej urykazy. Patrz przykładowo Davis, FF, i wsp., (1978) w GB Broun, i wsp., (Wyd.) Enzyme Engineering, Tom. 4 (str. 169-173) New York, Plenum Press; Nishimura, H, i wsp., (1979) Enzyme 24:261-264; Nishimura, H, i wsp., (1981) Enzyme 26:49-53; Davis, S, i wsp., (1981) Lancet 2(8241):281-283; Abuchowski, A, i wsp., (1981) J Pharmacol Exp Ther 219:352-354; Chen, RH-L, i wsp., (1981) Biochim Biophys Acta 660:293-298; Chua, CC, i wsp., (1988) Ann Int Med 109:114-117; Greenberg, ML, i wsp., (1989) Anal Biochem 176:290-293, które włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe. Urykazy pochodzące z narządów zwierzęcych są prawie nierozpuszczalne w rozpuszczalnikach, które są odpowiednie do bezpiecznego podawania leków na drodze iniekcji. Patrz przykładowo opis patentowy USA nr 3,616,231, który włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy. Niektóre urykazy pochodzące z roślin albo z mikroorganizmów są bardziej rozpuszczalne w dopuszczalnych do zastosowań medycznych rozpuszczalnikach. Jednakże wstrzykiwanie enzymów z mikroorganizmów szybko indukuje odpowiedzi immunologiczne, które mogą prowadzić do zagrażających życiu reakcji alergicznych albo do inaktywacji i/lub przyspieszonego klirensu urykazy z obiegu. Donadio, i wsp., (1981); Leaustic, i wsp., (1983). Enzymy w oparciu o wydedukowane sekwencje aminokwasowe urykaz z ssaków, włączając w to świnie i pawiana, albo z owadów, na przykład Drosophila melanogaster lub Drosophila pseudoobscura (Wallrath, LL, i wsp., (1990) Mol Cell Biol 10:5114-5127, włączone tu w całości jako odniesienie), nie są odpowiednimi kandydatami do zastosowań klinicznych na skutek problemów immunogenności I nierozpuszczalności w fizjologicznym pH.

Uprzednio, badacze zastosowali wstrzykiwaną urykazę do katalizowania przekształcenia kwasu moczowego w alantoinę in vivo. Patrz przykładowo Pui, i wsp., (1997). Jest to podstawą stosowania we Francji i Włoszech dla zapobiegania albo czasowej korekcji hiperurykemii związanej z cytotoksyczną terapią hematologicznych chorób nowotworowych albo przejściowego zmniejszenia poważnej hiperurykemii u pacjentów z dną urykazy z grzyba Aspergillus flavus (Uricozyme®). Patrz przykładowo Potaux, L, i wsp., (1975) Nouv Presse Med 4:1109-1112; Legoux, R, i wsp., (1992) J Biol Chem

PL 215 285 B1

267:8565-8570; patenty USA nr 5,382,518 i 5,541,098, które włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe. Z powodu krótkiego czasu rozpadu w obiegu, Uricozyme® wymaga dokonywania codziennych zastrzyków. Ponadto, nie jest on odpowiedni do stosowania w długotrwałej terapii z powodu immunogenności.

Niektóre urykazy są przydatne do wytwarzania koniugatów z glikolem polietylenowym albo tlenkiem polietylenowym (obydwa określanie jako PEG) do wytwarzania skutecznych terapeutycznie postaci urykazy, mających zwiększony okres półtrwania i zmniejszoną immunogenność. Patrz przykładowo opisy patentowe USA nr 4,179,337, 4,766,106, 4,847,325 i 6,576,235; publikacja zgłoszenia patentowego USA US2003/0082786A1, które włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe. Opisane w stanie techniki zostały także koniugaty urykazy z polimerami innymi niż PEG. Patrz przykładowo opis patentowy USA 4,460,683, który włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy.

W przypadku prawie wszystkich prób PEGylowania urykazy (tj. kowalencyjnego łączenia PEG z urykazą) PEG jest przyłączony przede wszystkim do grup aminowych, włączając w to resztę aminokohcowa i dostępne reszty lizynowe. W stosowanych powszechnie urykazach, całkowita liczba lizyn w każdej z czterech identycznych podjednostek wynosi pomiędzy 25 (Aspergillus flavus (Patent USA nr 5,382,518, włączony tu w całości jako odniesienie)) a 29 (Wu, X, i wsp., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9412-9416, włączone tu w całości jako odniesienie). Niektóre inne lizyny są niedostępne dla PEGylacji przy natywnej konformacji enzymu. Najbardziej powszechnym podejściem do zmniejszania immunogenności urykazy było przyłączanie dużej liczby nici PEG o niskiej masie cząsteczkowej. To niezmiennie prowadzi do ogromnego zmniejszenia aktywności enzymatycznej otrzymanych w rezultacie koniugatów.

Pojedyncze dożylne wstrzyknięcie preparatu urykazy połączonej z PEG 5 kDa zmniejsza obecność kwasu moczowego w surowicy do niewykrywalnych poziomów u osób, u których średnie stężenie kwasu moczowego w surowicy przez zastrzykiem wynosiło 6,2 mg/dl, co jest w normalnym zakresie. Davis, i wsp., (1981). Osobom tym podawano dodatkowe zastrzyki cztery tygodnie później, ale ich odpowiedzi nie były przedstawione. Nie wykrywano przeciwciał wobec urykazy po drugim (ostatnim) zastrzyku, stosując stosunkowo mało czuły test dyfuzji w żelu. W odnośniku tym nie przedstawiono wyników dla leczenia długotrwałego albo przewlekłego pacjentów-ludzi lub zwierząt eksperymentalnych.

Preparat urykazy z Arthrobacter protoformiae połączonej z PEG 5 kDa zastosowano do czasowej kontroli hiperurykemii u jednego pacjenta z chłoniakiem, u którego steżenie kwasu moczowego w surowicy przez zastrzykiem wynosiło 15 mg/dl. Patrz przykładowo Chua, i wsp., (1988). Z powodu krytycznego stanu pacjenta i krótkiego czasu leczenia (cztery zastrzyki w czasie 14 dni) nie jest możliwa ocena długotrwałej skuteczności ani bezpieczeństwa koniugatu.

Zwiększona ochrona przed rozpoznaniem immunologicznym jest możliwa poprzez modyfikowanie każdej podjednostki urykazy 2-10 nićmi PEG o wysokiej masie cząsteczkowej (>5 kD - 120 kD) Saifer, i wsp. (Patent USA nr 6,576,235; (1994) Adv Exp Med Biol 366:377-387, każdy włączony tu w całości jako odniesienie. Ta strategia umożliwia zatrzymanie >75% aktywności enzymatycznej urykazy z różnych gatunków po PEGylacji, zwiększony czas trwania w obiegu i umożliwia powtarzane wstrzyknięcia enzymu bez wzbudzania przeciwciał u myszy i królików.

Hershfield i Kelly (międzynarodowa publikacja WO 00/08196; zgłoszenie patentowe USA nr 60/095,489, które włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe) opracowali sposoby dostarczania białek rekombinowanych urykaz z różnych gatunków ssaków z optymalnymi liczbami miejsc PEGylacji. Zastosowali oni techniki PCR dla zwiększenia liczby dostępnych reszt lizynowych w wybranych miejscach enzymu, co miałoby służyć zmniejszaniu rozpoznawania przez układ immunologiczny, po następującej po tym PEGylacji, zachowując jednocześnie aktywność enzymu rozkładania kwasu moczowego. Niektóre ich białka urykaz są skrócone na końcu karboksylowym i/lub aminowym. Nie dostarczają one wskazań innych genetycznie indukowanych zmian białek.

W niniejszym zgłoszeniu, termin „immunogenność dotyczy indukcji odpowiedzi immunologicznej przez wstrzyknięty preparat zmodyfikowanej przez PEG albo niezmodyfikowanej urykazy (antygenu), podczas gdy „antygenowość dotyczy reakcji antygenu z istniejącymi wcześniej - przeciwciałami. We wcześniejszych badaniach nad PEG-urykazą, immunoreaktywncść badano rozmaitymi metodami, właczając w to: 1) reakcję in vitro PEG-urykazy z wytworzonymi uprzednio przeciwciałami; 2) pomiary indukowanej syntezy przeciwciał; i 3) przyspieszonego tempa klirensu po powtarzanych zastrzykach.

PL 215 285 B1

Wcześniejsze próby eliminacji immunogenności urykaz z różnych źródeł poprzez łączenie różnych nici PEG poprzez rozmaite łączniki zakończyły się ograniczonym sukcesem. PEG-urykazy były najpierw ujawnione przez F.E. Davis i przez Y. Inada i ich kolegów. Davis, i wsp., (1978); patent USA nr 4,179,337; Nishimura, i wsp., (1979); patenty japońskie 55-99189 i 62-55079, każdy włączony tu w całości jako odniesienie. Koniugat ujawniony w opisie patentowym USA nr 4,179,337 został syntetyzowany na drodze reakcji urykazy z niezdefiniowanego źródła z 2000-krotnym nadmiarem molowym PEG 750 daltonów, co wskazuje, ze prawdopodobnie duża liczba cząsteczek polimeru przyłączyła się do każdej podjednostki urykazy. Opis patentowy USA nr 4,179,337 ujawnia przyłączanie PEG bądź też glikolu polipropylenowego o masie cząsteczkowej 500 do 20000 daltonów, korzystnie o masie 500 do 5000 daltonów w celu dostarczania aktywnych, rozpuszczalnych w wodzie, nieimmunogennych koniugatów różnych hormonów peptydowych i enzymów, włączając w to oksydoreduktazy, których urykaza jest jednym z trzech przykładów. Dodatkowo, opis patentowy USA 4,179,337 ujawnia dołączanie od 10 do 100 nici polimeru na cząsteczkę enzymu i zachowanie co najmniej 40% aktywności enzymatycznej. Nie przedstawiono wyników testów dla stopnia łączenia się PEG z dostępnymi grupami aminowymi urykazy, pozostającej specyficznej aktywności rozkładania kwasu moczowego lub immunoreakiywności koniugatu.

W poprzednich publikacjach doniesiono, że znaczace zmniejszenie aktywności rozkładania kwasu moczowego in vitro było powodowane przez dołączanie do urykazy z Candida utilis różnej liczby nici PEG. Dołączanie dużej liczby nici PEG 5 kD do urykazy z wątroby świni dawało podobne wyniki, co zostało opisane zarówno w publikacji Chen, jak i doniesieniu z sympozjum przez tą samą grupę. Patrz Chen, i wsp., (1981); Davis, i wsp., (1978).

W siedmiu publikacjach ze stanu techniki opisano, że immunoreaktywność urykazy jest zmniejszana przez PEGylację, przy czym w pięciu innych badaniach była ona eliminowana. W trzech z tych ostatnich pięciu badań, eliminacja immunoreaktywności jest związana z istotnym zmniejszeniem aktywności rozkładania kwasu moczowego - do co najmniej 15%, 28% lub 45% wyjściowej aktywności. Patrz Nishimura, i wsp., (1979) (15% aktywności); Chen, i wsp., (1981) (28% aktywności); Nishimura, i wsp., (1981) (45% aktywności). W czwartym doniesieniu napisano, że PEG jest dołączony do 61% dostępnych reszt Iizynowych, ale pozostająca aktywność specyficzna nie była wspomniana. Abuchowski, i wsp., (1981). Jednakże zespół badawczy, w skład którego wchodzi dwóch tych samych naukowców i stosujący te same metody doniósł gdzie indziej, że ten stopień łączenia pozostawia jedynie 23-28% resztkowej aktywności. Chen, i wsp., (1981). Publikacje z 1981 Abuchowski i wsp. oraz Chen i wsp., wskazuja, że aby zasadniczo zmniejszyć immunogenność urykazy, PEG musi być przyłączony do około 60% dostępnych reszt lizynowych. Piąta publikacja, która donosi, że immunoreaktywność urykazy została wyeliminowana, dla odmiany nie ujawnia stopnia dołączania PEG, pozostającej aktywności rozkładania kwasu moczowego ani natury wiązania PEG-białko. Veronese, FM, i wsp., (1997) w JM Harris, i wsp., (Wyd.), Poly (ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (str. 182-192) Washington, DC: American Chemical Society, które włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe.

Dołączanie PEG do mniejszej frakcji reszt lizynowycn w urykazie zmniejsza, ale nie eliminuje jej immunoreaktywności u zwierząt doświadczalnych. Patrz przykładowo Tsuji, J, i wsp., (1985) Int J Immunopharmacol 7:725-730, które włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy (28-45% związanych grup aminowych); Yasuda, Y, i wsp., (1990) Chem Pharm Bull 38:2053-2056, które włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy (38% związanych grup aminowych). Pozostałe aktywności rozkładania kwasu moczowego odpowiednich adduktów zawierały się w zakresie od <33% (Tsuji, i wsp.) do 60% (Yasuda, i wsp.) ich wyjściowych wartości. Tsuji, i wsp. syntetyzował koniugaty z PEG 7,7 kD i 10 kD, oprócz PEG 5 kD. Wszystkie otrzymane w rezultacie koniugaty były do pewnego stopnia immunogenne i antygenowe, jednakże wykazując znacząco zmniejszone aktywności enzymatyczne.

Doniesiono, że PEGylowane preparaty urykazy z Candida utilis, które są bezpiecznie podawane dwukrotnie każdej z pięciu osób, zachowały jedynie 11% swojej wyjściowej aktywności. Patrz Davis, i wsp., (1981). Kilka lat później modyfikowana PEG urykaza z Arthrobacter protoformiae była podawana cztery razy pacjentowi z zaawansowanym chłoniakiem i poważną hiperurykemią. Chua, i wsp., (1988). Jakkolwiek pozostające aktywności tego preparatu enzymatycznego nie były mierzone, Chaa, i wsp. wykazali nieobecność przeciwciał anty-urykaza w surowicy pacjenta 26 dni po pierwszym wstrzyknięciu przy zastosowaniu enzymatycznego testu immunosorpcyjnego (ELISA).

PL 215 285 B1

Poprzednie badania PEGylowanej urykazy pokazały, że aktywność katalityczna ulega znacznemu zmniejszeniu poprzez przyłączenie dostatecznej liczby nici PEG w celu zasadniczego zmniejszenia jej immunoreaktywności. Ponadto, większość poprzednich preparatów PEG-urykazy była syntetyzowana przy użyciu PEG aktywowanego chlorkiem cyjanurowym, pochodną triazynową (2,4,6-trichloro-1,3,5-triazyna), dla której wykazano, że wprowadza nowe determinanty antygenowe i indukuje tworzenie przeciwciał u królików. Tsuji, i wsp., (1985).

Japoński opis patentowy nr 3-148298, A Sano, i wsp., który włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy, ujawnia zmodyfikowane białka, włączając w to urykazy, derywatyzowane PEG mającym masę cząsteczkową 1-12 kD, które wykazują zmniejszoną antygenowość i „ polepszone wydłużone działanie oraz sposoby wytwarzania takich derywatyzowanych peptydów. Jednakże nie ma ujawnień odnośnie liczby nici, testów enzymatycznych, testów biologicznych albo znaczenia „polepszone wydłużone. Japońskie opisy patentowe nr 55-99189 i 62-55079, które włącza się w całości do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe, Y. Inada, ujawniają koniugaty urykazy wytworzone z PEG-triazyną lub bis-PEG-triazyną (oznaczony jako PEG2), odpowiednio. Patrz Nishimura, i wsp., (1979 i 1981). W pierwszym typie koniugatu, masy cząsteczkowe PEG wynoszą 2 kDa i 5 kDa, podczas gdy w drugim stosuje się jedynie PEG 5 kDa. Nishimura, i wsp., (1979) donieśli o odzyskaniu 15% aktywności rozkładania kwasu moczowego po modyfikacji 43% dostępnych lizyn liniowym PEG 5 kDa, podczas gdy Nishimura, i wsp., (1981) donieśli o odzyskaniu 31% lub 45% aktywności rozkładania kwasu moczowego po modyfikacji, odpowiednio, 46% lub 36% lizyn PEG2.

Badane uprzednio białka urykazy były białkami bądź naturalnymi, bądź rekombinowanymi. Jednakże badania z zastosowaniem technik SDS-PAGE i/lub Western wykazały obecność peptydów o nieoczekiwanie niskiej masie cząsteczkowej, które okazały się być produktami degradacji i których częstość zwiększała się z czasem. Niniejszy wynalazek jest związany ze białkami zmutowanej rekombinowanej urykazy mającymi skrócenia i zwiększoną stabilność strukturalną.

Streszczenie wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanej, skróconej ssaczej urykazy skróconej na końcu aminowym lub na końcu karboksylowym lub na obydwu końcach, aminowym i karboksylowym, o 1-6 aminokwasów i obejmującej dodatkowo podstawienie aminokwasowe treoniną w pozycji 7 (D7T), podstawienie aminokwasowe treoniną w pozycji 46 (S46T), podstawienie aminokwasowe lizyną w pozycji 291 (R291K) oraz podstawienie aminokwasowe seryną w pozycji 301 (T301S), a skrócenie i podstawienie aminokwasowe są określone w stosunku do urykazy świni o sekwencji aminokwasowej SEK. NR ID. 11. Korzystnie, wyizolowana, skrócona ssacza urykaza według wynalazku dodatkowo obejmuje aminokońcowy aminokwas, którym jest alanina, glicyna, prolina, seryna lub treoniną. Szczególnie korzystnym amino-końcowym aminokwasem jest treoniną, a zwłaszcza korzystnie obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEK NR ID: 8. W szczególnie korzystnym wykonaniu wyizolowana, skrócona ssacza urykaza według wynalazku jest połączona z polimerem.

W innej korzystnej postaci wykonania wynalazku wyizolowanej skróconej ssaczej urykazy N-końcowym aminokwasem jest metionina. Korzystnie, taka wyizolowana skrócona ssacza urykaza obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEK NF, ID: 7.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest koniugat glikol polietylenowy-urykaza obejmujący wyizolowaną, skróconą ssaczą urykazę według wynalazku. Korzystnie koniugat obejmuje od 2 do 12 cząsteczek glikolu polietylenowego na każdą podjednostkę urykazy, korzystniej od 3 do 10 cząsteczek glikolu polietylenowego na każdą podjednostkę urykazy. Zgodnie z korzystną postacią wykonania ₃ wynalazku każda cząsteczka glikolu polietylenowego ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 1*10³ do

100*10³ u, korzystniej od 1*10³ do 50*10³ u, jeszcze korzystniej od 5*10³ do 20*10³ u a najkorzystniej ₃ ciężar cząsteczkowy wynosi 10*10³ u.

Niniejszy wynalazek dostarcza również wyizolowany kwas nukleinowy, którego sekwencja koduje białko wyizolowanej skróconej ssaczej urykazy według wynalazku. Korzystnie, sekwencja kwasu nukleinowego jest połączona funkcjonalnie z heterologicznym promotorem, którym szczególnie korzystnie jest promotor osmB.

Wynalazek dotyczy także wektora kwasu nukleinowego, który obejmuje kwas nukleinowy według wynalazku.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również komórka gospodarza obejmująca wektor według wynalazku.

Wynalazek dostarcza również wyizolowany kwas nukleinowy obejmujący sekwencję kwasu nukleinowego kodującą urykazę obejmującą sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEK NR ID: 7

PL 215 285 B1 lub SEK NR ID: 8, który korzystnie obejmuje także sekwencje przedstawioną na SEK NR ID: 9 lub SEK NR ID: 10. W szczególnie korzystnej postaci sekwencja kwasu nukleinowego jest połączona funkcjonalnie z heterologicznym promotorem, a w zwłaszcza korzystnym wykonaniu promotorem jest promotor osmB.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor kwasu nukleinowego, obejmujący kwas nukleinowy według wynalazku.

W kolejnym z wykonań wynalazek dostarcza komórkę gospodarza obejmującą wektor według wynalazku.

W innym wykonaniu, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania urykazy, który obejmuje etapy hodowania komórki gospodarza według wynalazku w takich warunkach, że sekwencja kwasu nukleinowego ulega ekspresji w komórce gospodarza, oraz izolowania wyrażonej urykazy.

Wynalazek ujawnia więc sposoby metabolizowania kwasu moczowego, obejmujące białko nowej rekombinowanej urykazy mające aktywność rozkładania kwasu moczowego. Aktywność rozkładania kwasu moczowego jest tu stosowana na określenie enzymatycznego przekształcania kwasu moczowego do alantiony.

W jednym z konkretnych przykładowych wykonań niniejszego wynalazku dostarczono wyizolowaną, skrócona urykazę zawierającą sekwencję aminokwasową ssaczej urykazy skróconej na końcu aminowym lub na końcu karboksylowym lub na obydwu końcacń, aminowym i karboksylowym, o około 1-13 aminokwasów i zawierającą dodatkowe podstawienie aminokwasowe około pozycji 46. W innym konkretnym wykonaniu urykaza zawiera aminokońcowy aminokwas, którym jest alanina, glicyna, prolina, seryna lub treonina. Opisana niniejszym została również urykaza, w której występuje podstawienie około pozycji 46 treoniną lub alaniną. W jednym z konkretnych przykładowych wykonań, urykaza obejmuje sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 8. W jednym z wykonań, urykaza jest połączona z polimerem w celu wytworzenia na przykład koniugatu glikol polietylenowy-urykaza. W innym konkretnym wykonaniu, koniugaty glikol polietylenowy-urykaza zawierają 2 do 12 cząsteczek glikolu polietylenowego na każdej podjednostce urykazy, korzystnie 3 do 10 cząsteczek glikolu polietylenowego na podjednostkę urykazy. W konkretnym wykonaniu, każda cząsteczka glikolu polietylenowego koniugatu glikol polietylenowy-urykaza ma masę cząsteczkową między około 1 kD a 100 kD; około 1 kD a 50 kD; około 5 kD a 20 kD; lub około 10 kD.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną oraz farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze, która jako substancję aktywną zawiera urykazę według wynalazku.

W innej postaci wykonania kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera jako substancję aktywną zawiera koniugat glikol polietylenowy-urykaza według wynalazku.

Korzystnie, kompozycje według wynalazku są odpowiednie do powtarzalnego podawania.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również zastosowanie kompozycji według wynalazku do wytwarzania leku użytecznego do zmniejszania poziomów kwasu moczowego w płynach biologicznych u wymagającego tego osobnika. Korzystnie, płynem biologicznym jest krew.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem ujawniony jest więc sposób zmniejszania poziomów kwasu moczowego w płynach biologicznych osobnika tego potrzebującego, obejmujący podawanie kompozycji farmaceutycznej zawierającej urykazę według wynalazku. W konkretnym wykonaniu płynem biologicznym jest krew.

W jednym z przykładowych wykonań, urykaza zawiera peptyd mający sekwencję od pozycji 44 do pozycji 56 Pig-KS-ΔΝ (SEK NR ID: 14).

W jednym z przykładowych wykonań, urykaza zawiera N-końcową metioninę. W konkretnym wykonaniu, urykaza zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 7.

Krótki opis Figur

Na Figurze 1 przedstawiono strukturę plazmidu pOUR-P^N-ks-1. Numery obok miejsc restrykcyjnych wskazują na pozycję nukleotydową względem miejsca HaeII, oznaczonego jako 1. Miejsca restrykcyjne, które zostały utracone w czasie klonowania są zaznaczone nawiasami.

Na Figurze 2 przedstawiono DNA i wydedukowaną sekwencję aminokwasową urykazy Pig-KS-ΔΝ (odpowiednio, SEK NR ID: 9 i SEK NR ID: 7). Numeracja aminokwasów na Fig. 2 odnosi się do pełnej sekwencji urykazy świni. Po reszcie inicjacyjnej metioniny, treoniną zastępuje kwas asparaginowy 7 w sekwencji urykazy świni. Wskazane są miejsca restrykcyjne, które są stosowane w różnych etapach subklonowania. Nie podlegająca translacji sekwencja 3' jest zaznaczona małymi literami. Kodon stop dla translacji jest zaznaczony gwiazdką.

PL 215 285 B1

Na Figurze 3 przedstawiono wzajemne dopasowanie wydedukowanych sekwencji aminokwasowych różnych rekombinowanych sekwencji urykazy, świni (SEK NR ID: 11), PBC-ΔΝΟ (SEK NR ID: 12) i Pig-KS-ΔΝ (SEK NR ID: 7). Gwiazdki wskazują pozycje, w których występują różnice aminokwasowe w Pig-KS-ΔΝ w porównaniu z opublikowaną sekwencją urykazy świni; kółka wskazują pozycje, w których występują różnice aminokwasowe w Pig-KS-ΔΝ w porównaniu do PBC-ANC. Linie przerywane wskazują delecję aminokwasową.

Na Figurze 4 przedstawiono SDS-PAGE urykazy świni i wysoce oczyszczonych wariantów urykazy wytwarzanych według przykładów 1-3. Data wytworzenia (miesiąc/rok) i odpowiedni numer ścieżki dla każdej próbki jest wskazany w legendzie poniżej. Na osi Y są zaznaczone masy cząsteczkowe markerów, a na górze rysunku zaznaczone są numery ścieżek. Ścieżki są następujące: Ścieżka 1 markery mas cząsteczkowego; Ścieżka 2 - Pig-KS-ΔΝ (7/98); Ścieżka 3 - Pig (9/98); Ścieżka 4 - Pig KS (6/99); Ścieżka 5 - Pig KS (6/99); Ścieżka 6 - Pig-ΔΝ (6/99); Ścieżka 7 - Pig KS-ΔΝ (7/99); Ścieżka 8 Pig KS-ΔΝ (8/99).

Na Figurze 5 przedstawiono profile farmakokinetyczne PEGylowanej (9x10 kD) urykazy Pig-KS-ΔΝ u szczurów po wstrzyknięciu IM (domięśniowym), SC (podskórnym) i IV (dożylnym), określane poprzez śledzenie aktywności enzymatycznej w próbkach krwi. Aktywność enzymatyczną urykazy w próbkach osocza, które zbiera się we wskazanych punktach czasowych, określa się stosując test kolorymetryczny. Wartości aktywności (mAU = jednostki miliabsorbancji) reprezentują szybkość reakcji enzymatycznej na 1 μl próbki osocza. Biodostępność (ilość leku osiągająca układ krążenia w stosunku do zastrzyku IV) wstrzykniętej urykazy obliczono z obszaru pod krzywą na wykresie.

Na Figurze 6 przedstawiono profile farmakokinetyczne PEGylowanej (9x10 kD) urykazy Pig-KS-ΔΝ u królików po wstrzyknięciu IM (domięśniowym), SC (podskórnym) i IV (dożylnym), określane poprzez śledzenie aktywności enzymatycznej w próbkach krwi. Aktywność enzymatyczną urykazy w próbkach osocza, które zbiera się we wskazanych punktach czasowych, określa się stosując test kolorymetryczny. Wartości aktywności (mAU = jednostki miliabsorbancji) reprezentują szybkość reakcji enzymatycznej na 1 μl próbki osocza. Biodostepność (ilość leku osiągająca układ krążenia w stosunku do zastrzyku IV) wstrzykniętej urykazy obliczono z obszaru pod krzywą na wykresie.

Na Figurze 7 przedstawiono profile farmakokinetyczne PEGylowanej (9x10 kD) urykazy Pig-KS-ΔΝ u psów po wstrzyknięciu IM (domięśniowym), SC (podskórnym) i IV tuożylnym), określane poprzez śledzenie aktywności enzymatycznej w próbkach krwi. Aktywność enzymatyczną urykazy w próbkach osocza, które zbiera się we wskazanych punktach czasowych, określa się stosując test kolorymetryczny. Wartości aktywności (mAU = jednostki miliabsorbancji) reprezentują szybkość reakcji enzymatycznej na 1 μl próbki osocza. Biodostepność (ilość leku osiągająca układ krążenia w stosunku do zastrzyku IV) wstrzykniętej urykazy obliczono z obszaru pod krzywą na wykresie.

Na Figurze 8 przedstawiono profile farmakokinetyczne PEGylowanej (9x10 kD) urykazy Pig-KS-ΔΝ u świń po wstrzyknięciu IM (domięśniowym), SC (podskórnym) i IV (dożylnym), określane poprzez śledzenie aktywności enzymatycznej w próbkach krwi. Aktywność enzymatyczna urykazy w próbkach osocza, które zbiera się we wskazanych punktach czasowych, określa się stosując test kolorymetryczny. Wartości aktywności (mAU = jednostki miliabsorbancji) reprezentują szybkość reakcji enzymatycznej na 1 μl próbki osocza. Biodostepność (ilość leku osiągająca układ krażenia w stosunku do zastrzyku IV) wstrzykniętej urykazy obliczono z obszaru pod krzywą na wykresie.

Szczegółowy opis wynalazku

Wcześniejsze badania pokazały, że kiedy uzyskuje się znaczące zmniejszenie immunogenności i/lub antygenowości urykazy poprzez PEGylację, wiaze sie z tym nieodmiennie istotna utrata aktywności rozkładania kwasu moczowego. Bezpieczeństwo, wygoda i stosunek koszty-skuteczność biofarmaceutyków, na wszystko to niekorzystny wpływ ma zmniejszenie ich mocy i w rezultacie potrzeba zwiększania podawanej dawki. A zatem, istnieje zapotrzebowanie na bezpieczne i skuteczne alternatywne sposoby zmniejszania podniesionych poziomów kwasu moczowego w płynach ciała, włączając w to krew. Niniejszy wynalazek dostarcza zmutowanej rekombinowanej urykazy, gdzie urykaza została skrócona o 1-20 aminokwasów na końcu aminowym albo na końcu karboksylowym lub na obydwu końcach, i zasadniczo zachowuje aktywność rozkładania kwasu moczowego występującej naturalnie urykazy.

Stosowany w niniejszym opisie termin „urykaza obejmuje poszczególne podjednostki, jak również tetrametr, o ile nie zaznaczono inaczej.

Stosowany w niniejszym opisie termin „zmutowana urykaza dotyczy cząsteczek urykazy mających aminokwasy zamienione na inne aminokwasy.

PL 215 285 B1

Stosowany w niniejszym opisie termin „konserwatywna mutacja to mutacja jednego albo większej liczby aminokwasów, w pewnej pozycji albo w jej okolicach, które nie zmieniają zasadniczo zachowania białka. W korzystnym wykonaniu urykaza zawierająca co najmniej jedną konserwatywną mutację ma taką samą aktywność urykazy co urykaza bez takiej mutacji. W innym wykonaniu, urykaza zawierajaca co najmniej jedną konserwatywną mutację ma zasadniczo taką samą aktywność urykazy, nie więcej niż 5% od aktywności, nie wiecej niż 10% od aktywności albo nie więcej niż 30% od aktywności urykazy bez takiej mutacji.

Konserwatywne podstawienie aminokwasowe jest zdefiniowane jako zmiana w składzie aminokwasowym poprzez zmianę aminokwasów peptydu, polipeptydu albo białka lub fragmentu. W konkretnych wykonaniach, urykaza ma jedną, dwie, trzy lub cztery konserwatywne mutacje. Podstawienie jest aminokwasami o generalnie podobnych właściwościach (np. kwaśne, zasadowe, aromatyczne, o rozmiarze, dodatnio albo ujemnie naładowane, polarne, niepolarne), tak że podstawienia nie zmieniają zasadniczo charakteru (np. ładunku, IEF, powinowactwa, widności, konformacji, rozpuszczalności) albo aktywności peptydu, polipeptydu lub białka. Typowe podstawienia, których można dokonać jako takie konserwatywne podstawienia aminokwasowe mogą być w obrębię następujących grup aminokwasów:

glicyna (G), alanina (A), walina (V), leucyna (L) i izoleucyna (I) kwas asparaginowy (D) i kwas glutaminowy (E) alanina (A), seryna (S) i treoniną (T) histydyna (H), lizyna (K) i arginina (R) asparagina (N) i glutamina (Q) fenyloalanina (F), tyrozyna (Y) i tryptofan (W)

Białko mające jedno albo większą liczbę konserwatywnych podstawień zachowuje swoją stabilność strukturalną i może katalizować reakcję nawet jeżeli jego sekwencja nie jest taka sama jak wyjściowego białka.

Stosowany w niniejszym opisie termin skrócona urykaza dotyczy cząsteczek urykazy mających skrócone pierwszorzędowe sekwencje aminokwasowe. Wśród możliwych skróceń są skrócenia na albo w pobliżu końców, aminowego i/lub karboksylowego. Konkretnymi skróceniami tego typu mogą być takie, że ostatnie aminokwasy (te na końcu aminowym i/lub karboksylowym) naturalnie występującego białka są obecne w skróconym białku. Skrócenia aminokońcowe mogą rozpoczynać się w pozycji 1, 2, 3, 4, 5 lub 6. Korzystne jest, jeżeli aminokońcowe skrócenia rozpoczynają się w pozycji 2, pozostawiając w ten sposób aminokońcową metioninę. Ta metionina może zostać usunięta przez potranslacyjną modyfikację. W konkretnych wykonaniach, aminokońcowa metionina jest usuwana po wytworzeniu urykazy. W konkretnym wykonaniu metionina jest usuwana przez endogenną bakteryjną aminopeptydazę.

Skrócona urykaza, w odniesieniu do sekwencji pełnej długości ma wyeliminowaną jedną albo więcej sekwencji aminokwasowych. Białko zawierające skróconą urykazę może zawierać oprócz skróconej sekwencji urykazy dowolną sekwencję aminokwasową, ale nie obejmuje białka zawierającego sekwencję urykazy zawierającą jakąkolwiek dodatkową kolejną sekwencję aminokwasową typu dzikiego. Innymi słowy, białko zawierające skróconą urykazę, gdzie skrócenie rozpoczyna się w pozycji 6 (tj. skrócona urykaza rozpoczyna się w pozycji 7) nie ma bezpośrednio przed skróconą urykazą jakiegokolwiek aminokwasu, który urykaza typu dzikiego miała w pozycji 6.

O ile nie zaznaczono inaczej przez specjalne odniesienie się do innych sekwencji albo konkretnej SEK NR ID, odniesienie sie do numerowanych pozycji aminokwasów opisanych tu urykaz jest dokonywane w odniesieniu do numeracji aminokwasów w sekwencji urykazy świni. Sekwencja aminokwasowa urykazy świni i numerowane pozycje aminokwasów zawartych w tej sekwencji można znaleźć na Fig. 3. Stosowane tu odniesienie do aminokwasów lub kwasów nukleinowych „od pozycji X do pozycji Y oznacza ciągłą sekwencję rozpoczynającą się od pozycji X i kończącą się w pozycji Y, włączając w to aminokwasy albo kwasy nukleinowe w obydwu pozycjach, X i Y.

Geny i białka urykazy zostały zidentyfikowane u kilku gatunków ssaków, na przykład u świni, pawiana, szczura, królika, myszy i małpy rezus. Sekwencje białek różnych urykaz są tu opisane w odniesieniu do ich numerów dostępów w publicznych bazach danych, jak następuje:

gi|50403728|sp|P25689; gi|20513634|dbj|BAB91555.1; gi|176610|gb|AAA35395.1;

gi|20513654|dbj|BAB91557.1;

PL 215 285 B1 gi|47523606|ref|NP_999435.1;

gi|6678509|ref|NP_033500.1;

gi|57463|emb|CAA31490.1;

gi|20127395|ref|NP_446220.1;

gi|137107|sp|P11645;

gi|51458661|ref|XP_497688.1;

gi|207619|gb|AAA42318.1;

gi|26340770|dbj|BAC34047.1 oraz gi|57459|emb|CAA30378.1.

Każda z tych sekwencji i przypisy do nich w publicznych bazach danych dostępne poprzez National Center for Biotechnology Information (NCBI) są tu włączone w całości jako odniesienie.

W jednym z wykonań wynalazku urykaza jest skrócona o 4-13 aminokwasów na końcu aminowym. W jednym z wykonań wynalazku urykaza jest skrócona o 4-13 aminokwasów na końcu karboksylowym. W jednym z wykonań wynalazku urykaza jest skrócona o 4-13 aminokwasów na obydwu końcacń, aminowym i karboksylowym.

W jednym z wykonań wynalazku urykaza jest skrócona o 6 aminokwasów na końcu aminowym. W jednym z wykonań wynalazku urykaza jest skrócona o 6 aminokwasów na końcu karboksylowym. W jednym z wykonań wynalazku urykaza jest skrócona o 6 aminokwasów na obydwu końcach, aminowym i karboksylowym.

W konkretnym wykonaniu białko urykazy zawiera sekwencję aminokwasową od pozycji 13 do pozycji 292 sekwencji aminokwasowej urykazy świni (SEK NR ID: 11). W konkretnym wykonaniu białko urykazy zawiera sekwencję aminokwasową od pozycji 8 do pozycji 287 sekwencji aminokwasowej

PBC-ANC (SEK NR ID: 12). W konkretnym wykonaniu białko urykazy zawiera sekwencję aminokwasową od pozycji 8 do pozycji 287 sekwencji aminokwasowej Pig-KS-ΔΝ (SEK NR ID: 7).

W innym wykonaniu, białko urykazy zawiera sekwencję aminokwasową od pozycji 44 do pozycji 56 Pig-KS-ΔΝ (SEK NR ID: 14). Ten region urykazy ma homologię sekwencji w obrębie domeny fałdu tunelowego (T-fold, od ang. tunneling fold) urykazy i ma w jej obrębie mutację w pozycji 46 w odniesieniu do natywnej sekwencji urykazy świni. Ta mutacja ku zaskoczeniu nie zmienia znacząco aktywności urykazy białka.

W pewnym wykonaniu wynalazku, aminokwasy w pozycji albo w pobliżu aminokwasów 7, 46 i 291 oraz 301 są zmutowane. W korzystnym wykonaniu wynalazku same aminokwasy 7, 46 i 291 oraz 301 są zmutowane.

W konkretnym wykonaniu, białko jest kodowane przez kwas nukleinowy, który koduje N-końcową metioninę. Korzystne jest, jeżeli po tej N-końcowej metioninie następuje kodon, który umożliwia usunięcie N-końcowej metioniny przez bakteryjną aminopeptydazę metioninową (MAP). (Ben-Bassat i Bauer (1987) Nature 326:315, włączone tu w całości jako odniesienie. Aminokwasami umożliwiającymi najbardziej kompletne usunięcie N-końcowej metioniny są alanina, glicyna, prolina, seryna i treonina.

W pewnym wykonaniu wynalazku aminokwasy w pozycji albo w pobliżu aminokwasów 7 i/lub 46 są zastąpione przez treoninę. Ku zaskoczeniu, aktywność enzymatyczna skróconych urykaz wytworzonych z tymi mutacjami jest podobna do enzymu nieskróconego. W dalszym wykonaniu wynalazku, mutacje aminokwasów obejmują treoninę, treoninę, lizynę i serynę w pozycjach, odpowiednio, 7, 46, 291 i 301.

Ujawnione w niniejszym opisie skrócone urykazy ssaków mogą ponadto zawierać metioninę na końcu aminowym. Przedostatni aminokwas może być tym, który umożliwia usunięcie N-końcowej metioniny przez bakteryjną aminopeptydazę metioninową (MAP). Aminokwasami umożliwiającymi najbardziej kompletne usuniecie N-końcowej metioniny są alanina, glicyna, prolina, seryna i treonina. W konkretnym wykonaniu urykaza zawiera dwa aminokońcowe aminokwasy, gdzie dwa aminokońcowe aminokwasy to metionina, po której następuje aminokwas wybrany z grupy składającej się z alaniny, glicyny, proliny, seryny i treoniny.

W innym wykonaniu wynalazku podstawione aminokwasy zostały zastąpione przez treoninę.

W pewnym wykonaniu wynalazku urykazą jest urykaza ssacza.

W kolejnym wykonaniu wynalazku urykaza ssacza obejmuje sekwencję urykazy z wątroby świńskiej, wołowej, owczej albo pawiana.

W jeszcze innym wykonaniu wynalazku urykazą jest urykaza chimerowa z dwóch albo większej liczby urykaz ssaczych.

PL 215 285 B1

W pewnym z wykonań wynalazku urykazy ssacze są wybrane spośród urykazy z wątroby świńskiej, wołowej, owczej albo pawiana .

W pewnym wykonaniu wynalazku urykaza zawiera sekwencję z SEK NR ID: 8.

W jeszcze innym wykonaniu wynalazku urykaza zawiera sekwencję z SEK NR ID: 13.

Wynalazek niniejszy dostarcza więc kwasów nukleinowych kodujących urykazę zawierającą sekwencję SEK NR ID: 10.

W pewnym wykonaniu wynalazku urykaza obejmuje urykazę grzybową albo z mikroorganizmu.

W pewnym wykonaniu wynalazku urykazą grzybową albo z mikroorganizmu jest urykaza Aspergillus flavus, Arthrobaeter globiformis lub Candida utilis.

W pewnym wykonaniu wynalazku urykaza obejmuje urykazę bezkręgowca.

W pewnym wykonaniu wynalazku urykazą bezkręgowca jest urykaza Drosophila melanogaster lub Drosophila pseudoobseura.

W pewnym wykonaniu wynalazku urykaza obejmuje urykazę roślinną.

W pewnym wykonaniu wynalazku urykazą roślinną jest urykaza Glycine max z guzów korzeniowych.

Niniejszy wynalazek dostarcza sekwencji kwasu nukleinowego kodującej urykazę.

Niniejszy wynalazek dostarcza wektora zawierającego sekwencję kwasu nukleinowego.

W konkretnym wykonaniu urykaza jest wyizolowana. W konkretnym wykonaniu urykaza jest oczyszczona. W konkretnych wykonaniach urykaza jest wyizolowana i oczyszczona.

Niniejszy wynalazek dostarcza komórki gospodarza zawierającej wektor.

Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania sekwencji kwasu nukleinowego, obejmującego modyfikację poprzez techniki PCR (od ang. polymerase chain reaction, reakcja łańcuchowa polimerazy) sekwencji kwasu nukleinowego kodującej nieskróconą urykazę. Specjalista w tej dziedzinie wie, że pożądaną sekwencję kwasu nukleinowego wytwarza się poprzez PCR przy zastosowaniu syntetycznych starterów oligonukleotydowych, które są komplementarne do regionów docelowego DNA (jeden dla każdej nici), który ma podlegać amplifikacji. Startery dodaje się do docelowego DNA (nie muszą być czyste) w obecności nadmiaru deoksynukleotydów i polimerazy Taq, termostabilnej polimerazy DNA. W serii (typowo 30) cykli temperaturowych, docelowy DNA jest wielokrotnie: denaturowany (około 90°C), łączony ze starterami (typowo w 50-60°C) i nić potomna jest wydłużana ze starterów (72°C). Nici potomne same działają jako matryce do kolejnych cykli, fragmenty DNA pasujące do obydwu starterów są powielane wykładniczo, a nie liniowo.

Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania zmutowanej rekombinowanej urykazy, obejmującego transfekowanie komórki gospodarza wektorem, gdzie komórka gospodarza wyraża urykazę, izolowanie zmutowanej rekombinowanej urykazy z komórki gospodarza, izolowanie oczyszczonej zmutowanej rekombinowanej urykazy, na przykład poprzez zastosowanie technik chromatograficznych i oczyszczanie zmutowanej rekombinowanej urykazy. Przykładowo, urykazę można wywarzać według metod opisanych w publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 00/08196, włączonego tu w całości jako odniesienie.

Urykazę można wyizolować i/lub oczyścić przy zastosowaniu dowolnej metody znanej specjalistom w tej dziedzinie. Wyrażane polipeptydy według wynalazku generalnie izoluje się w postaci zasadniczo czystej. Korzystne jest, jeżeli polipeptydy izoluje się do czystości co najmniej 80% wagowo, korzystniej do czystości co najmniej 95% wagowo, a najkorzystniej do czystości co najmniej 99%. Generalnie, takie oczyszczenie można uzyskać na przykład poprzez standardowe techniki frakcjonowania siarczanem amonu, elektroforezy SDS-PAGE i chromatografii powinowactwa. Korzystne jest, jeżeli urykazę izoluje się przy zastosowaniu kationowego czynni ka powierzchniowo czynnego, na przykład chlorku cetylopirydynowego (CPC), zgodnie z metodą opisaną w rozpatrywanym jednocześnie zgłoszeniu patentowym USA, złożonym 11 kwietnia 2005, o numerze zgłoszenia 60/670,520 i numerze odniesienia rzecznika 103864.146644, zatytułowanym „Oczyszczanie białek przy zastosowaniu kationowych czynników powierzchniowo czynnych, włączonym tu w całości jako odniesienie.

W korzystnym wykonaniu komórkę gospodarza traktuje się tak, aby wywołać ekspresję zmutowanej rekombinowanej urykazy. Specjalista w tej dziedzinie będzie wiedział, że transfekcję komórek wektorem zwykle uzyskuje się stosując DNA wytrącony jonami wapniowymi, jakkolwiek można zastosować rozmaite inne metody (np. elektroporację).

W pewnym wykonaniu wynalazku, wektor jest pod kontrolą promotora wrażliwego na ciśnienie osmotyczne. Promotorem jest region DNA, do którego wiąże się polimeraza RNA przed zapoczątkoPL 215 285 B1 waniem transkrypcji DNA do RNA. Promotor wrażliwy na ciśnienie osmotyczne rozpoczyna transkrypcję w rezultacie zwiększonego ciśnienia osmotycznego wyczuwanego przez komórkę.

W pewnym wykonaniu wynalazku promotorem jest zmodyfikowany promotor osmB.

W innych konkretnych wykonaniach urykazą według wynalazku jest urykaza połączona z polimerem.

W pewnym wykonaniu wynalazku, dostarczona jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca urykazę. W jednym z wykonań kompozycją jest roztwór urykazy. W korzystnym wykonaniu wynalazku roztwór jest jałowy i odpowiedni do wstrzyknięcia. W jednym z wykonań taka kompozycja zawiera urykazę jako roztwór w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. W jednym z wykonań kompozycja jest dostarczona w fiolce, ewentualnie mająca gumowe zamknięcie do zastrzyków. W konkretnych wykonaniach, kompozycja zawiera urykazę w roztworze w stężeniu od 2 do 16 miligramów urykazy na mililitr roztworu, od 4 do 12 miligramów na mililitr lub od 6 do 10 miligramów na mililitr. W korzystnym wykonaniu kompozycja zawiera urykazę w stężeniu 8 miligramów na mililitr. Korzystne jest, jeżeli masę urykazy mierzy się w odniesieniu do masy białka.

Tryby skutecznego podawania kompozycji według wynalazku mogą zostać określone przez specjalistę w tej dziedzinie. Przydatne wskaźniki do badania skuteczności danego trybu są znane specjalistom w tej dziedzinie. Przykłady takich wskaźników obejmują normalizację albo obniżenie poziomów kwasu moczowego w osoczu (PUA, od ang. plasma uric acid) i obniżenie lub utrzymywanie się PUA do 6,8 mg/dl lub mniej, korzystnie 6 mg/dl lub mniej. W korzystnym wykonaniu osobnik leczony kompozycją według wynalazku ma PUA wynoszący 6 mg/ml lub mniej przez co najmniej 70%, co najmniej 80% lub co najmniej 90% całego okresu leczenia. Przykładowo, korzystne jest, jeżeli osobnik w trakcie 24 tygodni leczenia ma PUA wynoszący 6 mg/ml lub mniej przez co najmniej 80% 24-tygodniowego okresu leczenia, tj. co najmniej przez czas równy ilości czasu w 134,4 dniach (24 tygodnie x 7 dni/tydzień x 0,8 = 134,4 dni).

W konkretnym wykonaniu, 0,5 do 24 mg urykazy w roztworze podaje się raz na 2 do 4 tygodni. Urykazę można podawać dowolną z dróg znanych specjaliście w tej dziedzinie, na przykład dożylnie, domięśniowo lub podskórnie. Przy podawaniu dożylnym korzystne jest podawanie 0,5 mg do 12 mg urykazy. Przy podawaniu podskórnym korzystne jest podawanie 4 do 24 mg urykazy. W korzystnym wykonaniu urykazę podaje się poprzez wlew dożylny przez okres 30 do 240 minut. W jednym z wykonań, 8 mg urykazy podaje się co dwa tygodnie. W konkretnym wykonaniu, wlew można przeprowadzić przy użyciu 100 do 500 ml roztworu soli fizjologicznej. W korzystnym wykonaniu 8 mg urykazy w roztworze podaje się przez okres 120 minut co dwa tygodnie albo co cztery tygodnie; korzystne jest, jeżeli urykazę rozpuszcza się w 250 ml roztworu soli fizjologicznej do wlewu. W konkretnych wykonaniach, podawanie urykazy następuje w okresie leczenia trwającym 3 miesiące, 6 miesięcy, 8 miesięcy lub 12 miesięcy. W innych wykonaniach okresem leczenia jest 12 tygodni, 24 tygodnie, 36 tygodni lub 48 tygodni. W konkretnym wykonaniu, okres leczenia obejmuje dłuższy okres czasu np. 2 lata lub dłużej, aż do końca życia leczonego osobnika. Dodatkowo, można zastosować wielokrotne okresy leczenia oddzielone od siebie czasem bez leczenia, np. 6 miesięcy leczenia, po którym następują 3 miesiące bez leczenia, a następnie 6 dodatkowycń miesięcy leczenia itd.

W niektórych wykonaniach związki przeciwzapalne można podawać profilaktycznie w celu eliminacji albo zmniejszenia występowania reakcji na wlew na skutek podawania urykazy. W jednym z wykonań wraz kompozycją podaje się również co najmniej jeden kortykosteroid, co najmniej jedną antyhistamine, co najmniej jeden NSAID albo ich kombinację. Przydatne kortykosteroidy obejmują betametazon, budesonid, kortyzon, deksametazon, hydrokortyzon, metyloprednizolon, prednizolon, prednizon i triamcynolon. Przydatne NSAID obejmują ibuprofen, indometacynę, naproksen, aspirynę, acetominofen, celekoksib i waldecoksib. Przydatne antyhistaminy obejmują azatadynę, bromofeniraminę, cetyryzynę, chlorfeniraminę, klemastin, cyproheptadynę, desloratadynę, dekschlorfeniraminę, dimenhydrynat, difenhydraminę, doksylaminę, feksofenadynę, hydroksyzynę, Ioratadynę i fenindaminę.

W korzystnym wykonaniu, antyhistaminą jest feksofenadyna, NSAIDem jest acetaminofen, a kortykosteroidem jest hydrokortyzon i/lub prednizolon. Korzystne jest, jeżeli kombinację wszystkich trzech (niekoniecznie jednocześnie) podaje się przed wlewem roztworu urykazy. W korzystnym wykonaniu NSAID i antyhistaminę podaje się doustnie 1 do 4 godzin przed wlewem urykazy. Odpowiednia dawka feksofenadyny obejmuje około 30 do około 180 mg, około 40 do około 150 mg, około 50 do około 120 mg, około 60 do około 90 mg, około 60 mg, korzystnie, 60 mg. Odpowiednia dawka acetaminofenu obejmuje około 500 do około 1500 mg, około 700 do około 1200 mg, około 800 do około

PL 215 285 B1

1100 mg, około 1000 mg, korzystnie 1000 mg. Odpowiednia dawka hydrokortyzonu obejmuje około 100 do około 500 mg, około 150 do około 300 mg, około 200 mg, korzystnie 200 mg. W jednym z wykonań, antyhistaminą nie jest difenńydramina. W innym wykonaniu NSAIDem nie jest acetaminofen. W korzystnym wykonaniu 60 mg feksofenadyny podaje się doustnie noc przed wlewem urykazy; 60 mg feksofenadyny i 1000 mg acetaminofenu podaje się doustnie następnego dnia rano, a na koniec, 200 mg hydrokortyzonu podaje się tuż przed wlewem roztworu urykazy. W jednym z wykonań, prednizon podaje się w przeddzień, korzystnie wieczorem przed podaniem urykazy. Odpowiednia dawka prednizonu obejmuje 5 do 50 mg, korzystnie 20 mg. W niektórycń wykonaniach te działania profilaktyczne stosuje się wobec osobników otrzymujących albo mających otrzymywać urykazę, włączając w to urykazę PEGylowana i niePEGylowaną. W konkretnych wykonaniach te działania profilaktyczne stosuje się wobec osobników otrzymujących albo mających otrzymywać peptydy terapeutyczne inne niż urykaza, gdzie inne terapeutyczne peptydy są PEGylowane lub niePEGylowane.

W pewnym wykonaniu wynalazku kompozycja farmaceutyczna zawiera urykazę, która została zmodyfikowana poprzez połączenie z polimerem i zmodyfikowana urykaza zachowuje aktywność rozkładania kwasu moczowego. W konkretnym wykonaniu koniugaty polimer-urykaza są wytwarzane jak opisano w międzynarodowej publikacji patentowej nr WO 01/59078 i zgłoszeniu USA nr 09/501730, włączonych tu w całości jako odniesienie.

W jednym z wykonań wynalazku, polimer jest wybrany z grupy składającej się z glikolu polietylenowego, dekstranu, glikolu polipropylenowego, hydroksypropylometylocelulozy, karboksymetylocelulozy, poliwinylopirolidonu i alkoholu poliwinylowego.

W pewnym wykonaniu wynalazku kompozycja zawiera 2-12 cząsteczek polimeru na każdą podjednostkę urykazy, korzystnie 3 do 10 cząsteczek polimeru na podjednostkę.

W pewnym wykonaniu wynalazku każda cząsteczka polimeru ma masę cząsteczkową między około 1 kD i około 100 kD.

W innym wykonaniu wynalazku każda cząsteczka polimeru ma masę cząsteczkową między około 1 kD i około 50 kD. W korzystnym wykonaniu wynalazku każda cząsteczka polimeru ma masę cząsteczkową między około 5 kD a około 20 kD, około 8 kD a około 15 kD, około 10 kD a 12 kD, korzystnie, około 10 kD. W korzystnym wykonaniu każda cząsteczka polimeru ma masę cząsteczkową około 5 kD lub około 20 kD. W szczególnie korzystnym wykonaniu wynalazku, każda cząsteczka polimeru ma masę cząsteczkową 10 kD. Brana jest również pod uwagę mieszanina cząsteczek o różnych masach. W pewnym wykonaniu wynalazku kompozycja jest odpowiednia do powtarzanego podawania kompozycji.

W konkretnym wykonaniu, przyłączenie urykazy do polimeru obejmuje wiązania wybrane z grupy składającej się z wiązań uretanowych, drugorzędowych wiązań aminowycń i wiązań amidowych.

Niniejszy wynalazek dotyczy także komórki o zdolności wytwarzania urykazy mającej sekwencję aminokwasową zrekombinowanej urykazy, gdzie urykaza została skrócona o 1-20 aminokwasów i ma zmutowane aminokwasy i aktywność metabolizowania kwasu moczowego.

Niniejszy wynalazek ujawnia także sposoby metabolizowania kwasu moczowego przy zastosowaniu urykazy.

Niniejszy wynalazek dostarcza zastosowania kompozycji urykazy do zmniejszania poziomów kwasu moczowego w płynie biologicznym.

W pewnym wykonaniu wynalazku kompozycję urykazy stosuje się do zmniejszania poziomów kwasu moczowego w płynie biologicznym obejmującym krew.

Dostarczane są również nowe cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące polipeptydy urykazy. Manipulacje, które prowadzą do ich wytwarzania są dobrze znane specjaliście w tej dziedzinie. Przykładowo, sekwencje kwasów nukleinowych urykazy można modyfikować przy zastosowaniu dowolnej z licznych strategii znanych w tej dziedzinie (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wyd. 2., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Sekwencje mogą być przecinane w odpowiednich miejscach przez endonukleazę(y) restrykcyjną (e), a następnie, jeśli to pożądane, poddane dalszej modyfikacji enzymatycznej, izolowane i poddane ligacji in vitro. Przy wytwarzaniu genu kodującego urykazę, należy zadbać o upewnienie się, że zmodyfikowany gen zachowuje odpowiednią ramkę odczytu dla translacji, nie przerwaną przez sygnały stop dla translacji. Dodatkowo, sekwencję kwasu nukleinowego kodującą urykazę można zmutować in vitro albo in vivo w celu wytworzenia i/lub zniszczenia sekwencji translacyjnych inicjacyjnych i/lub terminacyjnych albo do wytworzenia wariacji w regionach kodujących i/lub utworzenia nowych miejsc dla enzymów restrykcyjnych albo zniszczenia istniejących wcześniej, w celu ułatwienia dalszej modyfikacji in vitro. Można zastosować

PL 215 285 B1 dowolną technikę mutagenezy znaną w tej dziedzinie, włączając w to między innymi, ukierunkowaną mutagenezę in vitro (Hutchinson, C., i wsp., 1978, J. Biol. Chem 253:6551), zastosowanie łączników

TAB^® (Pharmacia), itd.

Sekwencję nukleotydową kodującą białko urykazy można wstawić do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, tj. wektora, który zawiera niezbędne elementy do transkrypcji i translacji wstawionej sekwencji kodującej białko. To obejmuje między innymi ssacze systemy komórkowe zakażane wirusem (np. wirusem krowianki, adenowirusem, itd.); systemy komórek owadów zakażanych wirusem (np. bakulowirusem), mikroorganizmy, takie jak drożdże, zawierające wektory drożdżowe albo bakterie transformowane DNA bakteriofagowym, DNA plazmidowym albo DNA kosmidowym. Elementy ekspresyjne tych wektorów mogą różnić się siłą i specyficznościami. W zależności od zastosowanego systemu gospodarz-wektor, można zastosować dowolny z wielu odpowiednich elementów transkrypcyjnych i translacyjnych.

Dowolną ze znanych metod wstawiania fragmentów DNA do wektora można zastosować w celu skonstruowania wektorów ekspresyjnych zawierających chimerowy gen składający się z odpowiednich sygnałów kontrolnych transkrypcyjnych/translacyjnych i sekwencji kodujących białko. Metody te mogą obejmować techniki rekombinowania DNA in vitro i techniki syntetyczne oraz rekombinację in vivo (rekombinację genetyczną). Ekspresję sekwencji kwasu nukleinowego kodującego urykazę można regulować przez drugą sekwencję kwasu nukleinowego, tak że białko urykazy jest wyrażane w gospodarzu transformowanym zrekombinowaną cząsteczką DNA. Przykładowo, ekspresja urykazy może być pod kontrolą dowolnego elementu promotora/wzmacniacza znanych w tej dziedzinie. Promotory, które można zastosować do kontrolowania ekspresji urykazy obejmują między innymi region wczesnego promotora SV40 (Bernoist i Chambon, 1981, Nature 290:304-310), promotor zatwary w długich końcowych powtórzeniach 3' wirusa mięsaka Rousa (Yamamoto, i wsp., 1980, Cell 22:787-797), promotor kinazy tymidynowej opryszczki (Wagner i wsp., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445), sekwencje regulacyjne genu metalotioneiny (Brinster i wsp., 1982, Nature 296:39-42); ekspresyjne wektory prokariotyczne, takie jak promotor β-laktamazy (Villa-Kamaroff, i wsp., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), promotor tac (DeBoer, i wsp., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25) oraz promotor osmB. W konkretnych wykonaniach kwasy nukleinowe zawierają sekwencję kwasu nukleinowego kodującą urykazę połączoną funkcjonalnie z promotorem heterologicznym.

Po wytworzeniu i wyizolowaniu konkretnej cząsteczki DNA zawierającej kodującą sekwencję kwasu nukleinowego, można zastosować kilka znanych w tej dziedzinie metod do jej namnażania. Po opracowaniu odpowiedniego systemu gospodarza i warunków wzrostu, zrekombinowabne wektory ekspresyjne można namnażać i uzyskiwać w dużych ilościach. Jak wcześniej wyjaśniono, wektory ekspresyjne, które można zastosować obejmują między innymi następujące wektory albo ich pochodne: ludzkie albo zwierzęce wirusy, takie jak wirus krowianki lub adenowirus, wirusy owadów, takie jak bakulowirus, wektory drożdżowe, wektory bakteriofagowe (np. lambda) oraz wektory DNA plazmidowe i kosmidowe, aby wymienić kilka.

Dodatkowo, można wybrać szczep komórek gospodarza, który moduluje ekspresję wstawionych sekwencji albo modyfikuje i dokonuje obróbki produktu genu w specyficzny, pożądany sposób. Ekspresję z pewnych promotorów można zwiększyć w obecności pewnych induktorów, a zatem ekspresja poddanej zabiegom inżynierii genetycznej urykazy może być kontrolowana. Ponadto, różne szczepy gospodarzy mają właściwości i specyficzne mechanizmy translacyj n ej i potransiacyjnej obróbki i modyfikacji (glikozylacja, cięcie) białek. Można wybrać odpowiednie linie komórkowe lub systemy gospodarzy dla zapewnienia pożądanej modyfikacji i obróbki wyrażonego obcego białka. Różne systemy ekspresyjne wektor/gospodarz mogą wpływać w różnym stopniu na reakcje obróbki, takie jak cięcia proteolityczne.

W konkretnych wykonaniach wynalazku ekspresję urykazy w E. coli przeprowadza się korzystnie przy użyciu wektorów, które zawierają promotor osmB.

Przykłady praktycznej realizacji wynalazku

P r z y k ł a d 1. Konstrukcja genu i ekspresja plazmidu dla ekspresji urykazy

Rekombinowana świńska urykaza (oksydaza moczanowa), Pig-KS-ΔΝ (białko urykazy świni ze skróconym końcem aminowym, z zastąpieniem aminokwasów 291 i 301, odpowiednio, lizyną i seryną) wyrażono w szczepie E. coli K-12 W3110 F^-. Skonstruowano serię plazmidów, z uzyskaniem na koniec pOUR-P-AN-ks-1, który, po transformacji komórek gospodarza E. coli był zdolny do kierowania wydajną ekspresją urykazy.

Izolacja i subklonowanie cDNA urykazy z wątroby świni i pawiana

PL 215 285 B1 cDNA urykaz wytworzono z wątrób świń i pawianów poprzez izolację i klonowanie odpowiedniego RNA. Całkowity komórkowy RNA ekstrahowano z wątrób świń i pawianów (Erlich, H. A. (1989). PCR Technology; Principles and Application for DNA Amplification; Sambrook, J., i wsp. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie 2; Ausubel, F. M. i wsp. (1998). Current protocols in molecular Biology), a następnie przepisywano przy zastosowaniu zestawu do syntezy pierwszej nici cDNA (First-Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech). Amplifikację PCR przeprowadzono przy użyciu polimerazy DNA Taq (Gibco BRL, Life Technologies).

Syntetyczne startery oligonukleotydowe stosowane do amplifikacji PCR oksydaz moczanowych (urykaz) świni i pawiana są pokazane w Tabeli 1.

T a b e l a 1. Startery do amplifikacji poprzez PCR cDNA dla urykazy

Sekwencjami enzymów restrykcyjnych wprowadzonymi na końcach starterów i zapisanymi małymi literami w Tabeli 1, były sensowne EcoRI i NcoI (Świna i pawian) i antysensowne NcoI, HindIII i XbaI (Świna), XbaI i NcoI (pawian). W starterze sensownym dla pawiana, trzeci kodon GAC (kwas asparaginowy) obecny w urykazie pawiana został zastąpiony CAC (histydyna), kodonem, który jest obecny w tej pozycji w sekwencji kodującej pseudogenu ludzkiej oksydazy moczanowej. Konstrukt dla rekombinowanej urykazy pawiana wytworzony przy użyciu tych starterów jest nazwany D3H Baboon Uricase.

Produkt PCR dla urykazy świni został strawiony EcoRI i HindIII i sklonowany w pUC18 z wytworzeniem pUC18-Pig Uricase. Produkt PCR dla D3H Baboon Uricase sklonowano bezpośrednio w wektorze pCR™II, stosując TA Cloning™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), z wytworzeniem pCR™II-D3H Baboon Uricase.

Poddane ligacji cDNA zastosowano do transformacji szczepu E. coli XL1-Blue (Stratagene, La Jolla, CA). Wytworzono plazmidowy DNA zawierający sklonowane cDNA urykazy i klony, które posiadały opublikowaną sekwencję DNA kodującą urykazę (z różnicą polegającą na podstawieniu D3H w urykazie pawiana, pokazanej w Tabeli 1) wybrano i wyizolowano. W wybranym klonie pCR™II-D3H Baboon Uricase, sekwencje pCR™II znajdowały się obok kodonu stop urykazy, co było wynikiem delecji sekwencji wprowadzonej poprzez PCR. W konsekwencji, miejsca restrykcyjne XbaI i NcoI z nie podlegającego translacji regionu 3' zostały wyeliminowane, umożliwiając bezpośrednie klonowanie przy zastosowaniu NcoI na końcu 5' produktu PCR i BamHI, które pochodzi z wektora pCR™II.

Subklonowanie cDNA urykazy do wektorów ekspresyjnych pET

Subklonowanie urykazy pawiana cDNA D3H pawiana zawierający sekwencję kodującą pełnej długości dla urykazy wprowadzono do wektora ekspresyjnego pET-3d (Novagen, Madison, WI). pCR™II-D3H Baboon Uricase strawiono NcoI i BamIII i wyizolowamo fragment 960 bp. Plazmid ekspresyjny pET-3d strawiono NcoI i BamHI i wyizolowano fragment 4600 bp. Dwa fragmenty poddano ligaćji z wytworzeniem pET-3d-D3H Baboon.

Subklobowanie chimerowej urykazy świni-pawiana

Chimerową urykazę świni-pawiana (PBC, od ang. Pig-baboon chimera) skonstruowano w celu osiągnięcia wyższej ekspresji, stabilności i aktywności rekombinowanego genu. PBC skonstruowano poprzez wyizolowanie fragmentu NcoI-ApaI o wielkości 4936 bp z klonu pET-3d-D3H Baboon i poddania ligacji wyizolowanego fragmentu z fragmentem NcoI-ApaI o wielkości 624 bp wyizolowanym z pUC18-Pig Uricase, prowadząc do wytworzenia pET-3d-PBC. cDNA urykazy PBC składa się z kodonów 1-225 urykazy świni połączonych w ramce z kodonami 226-304 urykazy pawiana.

Subklonowanie cDNA urykazy Pig-KS

Urykazę Pig-KS skonstruowano w celu dodania jednej reszty lizyny, która może dostarczać dodatkowego miejsca PEGylacji. KS oznacza wstawienie aminokwasu lizyny do urykazy świni, w pozycji

PL 215 285 B1

291, w miejsce argininy (R291K). Dodatkowo, treoniną w pozycji 301 została zastąpiona przez serynę (T301S). Plazmid z urykazą PigKS skonstruowano poprzez wyizolowanie fragmentu NcoI-NdeI o wielkości 4696 bp z pET-3d-D3H Baboon, a następnie ligację z fragmentem NcoI-NdeI o wielkości 864 bp wyizolowanym z pUC18-Pig Uricase, czego wynikiem było wytworzenie pET-3d-Pig-KS. Otrzymana w rezultacie sekwencja urykazy PigKS składa się z kodonów 1-288 połączonych w ramce z kodonami 289-304 urykazy pawiana.

Subklonowanie sekwencji urykazy regulowanej przez promotor osmB

Gen urykazy subklonowano w wektorze ekspresyjnym zawierającym promotor osmB (zgodnie ze wskazówkami patentu USA nr 5,795,776, włączonego tu w całości jako odniesienie). Wektor ten umożliwia indukcję ekspresji białka w odpowiedzi na wysokie ciśnienie osmotyczne albo starzenie się hodowli. Plazmid ekspresyjny pMFOA-16 zawierał promotor osmB, sekwencję miejsca wiązania rybosomów (rbs, od ang. ribosomal binding site) i sekwencję terminatora transkrypcji (ter). Nadaje on oporność na ampicylinę (AmpR) i wyraża rekombinowaną ludzką esterazę acetylocholiny (AChE, od ang. human acetylcholine esterase).

Subklonowanie D3H Baboon Uricase

Plazmid pMFOA-18 strawiono NcoI i BamHI i wyizolowano duży fragment. Konstrukt pET-3d-D3H Baboon Uricase strawiono NcoI i BamHI I i wyizolowano fragment o wielkości 960 bp, który zawierał gen D3H Baboon Uricase. Te dwa fragmenty poddano ligacji z wytworzeniem pMF0U18.

Plazmid ekspresyjny pMFXT133 zawierał promotor osmB, rbs (operon deo E. coli), ter (TrypA E. coli), rekombinowany polipeptyd inhibitora czynnika Xa (FxaI), i niesie gen oporności na tetracyklinę (TetR). Gen urykazy pawiana wstawiono do tego plazmidu w celu zamiany genów oporności na antybiotyk. Plazmid pMFOU18 strawiono NcoI, wypełniono końce, a następnie strawiono XhoI i wyizolowano fragment o wielkości 1030 bp. Plazmid pMFXT133 strawiono NdeI, wypełniono końce, a następnie strawiono XhoI i wyizolowano duży fragment. Dwa fragmenty poddano ligacji z wytworzeniem wektora ekspresyjnego dla urykazy pawiana, pURBA16.

Subklonowanie chimerowej urykazy świni-pawiana

Plazmid pURBA16 strawiono ApaI i AlwNI i wyizolowano fragment o wielkości 2320 bp. Plazmid pMFXT133 strawiono NdeI, wypełniono końce, a następnie strawiono AlwNI i wyizolowano fragment o wielkości 620 bp. Konstrukt pET-3d-PBC strawiono XbaI, wypełniono końce, a następnie strawiono ApaI i wyizolowano fragment o wielkości 710 bp. Trzy fragmenty poddano ligacji z wytworzeniem pURPB, plazmidu, który wyrażał urykazę PBC pod kontrolą promotora i rbs osmB, jak również rbs T7, który pochodził z wektora pET-3d.

Rbs T7 został wycięty w dodatkowym etapie. pUR-PB strawiono NcoI, wypełniono końce, a następnie strawiono AlwNI i wyizolowano fragment o wielkości 3000 bp. Plazmid pMFXT133 strawiono NdeI, wypełniono końce, a następnie strawiono AlwNI i wyizolowano fragment o wielkości 620 bp. Te dwa fragmenty poddano ligacji z pDUR-PB, który wyraża PBC pod kontrolą promotora osmB.

Konstrukcja pOUR-PB-ANC

Wprowadzono kilka zmian w cDNA urykazy, które prowadzą do zasadniczego zwiększenia stabilności rekombinowanego enzymu. Skonstruowano plazmid pOUR-PBC-ANC, w którym N-końcowy peptyd dojrzewania złożony z sześciu reszt i tripeptyd na końcu C, który działa in vivo jako sygnał kierujący do peroksysomów, obydwa zostały usunięte. Przeprowadzono to z użyciem sekwencji PBC w plazmidzie pDUR-PB i specyficznych starterów oligonukleotydowych zamieszczonych w Tabeli 2, przy zastosowaniu amplifikacji w reakcji PCR.

T a b e l a 2. Startery do amplifikacji urykazy PBC-ANC w reakcji PCR

Urykaza PBC-ANC:.................................................. i

Sensowny

5' gcgcatATGACTTACAAAAAGAATGATGAGGTAGAG 3’ (SEK NR ID: 5)

Antysensowny

5' ccgtctagaTT AAG ACAACTTCCTCTTGACTGTACCAGTAATTTTTCCGT ATGG 3^f (SEK NR ID: S)

Sekwencje enzymów restrykcyjnych wprowadzone na końcach starterów pokazane jako wytłuszczenie i regiony niekodujące są pokazane w Tabeli 2 małymi literami. NdeI jest sensowny, a XbaI jest antysensowny. Starter sensowny zastosowano również w celu wyeliminowania wewnętrznego miejsca restrykcyjnego NdeI poprzez wprowadzenie mutacji punktowej (podkreślona), która nie wpływa na sekwencję aminokwasową, a zatem ułatwiała subklonowanie przy zastosowaniu NaeI.

Fragment o wielkości 900 par zasad wytworzony poprzez amplifikację w reakcji PCR pDUR-PB przecięto NdeI i XbaI i wyizolowano. Otrzymany fragment wprowadzono następnie do plazmidu eks16

PL 215 285 B1 presyjnego deo, pDBAST-RAT-N, który niesie promotor deo-P1P2 i rbs pochodzący z E. coli i wyraża konstytutywnie prekursor ludzkiej rekombinowanej insuliny. Plazmid strawiono NdeI i XbaI i wyizolowano fragment o wielkości 4035 bp i poddano go ligacji z produktem PCR dla urykazy PBC. Otrzymany w rezultacie konstrukt, pDUR-PB-ANC, użyto do transformacji E. coli K-12 Sφ733 (F-cytR strA), która wyrażała wysokie poziomy aktywnej skróconej urykazy.

Podwójne skrócona sekwencja PBC-ANC została również wyrażona pod kontrolą promotora osmB. Plazmid pDUR-PB-ANC strawiono AlwNI - NdeI i wyizolowano fragment o wielkości 3459 bp. Plazmid pMFXT133, opisany powyżej, strawiono NdeI - AlwNI, i wyizolowano fragment o wielkości 660 bp. Fragmenty poddano następnie ligacji z wytworzeniem pOUR-PB-ANC, który został wprowadzony do szczepu E. coli K-12 W3110 F^- i wyrażał wysokie poziomy aktywnej skróconej urykazy.

Konstrukcja plazmidu ekspresyjnego dla urykazy pOUR-P^^ks-1

Plazmid ten skonstruowano w celu polepszenia stabilności rekombinowanego enzymu. Urykazę Pig-KS-ΔΝ skrócono jedynie na końcu N (ΔΝ), gdzie usunięty został N-końcowy peptyd dojrzewania złożony z sześciu reszt i zawierała ona mutatcje S46T, R291K i T301S. W pozycji 46 występowała reszta treoniny zamiast seryny na skutek mutacji konserwatywnej, która nastąpiła w czasie amplifikacji PCR i klonowania. W pozycji 291 lizyna zastąpiła argininę, a w pozycji 301 seryna została wstawiona zamiast treoniny. Obydwie reszty pochodziły z sekwencji urykazy pawiana Modyfikacje R291K i T301S są oznaczone jako KS i były dyskutowane powyżej. Dodatkowa reszta lizyny dostarczała dodatkowego potencjalnego miejsca PEGylacji.

W celu skonstruowania pOUR-P-AN-ks-1 (Fig. 1), plazmid pOUR-PB-ANC strawiono ApaI XbaI i wyizolowano fragment o wielkości 3873 bp. Plazmid pET-3d-PKS (konstrukcj a pokazana na Fig. 4) strawiono ApaI - SpeI i wyizolowano fragment o wielkości 270 bp. Cięcie SpeI pozostawia wystający w stronę 5' koniec CTAG, który był wydajnie łączony poprzez ligację z fragmentami DNA wytworzonymi przez XbaI. Te dwa fragmenty poddano ligacji z wytworzeniem pOUR-P-AN-ks-1. Po ligacji miejsca rozpoznawane przez enzymy SpeI i XbaI zostały utracone (ich miejsce jest pokazane w nawiasach na Fig. 9). Konstrukt pOUR-P-AN-ks-1 został wprowadzony do szczepu E. coli K-12 W3110 F^-, prototroficznego, ATCC#27325. Otrzymana w rezultacie urykaza Pig-KS-ΔΝ, wyrażana pod kontrolą promotora osmB, dawała wysokie poziomy rekombinowanego enzymu mającego lepszą aktywność i stabilność.

Na Figurze 1 przeastawiono strukturę plazmidu pOUR-Ρ-ΔΝ-ks-1. Numery obok miejsc restrykcyjnych wskazują pozycję nukleotydową w odniesieniu do miejsca HaeII, oznaczonego jako I.'Miejsca restrykcyjne, które zostały utracone w czasie klonowania są zaznaczone nawiasami. Plazmid pOUR-P-AN-ks-1, kodujący urykazę Pig-KS-ΔΝ ma długość 4143 par zasad (bp) i zawiera następujące elementy:

1. Fragment DNA o długości 113 bp, rozciągający się od nukleotydu numer 1 do miejsca NdeI (w pozycji 113), który zawiera promotor osmB i miejsce wiązania rybosomów (rbs).

2. Fragment DNA o długości 932 bp, rozciągający się od NdeI (w pozycji 113) do styku Spel/Xbal (w pozycji 1045), który zawiera: 900 bp region kodujący Pig-KS-ΔΝ (sekwencja kwasu nukleinowego dla końca aminowego białka skróconej urykazy świni, w którym aminokwasy 291 i 301 są zastąpione, odpowiednio, lizyną, seryną) i sekwencję flankującą o długości 32 bp pochodzącą z pCR™II, z miejsca klonowania TA przed miejscem restrykcyjnym Spel/Xbal.

3. Sekwencję z wieloma miejscami do klonowania (MCS, od ang. multiple cloning sites) o wielkości 25 bp od styku Spel/Xbal (w pozycji 1045) do HindIII (w pozycj i 1070).

4. Syntetyczny oligonukleotyd o wielkości 40 bp, zawierający terminator transktypcji TrpA (ter) z końcami HindIII (w pozycji 1070) i AatII (w pozycji 1110).

5. Fragment DNA o długości 1519 bp, rozciągający sie od miejsca AatII (w pozycji 1110) do MscI/Scal (w pozycji 2629) na pBR322, który zawiera gen oporności na tetracyklinę (TetR).

6. Fragment DNA o długości 1514 bp, rozciągający się od miejsca Scal (w pozycji 2629) do HaeII (w pozycji 4143) na pBR322, który zawiera początek replikacji.

Na Figurze 2 pokazano DNA i wydedukowane sekwencje aminokwasowe urykazy Pig-KS-ΔΝ. Na tym rysunku numeracja aminokwasów jest według kompletnej sekwencji urykazy świni. Po reszcie inicjacyjnej metioniny wstawiona została treonina w miejsce kwasu asparaginowego w sekwencji urykazy świni. Ta reszta treoninowa umożliwiała usuwanie metioniny przez bakteryjną aminopeptydazę. Przerwa w sekwencji aminokwasowej przedstawia usunięty N-końcowy peptyd dojrzewania. Wskazane są miejsca restrykcyjne, które zostały wykorzystane na różnych etapach subklonowania różnych

PL 215 285 B1 sekwencji urykazy (Apal, NdeI, BamHI, EcoRI i SpeI). Nie podlegająca translacji sekwencja 3', zapisana małymi literami, pochodziła z sekwencji pCR^TMII. Kodon stop dla translacji jest zaznaczony gwiazdką.

Na Figurze 3 pokazuje dopasowanie sekwencji aminokwasowych różnych sekwencji rekombinowanych urykaz. Górna linia przedstawia urykazę świni, która obejmuje pełną sekwencję aminokwasową. Druga linia to sekwencja podwójnie skróconej chimerowej urykazy świni-pawiana (PBC-ANC). Trzecia linia pokazuje sekwencję urykazy Pig-KS-ΔΝ, która jest skrócona jedynie na końcu N i zawiera mutacje S46T i zmiany aminokwasowe R291K i T301S, obydwie odzwierciedlające pochodzenie z pawiana końca karboksylowego sekwencji kodującej urykazę. Gwiazdka wskazuje pozycję, w której występują różnice aminokwasów w urykazie Pig-KS-ΔΝ w porównaniu z opublikowaną sekwencją urykazy świni; kółka wskazują na pozycje, w których występują różnice aminokwasów w Pig-KS-ΔΝ w porównaniu z PBC-ΔΝ, chimerze ze świni-pawiana; a linie przerywane wskazują delecje aminokwasów.

cDNA z natywnej urykazy pawiana, świni i królika, z mutacją Y97K oraz chimery ze świni/pawiana (PBC) skonstruowano do klonowania w E. coli. Klony wyrażające wysokie poziomy wariantów urykazy skonstruowano i wyselekcjonowano tak, że wszystkie były w E. coli W3110 F^-, a ekspresja była regulowana przez osmB. Plazmidowe DNA izolowano, sprawdzano poprzez sekwencjonowanie DNA i analizę enzymami restrykcyjnymi i komórki hodowano.

Konstrukcji skróconych urykaz, włączając w to pig-ΔΝ i Pig-KS-ΔΝ dokonano poprzez ligację krzyżową pomiędzy PBC-ANC i Pig-KS, a następnie cięcie endonukleazami restrykcyjnymi, odpowiednio, ApaI i XbaI oraz ApaI plus SpeI. Można było sądzić, że te skrócone mutanty zachowają aktywność, ponieważ sześć N-końcowych reszt, peptyd „dojrzewania (1-2), i C-końcowy tri-peptyd, „sygnał kierowania do peroksysomów (3-5), nie ma funkcji, która znacząco wpływa na aktywność enzymatyczną, a jest możliwe że te sekwencje mogą być immunogenne. Wybrano klony wyrażające bardzo wysokie poziomy urykazy.

P r z y k ł a d 2. Transformacja plazmidu ekspresyjnego do bakteryjnej komórki gospodarza

Plazmid ekspresyjny, pOUR-P-AN-ks-1, został wprowadzony do was szczepu E. coli K-12 W3110 F^-. Przygotowano komórki bakteryjne do transformacji, co obejmowało hodowanie do środka fazy logarytmicznej w buforze Luria (LB), następnie komórki zbierano poprzez wirowanie, przemywano zimną wodą i zawieszano w 10% glicerolu w wodzie w stężeniu około 3x10¹⁰ komórek na ml. Komórki przechowywano w porcjach w -70°C. Plazmidowy DNA wytrącano następnie etanolem i rozpuszczano w wodzie.

Komórki bakteryjne i plazmidowy DNA mieszano i przeprowadzano transformację przy zastosowaniu metody wysokonapięciowej elektroporacji z użyciem Gene Pulser II z BIO-RAD (Trevors i wsp. (1992). Electrotransformation of bacteria by plasmid DNA, w Guide to Electroporation and Electrofusion (D.C. Chang, B. M. Chassy, J. A. Saunders and A. E. Sowers, wyd.), str. 265-290, Academic Press Inc., San Diego, Hanahan i wsp. (1991) Meth. Enzymol., 204, 63-113). Transformowane komórki zawieszano w pożywce SOC (2% trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glukoza), inkubowano w 37°C przez 1 godzinę i poddawano selekcji pod kątem oporności na tetracyklinę. Wybrano klony o wysokiej ekspresji.

P r z y k ł a d 3. Wytwarzanie rekombinowanej urykazy

Bakterie, takie jak te transformowane (patrz wyżej), hodowano w pożywce zawierającej glukozę; pH utrzymywano na poziomie 7,2±0.2, w około 37°C.

W trakcie ostatnich 5-6 godzin hodowli, pożywka była uzupełniona KCl do końcowego stężenia 0,3 M. Hodowlę kontynuowano dla umożliwienia akumulacji urykazy.

Rekombinowana urykaza akumulowała się w komórkach bakteryjnych jako nierozpuszczalny precypitat podobny do ciał inkluzyjnych (IB, od ang. inclusion bodies). Zawiesinę komórek przemywano poprzez wirowanie i zawieszano 50 mM buforze Tris, pH 8,0 i 10 mM EDTA i doprowadzano do ostatecznej objętości około 40 razy sucha masa komórek.

IB zawierające rekombinowana urykazę izolowano poprzez wirowanie po rozbiciu komórek bakteryjnych przy użyciu Iizozymu i wysokiego ciśnienia. Traktowanie lizozymem (2000-3000 jednostek/ml) przeprowadzano przez 16-20 godzin przy pH 8,0 i 7±3°C, z mieszaniem. Osad przemywano wodą i przechowywano w -20°C do chwili użycia.

Wzbogacone IB puddawano dalszej obróbce po zawieszaniu w 50 mM buforze NaHCO3, pH 10,3±0,1. Zawiesinę inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej w celu umożliwienia upłynnienia urykazy pochodzącej z IB, a następnie klarowano poprzez wirowanie.

PL 215 285 B1

Urykazę oczyszczano następnie poprzez kilka etapów chromatografii. Na początek chromatografię przeprowadzono na kolumnie Q-Sepharose FF. Załadowaną kolumnę przemywano buforem wodorowęglanowym zawierającym 150 mM NaCl i urykazę wymywano buforem wodorowęglanowym zawierającym 250 mM NaCl. Następnie zastosowano złoże ksantyna-agaroza, Xanthine Agarose (Sigma) w celu usunięcia z preparatu urykazy niewielkich zanieczyszczeń. Wyciek z Q-Sepharose FF rozcieńczano 50 mM buforem glicynowym, pH 10,3±0,1, do stężenia białka około 0,25 mg/ml i nakładano na kolumnę. Kolumnę przemywano buforem wodorowęglanowym, pH 10,3±0,1, zawierającym 100 mM NaCl, i urykazę wymywano tym samym buforem uzupełnionym 60 μΜ ksantyną. Na tym etapie urykaza była ponownie czyszczona poprzez chromatografię na Q-Sepharose w celu usunięcia form zagregowanych.

Czystość każdego preparatu urukazy jest większa niż 95%, co oceniano poprzez sączenie molekularne. W każdym preparacie wykrywano przy zastosowaniu kolumny Superdex 200 mniej niż 0,5% zagregowanych form.

Tabela 3 podsumowuje oczyszczenie urykazy Pig-KSAN z IB pochodzących z 25 I buforu fermentacyjnego.

T a b e l a 3. Oczyszczanie urykazy Pig-KSAN

Etap oczyszczania	Białko(mg)	Aktywność (jedn.)	Aktywność specyficzna (jedn./mg)
Nierozpuszczalne IB	12748	47226	3,7
Klarowny roztwór	11045	44858	4,1
Q-Sepharose I - główna pula	7590	32316	4,3
Xanthine Agarose - główna pula	4860	26361	5,4
Q-Sepharose II - główna pula	4438	22982	5,2
Frakcja UF 30 kD	4262	27556	6,5

P r z y k ł a d 4. Charakterystyka rekombinowanych urykaz SDS-PAGE

Analiza SDS-PAGE wysoce oczyszczonych wariantów urykazy (Fig. 4) wykazała dość wyróżnialny wzór. Próbki przechowywano w 4°C, w buforze węglanowym, pH 10,3, do kilku miesięcy. Warianty pełnej długości, Pig, Pig-KS i PBC, wykazywały akumulację dwóch głównych produktów degradacji mających ciężar cząsteczkowy około 20 i 15 kD. Ta obserwacja sugeruje, że co najmniej pojedyncze cięcie dzieli cząsteczkę podjednostki urykazy. Inny wzór degradacji jest wykrywany dla klonów skróconych na końcu aminowym, a także dla urykazy królika, ale w mniejszej proporcji. Koniec aminowy królika przypomina ten dla skróconych klonów. Określono aminokońcowe sekwencje fragme n tów urykazy wytworzone w czasie oczyszczania i przechowywania.

Sekwencjonowanie peptydów

N-końcowe sekwencjonowanie dużych preparatów urykazy przeprowadzono przy zastosowaniu metody degradacji Edmana. Przeprowadzono dziesięć cykli. Rekombinowana urykaza Pig (klon pełnej długości) dawała więcej fragmentów degradacji w porównaniu z urykazą Pig-KS-ΔΝ. Wydedukowane miejsca cięcia prowadzące do fragmentów degradacji są jak następuje:

1) Główne miejsce w pozycji 168 mające sekwencję:

--QSG i FEGFI-2) Drugorzędne miejsce w pozycji 142 mające sekwencję:

--IRN i GPPVI-Powyższe sekwencje nie sugerują żadnego znanego miejsca proteolitycznego. Pomimo tego, cięcie może nastąpić bądź na skutek proteolizy bądź jakiejś reakcji chemicznej. Urykazy skrócone na końcu aminowym są zaskakująco bardziej stabilne niż urykazy nie skrócone na końcu aminowym. PBC-ANC miała również stabilność podobną do innych cząsteczek ΔΝ i mniejszą niż PBC bez skrócenia aminowego.

Aktywność

Aktywność urykazy mierzono metodą UV. Szybkość reakcji enzymatycznej określano poprzez pomiar zmniejszenia absorbancji przy 292 nm będącej wynikiem utleniania kwasu moczowego do alantoiny. Jedna jednostka aktywności jest zdefiniowana jako ilość urykazy wymagana do utlenienia

PL 215 285 B1 jednego μmola kwasu moczowego na minutę w 25°C, w podanych warunkach. Moc urykazy jest wyrażana w aktywnościach na mg białka (jedn./mg).

-1 -1

Współczynnik ekstynkcji 1 mM kwasu moczowego przy 292 nm wynosi 12,2 mM^-1 cm^-1. A zatem utlenienie 1 μmola kwasu moczowego na ml mieszaniny reakcyjnej prowadziło do zmniejszenia absorbancji wynoszącego 12,2 mA292. Zmiana absorbancji w czasie (ΔΑ292 na minutę) pochodziła z liniowej części krzywej.

Stężenie białka określano przy zastosowaniu zmodyfikowanej metody Bradford (Macart i Gerbaut (1982) Clin Chim Acta 122:93-101). Aktywność specyficzną (moc) urykazy obliczano dzieląc aktywność w jedn./ml przez stężenie w mg/ml. Wyniki aktywności enzymatycznej dla różnych rekombinowanych urykaz są zestawione w Tabeli 4. Wyniki preparatów handlowych są włączone do tej tabeli jako wartości odnośnikowe. Widać z tych wyników, że skrócenie białek urykazy nie ma znaczącego wpływu na ich aktywność enzymatyczną.

T a b e l a 4. Podsumowanie parametrów kinetycznych natywnych urykaz

Urykazy	Stężenie(1) roztworu podstawowego (mg/ml)	Aktywność specyficzna (jedn./mg)(2)	Km(4) ^M kwasu moczowego)	Kcat (5) (1/min.)
Rekombinowana
Świni	0,49	7,41	4,39	905
Pig-AN	0,54	7,68	4,04	822
Pig-KS	0,33	7,16	5,27	1085
Pig-KS-AN	1,14	6,20	3,98	972
PBC	0,76	3,86	4,87	662
PBC-ANC	0,55	3,85	4,3	580
Królika	0,44	3,07	4,14	522
Natywna
Świni (Sigma)	2,70	3,26(3)	5,85	901
A.flavus 9merck)	1,95	0,97(3)	23,54	671

Przypisy do Tabeli 4:

(1) Stężenie białka określano poprzez absorbancję mierzoną przy 278 nm, stosując współczynnik ekstynkcji 11,3 dla roztworu urykazy 10 mg/ml (Mahler, 1963).

(2) 1 jednostka aktywności urykazy jest zdefiniowana jako ilość enzymu, która utlenia 1 μmol kwasu moczowego do alantoiny na minutę, w 25°C.

(3) Wartości aktywności specyficznej pochodziły z wykresów Lineweaver-Burk przy stężeniu substratu równym 60 μΜ.

(4) Mieszaniny reakcyjne składały się z różnych kombinacji następujących roztworów podstawowych

100 mM buforu-boranu sodowego, pH 9,2

300 μΜ kwasu moczowego w 50 mM buforze-boranie sodowym, pH 9,2 mg/ml BSA w 50 mM buforze-boranie sodowym, pH 9,2 (5) Kcat obliczono poprzez podzielenie Vmax (obliczonej z odpowiednich wykresów Lineweaver-Burk) przez stężenie urykazy w mieszaninie reakcyjnej (wyrażone w równoważnikach molowych, w oparciu o masę cząsteczkową tetramerycznych urykaz).

P r z y k ł a d 5. Sprzęganie urykazy z m-PEG (PEGylacja)

Urykaza Pig-KS-ΔΝ była sprzęgana przy zastosowaniu m-PEG-NPC (węglan monometoksypoli(etylenoglikolo)-nitrofenylu). Ustalono warunki dajace 2 - 12 nici 5, 10 lub 20 kD PEG na podjednostkę urykazy. m-PEG-NPC dodawano stopniowo do roztworu białka. Po zakończeniu dodawania PEG, mieszaninę reakcyjną urykaza/m-PEG-NPC inkubowano w 2-8°C przez 16-18 godzin, aż maksymalna liczba niezwiązanych nici m-PEG przyłączyła się do urykazy.

PL 215 285 B1

Liczbę nici PEG na monomer PEG-urykaza określono poprzez sączenie molekularne (SEC, od ang. size exclusion chromatography), na Superose 6, stosując jako standardy PEG i urykazę. Liczbę związanych nici PEG na podjednostkę określano przy zastosowaniu następującego równania:

Nici PEG 3,42 x Ilość PEG we wstrzykiwanej próbce ^g) /podjednostkę = Ilość białka we wstrzykiwanej próbce ^g)

Stężenie PEG i reszt białkowych w próbce PEG-urykaza ustalano poprzez sączenie molekularne (SEC) przy zastosowaniu detektorów nadfioletu (UV) i współczynnika załamania (RI) ustawionych szeregowo (opracowane przez Kunitani i wsp., 1991). Wytworzono trzy krzywe kalibracyjne: krzywą białkową (absorpcja mierzona przy 220 nm); krzywą białkową (mierzona przez RI) i krzywą PEG (mierzoną poprzez RI). Następnie próbki PEG-urykaza analizowano przy zastosowaniu tego samego systemu. Otrzymane w rezultacie wartości powierzchni pod pikami UV i RI próbek eksperymentalnych zastosowano do obliczenia stężeń PEG i białka w stosunku do krzywych kalibracyjnych. Współczynnik 3,42 to stosunek masy cząsteczkowej monomeru urykazy (34192 Daltonów) do masy 10 kD PEG.

Przyłączenie PEG poprawiało rozpuszczalność urykazy w roztworach mających fizjologiczne wartości pH. Tabela 5 wskazuje na zróżnicowanie pomiędzy partiami produktu - PEGylowanej urykazy Pig-KS-ΔΝ. Generalnie, istnieje odwrotna proporcja pomiędzy liczbą przyłączonych nici PEG i zachowaniem specyficznej aktywności (SA) enzymu.

T a b e l a 5

Aktywność enzymatyczna koniugatów PEGylowanej urykazy Pig-KS- ΔΝ

Partie koniugatu	PEG MW (kD)	Nici PEG na pod- jednostkę urykazy	SA urykazy (U/mg)	SA-procent kontroli
Pig-KS-AN	-	-	8,2	100
1-17 #	5	9,7	5,8	70,4
LP-17	10	2,3	7,8	94,6
1-15 #	10	5,1	6,4	77,9
13 #	10	6,4	6,3	76,9
14 #	10	6,5	6,4	77,5
5-15 #	10	8,8	5,4	65,3
5-17 #	10	11,3	4,5	55,3
4-17 #	10	11,8	4,4	53,9
1-18 #	20	11,5	4,5	54,4

P r z y k ł a d 6. PEGylacja urykazy przez PEG 1000 D i 100000 D

Urykaza Pig-KS-ΔΝ została połączona z m-PEG-NPC 1000 D i 100000 D, jak opisano w przykładzie 5. Zastosowano warunki, w których uzyskiwano 2-11 nici PEG na podjednostkę urykazy. Po zakończeniu dodawania PEG, mieszanina reakcyjna urykaza/m-PEG-NPC była inkubowana w 2-8°C przez 16-18 godzin, aż maksymalna liczba niezwiązanych nici m-PEG przyłączyła się do urykazy.

Liczbę nici PEG na monomer PEG-urykaza określono jak opisano powyżej.

Przyłączenie PEG poprawiało rozpuszczalność urykazy w roztworach mających fizjologiczne wartości pH.

P r z y k ł a d 7. Farmakokinetyka urykazy Pig-KS-AN połączonej z PEG

Przeprowadzono doświadczenia biologiczne w celu określenia optymalnego zakresu i wielkości PEGylacji niezbędnej dla dostarczenia korzyści terapeutycznej.

Badania farmakokinetyczne na szczurach, przy zastosowaniu zastrzyków dożylnych (i.v.) z 0,4 mg (2 jedn.) na kg wagi ciała niezmodyfikowanej urykazy, podawanej w dniu 1 i dniu 8, dawało okres półtrwania w obiegu około 10 minut. Jednakże badania szybkości klirensu u szczurów dla 2-11x10 kD urykazy PEG-Pig-KS-ΔΝ, po aż 9 cotygodniowych zastrzykach, wskazywały, że klirens nie zależy od liczby nici PEG (w tym zakresie) i pozostawał stosunkowo stały w trakcie okresu badania (patrz Tabela 6; z okresem półtrwania około 30 godzin). Różnice od tygodnia do tygodnia są w zakresie błędu eksperymentalnego. Ten sam wzór jest widoczny po dziewięciu wstrzyknięciach koniugatów 10x5kD PEG- i 10x20kD PEG-urykaza. Wyniki wskazują, że w modelu szczurzym niezależnie od stopnia PEGylacji urykazy, w tym zakresie, obserwowane były podobne efekty biologiczne.

PL 215 285 B1

T a b e l a 6. Okresy półtrwania preparatów PEGylowanej urykazy Pig-KS-ΔΝ u szczurów

	Stopień modyfikacji (nici PEG na podjednostkę urykazy)
5kD PEG	10kD PEG	20kD PEG
Tydzień	10x	2x	5x	7x	9x	11x	10x
1	25,7±1,7	29,4±3,4	37,7±3,1	37,6±3,9	36,9±4,3	31,4±4,3	21,6±1,5
(5)	(5)	(5)	(5)	(5)	(5)	(5)
2				26,7±3,0	28,4±1,6
			(5)	(5)
3	27,5±3,8	29,0±2,6	29,9±11,7	32,7±11,1	26,3±4,7	11,8±3,3	14,5±2,7
(5)	(5)	(5)	(5)	(5)	(5)	(5)
4			27,1±5,3	18,4±2,2	19,7±5,6
		(5)	(4)	(4)
5	28,6±1,7	22,5±2,7	34,4±3,9	37,3±3,0	30,4±3,6	30,5±1,3	19,3±2,5
(5)	(5)	(4)	(5)	(5)	(5)	(5)
6			35,4±3,1	27,1±3,6	30,7±2,9
		(14)	(13)	(13)
7	16,5±4,9	32,5±4,3				16,12±2,7	25,8±2,5
(5)	(5)				(5)	(5)
8	-	-	-	-	-	-	-
9	36,8±4,0	28,7±2,7	34,0±2,4	24,2±3,4	31,0±2,6	29,3±1,4	26,7±0,5
(15)	(15)	(13)	(13)	(13)	(15)	(15)

Przypisy do Tabeli 4:

Wyniki są wskazane w godzinach ± błędy standardowe średniej. Numery w nawiasach wskazują na liczbę testowanych zwierząt.

Szczury otrzymywały co tydzień i.v. zastrzyki z 0,4 mg na kg wagi ciała urykazy Pig-KS-ΔΝ zmodyfikowanej jak wskazano w tabeli. Każda grupa wyjściowo obejmowała 15 szczurów, które były na kolejno skrwawiane w podgrupach po 5. Kilka szczurów zdechło w czasie tego badania na skutek znieczulenia. Okres półtrwania określano poprzez pomiar aktywności urykazy (test kolorymetryczny) w próbkach osocza zbieranych w 5 minucie, 6, 24 i 48 godzinie po zastrzyku.

Tabela 5 opisuje partie PEGylowanej urykazy użytej w tych badaniach.

Badania biodostępności dla urykazy 6x5 kD PEG-Pig-KS^N u królików wskazuje, że po pierwszym zastrzyku okres półtrwania w obiegu wynosi 98,2±1,8 godzin (i.v.), a biodostępność po wstrzyknięciu domięśniowym (i.m.) i podskórnym (s.c.) wynosiła, odpowiednio, 71% i 52%. Jednakże, wykrywano znaczące miana przeciwciała anty-urykaza po drugim zastrzyku i.m. i s.c. u wszystkich królików i klirens był przyspieszony po następnych zastrzykach. Wstrzyknięcie szczurom tych samych koniugatów prowadziło do czasu półtrwania 26±1,6 godzin (i.v.), a biodostępność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 33% i 22%.

Badania na szczurach z urykazą 9x10 KD PEG-Pig-KS-ΔΝ wskazują, że okres półtrwania w obiegu po pierwszym zastrzyku w wynosi 42,4 godzin (i.v.), a biodostępność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 28,9% i 14,5% patrz Fig. 5 i Tabela 7). Po czwartym zastrzyku okres półtrwania w obiegu wynosił 32,1±2,4 godziny, a biodostępność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 26,1% i 14,9%.

Podobne badania farmakokinetyczne, u królików dla urykazy 9x10 kD PEG-Pig-KS-ΔΝ wskazują, że nie obserwuje się przyspieszonego klirensu po wstrzyknięciu tego koniugatu (podawano 4 zastrzyki co dwa tygodnie). U tych zwierząt okres półtrwania w obiegu po pierwszym zastrzyku wynosił 88,5 godzin (i.v.), a biodostępność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 98,3% i 84,4%. (patrz Fig. 6 i Tabela 7). Po czwartym zastrzyku okres półtrwania w obiegu wynosił 141,1±15,4 godziny, a biodostępność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 85% i 83%.

Podobne badania farmakokinetyczne dla urykazy 9x10 kD PEG-Pig-KS-ΔΝ przeprowadzono w celu zbadania biodostępności u psów rasy beagle (2 samce i 2 samice w każdej grupie). Okres

PL 215 285 B1 półtrwania w obiegu zanotowano jako 70±11,7 godzin po pierwszym zastrzyku i.v., a biodostępność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 69,5% i 50,4% (patrz Fig. 7 i Tabela 7).

Badanie z preparatami urykazy 9x10 kD PEG-Pig-KS-ΔΝ przeprowadzono z użyciem świń. Trzy zwierzęta na grupę użyto do podawania drogami i.v., s.c. i i.m. Okres półtrwania w obiegu zanotowano jako 178±24 godzin po pierwszym zastrzyku i.v., a biodostepność po wstrzyknięciu i.m. i s.c. wynosiła, odpowiednio, 71,6% i 76,8% (patrz Fig. 8 i Tabela 7).

T a b e l a 7. Badania farmakokinetyczne z urykazą 9x10 kD PEG-Pig-KS-ΔΝ

Zastrzyk #	Okres półtrwania (godziny)	Biodostępność
i.v.	i.m.	s.c.
Szczury
1	42,4±4,3	28,9%	14,5%
2	24,115,0	28,9%	14,5%
4	32,1 ±2,4	26,1%	14,9%
Króliki
1	88,5±8,9	98,3%	84,4%
2	45,7±40,6	100%	100%
4	141,1±15,4	85%	83%
Psy
1	70,0±11,7	69,5%	50,4%
Świnie
1	178±24	71,6%	76,8%

Badania abspopcji, dystrybucji, metabolizmu i wydalania (ADME, od ang. Absorption, distribution, metabolism, and excretion) wykonano po jodowaniu urykazy 9x10 kD PEG-Pig-KS-ΔΝ stosując

125 metodę Bolton & Hunter przy użyciu ¹²⁵I. Wyznakowany koniugat wstrzyknięto 7 grupom, każda po 4 szczury (2 samce i 2 samice). Dystrybucję radioaktywności analizowano po I godzinie i co 24 godziny przez 7 dni (z wyjątkiem dnia 5). Każda grupę kolejno uśmiercano i różne narządy wycinano i analizowano. Siódmą grupę trzymano w klatce metabolicznej, z której zbierano mocz i kał. Dystrybucję materiału w ciele zwierzęcia oceniano poprzez pomiar całkowitej radioaktywności w każdym narządzie i frakcję zliczeń (nerka, wątroba, płuco i śledziona), która była dostępna do wtrącania TCA (tj.) związane białko, normalizowane w stosunku do rozmiaru narządu). Spośród narządów, które zostały wycięta, żaden nie miał wyższej radioaktywności specyficznej niż inne, a zatem nie obserwowano znaczącej akumulacji, na przykład w wątrobie albo nerce. 70% radioaktywności była wydalana przed upływem 7 dnia.

P r z y k ł a d 8. Wyniki testów klinicznych

Przeprowadzono randomizowane, otwarte, wieloośrodkowe, równoległe badania grupowe w celu zbadania odpowiedzi na moczan i profile bezpieczeństwa PEG-urykazy (Puricase®, Savient Pharmaceuticals) u pacjentów-ludzi z hiperurykemią i ostrą dną moczanową, którzy nie odpowiadali albo nie tolerowali konwencjonalnej terapii. Średni czas choroby wynosił 14 lat i 70 procent badanej populacji miało jeden albo więcej guzków dnawych.

W tym badaniu 41 pacjentów (średnia wieku 58,1 lat) randomizowano do 12 tygodni leczenia dożylną PEG-urykazą w jednym z czterech trybów dawkowania: 4 mg co dwa tygodnie (7 pacjentów); 8 mg co dwa tygodnie (8 pacjentów); 8 mg co dwa tygodnie (13 pacjentów); lub 12 mg co cztery tygodnie (13 pacjentów). Aktywność urykazy w osoczu i poziomy moczanu mierzono w określonych odstępach czasu. Parametry farmakokinetyczne, średnie stężenie moczanu w osoczu i procent czasu, kiedy poziom moczanu w osoczu był mniejszy niż lub równy 6 mg/dl pochodziły z analiz aktywności urykazy i poziomów moczanu.

PL 215 285 B1

Pacjenci, którzy otrzymywali 8 mg PEG-urykazy co dwa tygodnie mieli większe zmniejszenie

PUA, z poziomami poniżej 6 mg/dl przez 92 procent czasu leczenia (poziom moczanu w osoczu sprzed leczenia 9,1 mg/dl vs. średni poziom moczanu w osoczu 1,4 mg/dl na przestrzeni 12 tygodni).

Zasadnicze i utrzymujące się niższe poziomy moczanu w osoczu obserwowano również w innych grupach dawek przy traktowaniu PEG-urykaza: PUA poniżej 6 mg/ml przez 86 procent czasu leczenia w grupie 8 mg co cztery tygodnie (poziom moczanu w osoczu sprzed leczenia 9,1 mg/dl vs. średni poziom moczanu w osoczu 1,4 mg/dl na przestrzeni 12 tygodni); PUA poniżej 6 mg/ml przez 84 procent czasu leczenia w grupie 12 mg co cztery tygodnie (poziom moczanu w osoczu sprzed leczenia 8,5 mg/dl vs. średni poziom moczanu w osoczu 2,6 mg/dl na przestrzeni 12 tygodni) i PUA poniżej 6 mg/ml przez 73 procent czasu leczenia w grupie 4 mg co cztery tygodnie (poziom moczanu w osoczu sprzed leczenia 7,6 mg/dl vs. średni poziom moczanu w osoczu 4,2 mg/dl na przestrzeni 12 tygodni).

Maksymalny procent zmniejszenia poziomu kwasu moczowego w osoczu w stosunku do poziomu podstawowego w czasie pierwszych 24 godzin podawania dawki PEG-urykazy wynosił 72% dla osobników otrzymujących 4 mg/2 tygodnie (p wynosi 0,0002); 94% dla osobników otrzymujących 8 mg/2 tygodnie (p mniej niż 0,0001); 87% dla osobników otrzymujących 8 mg/4 tygodnie (p mniej niż 0,0001); i 93% dla osobników otrzymujących 12 mg/4 tygodnie (p mniej niż 0,0001).

Procent zmniejszenia poziomu kwasu moczowego w osoczu w stosunku do poziomu podstawowego w okresie 12-tygodni leczenia wynosił 38% dla osobników otrzymujących 4 mg/2 tygodnie (p wynosi 0,0002); 86% dla osobników otrzymujących 8 mg/2 tygodnie (p mniej niż 0,0001); 58% dla osobników otrzymujących 8 mg/4 tygodnie (p mniej niż 0, 0001); i 67% dla osobników otrzymujących 12 mg/4 tygodnie (p mniej niż 0, 0001).

Ku zaskoczeniu, niektóre osoby otrzymujące PEG-urykazę doświadczały związanych z wlewem efektów ubocznych, tj. reakcji na wlew. Te reakcje następowały w 14% wszystkich wlewów.

Wszystkie zacytowane tu odnośniki są tu włączone w całości jako odniesienie i dla wszystkich celów w takim samym zakresie jak gdyby każda indywidualna publikacja albo zgłoszenie patentowe były konkretnie i indywidualnie wskazane aby zostać włączone jako odniesienie w całości dla wszystkich celów.

Można dokonać wielu modyfikacji i odmian niniejszego wynalazku bez odchodzenia od jego ducha i zakresu, co będzie oczywiste dla specjalistów w dziedzinie. Konkretne opisane tu wykonania są przedstawione jedynie jako przykład i wynalazek ma być ograniczony jedynie przez załączone zastrzeżenia, łącznie z pełnym zakresem równoważników, których te zastrzeżenia dotyczą.

PL 215 285 B1

Lista sekwencji <110> Savient Pharmaceuticals, Inc.

Hartman, 3acob Mendelovitz, Simona <120> Warianty oksydazy moczanowej i ich zastosowanie <130> 103864-146638 <150> US 60/670,573 <151> 2005-04-11 <160> 16 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22O>

<223> urykaza z wątroby świni (sensowna) <400> 1 gcgcgaattc catggctcat taccgtaatg actaca 36 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Urykaza z wątroby świni (antysensowna) <400> 2 gcgctctaga agcttccatg gtcacagcct tgaagtcagc 40 <210> 3 <211> 35 <2ł2> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> urykaza z wątroby pawiana (D3n) (sensowna) <400> 3 gcgcgaattc catggcccac taccataaca actat 35 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22O>

<223> urykaza z wątroby pawiana (D3H) (antysensowna) <400> 4 gcgcccatgg tctagatcac agtcttgaag acaacttcct 40 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

PL 215 285 B1 <220>

<223> Urykaza PBC-DeltaNC (sensowna) <400> 5 gcgcatatga cttacaaaaa gaatgatgag gtagag 36 <210> 6 <211> 54 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22O>

<223> urykaza PBC-DeltaNC (antysensowna) <400> 6 ccgtctagat taagacaact tcctcttgac tgtaccagta atttttccgt atgg 54 <21O> 7 <211> 299 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22O>

<223> Pig-KS-DeltaN <400> 7

Met Thr 1

Tyr Lys

Lys 5

Asn

Asp Glu Val

Glu Phe Val 10

Arg

Thr

Gly 15

Tyr

Gly

Lys

Asp

Met 20

Ile

Lys

Val

Leu

Hi 5 25

ile

Gin

Arg

Asp

Gly 30

Lys

Tyr

HIS

Ser

ile

Lys

Glu

Val

Ala

Thr

Thr

val

Gin

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

35

40

45

Lys

Lys

Asp

Tyr

Leu

Hi s

Gly

Asp

Asn

Ser

Asp

val

ile

pro

Thr

ASP

50

55

60

Thr

ile

Lys

Asn

Thr

val

Asn

Val

Leu

Ala

Lys

Phe

Lys

Gly

ile

Lys

65

70

75

80

Ser

Ile

Glu

Thr

Phe

Ala

val

Thr

ile

Cys

Glu

His

Phe

Leu

Ser

Ser

85

90

95

phe

Lys

His

Val

ile

Arg

Ala

Gin

val

Tyr

Val

Glu

Glu

Val

Pro

Trp

100

105

110

Lys

Arg

Phe

Glu

Lys

Asn

Gly

val

Lys

His

val

HIS

Ala

Phe

Ile

Tyr

115

120

125

Thr

pro

Thr

Gly

Thr

His

Phe

Cys

Glu

Val

Glu

Gin

Ile

Arg

Asn

Gly

130

135

140

Pro

Pro

val

Ile

Hi S

Ser

Gly

ile

Lys

Asp

Leu

Lys

Val

Leu

Lys

Thr

145

150

155

160

PL 215 285 B1

Thr

Gln

Ser

Gly

Phe 165

Glu

Gly

Phe

ile

Lys 170

Asp

Gln

Phe

Thr

Thr 175

Leu

Pro

Glu

val

Lys

ASP

Arg

Cys

Phe

Ala

Thr

Gln

Val

Cys

Lys

Trp

180

185

190

Arg

Tyr

Hi s

Gln

Gly

Arg

Asp

Val

Asp

Phe

Glu

Ala

Thr

Trp

Asp

Thr

195

200

205

Val

Arg

Ser

ile

val

Leu

Gln

Lys

Phe

Al a

Gly

Pro

Tyr

Asp

Lys

Gly

210

215

220

Glu

Tyr

ser

pro

ser

Va1

Gln

Lys

Thr

Leu

Tyr

ASP

He

Gln

val

Leu

225

230

235

240

Thr

Leu

Gly

Gln

val

Pro

Glu

Ile

Glu

Asp

wet

Glu

ile

Ser

Leu

Pro

245

2 50

255

Asn

ile

His

Tyr

Leu

Asn

ll e

Asp

Met

Ser

Lys

Met

Gly

Leu

ile

Asn

260

265

270

Lys

Glu

Glu

val

teu

Leu

Pro

Leu

Asp

Asn

Pro

Tyr

Gly

tys

Ile

Thr

275

280

285

Gly

Thr

val

Lys

Arg

Lys

Leu

Ser

ser

Arg

Leu

290 295 <210> 8 <211> 298 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <22O>

<223> Pig-KS-DeltaN bez startowej Met <400> 8

Thr Tyr Lys 1

Lys Asn 5

Asp

Glu val Glu Phe Val Arg Thr 10

Gly

Tyr 15

Gly

Lys

ASP

Met

Ile

Lys

val

Leu

HIS

ile

Gln

Arg

Asp

Gly

Lys

Tyr

Hi s

20

25

30

Ser

ile

Lys

Glu

val

Ala

Thr

Thr

val

Gln

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

Lys

35

40

45

Lys

Asp

Tyr

Leu

His

Gly

Asp

Asn

ser

Asp

val

Ile

Pro

Thr

Asp

Thr

50

55

60

Ile

Lys

Asn

Thr

Val

Α5Π

val

Leu

Ala

Lys

Phe

Lys

Gly

Ile

Lys

Ser

65

70

75

80

Ile

Glu

Thr

Phe

Ala

val

Thr

ile

Cys

Glu

His

Phe

Leu

Ser

Ser

Phe

85

90

95

PL 215 285 B1

Lys

HIS

val

ile Arg Ala Gin val Tyr Val

Glu

Glu

val

Pro

Trp

Lys

100

105

Arg

Phe

Glu

Lys

Asn

Gly

val

Lys

His

val

His

Ala

Phe

ile

Tyr

Thr

115

120

125

Pro

Thr

Gly

Thr

Hi s

phe

cys

Glu

val

Glu

Gin

ile

Arg

Asn

Gly

pro

130

135

140

Pro

Val

ile

His

Ser

Gly

ile

Lys

Asp

Leu

Lys

val

Leu

Lys

Thr

Thr

145

150

155

160

Gin

Ser

Gly

Phe

Glu

Gly

Phe

ile

Lys

Asp

Gin

Phe

Thr

Thr

Leu

Pro

165

170

175

Glu

val

Lys

Asp

Arg

Cys

Phe

Ala

Thr

Gin

val

Tyr

cys

Lys

Trp

Arg

180

185

190

Tyr

His

Gin 195

Gly

Arg

Asp

val

Asp 200

Phe

Gl u

Ala

Thr

Trp 205

ASp

Thr

Val

Arg

ser

Ile

val

Leu

Gin

Lys

Phe

Ala

Gly

Pro

Tyr

Asp

Lys

Gly

Glu

210

215

220

Tyr

Ser

pro

Ser

Val

Gin

Lys

Thr

Leu

Ty r

Asp

ile

Gin

Val

Leu

Thr

225

230

235

240

Leu

Gly

Gin

Val

Pro

Glu

Ile

Glu

Asp

Met

Glu

ile

Ser

Leu

Pro

Asn

245

250

255

ile

His

Tyr

Leu

Asn

ile

Asp

Met

Ser

Lys

Met

Gly

Leu

Ile

Asn

Lys

260

265

270

Glu

Glu

val

Leu

Leu

Pro

Leu

Asp

Asn

Pro

Tyr

Gly

Lys

Ile

Thr

Gly

275

280

285

Thr

Val

Lys

Arg

Lys

Leu

Ser

Ser

Arg

Leu

290

295

<210> 9 <213> 897 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22O>

<223> Pig-KS-DeltaNA <400> 9 atgacttaca aaaagaatga tgaggtagag tttgtccgaa ctggctatgg gaaggatatg 60 ataaaagttc tccatattca gcgagatgga aaatatcaca gcattaaaga ggtggcaact 120 acagtgcaac tgactttgag ctccaaaaaa gattacctgc atggagacaa ttcagatgtc 180

PL 215 285 B1

atccctacag acaccatcaa gaacacagtt aatgtcctgg cgaagttcaa aggcatcaaa	240
agcatagaaa cttttgctgt gactatctgt gagcatttcc tttcttcctt caagcatgtc	300
atcagagctc aagtctatgt ggaagaagtt ccttggaagc gttttgaaaa gaatggagtt	360
aagcatgtcc atgcatttat ttatactcct actggaacgc acttctgtga ggttgaacag	420
ataaggaatg gacctccagt cattcattct ggaatcaaag acctaaaagt cttgaaaaca	480
acccagtctg gctttgaagg attcatcaag gaccagttca ccaccctccc tgaggtgaag	540
gaccggtgct ttgccaccca agtgtactgc aaatggcgct accaccaggg cagagatgtg	600
gactttgagg ccacctggga cactgttagg agcattgtcc tgcagaaatt tgctgggccc	660
tatgacaaag gcgagtactc gccctctgtc cagaagacac tctatgacat ccaggtgctc	720
accctgggcc aggttcctga gatagaagat atggaaatca gcctgccaaa tattcactac	780
ttaaacatag acatgtccaa aatgggactg atcaacaagg aagaggtctt gctaccttta	840
gacaatccat atggaaaaat tactggtaca gtcaagagga agttgtcttc aagactg	897
<210» 10 <211» 894 <212» DNA <213» Sekwencja sztuczna <220> <223» Pig-KS-DeltaN bez startowej ATG <400» 10 acttacaaaa agaatgatga ggtagagttt gtccgaactg gctatgggaa ggatatgata	60
aaagttctcc atattcagcg agatggaaaa tatcacagca ttaaagaggt ggcaactaca	120
gtgcaactga ctttgagctc caaaaaagat tacctgcatg gagacaattc agatgtcatc	180
cctacagaca ccatcaagaa cacagttaat gtcctggcga agttcaaagg catcaaaagc	240
atagaaactt ttgctgtgac tatctgtgag catttccttt cttccttcaa gcatgtcatc	300
agagctcaag tctatgtgga agaagttcct tggaagcgtt ttgaaaagaa tggagttaag	360
catgtccatg catttattta tactcctact ggaacgcact tctgtgaggt tgaacagata	420
aggaatggac ctccagtcat tcattctgga atcaaagacc taaaagtctt gaaaacaacc	480
cagtctggct ttgaaggatt catcaaggac cagttcacca ccctccctga ggtgaaggac	540
cggtgctttg ccacccaagt gtactgcaaa tggcgctacc accagggcag agatgtggac	600
tttgaggcca cctgggacac tgttaggagc attgtcctgc agaaatttgc tgggccctat	660
gacaaaggcg agtactcgcc ctctgtccag aagacactct atgacatcca ggtgctcacc	720
ctgggccagg ttcctgagat agaagatatg gaaatcagcc tgccaaatat tcactactta	780
aacatagaca tgtccaaaat gggactgatc aacaaggaag aggtcttgct acctttagac	840
aatccatatg gaaaaattac tggtacagtc aagaggaagt tgtcttcaag actg	894

<210» 11 <211> 304 <212» PRT <213» Sus scrofa

PL 215 285 B1 <400> 11

Met

Ala

His

Tyr

Arg

Asn

Asp

Tyr

Lys

Lys

Asn

Asp

Glu

Val

Glu

Phe

ł

5

10

15

val

Arg

Thr

Gly 20

Tyr

Gly

Lys

ASP

Met 25

ile

Lys

val

Leu

His 30

ile

Gl n

Arg

Asp

Gly 35

Lys

Yy p

His

Ser

ile 40

Lys

Glu

Val

Ala

Thr 45

ser

val

Gln

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

tys

Lys

Asp

Yy f·

Leu

His

Gly

Asp

Asn

Ser

Asp

50

55

60

val

Ile

Pro

Thr

Asp

Thr

ile

Lys

Asn

Thr

Val

Asn

val

Leu

Ala

Lys

65

70

75

80

Phe

Lys

Gly

Ile

Lys

ser

Ile

Glu

Thr

Phe

Ala

val

Thr

ile

Cys

Glu

85

90

95

Hi s

Phe

Leu

Ser

Ser

Phe

Lys

His

val

li e

Arg

Ala

Gln

val

Tyr

val

100

105

110

Glu

Glu

val

Pro

Trp

Lys

Arg

Phe

Glu

Lys

Asn

Gly

Val

Lys

His

Val

115

120

125

His

Ala

Phe

Ile

Tyr

Thr

Pro

Thr

Gly

Thr

His

Phe

Cys

Glu

Val

Glu

130

135

140

Gln

Ile

Arg

Asn

Gly

Pro

pro

val

ile

His

Ser

Gly

ile

Lys

Asp

Leu

145

150

155

160

Lys

Val

Leu

Lys

Thr

Thr

Gln

Ser

Gly

Phe

Glu

Gly

Phe

Ile

Lys

Asp

165

170

175

Gln

Phe

Thr

Thr

Leu

Pro

Glu

val

Lys

Asp

Arg

Cys

Phe

Ala

Thr

Gln

180

185

190

Val

Tyr

cys

Lys

Trp

Arg

Tyr

His

Gin

Gly

Arg

Asp

val

Asp

Phe

Glu

195

200

205

Ala

Thr

Trp

Asp

Thr

val

Arg

Ser

Ile

Val

Leu

Gln

Lys

Phe

Ala

Gly

210

215

220

Pro

Tyr

Asp

Lys

Gly

Glu

Tyr

Ser

Pro

Ser

Val

Gln

Lys

Thr

Leu

Tyr

225

230

235

240

Asp

ile

Gln

val

Leu

Thr

Leu

Gly

Gln

va1

Pro

Glu

ile

Glu

Asp

Met

245

250

255

Glu

ile

Ser

Leu

Pro

Asn

Ile

His

Tyr

Leu

Asn

Ile

Asp

Met

Ser

Lys

260

265

270

PL 215 285 B1

Met

Gly

Leu

Asn

Lys

Gl U

Glu

val

Leu

Leu

Pro

Leu

Asp

Asn

Pro

275

280

285

Tyr

Gly

Arg

ile

Thr

Gly

Thr

val

Lys

Arg

Lys

Leu

Thr

Ser

Arg

Leu

290

295

300

<210> 12 <211> 296 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

<22O> <223> PBC-DeltaNC
<400> 12
Met Thr Tyr Lys Lys Asn Asp Glu val Glu Phe val Arg Thr Gly Tyr
15 10 15
Gly tys Asp Met ile Lys val Leu His Ile Gin Arg Asp Gly Lys Tyr 20 25 30
His Ser ile Lys Glu Va1 Ala Thr Thr Val Gin Leu Thr Leu Ser Ser
35 40 45
Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp Val Ile Pro Thr Asp
50 55 60
Thr ile Lys Asn Thr val Asn val Leu Ala Lys Phe tys Gly ile Lys
65 70 75 80
Ser ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser
85 90 95
Phe Lys His Va1 ile Arg Ala Gin Val Tyr val Glu Glu val Pro Trp
100 105 110
Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly val Lys His Val His Ala Phe Ile Tyr
115 120 125
Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu val Glu Gin ile Arg Asn Gly
130 135 140
Pro Pro val ile His Ser Gly ile Lys Asp Leu Lys val Leu Lys Thr
145 150 155 160
Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe ile Lys Asp Gin Phe Thr Thr Leu
165 170 175
Pro Glu val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gin val Tyr cys Lys Trp
180 185 190
Arg Tyr His Gin Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr

PL 215 285 B1

195 200 205

Val

Arg Ser Ile Val 210

Leu Gln Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys

Gly

215

220

Glu

Tyr

Ser

Pro

Ser

Val

Gln

Lys

Thr

Leu

Tyr

Asp

ile

Gln

val

Leu

225

230

235

240

ser

Leu

Ser

Arg

val

Pro

Glu

ile

Glu

ASp

Met

Glu

ile

ser

Leu

pro

245

250

255

Asn

Ile

His

Tyr

Phe

Asn

ile

Asp

Met

Ser

Lys

Met

Gly

Leu

Ile

Asn

260

265

270

Lys

Glu

Glu

Val

Leu

Leu

Pro

Leu

Asp

Asn

Pro

Tyr

Gly

Lys

Ile

Thr

275

280

285

Gly

Thr

val

Lys

Arg

Lys

Leu

Ser

290

295

<210> 13 <211> 295 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22O>

<223> PBC-DeltaNC bez startowej Met <400> 13

Thr Tyr Lys Lys 1

Asn Asp 5

Glu

va!

Glu Phe val Arg Thr Gly Tyr Gly

10

15

Lys

Asp

Met

Ile 20

Lys

val

Leu

His

ile 25

Gln

Arg

Asp

Gly

Lys 30

Tyr

Hi s

Ser

il e

Lys

Glu

val

Ala

Thr

Thr

va1

Gln

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

Lys

35

40

45

Lys

ASp 50

py p

Leu

His

Gly

Asp 55

Asn

ser

Asp

val

Ile 60

Pro

Thr

Asp

Thr

Ile

Lys

Asn

Thr

val

Asn

val

Leu

Ala

Lys

Phe

Lys

Gly

ile

Lys

Ser

65

70

75

80

Ile

Glu

Thr

phe

Ala

Va1

Thr

ile

cys

Glu

His

phe

Leu

Ser

Ser

phe

85

90

95

Lys

His

Val

ile

Arg

Ala

Gln

val

Tyr

val

Glu

Gl u

val

pro

Trp

Lys

100

105

110

Arg

Phe

Glu

Lys

Asn

Gly

val

Lys

His

Val

His

Ala

Phe

il e

Tyr

Thr

115

120

125

PL 215 285 B1

pro

Thr 130

Gly

Thr

His

phe

Cys Glu 135

val Glu

Gin

ile 140

Arg Asn

Gly

pro

pro

val

ile

His

Ser

Gly

Ile

Lys

Asp

Leu

Lys

Val

Leu

Lys

Thr

Thr

145

150

155

160

Gin

Ser

Gly

Phe

Glu

Gly

Phe

Ile

Lys

Asp

Gin

Phe

Thr

Thr

Leu

Pro

165

170

175

Glu

val

Lys

Asp

Arg

cys

Phe

Ala

Thr

Gl n

val

Tyr

Cys

Lys

Trp

Arg

180

185

190

Tyr

Hi s

Gin 195

Gly

Arg

Asp

Val

Asp 200

Phe

Glu

Ala

Thr

Trp 205

Asp

Thr

Val

Arg

Ser

ile

val

Leu

Gin

Lys

Phe

Al a

Gly

Pro

Tyr

Asp

Lys

Gly

Glu

210

215

220

Tyr

Ser

Pro

Ser

val

Gin

Lys

Thr

Leu

Tyr

Asp

Ile

Gin

Va1

Leu

Ser

225

230

235

240

Leu

Ser

Arg

Val

Pro

Glu

ile

Gl u

Asp

Met

Glu

Ile

Ser

Leu

Pro

Asn

245

250

255

Ile

His

Tyr

phe 260

Asn

ile

Asp

Met

ser 265

Lys

Met

Gly

Leu

ile 270

Asn

Lys

Glu

Glu

Val

Leu

Leu

Pro

Leu

Asp

Asn

Pro

Tyr

Gly

Lys

Ile

Thr

Gly

275

280

285

Thr

Yal

Lys

Arg

Lys

Leu

Ser

290

295

<210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22O>

<223> PBC-DeltaNC (Fragment 44-56 z PBC-DeltaNC) <400> 14

Ala Thr Thr Val Gin Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp 1 5 10 <210> 15 <211> 936 <212> DNA <213> Papio hamadryas (pawian hamadryas) <400> 15 ccagaagaaa atggccgact accataacaa ctataaaaag aatgatgaat tggagtttgt 60 ccgaactggc tatgggaagg atatggtaaa agttctccat attcagcgag atggaaaata 120 tcacagcatt aaagaggtgg caacttcagt gcaacttact ctgagttcca aaaaagatta 180

PL 215 285 B1

cctgcatgga	gataattcag	atatcatccc	tacagacacc	atcaagaaca	cagttcatgt	240
cttggcaaag	tttaagggaa	tcaaaagcat	agaagccttt	ggtgtgaata	tttgtgagta	300
ttttctttct	tcttttaaec	atgtaatccg	agctcaagtc	tacgtggaag	aaatcccttg	360
gaagcgtctt	gaaaagaatg	gagttaagca	tgtccatgca	tttattcaca	ctcccactgg	420
aacacacttc	tgtgaagttg	aacaactgag	aagtggaccc	cccgtcatta	cttctggaat	480
caaagacctc	aaggtcttga	aaacaacaca	gtctggattt	gaaggtttca	tcaaggacca	540
gttcaccacc	ctccctgagg	tgaaggaccg	atgctttgcc	acccaagtgt	actgcaagtg	600
gcgctaccac	cagtgcaggg	atgtggactt	cgaggctacc	tggggcacca	ttcgggacct	660
tgtcctggag	aaatttgctg	ggccctatga	caaaggcgag	tactcaccct	ctgtgcagaa	720
gaccctctat	gatatccagg	tgctctccct	gagccgagtt	cctgagatag	aagatatgga	780
aatcagcctg	ccaaacattc	actacttcaa	tatagacatg	tccaaaatgg	gtctgatcaa	840
caaggaagag	gtcttgctgc	cattagacaa	tccatatgga	aaaattactg	gtacagtcaa	900
gaggaagttg	tcttcaagac	tgtgacattg	tggcca			936

<210> 16 <211> 304 <212> PRT <213> Paplo hamadryas (pawian hamadryas) <400> 16

Met 1

Ala

Asp Tyr

HIS 5

Asn Asn Tyr

Lys

Lys Asn Asp Glu Leu Glu Phe

10

15

Val

Arg

Thr

Gly 20

Tyr

Gly

Lys

Asp

Met 25

val

Lys

val

Leu

His 30

ile

Gin

Arg

Asp

Gly

Lys

Tyr

His

Ser

ile

Lys

Glu

Val

Ala

Thr

Ser

Val

Gin

35

40

45

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

tys

Lys

Asp

Tyr

Leu

Hi s

Gly

Asp

Asn

Ser

Asp

50

55

60

Ile

Ile

Pro

Thr

Asp

Thr

Ile

Lys

Asn

Thr

Val

His

val

Leu

Ala

Lys

65

70

75

80

Phe

Lys

Gly

Ile

Lys

Ser

ll e

Glu

Ala

Phe

Gly

Val

Asn

Ile

Cys

Glu

85

90

95

Tyr

phe

Leu

Ser

Ser

Phe

Asn

His

val

ile

Arg

Ala

Gin

Val

Tyr

Val

100

105

110

Glu

Glu

ile

Pro

Trp

Lys

Arg

Leu

Glu

Lys

Asn

Gly

val

Lys

Hi s

val

115

120

125

His

Ala

Phe

ile

His

Thr

Pro

Thr

Gly

Thr

His

Phe

Cys

Glu

Val

Glu

130

135

140

PL 215 285 B1

Gin 145

Leu

Arg

Ser Gly

Pro 150

Pro

Val

Ile

Thr

Ser Gly Ile 155

Lys

Asp

Leu 160

Lys

val

Leu

Lys

Thr

r*

Gin

ser

Gly

phe

Glu

Gly

phe

il e

Lys

Asp

165

170

175

Gin

Phe

Thr

Thr

Leu

Pro

Glu

Val

Lys

Asp

Arg

Cys

Phe

Ala

Thr

Gin

180

185

190

va1

Tyr

Cys 195

Lys

Trp

Arg

Tyr

His 200

Gin

Cys

Arg

Asp

val 205

ASP

Phe

Glu

Ala

Thr

Trp

Gly

Thr

il e

Arg

Asp

Leu

val

Leu

Glu

Lys

Phe

Ala

Gly

210

215

220

Pro

Tyr

ASP

Lys

Gl y

Gl u

Tyr

Ser

Pro

Ser

Val

Gin

Lys

Thr

Leu

Tyr

225

230

235

240

ASP

ile

Gin

val

Leu

Ser

Leu

Ser

Arg

val

Pro

Glu

Ile

Glu

Asp

Met

245

250

255

Glu

il e

Ser

Leu

Pro

Asn

ile

His

Tyr

Phe

Asn

ile

Asp

Met

Ser

Lys

260

265

270

Met

Gly

Leu

Ile

Asn

Lys

Glu

Glu

val

Leu

Leu

pro

Leu

ASP

Asn

Pro

275

280

285

Tyr

Gly

Lys

Ile

Thr

Gly

Thr

Val

Lys

Arg

Lys

Leu

Ser

Ser

Arg

Leu

290

295

300

Zastrzeżenia patentowe

Claims (34)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Wyizolowana, skrócona ssacza urykaza, znamienna tym, że jest skrócona na końcu aminowym lub na końcu karboksylowym lub na obydwu końcach, aminowym i karboksylowym, o 1-6 aminokwasów i dodatkowo obejmuje podstawienie aminokwasowe treoniną w pozycji 7 (D7T), podstawienie aminokwasowe treoniną w pozycji 46 (S46T), podstawienie aminokwasowe lizyną w pozycji 291 (R291K) oraz podstawienie aminokwasowe seryną w pozycji 301 (T301S), a skrócenie i podstawienie aminokwasowe są określone w stosunku do urykazy świni o sekwencji aminokwasowej SEK. NR ID. 11.
2. 2. Wyizolowana, skrócona ssacza urykaza według zastrz. 1, znamienna tym, że dodatkowo obejmuje aminokońcowy aminokwas, którym jest alanina, glicyna, prolina, seryna lub treoniną.
3. 3. Wyizolowana, skrócona ssacza urykaza według zastrz. 2, znamienna tym, że aminokońcowym aminokwasem jest treoniną.
4. 4. Wyizolowana, skrócona ssacza urykaza według zastrz. 3, znamienna tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEK NR ID: 8.
5. 5. Wyizolowana, skrócona ssacza urykaza według jednego z zastrz. 1-4, znamienna tym, że jest połączona z polimerem.
6. 6. Koniugat glikol polietylenowy-urykaza obejmujący wyizolowaną, skróconą ssaczą urykazę określoną w dowolnym z zastrz. od 1 do 4.
7. 7. Koniugat według zastrz. 6, znamienny tym, że obejmuje od 2 do 12 cząsteczek glikolu polietylenowego na każdą podjednostkę urykazy.

   PL 215 285 B1
8. 8. Koniugat według zastrz. 7, znamienny tym, że obejmuje od 3 do 10 cząsteczek glikolu polietylenowego na każdą podjednostkę urykazy.
9. 9. Koniugat według zastrz. 6, znamienny tym, że każda cząsteczka glikolu polietylenowego ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 1*10³ do 100*10³ u.
10. 10. Koniugat według zastrz. 9, znamienny tym, że każda cząsteczka glikolu polietylenowego ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 1*10³ do 50*10³ u.
11. 11. Koniugat według zastrz. 10, znamienny tym, że każda cząsteczka glikolu polietylenowego ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 5*10³ do 20*10³ u.
12. 12. Koniugat według zastrz. 11, znamienny tym, że każda cząsteczka glikolu polietylenowego ₃ ma ciężar cząsteczkowy wynoszący 10*10³ u.
13. 13. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną oraz farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze, znamienna tym, że jako substancję aktywną zawiera urykazę określoną w dowolnym z zastrz. od 1 do 3.
14. 14. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną oraz farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze, znamienna tym, że jako substancję aktywną zawiera koniugat glikol polietylenowy-urykaza określony w zastrz. 6.
15. 15. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 13, znamienna tym, że jest odpowiednia do powtarzalnego podawania.
16. 16. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 14, znamienna tym, że jest odpowiednia do powtarzalnego podawania.
17. 17. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 13 do wytwarzania leku użytecznego do zmniejszania poziomów kwasu moczowego w płynach biologicznych u wymagającego tego osobnika.
18. 18. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 14 do wytwarzania leku użytecznego do zmniejszania poziomów kwasu moczowego w płynach biologicznych u wymagającego tego osobnika.
19. 19. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że płynem biologicznym jest krew.
20. 20. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że płynem biologicznym jest krew.
21. 21. Wyizolowana skrócona ssacza urykaza jak określona) w zastrz. 1, w której N-końcowym aminokwasem jest metionina.
22. 22. Wyizolowana skrócona ssacza urykaza według zastrz. 21, znamienna tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEK NR ID: 7.
23. 23. Wyizolowany kwas nukleinowy, którego sekwencja koduje białko określone w zastrz. 1, zastrz. 3, zastrz. 4, zastrz. 21 lub zastrz. 22.
24. 24. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 23, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego jest połączona funkcjonalnie z heterologicznym promotorem.
25. 25. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 24, znamienny tym, że promotorem jest promotor osmB.
26. 26. Wektor kwasu nukleinowego, który obejmuje kwas nukleinowy określony w zastrz. 24.
27. 27. Komórka gospodarza obejmująca wektor określony w zastrz. 26.
28. 28. Wyizolowany kwas nukleinowy obejmujący sekwencję kwasu nukleinowego kodującą urykazę obejmującą sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEK NR ID: 7 lub SEK NR ID: 8.
29. 29. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 28, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego obejmuje sekwencję przedstawioną na SEK NR ID: 9 lub SEK NR ID: 10.
30. 30. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 28, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego jest połączona funkcjonalnie z heterologicznym promotorem.
31. 31. Kwas nukleinowy według zastrz. 30, znamienny tym, że promotorem jest promotor osmB.
32. 32. Wektor kwasu nukleinowego, obejmujący kwas nukleinowy określony w zastrz. 30.
33. 33. Komórka gospodarza obejmująca wektor określony w zastrz. 32.
34. 34. Sposób wytwarzania urykazy, znamienny tym, że obejmuje etapy hodowania komórki gospodarza określonej w zastrz. 27 lub 33 w takich warunkach, że sekwencja kwasu nukleinowego ulega ekspresji w komórce gospodarza, oraz izolowania wyrażonej urykazy.