JPH09154581A - ウリカーゼを生産する実質上純粋な微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 尿酸の定量に有用なウリカーゼを効率よく生
産する微生物を開発し、この微生物を用いて該酵素を量
産する方法を提供する。 【解決手段】 アースロバクター属由来のウリカーゼ遺
伝子のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する組換
えプラスミドによって形質転換されたエッシェリヒア・
コリーに属する微生物であるウリカーゼを生産する実質
上純粋な微生物、そのウリカーゼを発現する実質上純粋
なＤＮＡおよびウリカーゼの製造方法である。 【効果】 アースロバクター属に属するウリカーゼを発
現する遺伝子ＤＮＡをスクリーニングし、これを用いて
構築された発現ベクターの組換えプラスミドを例えばエ
ッシェリヒア・コリーに属する微生物に導入することに
よって、形質転換微生物は効率よくウリカーゼを生産す
ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はウリカーゼを生産す
る実質上純粋な微生物、ウリカーゼを発現する実質上純
粋なＤＮＡ及びウリカーゼの製造法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】ウリカーゼ（ＥＣ １．７．３．３）
は、１モルの水分子及び１モルの酸素の存在下で１モル
の尿酸を酸化して最終的に１モルのアラントインと１モ
ルの過酸化水素及び１モルの二酸化炭素を生成する反応
を触媒する酵素であり、血中あるいは尿中の尿酸含有量
の測定や、染毛用試薬としても使用される。

【０００３】ウリカーゼは、微生物、動物等に広く存在
し、例えばアースロバクター属〔Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，ｖｏｌ．１５１、５４（１９６
８）〕、セルロモナス属（特開平６−３８７６６号公
報）、キャンディダ属（特開平５−３１７０５５号公
報）、バチルス属（特開平２−５３４８８号公報）など
数多くの報告があり、上記のセルロモナス属、キャンデ
ィダ属、バチルス属では遺伝子配列の情報も知られてい
る。

【０００４】その中でも、アースロバクター・グロビホ
ルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ・ｇｌｏｂｉｆｏｒ
ｍｉｓ）Ｂ−０５７７〔通商産省工業技術院微生物工業
研究所（現・生命工学技術研究所）寄託番号・微工研条
寄第３６０、ＦＥＲＭ ＢＰ−３６０；以下、アースロ
バクター・グロビホルミスＦＥＲＭ ＢＰ−３６０と略
す））株の産生するウレアーゼは、基質特異性、熱安定
性にも優れ、既に臨床診断用、工業用酵素として広く利
用されている。しかしながらアースロバクター・グロビ
ホルミスＦＥＲＭ ＢＰ−３６０株が産生するウリカー
ゼ量が著しく低いため遺伝子組換え技術を用いた高生産
法の開発が待たれていた。

【０００５】そこで、アースロバクター・グロビホルミ
スＦＥＲＭ ＢＰ−３６０株のウリカーゼ遺伝子を取得
しようと試み、この株のウリカーゼのＤＮＡ塩基配列、
アミノ酸配列の情報検索を試みたが、他のアースロバク
ター属さえもウリカーゼについての情報が報告されてい
ない。即ち、アースロバクター属のウリカーゼがどのよ
うなアミノ酸配列であるかは全く推定できないものであ
った。

【０００６】このような状況下、反応性、安定性が共に
高く、尿酸の測定に有効であるアースロバクター・グロ
ビホルミスＦＥＲＭ ＢＰ−３６０株由来のウリカーゼ
においては生産性が低いことから、遺伝子工学等を用
い、効率よくこの酵素を生産する微生物の開発が望まれ
ていたが、本ウリカーゼを構成するポリペプチドの一次
構造及び該酵素のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩
基配列については未だ発表されていない。

【０００７】従って、ウリカーゼを構成するポリペプチ
ドの一次構造の決定、該酵素のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡの塩基配列の決定及び遺伝子工学による該酵素
の生産が望まれていた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
実情のもとで、少なくとも尿酸の定量に有用なウリカー
ゼを効率よく生産する微生物を開発し、この微生物を用
いて該酵素を量産する方法を提供することを目的として
なされたものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は前記目的を達
成するために鋭意研究を重ね、公知のウリカーゼの部分
的なアミノ酸配列から種々プローブを作成したが目的と
するクローンを得られず、さらに研究した結果、ウリカ
ーゼを生産する微生物由来の染色体ＤＮＡライブラリー
の中から、該酵素を発現する遺伝子ＤＮＡをスクリーニ
ングし、次いでこのＤＮＡを用いて発現ベクターを構築
したのち、例えばエッシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；以下Ｅ．ｃｏｌｉ、もしくは
大腸菌と略称することがある）に属する微生物に導入し
て形質転換微生物を作出し、これを培地中で培養するこ
とによって、該ウリカーゼを効率よく量産することを見
い出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至っ
た。

【００１０】すなわち、本発明は、ウリカーゼを発現す
るＤＮＡを有する組換えプラスミドによって形質転換さ
れたＥ．ｃｏｌｉに属する微生物であることを特徴とす
るウリカーゼを生産する実質上純粋な微生物、配列表の
配列番号１におけるアミノ酸配列の１位から３０２位に
相当する図１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基
配列を有することを特徴とするウリカーゼを発現する実
質上純粋なＤＮＡ、及び前記の形質転換された微生物で
あるウリカーゼを生産する実質上純粋な微生物を培地に
培養し、次いでその培養物からウリカーゼを採取するこ
とを特徴とするウリカーゼの製造法を提供するものであ
る。

【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいて、ウリカーゼを生産する形質転換された微生物を
作出するのに用いられるウリカーゼを発現する遺伝子Ｄ
ＮＡは、例えば該酵素を生産する微生物由来の染色体Ｄ
ＮＡライブラリーの中から、スクリーニングすることに
よって得ることができる。

【００１２】本発明においては、前記のウリカーゼを生
産する微生物として、アースロバクター属が好ましく用
いられ、更にアースロバクター・グロビホルミスＦＥＲ
ＭＢＰ−３６０株がより好ましく用いられる。このアー
スロバクター・グロビホルミスＦＥＲＭ ＢＰ−３６０
株の染色体ＤＮＡライブラリーから該酵素を発現する遺
伝子ＤＮＡをスクリーニングする方法の具体例について
説明すると、まず、該微生物の染色体ＤＮＡ１００〜２
０００μｇ程度を通常用いられている方法によって抽出
する。

【００１３】次に、ウリカーゼをコードする遺伝子ＤＮ
Ａを組み込んだプラスミドを構築する。このライブラリ
ー作製ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖し
得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用とし
て構築されたものが適している。前者のファージとして
は、例えばＥ．ｃｏｌｉを宿主微生物とする場合には、
λｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが用いられる。また、
プラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｌｉを宿主微生物とする
に、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１
８４、ｐＫＮ１７、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１
８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ブルー
スクリプトシリーズベクターなどが用いられる。さら
に、バチルス属を宿主微生物とする場合は、例えばｐＨ
Ｙ３００ＰＬＫなどを用いればよく、サッカロミセス属
を宿主微生物とする場合は、例えばｐＹＣ１などを用い
ればよい。

【００１４】これらのベクターに、該ウリカーゼ遺伝子
ＤＮＡを組み込む方法については特に制限はなく、従来
慣用されている方法を用いることができる。例えば先に
抽出した該微生物の染色体ＤＮＡ１〜１０μｇ程度を適
当な制限酵素を用い、同様にライブラリー作製ベクター
１〜１０μｇ程度も適当な制限酵素を作用させたのち、
それぞれの接着末端をアニーリング後、適当なＤＮＡリ
ガーゼを用いて結合させ、目的の宿主微生物に形質転換
させることによって、染色体ＤＮＡライブラリーが得ら
れる。

【００１５】この際用いられる宿主微生物としては、
Ｅ．ｃｏｌｉがよく使用され、例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｄ
Ｈ１株、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｃ６００株など、バチルス属に属する宿主微生物として
は例えばバチルス・ズブチリスＩＳＷ１２１４株、サッ
カロミセス属に属する宿主微生物としては例えばサッカ
ロミセス・セレビジアエＡＨ２２株などが挙げられ、ま
た構築されたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉに属する微生物
や他の微生物に導入する方法としては、コンピテントセ
ル法を用いてもよく、あるいはカルシウムイオンの存在
下に組換えＤＮＡの導入を行ってもよい。また宿主微生
物への所望組換えＤＮＡ導入の有無の選択については、
組換えＤＮＡを構成するベクターの薬剤耐性マーカーに
基づく選択培地で、該宿主微生物を培養し、生育する宿
主微生物を選択すればよい。

【００１６】一方、ウリカーゼ精製標品のＮ末端側アミ
ノ酸配列、エンドプロテイナーゼ・Ａｓｐ−Ｎ（アスパ
ラギン酸−Ｎ）処理断片アミノ酸配列を決定し、これに
基づいて種々のオリゴヌクレオチドを合成した後、例え
ばアイソトープで標識して放射性オリゴヌクレオチドプ
ローブを作製する。次いで、これらの放射性オリゴヌク
レオチドプローブを用い、従来慣用されている方法に従
って、前記の染色体ＤＮＡライブラリーの中から、ウリ
カーゼを発現する遺伝子を持つ組換え体大腸菌をスクリ
ーニングするが、この段階が本発明において非常に困難
な部分であり、ウリカーゼの部分的なアミノ酸配列から
種々のプローブを作製したが、ウリカーゼ遺伝子を保持
するクローンを見い出せなかった。

【００１７】具体的に述べるとプローブを設計する場
合、一般に推定されるＤＮＡ配列の組合せがなるべく少
ない配列を選択してプローブを合成するが、本発明のウ
リカーゼの場合、組合せの少ない配列が余り存在しな
い。発明の実施の形態で更に詳しく述べているが、アー
スロバクターの遺伝子のコドン使用頻度を参考にして数
多い組合せの中から組合せを絞ったプローブを作製しよ
うとして情報を収集しようとしたが、アースロバクター
の遺伝子のコドン使用頻度をまとめた資料は検索できな
かった。複数に推定される部分の塩基をイノシンにした
プローブを作製した配列番号２および３に示されるウリ
カーゼ遺伝子プローブＵＯＤａおよびＵＯＤｂでもクロ
ーニングが達成されなかった。

【００１８】また配列番号４から７に示されるウリカー
ゼ遺伝子プローブＵＯＤｃ、ＵＯＤｄ、ＵＯＤｅ、ＵＯ
Ｄｆで示されるようなプローブの長さ、組み合わせ状態
についても種々検討し、さらにハイブリダイゼーショ
ン、及びその後の洗浄の条件（溶液の組成、温度、時
間）を種々検討した結果、後の発明の実施の形態で述べ
るが、本発明においてはエンドプロテイナーゼ・Ａｓｐ
−Ｎ処理断片のアミノ酸配列に基づく放射性オリゴヌク
レオチドプローブを用い、特定の条件でハイブリダイゼ
ーション、洗浄を行って釣り上げられた組換え体大腸菌
が、目的の遺伝子ＤＮＡを持つものであることが判明し
た。

【００１９】次に、この目的の遺伝子ＤＮＡを含む組換
え体ライブラリーから、例えばマニアティス（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ）らの方法〔「モレキュラル・クローニング：
コールドスプリングハーバー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ）」（１９８２年）〕などに従って、ウリカーゼ遺伝
子を有するＤＮＡを含む組換えベクタープラスミド（ｐ
ＵＯＤ２と命名）を調製することができる。このプラス
ミドの構成を示す模式図を図４に示す。また、該プラス
ミド中のアースロバクター・グロビホルミスＦＥＲＭ
ＢＰ−３６０株染色体ＤＮＡ由来の部位の制限酵素地図
は図３に示すとおりである。

【００２０】ウリカーゼの発現には、このｐＵＯＤ２を
用いてもよく、さらにウリカーゼをコードしている遺伝
子ＤＮＡを新たにに組み込んだ発現ベクターを構築して
もよい。この発現用ベクターとしては、宿主微生物で自
律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子
組換え用として構築されたものが適している。前者のフ
ァージとしては、例えばＥ．ｃｏｌｉを宿主微生物とす
る場合には、λｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが用いら
れる。また、プラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｌｉを宿主
微生物とするに、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、
ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＫＮ１７、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１
３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１
１９、ブルースクリプトシリーズベクターなどが用いら
れる。さらに、バチルス属を宿主微生物とする場合は、
例えばｐＨＹ３００ＰＬＫなどを用いればよく、サッカ
ロミセス属を宿主微生物とする場合は、例えばｐＹＣ１
などを用いればよい。

【００２１】これらのベクターに、該ウリカーゼ遺伝子
ＤＮＡを組み込む方法については特に制限はなく、従来
慣用されている方法を用いることができる。例えば適当
な制限酵素を用いて、前記のウリカーゼ遺伝子ＤＮＡを
含む組換えプラスミドＤＮＡ及び該発現用ベクターを処
理し、それぞれウリカーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片及び
ベクター断片を得たのち、それぞれの接着末端をアニー
リング後、適当なＤＮＡリガーゼを用いて結合させるこ
とによって、あらたな発現ベクターが得られる。

【００２２】このようにして、構築されたプラスミドの
Ｅ．ｃｏｌｉへの導入および宿主微生物への所望組換え
ＤＮＡ導入の有無の選択については、前述した方法を用
いればよい。本発明においては、前記組換えベクタープ
ラスミドｐＵＯＤ２によって形質転換されたＥ．ｃｏｌ
ｉに属する微生物は、エシェリヒア・コリーＤＨ１−ｐ
ＵＯＤ２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１
−ｐＵＯＤ２：ＦＥＲＭ Ｐ−１５３０８）と命名され
る。

【００２３】このようにして得られた形質転換微生物の
培養は、該微生物の生育に必要な炭素源や窒素源などの
栄養源や無機成分などを含む培地中において行うことが
できる。該炭素源としては、例えばグルコース、デンプ
ン、ショ糖、モラッセス、デキストリンなどが、窒素源
としては、例えばペプトン、肉エキス、カゼイン加水分
解物、コーンスチープリカー、硝酸塩、アンモニウム塩
などが、無機成分としては、例えばナトリウム、カリウ
ム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、亜鉛、銅、
マンガン、鉄などの陽イオンや塩素、硫酸、リン酸など
の陰イオンを含む塩が挙げられる。

【００２４】培養方法については特に制限はなく公知の
方法、例えば通気撹拌培養、振盪培養、回転培養、静置
培養などの方法によって、通常２０〜５０℃、好ましく
は２５〜４２℃、より好ましくは３７℃近辺で、１２〜
４８時間程度培養する方法が用いられる。このようにし
て培養を行ったのち、遠心分離処理などの手段によって
菌体を集め、次いで酵素処理、自己消化、フレンチプレ
ス、超音波処理などによって細胞を破壊して目的とする
酵素を含有する抽出液を得る。この抽出液から、該酵素
を分離、精製するには、例えば、塩析、脱塩、イオン交
換樹脂による吸脱着処理などを行ったのち、さらに吸着
クロマトグラフィー、ゲル濾過、電気泳動法などによっ
て精製すればよい。

【００２５】この精製標品について、ウリカーゼの酵素
活性及び物理化学的性質を調べることによって、該形質
転換微生物がウリカーゼの産生能を有することが確認さ
れた。したがって、本発明において用いたウリカーゼを
発現する遺伝子ＤＮＡは、図１で表されるアミノ酸配列
をコードする塩基配列を有し、かつその塩基配列が図２
に示す配列であることが明らかである。

【００２６】このようにして得られたウリカーゼは、ア
ースロバクター・グロビホルミスＦＥＲＭ ＢＰ−３６
０株のウリカーゼと同様な触媒作用、酵素学的性質を有
していた。即ち１モルの酸素と１モルの水分子の存在下
で、１モルの尿酸から最終的に１モルのアラントインと
１モルの二酸化炭素と１モルの過酸化水素を生成させる
反応を触媒し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルクロマ
ト法での分子量が３０，０００±５，０００であり、等
電点が４．６４±０．５であり、５５℃までの熱安定性
を有し、ｐＨ６．０〜９．５までのｐＨ安定性を有す
る、などである。

【００２７】このことからこのようにして得られたウリ
カーゼは、例えば血清中の尿酸定量などの臨床用酵素と
して有用であるし、染毛試薬原料としても用いることが
できる。なお、本発明明細書に記載の塩基配列の記号及
びアミノ酸配列の記号は、当該分野における慣用略号に
基づくもので、それらの例を以下に列記する。また、す
べてのアミノ酸はＬ体を示すものとする。

【００２８】ＤＮＡ：デオキシリボ核酸 Ａ：アデニン Ｔ：チミン Ｇ：グアニン Ｃ：シトシン Ｓ：グアニンまたはシトシン Ｒ：アデニンまたはグアニン Ｗ：アデニンまたはチミン Ｙ：チミンまたはシトシン Ｎ：アデニン、チミン、グアニン、シトシンまたは他の
塩基 Ａｌａ：アラニン Ａｒｇ：アルギニン Ａｓｎ：アスパラギン Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｃｙｓ：システイン Ｇｌｎ：グルタミン Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ｈｉｓ：ヒスチジン Ｉｌｅ：イソロイシン Ｌｅｕ：ロイシン Ｌｙｓ：リジン Ｍｅｔ：メチオニン Ｐｈｅ：フェニルアラニン Ｐｒｏ：プロリン Ｓｅｒ：セリン Ｔｈｒ：スレオニン Ｔｒｐ：トリプトファン Ｔｙｒ：チロシン Ｖａｌ：バリン Ｘａａ：不明または他のアミノ酸

【００２９】

【発明の実施の形態】本発明は、配列表の配列番号１に
おけるアミノ酸配列の１位から３０２位で表されるアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を有する組換えベクター
によって形質転換されたエッシェリヒア・コリーに属す
る微生物であることを特徴とするウリカーゼを生産する
実質上純粋な微生物、配列表の配列番号１におけるアミ
ノ酸配列の１位から３０２位で表されるアミノ酸配列を
コードする塩基配列を有することを特徴とするウリカー
ゼを発現する実質上純粋なＤＮＡ、配列表の配列番号１
におけるアミノ酸配列の１位から３０２位で表されるア
ミノ酸配列をコードする塩基配列を有する組換えベクタ
ーによって形質転換された微生物であるウリカーゼを生
産する実質上純粋な微生物を培地に培養し、次いでその
培養物からウリカーゼを採取することを特徴とするウリ
カーゼの製造方法であり、さらに配列表の配列番号１に
おけるアミノ酸配列の１位から３０２位で表されるアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を有する組換えベクター
によって形質転換された微生物であるウリカーゼを生産
する実質上純粋な微生物を培地に培養し、次いでその培
養物からウリカーゼを採取することを特徴とするウリカ
ーゼの製造方法である。

【００３０】本発明における好適な態様としては、形質
転換されたエッシェリヒア・コリーに属する微生物がベ
クタープラスミドｐＵＯＤ２によって形質転換されたも
のである微生物であり、またベクタープラスミドｐＵＯ
Ｄ２によって形質転換されたエッシェリヒア・コリーに
属する微生物がエッシェリヒア・コリーＤＨ１−ｐＵＯ
Ｄ２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１−ｐ
ＵＯＤ２：ＦＥＲＭＰ−１５３０８）である微生物であ
り、塩基配列が配列表の配列番号１における塩基配列の
３１位から９３６位で表される塩基配列であるＤＮＡで
ある。

【００３１】次に、参考例及び発明の実施の形態によっ
て本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの
例によってなんら限定されるものではない。

【００３２】

【参考例１】 染色体ＤＮＡの分離 アースロバクター・グロビホルミスＦＥＲＭ ＢＰ−３
６０株を培地（酵母エキス０．５％、ペプトン０．５
％、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．０５％、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．０５
％、ＮＨ₄ Ｃｌ０．０５％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．
０３％、〔ｐＨ７．０〕）１００ｍｌにて３０℃で２４
時間振盪培養した後、この培養液を高速冷却遠心機（ト
ミーＣＸ−２５０型）を用い、６５００ｒｐｍ（７６６
０Ｇ）で１０分間遠心分離処理して、菌体を集菌した。

【００３３】次いで、この菌体を５０ｍＭトリス−塩酸
（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミ
ン４酢酸・２ナトリウム）（ｐＨ８．０）及び１５％シ
ュークロースからなる溶液２０ｍｌに懸濁し、最終濃度
が２ｍｇ／ｍｌとなるようにリゾチーム（生化学工業
（株）社製）を加え、３７℃で１０分間処理して菌株の
細胞壁を破壊した。

【００３４】次に、これに１０％ラウリル硫酸ナトリウ
ム（シグマ社製）水溶液１ｍｌを加えて、３７℃で５分
間処理した後、クロロホルム／フェノール（１：１）混
合液２１ｍｌを加え撹拌後、１００００ｒｐｍ（１２０
８０Ｇ）で１０分間遠心分離処理して水相を回収した。
この水相に２倍量のエタノールを静かに混合し、ガラス
棒でゆっくり撹拌しながら、ＤＮＡをガラス棒にまきつ
かせて分離した後、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．
０）及び１ｍＭのＥＤＴＡからなる溶液２０ｍｌで溶解
し、最終濃度が１０μｇ／ｍｌとなるようにＲＮａｓｅ
（ファルマシア社製）を加えて３７℃で３０分処理をし
た。ついでこれに等量のフェノール／クロロホルム（１
／１）混合液を加え、前記と同様に処理してそれぞれ水
相を分取した。

【００３５】次に、この水相に２倍量のエタノールを加
えて前記の方法で再度ＤＮＡを分離した後、１０ｍＭト
リス−塩酸（ｐＨ８．０）及び１ｍＭのＥＤＴＡからな
る溶液２ｍｌに溶解した。

【００３６】

【参考例２】 アースロバクター・グロビホルミスＦＥＲＭ ＢＰ−３
６０株遺伝子ライブラリーの作製 参考例１で得られたアースロバクター・グロビホルミス
ＦＥＲＭ ＢＰ−３６０株染色体５μｇを、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ（宝酒造社製）１０単位を用い、１０ｍＭトリ
ス−塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０
ｍＭのＭｇＣｌ ₂ 及び１ｍＭのＤＴＴからなる溶液中、
３７℃で４時間切断処理した。

【００３７】一方、ベクタープラスミドｐＵＣ１１８
（宝酒造社製）３μｇを別の容器中で、制限酵素Ｂａｍ
ＨＩ（宝酒造社製）１０単位を用い、１０ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭ
のＭｇＣｌ₂ 及び１ｍＭのＤＴＴからなる溶液中で、３
７℃で４時間切断処理した後、５’末端を脱リン酸化す
るために、反応液にアルカリ性ホスファターゼ（宝酒造
社製）１単位を加えて６５℃で２時間処理した。

【００３８】次に、前記のようにして得られた２種のＤ
ＮＡ溶液を混合し、この混合液に等量のフェノール／ク
ロロホルム（１／１）混合液を加えて処理した後、遠心
分離処理によって水相を分取した。さらに、この水相に
１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液および２倍量のエ
タノールを加えて遠心分離処理することによってＤＮＡ
を回収し、減圧乾燥した。

【００３９】そのＤＮＡを１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
８．０）及び１ｍＭのＥＤＴＡ溶液からなる溶液にて溶
解した後、６６ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、６．
６ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭのＤＴＴ及び６６０μＭ
のＡＴＰ（ベーリンガーマンハイム社製）の存在下、Ｔ
４ＤＮＡライゲース（宝酒造社製）３００単位を用い、
４℃で１６時間ライゲーションを行った。

【００４０】次にこれを、Ａ．Ｍｉｓｈｉｍｕｒａらの
方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１
８巻、第６１６９ページ（１９９０年））によってコン
ピテント細胞としたＥ．ｃｏｌｉＤＨ１（ＡＴＣＣ３３
８４９）〔Ｆ^- 、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９
６、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７（ｒk ^- 、ｍk ⁺ ）、Ｓ
ｕｐＥ４４、ｒｅｌＡ１、λ^- 〕〔「モレキュラル・ク
ローニング：コールドスプリングハーバー（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ）」５０４〜５０６ページ（１９８２
年）〕にトランスフォーメーションし、これをアンピシ
リン５０μｇ／ｍｌ含有ＢＨＩ寒天培地にて、３７℃で
一昼夜培養し、約１０，０００の形質転換微生物を得
て、アースロバクター・グロビホルミスＦＥＲＭ ＢＰ
−３６０株遺伝子ライブラリーとした。

【００４１】

【実施例１】 放射性オリゴヌクレオチドプローブの作製 ウリカーゼ精製標品のエンドプロテイナーゼ・Ａｓｐ−
Ｎ処理断片のアミノ酸配列を調べたところ、図５に示す
配列が決定された。この情報をもとに遺伝子の５’末端
側から塩基配列を予想した。この予想された塩基配列に
は種々の組合せが考えられるので、組合せの数が少ない
部分のオリゴヌクレオチドを設計して実験を行った。こ
のオリゴヌクレオチドはアール・エル・レッシンジャー
らの方法〔「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル
・ソサエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」第９
８巻、３６５５ページ〕に基づき、ＤＮＡシンセサイザ
ー［サイクロン（バイオサーチ社製）］を用いて作製し
た。

【００４２】まず図５のＤ−２０アミノ酸配列で、１ア
ミノ酸残基目のＡｓｐから６アミノ酸残基目のＨｉｓに
対応する合成ＤＮＡを作製した。この組合せは１７マー
のものを考えた場合１２８通りも存在する。そこでアー
スロバクター遺伝子のコドン使用頻度を参考にして、使
用頻度の高いコドンでオリゴヌクレオチドプローブを作
製しようとした。種々の生物の遺伝子のコドン使用頻度
をまとめてあるＫ．Ｗａｄａらのデータ（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２０巻、第２１１４
ページ、１９９２年）を参考にしようとしたが、アース
ロバクター由来の遺伝子情報は少なすぎて、Ｗａｄａら
のデータにはアースロバクター属の情報は記載されてい
なかった。つまりコドン使用頻度を利用して組み合わせ
数を少なくすることはできなく、すべての組み合わせに
よりオリゴヌクレオチドプローブを作製せざるを得なか
った。よってこのアミノ酸配列から推定されるｍＲＮＡ
に相補的な図６の、配列番号２に示すプローブＵＯＤ
ａ、１７マーのオリゴヌクレオチドを作製した。

【００４３】このようにして得られたオリゴヌクレオチ
ド５ｐｍｏｌをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼバッファ
ー〔５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、４ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、
０．１ｍＭ スペルミジン〕及び３７０キロベクレルの
〔γ- ³²Ｐ〕ＡＴＰ（アマシャム社製）の存在下、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績社製）８．５単位
を用い、３７℃で３０分間反応させて、アイソトープ³²
Ｐを取り込ませ、放射性オリゴヌクレオチドプローブを
作製した。しかしながら本放射性オリゴヌクレオチドプ
ローブを用い、種々の条件を検討してウリカーゼ遺伝子
のクローニングを試みたが目的の遺伝子は取得できなか
った。

【００４４】次に、図５のＤ−１５アミノ酸配列で、１
アミノ酸残基目のＡｓｐから１１アミノ酸残基目のＰｈ
ｅに対応する合成ＤＮＡを作製した。この組合せは３２
マーのものを考えた場合２７６４８通りも存在する。そ
こですべてのアミノ酸においてはコドンの３レター目に
イノシンを用い、さらにＳｅｒの１レター目の部分はＡ
とＴの両方を用い、Ｓｅｒの２レター目の部分はＣとＧ
の両方を用いた計４通りの組み合わせに絞ったものを考
案した。このアミノ酸配列から推定されるｍＲＮＡに相
補的な図６の、配列番号３に示すプローブＵＯＤｂ、
３２マーのオリゴヌクレオチドを作製した。

【００４５】このオリゴヌクレオチドについても前記と
同様に、アイソトープ³²Ｐを取り込ませ、放射性オリゴ
ヌクレオチドプローブを作製した。しかしながら本放射
性オリゴヌクレオチドプローブを用いたものについて
も、種々の条件を検討してウリカーゼ遺伝子のクローニ
ングを試みたが目的の遺伝子は取得できなかった。そこ
で鋭意思考努力した結果、図６の、配列番号２に示す
プローブＵＯＤａ、１７マーのオリゴヌクレオチドを更
に長くしたものを考案した。即ち図５のＤ−２０アミノ
酸配列の下線部分で、１アミノ酸残基目のＡｓｐから７
アミノ酸残基目のＴｈｒに対応する合成ＤＮＡを作製し
た。この組合せは２０マーのものを考えた場合２５６通
りも存在してしまう。よってこの組み合わせを４種類に
分け、２０マーで６４通りのオリゴヌクレオチドプロー
ブを４本考案した。このアミノ酸配列から推定されるｍ
ＲＮＡに相補的な図６の、配列番号４に示すプローブ
ＵＯＤｃと、図６の、配列番号５に示すプローブＵＯ
Ｄｄと、図６の、配列番号６に示すプローブＵＯＤｅ
と、図６の、配列番号７に示すプローブＵＯＤｆを別
々に作製した。

【００４６】これらオリゴヌクレオチドについても前記
と同様に、アイソトープ³²Ｐを取り込ませ、放射性オリ
ゴヌクレオチドプローブを作製した。

【００４７】

【実施例２】 ウリカーゼ遺伝子含有ＤＮＡのスクリーニング 参考例２で得たアースロバクター・グロビホルミスＦＥ
ＲＭ ＢＰ−３６０株遺伝子ＤＮＡライブラリー、すな
わち平板寒天培地上のアンピシリン耐性コロニーの上
に、ナイロンメンブレンフィルター〔マグナグラフナイ
ロン（ミクロンセパレーション社製）〕を重ね、フィル
ター上に該コロニー菌体の一部を移行させた後、このフ
ィルターをアルカリ変性溶液（１．５ＭのＮａＣｌ含有
０．５Ｎ−ＮａＯＨ溶液）中に５分間浸し、さらに中和
溶液〔０．５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．０）及び３Ｍの
ＮａＣｌ混合液〕に５分間浸漬後、乾燥させた。

【００４８】次に、このフィルターを８０℃で２時間加
熱し、菌体中にあったプラスミドＤＮＡをフィルターに
固定した。さらに、このフィルターを、１．８ＭのＮａ
Ｃｌ、０．１８Ｍクエン酸ナトリウム、０．０５％二リ
ン酸ナトリウム、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム、
０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、
０．１％ＢＳＡ及び０．０１％サケ精子ＤＮＡを含有す
るプレハイブリダイゼション溶液に浸し、３７℃で２時
間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、フィ
ルターを、１．８ＭのＮａＣｌ、０．１８Ｍクエン酸ナ
トリウム、０．０５％二リン酸ナトリウム、０．１％ラ
ウリル硫酸ナトリウム、０．１％フィコール、０．１％
ポリビニルピロリドン、０．１％ＢＳＡ及び０．００２
％大腸菌由来のトランスファーＲＮＡを含有するハイブ
リダイゼーション溶液に浸した後、先に実施例１で得ら
れた図６の〜に示した配列の放射性オリゴヌクレオ
チドプローブを別々に加え、４２℃で一昼夜ハイブリダ
イゼーションを行った。

【００４９】ハイブリダイゼーション後、１．８ＭのＮ
ａＣｌ、０．１８Ｍクエン酸ナトリウム、０．０５％二
リン酸ナトリウムを含む洗浄液でフィルターを３回洗浄
した後、４５℃の洗浄液に１０分間浸し、余分なプロー
ブを洗い落とした。ついで、フィルターを風乾後、Ｘ線
フィルム（富士写真フィルム社製、ＨＲ−Ｈ）に重ね、
遮光下−８０℃で２４時間オートラジオグラフィーを行
った。

【００５０】その後、フィルムを現像したところ、図６
のに示した配列の放射性オリゴヌクレオチドプローブ
を用いたものにおいてポジティブシグナルを示すコロニ
ーを確認した。該コロニーを形成する組換え体Ｅ．ｃｏ
ｌｉに含まれるプラスミドに挿入されたＤＮＡの制限酵
素切断地図を図３に示した。該コロニーを、ウリカーゼ
をコードするＤＮＡを含む形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１−ｐＵＯＤ２（ＦＥＲＭ Ｐ
−１５３０８）と命名し、その形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ
ＤＨ１−ｐＵＯＤ２中に含まれるベクタープラスミド
はプラスミドｐＵＯＤ２と命名した。

【００５１】

【実施例３】 ウリカーゼをコードするＤＮＡ塩基配列の決定 ベクタープラスミドｐＵＯＤ２で形質転換したＥ．ｃｏ
ｌｉＤＨ１から、ティー・マニアティスらの方法〔「モ
レキュラル・クローニング：コールド・スプリング・ハ
ーバー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）」第８６〜９４ペー
ジ（１９８２年）〕によって、ｐＵＯＤ２ＤＮＡを抽出
した。このプラスミドの構成を示す模式図を図４に示
す。該プラスミド中のアースロバクター・グロビホルミ
スＦＥＲＭ ＢＰ−３６０株染色体由来の部位をジデオ
キシ法〔「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」第２１４
巻、第１２０５〜１２１０ページ（１９８１年）〕によ
り、塩基配列を決定し、ウリカーゼをコードする全ＤＮ
Ａが含まれていることを確認すると共に、その全塩基配
列を決定し、少なくとも図２にて示される配列を含むも
のであることを確認した。

【００５２】今回解析したウリカーゼのエンドプロテイ
ナーゼ Ａｓｐ−Ｎ処理断片アミノ酸配列とも同一フレ
ームにおいて完全に一致した。

【００５３】

【実施例４】 大腸菌内でのウリカーゼの活性発現 発明の実施の形態２で得られたウリカーゼをコードする
ＤＮＡを含む形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１−ｐＵＯ
Ｄ２をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有ＢＨＩ培地にて
３７℃一昼夜培養した後、培養液を１５，０００ｒｐｍ
で１分間遠心分離処理して沈澱を回収した。この沈澱
に、該培養液と同量の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）を加え、超音波破砕を行った。

【００５４】ウリカーゼ活性の測定は、４０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ尿酸（ｐＨ７．０）、
１．５ｍＭ４−アミノアンチピリン、０．０４％Ｎ，
Ｎ’−ジメチルアニリン、１０ユニットペルオキシダー
ゼを加えた反応液１ｍｌを３７℃に保温しておき、先に
示した超音波砕液を適宜希釈した後、２０μｌ加えて正
確に３７℃で１０分間反応させた。３７ｍＭクエン酸、
１２６ｍＭリン酸水素２ナトリウムに０．１ＭのＥＤＴ
Ａを加えた反応停止液２ｍｌを加えて５６５ｎｍの吸光
度を測定することによって、ウリカーゼ活性を定量し
た。なお、比較のためにｐＵＣ１１８をトランスフォー
メーションしたＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１の破砕液について
も前記と同様の処理を行い、ウリカーゼ活性を測定し
た。

【００５５】その結果、驚くことにベクタープラスミド
ｐＵＯＤ２を保持した形質転換微生物での活性は０．２
７Ｕ／ｍｌも発現していたが、ｐＵＣ１１８を持つもの
の活性は０Ｕ／ｍｌであった。これより、ウリカーゼ活
性をもつ形質転換体が得られていることが確認された。
さらに得られたウリカーゼを単離・精製し、分子量、等
電点、安定性が先に示したアースロバクター・グロビホ
ルミスＦＥＲＭ ＢＰ−３６０株と全く同一であったこ
となど、発現蛋白質の物理化学的性質を確認した。

【００５６】

【発明の効果】本発明によるとアースロバクター・グロ
ビホルミスＦＥＲＭ ＢＰ−３６０株由来の染色体ＤＮ
Ａライブラリーから、ウリカーゼを発現する遺伝子ＤＮ
Ａをスクリーニングし、これを用いて構築された発現ベ
クターの組換えプラスミドを例えばＥ．ｃｏｌｉに属す
る微生物に導入することによって、得られた形質転換微
生物は効率よくウリカーゼを生産することができる。

【００５７】また、本発明によって、ウリカーゼの全ア
ミノ酸配列及びこのアミノ酸をコードする遺伝子ＤＮＡ
の塩基配列が決定できたので、該酵素の基質及び補酵素
特異性の変換や耐熱性の向上などのプロテインエンジニ
アリングが可能となった。

【００５８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：９４７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：アースロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈ
ｒｏｂａｃｔｅｒ・ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ） 株名：ＦＥＲＭ ＢＰ−３６０ 配列の特徴：３１−９３６ Ｅ ウリカーゼ遺伝子 配列 TGGATTTTCA ACCTACCGAG GGAGTTAGCC ATG ACT GCC ACC GCA GAA ACC TCA 54 Met Thr Ala Thr Ala Glu Thr Ser 1 5 ACC GGC ACC AAG GTC GTG CTC GGA CAG AAC CAG TAC GGC AAG GCC GAA 102 Thr Gly Thr Lys Val Val Leu Gly Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu 10 15 20 GTC CGC CTC GTC AAG GTC ACG CGC AAT ACC GCC CGG CAC GAG ATC CAG 150 Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg Asn Thr Ala Arg His Glu Ile Gln 25 30 35 40 GAC CTG AAT GTC ACC TCG CAG CTG CGC GGC GAC TTC GAG GCC GCA CAC 198 Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu Arg Gly Asp Phe Glu Ala Ala His 45 50 55 ACC GCC GGC GAC AAC GCG CAC GTG GTC GCC ACC GAC ACG CAG AAG AAC 246 Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn 60 65 70 ACC GTC TAC GCC TTC GCC CGC GAC GGC TTC GCC ACC ACC GAG GAG TTC 294 Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe 75 80 85 CTG CTC CGG CTG GGC AAA CAC TTC ACC GAG GGC TTC GAC TGG GTA ACC 342 Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr 90 95 100 GGC GGG CGC TGG GCG GCG CAG CAG TTC TTC TGG GAC CGC ATC AAC GAC 390 Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln Phe Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp 105 110 115 120 CAC GAC CAC GCC TTC TCC CGG AAC AAG AGC GAG GTC CGC ACC GCC GTG 438 His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val 125 130 135 CTC GAG ATC TCG GGC AGC GAG CAG GCC ATC GTC GCC GGG ATC GAG GGC 486 Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly 140 145 150 CTG ACG GTC CTG AAG TCC ACC GGT TCG GAA TTC CAC GGC TTC CCG CGG 534 Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg 155 160 165 GAC AAG TAC ACC ACC CTG CAG GAA ACC ACC GAC CGT ATC CTC GCC ACG 582 Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr 170 175 180 GAT GTC AGC GCC CGC TGG CGC TAC AAC ACC GTC GAG GTT GAC TTC GAC 630 Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr Asn Thr Val Glu Val Asp Phe Asp 185 190 195 200 GCC GTC TAC GCG AGC GTC CGC GGG CTG CTG CTC AAG GCC TTC GCC GAG 678 Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly Leu Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu 205 210 215 ACC CAC TCG CTG GCC CTG CAG CAG ACC ATG TAT GAG ATG GGC CGG GCC 726 Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala 220 225 230 GTC ATC GAG ACG CAC CCG GAA ATC GAC GAA ATC AAG ATG TCC CTG CCG 774 Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile Asp Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro 235 240 245 AAC AAG CAC CAT TTC CTG GTG GAC CTG CAG CCC TTC GGA CAG GAC AAC 822 Asn Lys His His Phe Leu Val Asp Leu Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn 250 255 260 CCG AAT GAG GTG TTC TAC GCC GCC GAC CGT CCC TAC GGA CTG ATC GAA 870 Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu 265 270 275 280 GCC ACC ATC CAG CGC GAG GGC TCG CGC GCC GAC CAC CCG ATC TGG TCG 918 Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser Arg Ala Asp His Pro Ile Trp Ser 285 290 295 AAC ATC GCC GGA TTC TGC TAG CCACATGC 947 Asn Ile Ala Gly Phe Cys *** 300 302

【００５９】

【配列表】

配列番号：２ 配列の長さ：１７塩基対 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の名称：ウリカーゼ遺伝子プローブ ＵＯＤａ 配列の特徴：Ｎはアデニン、チミン、グアニンまたはシ
トシン 配列 GAYTTYGARG CNGCNCA 17

【００６０】

【配列表】

配列番号：３ 配列の長さ：３２塩基対 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の名称：ウリカーゼ遺伝子プローブ ＵＯＤｂ 配列の特徴：Ｎはイノシン 配列 GANCANCCNA TNTGGWSNAA NATNGCNGGN TT 32

【００６１】

【配列表】

配列番号：４ 配列の長さ：２０塩基対 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の名称：ウリカーゼ遺伝子プローブ ＵＯＤｃ 配列の特徴：Ｎはアデニン、チミン、グアニンまたはシ
トシン 配列 GAYTTCGAAG CNGCNCAYAC 20

【００６２】

【配列表】

配列番号：５ 配列の長さ：２０塩基対 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の名称：ウリカーゼ遺伝子プローブ ＵＯＤｄ 配列の特徴：Ｎはアデニン、チミン、グアニンまたはシ
トシン 配列 GAYTTCGAGG CNGCNCAYAC 20

【００６３】

【配列表】

配列番号：６ 配列の長さ：２０塩基対 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の名称：ウリカーゼ遺伝子プローブ ＵＯＤｅ 配列の特徴：Ｎはアデニン、チミン、グアニンまたはシ
トシン 配列 GAYTTTGAAG CNGCNCAYAC 20

【００６４】

【配列表】

配列番号：７ 配列の長さ：２０塩基対 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の名称：ウリカーゼ遺伝子プローブ ＵＯＤｆ 配列の特徴：Ｎはアデニン、チミン、グアニンまたはシ
トシン 配列 GAYTTTGAGG CNGCNCAYAC 20

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はウリカーゼのアミノ酸配列を示す図であ
る。

【図２】図２は図１のアミノ酸をコードするウリカーゼ
遺伝子ＤＮＡの塩基配列を示す図である。

【図３】図３はベクタープラスミドｐＵＯＤ２における
アースロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒ・ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）由来の染色体ＤＮ
Ａの制限酵素地図である。

【図４】図４はベクタープラスミドｐＵＯＤ２の構造を
示す模式図である。

【図５】図５はウリカーゼ精製標品のエンドプロテイナ
ーゼ・Ａｓｐ−Ｎ処理断片アミノ酸配列を解析したウリ
カーゼのアミノ酸配列を示す図である。下線で示した部
分は作製したオリゴヌクレオチドプローブＵＯＤｄに対
応する領域である。

【図６】図６はオリゴヌクレオチドプローブの作製に用
いたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す図である。な
お、ここでのＮはイノシンである。

【図７】図７は本発明で用いたウリカーゼ遺伝子発現ベ
クターの構築の流れを示す模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１におけるアミノ酸配
   列の１位から３０２位で表されるアミノ酸配列をコード
   する塩基配列を有する組換えベクターによって形質転換
   されたエッシェリヒア・コリーに属する微生物であるこ
   とを特徴とするウリカーゼを生産する実質上純粋な微生
   物。
2. 【請求項２】 形質転換されたエッシェリヒア・コリー
   に属する微生物が、ベクタープラスミドｐＵＯＤ２によ
   って形質転換されたものである請求項１記載の微生物。
3. 【請求項３】 ベクタープラスミドｐＵＯＤ２によって
   形質転換されたエッシェリヒア・コリーに属する微生物
   が、エッシェリヒア・コリーＤＨ１−ｐＵＯＤ２（Ｅｓ
   ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１−ｐＵＯＤ２：
   ＦＥＲＭ Ｐ−１５３０８）である請求項２記載の微生
   物。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号１におけるアミノ酸配
   列の１位から３０２位で表されるアミノ酸配列をコード
   する塩基配列を有することを特徴とするウリカーゼを発
   現する実質上純粋なＤＮＡ。
5. 【請求項５】 塩基配列が、配列表の配列番号１におけ
   る塩基配列の３１位から９３６位で表される塩基配列で
   ある請求項４記載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】 アースロバクター属由来のウリカーゼ遺
   伝子を有する組換えプラスミドによって形質転換された
   微生物であるウリカーゼを生産する実質上純粋な微生物
   を培地に培養し、次いでその培養物からウリカーゼを採
   取することを特徴とするウリカーゼの製造方法。
7. 【請求項７】 配列表の配列番号１におけるアミノ酸配
   列の１位から３０２位で表されるアミノ酸配列をコード
   する塩基配列を有する組換えベクターによって形質転換
   された微生物であるウリカーゼを生産する実質上純粋な
   微生物を培地に培養し、次いでその培養物からウリカー
   ゼを採取することを特徴とするウリカーゼの製造方法。
8. 【請求項８】 形質転換された微生物が、ベクタープラ
   スミドｐＵＯＤ２によって形質転換された微生物である
   請求項７記載のウリカーゼの製造方法。
9. 【請求項９】 ベクタープラスミドｐＵＯＤ２によって
   形質転換された微生物が、エッシェリヒア・コリーＤＨ
   １−ｐＵＯＤ２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
   ＤＨ１−ｐＵＯＤ２：ＦＥＲＭ Ｐ−１５３０８）であ
   る請求項８記載のウリカーゼの製造方法。