JPH05115281A - 新規なザルコシン・オキシダーゼｍ、その遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びザルコシン・オキシダーゼｍの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 バチルス属に属する微生物に由来し、下記の
制限酵素開裂地図で規定される新規なザルコシン・オキ
シダーゼＭ遺伝子、該遺伝子から翻訳される新規なザル
コシン・オキシダーゼＭ、該遺伝子をベクターＤＮＡに
挿入した新規な組み換え体ＤＮＡ、及び該組み換え体Ｄ
ＮＡを含み、ザルコシン・オキシダーゼＭ生産能を有す
るエッシェリシア属に属する微生物を培地に培養してザ
ルコシン・オキシダーゼＭを製造する方法。 【化１】 (式中、PsはPstＩ、PvはPvuII、H はHindIII、N はNru
Ｉを表す。) 【効果】 高い基質特異性と熱安定性を有するザルコシ
ン・オキシダーゼＭを提供することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床医学分野におい
て、腎臓疾患等の診断用酵素として用いるためのより好
適な新規ザルコシン・オキシダーゼＭ、その遺伝子、新
規な組み換え体ＤＮＡ及びザルコシン・オキシダーゼＭ
の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、臨床医学分野では、血清、尿中の
クレアチニンあるいはクレアチンを酵素定量法により測
定し、腎臓機能の疾患、筋肉疾患等の診断を行なってい
る。その定量法は下記の通りであって、これにザルコシ
ン・オキシダーゼが使用されている。なお、下記の式
中、括弧内は使用酵素である。

【０００３】

【化２】

【０００４】従来、ザルコシン・オキシダーゼは、コリ
ネバクテリウム属〔J. Biochem., 89, 599(1981)〕、バ
チルス属 (特開昭54-52789号公報、特開昭61-162174号
公報)、シリンドロカーボン属 (特開昭56-92790号公報)
、シュードモナス属 (特開昭60-43379号公報) 、アー
スロバクター属 (特開平2-265478号公報) 等の菌株によ
り生産されることが知られている。しかしながら、熱安
定性が悪く、ザルコシンに対するKm値が大きいもの、エ
チル・グリシンやプロリンにも大きく作用するなど特異
性の劣る酵素であった。このエチル・グリシンやプロリ
ンは、治療中の投薬由来によるもので、これにもザルコ
シン・オキシダーゼが作用すると正の測定誤差を与え、
治療上問題となっている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記したように、クレ
アチニンあるいはクレアチンを、酵素的に定量する方法
が用いられているが、血清、尿中に含まれているクレア
チニン量あるいはクレアチン量は極めて微量であるの
で、投薬由来の物質に作用すると測定値の信頼性が失わ
れる。

【０００６】従って、その定量に際しては、高感度で、
しかも特異性の高い酵素的測定法が期待されている。ま
た、定量に用いられる酵素としては、夾雑酵素を含まな
い純度の高い酵素が要求され、それを得るために酵素の
多量精製工程において夾雑酵素 (例えば、カタラーゼ、
ウリカーゼ等) を加熱処理で完全に失活させるなどし
て、比活性の高い高純度の酵素とする必要がある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記した背景を踏まえ、
本発明者等のうちの一人は、クレアチニンあるいはクレ
アチンの高感度で特異性の高い酵素的測定法に好適な、
熱に安定で、ザルコシンに対する特異性の高い酵素的性
質を同時に所有する新規なザルコシン・オキシダーゼを
提供すべく鋭意検討を重ねた結果、新たに土壌より分離
したバチルス属に属する菌株｛バチルス・エスピー．KS
-11A〔微工研条寄3605号〕｝を培養したものより、高い
基質特異性と熱安定性を同時に有する新規なザルコシン
・オキシダーゼＭが得られることを知った。

【０００８】また、本発明者等は、この新規ザルコシン
・オキシダーゼＭをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体をエッシェリシ
ア (Escherichia)属に属する菌株に含ませたザルコシン
・オキシダーゼＭ生産能を有する菌株を創成することに
より、培地中にクレアチニン、クレアチン及び／又はザ
ルコシンを添加することなく、効率よくザルコシン・オ
キシダーゼＭが生産されることを知り、更に、ザルコシ
ン・オキシダーゼＭ遺伝子について検討した結果、この
新規ザルコシン・オキシダーゼＭ遺伝子を初めて単離及
び構造決定することに成功し、本発明を完成した。

【０００９】即ち、本発明の第１は、配列表の配列番号
１のアミノ酸配列で示される新規なザルコシン・オキシ
ダーゼＭであり、本発明の第２は、バチルス属に属する
微生物に由来し、下記の制限酵素開裂地図で規定される
新規なザルコシン・オキシダーゼＭ遺伝子

【００１０】

【化３】

【００１１】(式中、PsはPstＩ、PvはPvuII、H はHindI
II、N はNruＩを表す。) であり、本発明の第３は、配
列表の配列番号１のアミノ酸配列をコードし、配列表の
配列番号２の塩基配列で示される新規なザルコシン・オ
キシダーゼＭ遺伝子であり、本発明の第４は、前記本発
明の第２の新規なザルコシン・オキシダーゼＭ遺伝子を
ベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な組み
換え体ＤＮＡであり、本発明の第５は、配列表の配列番
号１のアミノ酸配列をコードし、配列表の配列番号２の
塩基配列で示される新規なザルコシン・オキシダーゼＭ
遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新
規な組み換え体ＤＮＡであり、本発明の第６は、前記本
発明の第２の新規なザルコシン・オキシダーゼＭ遺伝子
をベクターＤＮＡに挿入した新規な組み換え体ＤＮＡを
含み、ザルコシン・オキシダーゼＭ生産能を有するエッ
シェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養物よ
りザルコシン・オキシダーゼＭを採取することを特徴と
するザルコシン・オキシダーゼＭの製造法であり、本発
明の第７は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列をコー
ドし、配列表の配列番号２の塩基配列で示される新規な
ザルコシン・オキシダーゼＭ遺伝子をベクターＤＮＡに
挿入した新規な組み換え体ＤＮＡを含み、ザルコシン・
オキシダーゼＭ生産能を有するエッシェリシア属に属す
る微生物を培地に培養し、培養物よりザルコシン・オキ
シダーゼＭを採取することを特徴とするザルコシン・オ
キシダーゼＭの製造法である。

【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。先ず、本
発明酵素の理化学的性質等を以下に示す。 ａ. 作用 本酵素は、ザルコシンを酸化分解して、グリシン、ホル
ムアルデヒドと過酸化水素を生成する反応を触媒する酵
素である。

【００１３】ザルコシン＋H₂O ＋O₂ →グリシン＋ホル
ムアルデヒド＋H₂O₂ ｂ. 基質特異性 各基質 (0.01Ｍ) 0.５ml、0.３Ｍリン酸緩衝液 (pH7.7)
0.1ml、0.２％ (W/V)の２, ４−ジクロロフェノール・
サルフォネート0.１ml、70mg／dlの４−アミノアンチピ
リン0.１ml及び70ユニット／mlのパーオキシダーゼ0.１
mlを混合したものに、17ユニット／mlの本酵素液及び特
公平1-34035号公報実施例記載の耐熱性ザルコシン・オ
キシダーゼＮを夫々0.１ml加え、37℃で20分間反応さ
せ、1.０Ｎの酢酸を２ml添加し反応を停止させ、次に反
応時間ゼロ時間の反応液を対照として波長510nm での吸
光度値を測定した。なお、相対活性 (％) は、Ｎ−メチ
ル・グリシン (ザルコシン) を基質として酵素反応させ
て得られる波長510nm の吸光度を１00％とし、他の物質
を基質とした場合の比較値 (％) で示した。 相対活性 (％) 基 質 本酵素 特公平1-34035号公報記載の ザルコシン・オキシダーゼＮ Ｎ−メチル−グリシン (ザルコシン) 100 100 Ｎ−エチル−グリシン 2.5 4.4 Ｎ−メチル−バリン 1.9 7.7 Ｎ−メチル−ロイシン 6.0 25.4 Ｎ−メチル−イソロイシン 3.2 7.2 Ｎ−メチル−フェニルアラニン 0 0 Ｎ−メチル−セリン 0 0 Ｎ−メチル−グルタミン酸 0 0 Ｎ−メチル−リジン 0 0 Ｌ−アラニン 0 0 Ｌ−セリン 0 0 Ｌ−グルタミン酸 0 0 Ｎ，Ｎ−ジメチル−グリシン 0 0 ベタイン 0 0 コリン 0 0 プロリン 0.3 0.5 ｃ. 至適pH 本酵素の至適pHは、ザルコシンを基質とした場合、図１
に示すようにpH8.０〜9.０である。図１中、×−×：Na
₂HPO₄−クエン酸、○−○：リン酸バッファー、●−
●：トリス−塩酸、△−△：ＴＥＳ−NaOH、▲−▲：PO
PSO −NaOH、□−□：Gly・Gly−NaOH、■−■：Gly・N
aCl−NaOHである。 ｄ. 力価の測定法 0.２Ｍのザルコシン溶液0.３mlに、0.３Ｍのトリス−塩
酸緩衝液 (pH8.8) 0.1ml及び適当な濃度の本酵素液0.１
mlを加え、37℃で、10分間反応させた後、1.０Ｎの酢酸
液0.５mlを添加して反応を停止させ、次に、これにアセ
チル・アセトン呈色液〔アセチル・アセトン0.２％ (V/
V)、リン酸水素二アンモニウム10％ (W/V)〕 (pH6.５)
を３ml添加し、37℃で40分間発色させて、光電比色計に
より波長410nm における吸光度値を測定した。

【００１４】そして、予め作製したホルムアルデヒドの
検量曲線より、その生成量を調べておき、37℃、１分間
当り１μM のホルムアルデヒドを生成する酵素量を１ユ
ニットとした。 ｅ. 作用適温の範囲 図２に示すように本酵素の作用適温の範囲は、50〜60℃
にある。 ｆ. 熱安定性 精製した本酵素を３ユニット含有する酵素液0.５ml〔0.
３Ｍトリス−塩酸緩衝液 (pH8.０) 〕を各温度に20分間
放置して、残存する酵素活性量を調べた結果、図３に示
すように、50℃において１00％、60℃において64％の残
存活性を示した。 ｇ. pH安定性 0.２ユニットの本酵素を含有する各緩衝液0.５mlを５℃
で48時間放置後、残存する酵素活性を調べた。その結果
は図４に示すように、pH7.０〜10.0である。なお、使用
した緩衝液は至適pHを求めたときと同一のものである。 ｈ. 阻害、活性化及び安定化 本酵素は、銅、亜鉛、銀、水銀等のイオン及びＳＤＳ
(ドデシル硫酸ナトリウム) により強く阻害される。活
性化剤及び安定化剤は特にない。 ｉ. 分子量 本酵素の遺伝子の塩基配列から翻訳されるポリペプチド
の分子量は、43072 である。

【００１５】次に、この新規ザルコシン・オキシダーゼ
Ｍ (以下「ＳＯＭ」という。) をコードする遺伝子を含
有するＤＮＡの調製について述べる。ＳＯＭをコードす
る遺伝子のドナー微生物としては、例えばバチルス・エ
スピー． (Bacillus sp.) KS-11Aが挙げられる。バチル
ス・エスピー． (Bacilluc sp.) KS-11Aは、本発明者が
土壌中より新たに分離した菌株であり、その菌学的性質
は下記の通りである。

【００１６】(ａ) 形態 顕微鏡的観察 (肉汁寒天培地30℃、１〜３日間培養) (1) 細胞の形及び大きさ ：0.８〜1.１×3.０〜4.５ミ
クロンの桿菌 (2) 細胞の多形性の有無 ：認められない。 (3) 運動性の有無 ：周鞭毛で運動する。

【００１７】(4) 胞子の有無 ：内生胞子は極
めてできにくい。 (5) グラム染色性 ：陽性。 (6) 抗酸性 ：陰性。 (ｂ) 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養 ：30℃、24時間で淡灰褐色コ
ロニー、表面平滑で鈍い光沢を有し、不透明である。色
素の生成はない。

【００１８】(2) 肉汁寒天斜面培養 ：生育は良好で
(1) に同じ。 (3) 肉汁液体培養 ：静置培養は生育が悪く、生
育菌体の沈澱を形成する。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養：25℃で培養して液化する。 (5) リトマスミルク：変化しない。

【００１９】(ｃ) 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元 ：陰性 (2) 脱窒反応 ：陰性 (3) ＭＲテスト ：陰性 (4) ＶＰテスト ：陰性 (5) インドールの生成 ：陰性 (6) 硫化水素の生成 ：陰性 (7) デンプンの加水分解 ：陽性 (8) カゼインの加水分解 ：陰性 (9) 尿酸の分解 ：陰性 (10) チロシンの分解 ：陰性 (11) セルロースの加水分解：陰性 (12) クエン酸塩の利用 ：陰性 (13) 無機窒素源の利用 ：アンモニアの利用は弱
い、硝酸塩は利用しない。

【００２０】(14) ウレアーゼ ：陰性 (15) オキシダーゼ ：陽性 (16) カタラーゼ ：陽性 (17) 色素の生成 ：陰性 (18) 耐塩性 ：５％ NaCl で生育しな
い。

【００２１】(19) 酸素に対する態度 ：好気性 (20) 生育の範囲 ：生育pH域は６〜９、生育
温度は22℃〜37℃ 85℃、30分間処理で完全に死滅する。 (21) Ｏ−Ｆテスト ：酸化 (グルコース) (22) 糖類からの酸及びガスの生成 糖 類 酸の生成 ガスの生成 (1) Ｌ−アラビノース − − (2) Ｄ−キシロース − − (3) Ｄ−グルコース ＋ − (4) Ｄ−マンノース − − (5) Ｄ−フラクトース − − (6) Ｄ−ガラクトース − − (7) 麦芽糖 − − (8) ショ糖 − − (9) 乳糖 − − (10) トレハロース − − (11) Ｄ−ソルビット − − (12) Ｄ−マンニット − − (13) イノシット − − (14) グリセリン − − (15) デンプン − − (ｄ) その他の性質 細胞壁中の meso-ジアミノピメリン酸の存在は陽性でキ
ノン系はＭＫ-7であり、ＤＮＡのＧＣ含量 (％) は37％
である。

【００２２】カタラーゼ陽性のグラム陽性桿菌で細胞壁
のジアミノ酸及びキノン系等の測定よりバチルス属に属
する菌株と考えられ、 Bacilluscirculans の近い菌株
であるが、同一とは考えられず、バチルス・エスピー
(Bacillus sp.) KS-11A株と命名した。なお、バチルス
・エスピー． (Bacillus sp.) KS-11A株は、工業技術院
微生物工業技術研究所に、微工研条寄第3605号(FERM BP
-3605)として寄託されている。

【００２３】例えば、バチルス・エスピー．KS-11A株
を、特開昭61-162174号公報記載の方法と全く同様にし
て培養し、培養物を得る。この培養物を、例えば3000r.
p.m.以上、好ましくは8000〜10000r.p.m. で５分以上、
好ましくは10〜15分間遠心分離してバチルス・エスピ
ー．KS-11Aの菌体を得る。この菌体より、例えば、カレ
ント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロ
ジー〔Current Protocols in MolecularBiology、第１
巻、第２号 (1987年）〕記載の方法等により染色体ＤＮ
Ａを得ることができる。

【００２４】次いで、この染色体ＤＮＡに、ＳＯＭ遺伝
子上に切断部位を有しない制限酵素、例えばBamHＩ（宝
酒造社製）を温度30℃以上、好ましくは37℃、酵素濃度
は10〜1000ユニット／mlで３時間以上、好ましくは16時
間作用させて消化し、種々の染色体ＤＮＡ断片混合物を
得る。このようにして得たＤＮＡ断片混合物から、例え
ば、通常のアガロースゲル電気泳動法により、好ましく
は15〜20Kb（キロ・ベース・ペアー）の大きさのＤＮＡ
断片混合物を得、これにアルカリ性ホスファターゼ処理
等を行なった後、更に、例えばフェノール抽出等の精製
手段により精製し、また、更に例えば、エタノール沈澱
等の手段により濃縮し、純化されたＤＮＡ断片混合物
（この中にＳＯＭをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
断片が含まれる。）を得る。

【００２５】一方、本発明において用いることのできる
ベクターＤＮＡとしては、例えば、バクテリオファージ
ベクターＤＮＡ、プラスミドベクターＤＮＡ等が挙げら
れるが、具体的に例えばλEMBL4 ＤＮＡ〔ストラタジー
ン (STRATAGENE) 社製〕等が好ましい。上記ファージベ
クターＤＮＡを、BamHＩ断片取り込み可能な状態にする
ため、例えばBamHＩ及びSalＩ（夫々、宝酒造社製）
を、温度30℃以上、好ましくは37℃、酵素濃度10〜1000
ユニット／mlで１時間以上、好ましくは１〜６時間作用
させて消化し、更にイソプロパノール沈澱処理等を行な
うことにより、BamHＩ断片取り込み可能なファージベク
ターＤＮＡを得る。

【００２６】次いで、上記のようにして得たバチルス・
エスピーKS-11A由来で、ＳＯＭをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡ断片混合物と、同じく上記のようにして得
た BamHＩ断片取り込み可能なファージベクターＤＮＡ
を混合し、これに、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ〔ベーリ
ンガー・マンハイム (Boehringer Mannheim)社製〕を、
温度４〜37℃、好ましくは４〜16℃、酵素濃度１〜１00
ユニット／mlで１時間以上、好ましくは６〜24時間反応
させて組み換え体ファージＤＮＡを得る。

【００２７】このようにして得られた組み換え体ファー
ジＤＮＡについては、通常のインビトロ・パッケージン
グ法により、ファージ粒子を形成させることができ、更
に、該ファージは、例えば大腸菌Ｐ２ 392（東洋紡より
入手）に感染させ、種々のＤＮＡ断片を保有する組み換
え体ファージのプラークを得ることができる。このよう
にして得たプラークの中より、ＳＯＭ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を保有する組み換え体ファージを検索するには、
例えば、〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰ〔アマシャム・ジャパン
(Amersham Japan)より入手〕で標識したザルコシン・オ
キシダーゼＮ遺伝子（特開平1-668287号公報）をプロー
ブとして、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュ
ラー・バイオロジー〔Current Protocols in Molecular
Biology、第１巻、第６号 (1987年）〕記載の方法によ
りプラーク・ハイブリダイゼーションを行なうことがで
きる。

【００２８】このようにして得られた組み換え体ファー
ジ（その中にＳＯＭ遺伝子を含むＤＮＡ断片を含有して
いる。）より、純化されたファージＤＮＡを得るには、
例えば、モレキュラー・クローニング〔Molecular Clon
ing 、第371〜372頁、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー (Cold Spring Harbor Labolatory)(198
2年) 〕記載の方法により得ることができる。

【００２９】そして、以上のようにして得られ、かつ純
化された組み換え体ファージＤＮＡの中のＳＯＭをコー
ドする遺伝子を含有するＤＮＡには、ＳＯＭをコードす
る遺伝子以外に不用なＤＮＡが大量に存在するため、以
下の操作により該不用なＤＮＡを除去するのである。次
いで、このようにして得られ、かつ純化された組み換え
体ＤＮＡに、ＳＯＭ遺伝子上に切断部位を有していない
制限酵素、例えばBglII、EcoRＩ等を、温度30℃以上、
好ましくは37℃、酵素濃度10〜1000ユニット／mlで１時
間以上、好ましくは１〜６時間作用させて消化し、ＤＮ
Ａ断片混合物を得る。

【００３０】このようにして得たＤＮＡ断片混合物中
の、何れのＤＮＡ断片にＳＯＭをコードする遺伝子が含
有されているかを判定するには、ベーリンガー・マンハ
イム社製のＤＮＡ・ラベリング・アンド・デテクション
・キット (DNA Labeling andDetection Kit)を使用し、
非放射性のジゴキシゲニンで標識したザルコシン・オキ
シダーゼＮ遺伝子（特開平1-168287号公報）をプローブ
として用いることにより、常法にてサザン・ハイブリダ
イゼーション等を行なうことができる。

【００３１】次いで、上記のように消化して得られたＤ
ＮＡ断片混合物について、通常のアガロース電気泳動を
行い、例えば、上記のようにしてＳＯＭをコードする遺
伝子を含有するものと判定されたＤＮＡ断片のみを、フ
ナコシ社製のジーンクリーンIIキット (GENECLEAN II K
IT)を用いて精製し、純化されたBglII消化断片（この中
にＳＯＭをコードする遺伝子が含有されている。）を得
る。

【００３２】一方、本発明において用いることのできる
ベクターＤＮＡとしては、如何なるものでもよく、例え
ば、プラスミドベクターＤＮＡ、バクテリオファージベ
クターＤＮＡ等が挙げられるが、具体的に例えばプラス
ミドpUC118、 pUC119 ＤＮＡ〔夫々、宝酒造社製〕等が
好ましい。上記ベクターＤＮＡに、制限酵素、例えばBa
mHＩ、EcoRＩ等（夫々、宝酒造社製）を温度30℃以上、
好ましくは37℃、酵素濃度10〜1000ユニット／mlで１時
間以上、好ましくは１〜６時間作用させて消化し、切断
されたベクターＤＮＡを得る。

【００３３】次いで、上記のようにして得たバチルス・
エスピーKS-11A由来で、ＳＯＭをコドする遺伝子を含有
するＤＮＡ断片混合物と、切断されたベクターＤＮＡを
混合し、これに例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ〔ベーリンガ
ー・マンハイム社製〕を、温度４〜37℃、好ましくは４
〜16℃、酵素温度１〜１00ユニット／mlで１時間以上、
好ましくは６〜24時間反応させて組み換え体ＤＮＡを得
る。

【００３４】この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大
腸菌Ｋ-12 、好ましくは大腸菌ＪＭ109 (宝酒造株より
入手）、大腸菌ＨＢ101 (ATCC 33694)、大腸菌ＤＨ１(A
TCC 33849)、大腸菌ｘ-1776 (ATCC 31244)等を形質転換
あるいは形質導入して夫々の菌株を得る。この形質転換
はディー・エム・モーリソン(D. M. Morrison)の方法
〔メソズ・イン・エンザイモロジー (Methods in Enzym
ology)、第68巻、第326〜331頁 (1979年) 〕により行な
うことができる。また形質導入はビー・ホーン(B. Hoh
n)の方法〔メソズ・イン・エンザイモロジー、第68巻、
第299〜309頁 (1979年) 〕により行なうことができる。

【００３５】そして上記菌株よりザルコシン・オキシダ
ーゼ活性を有する菌株をスクリーニングすることによ
り、ＳＯＭをコードする遺伝子の全長を含有するＤＮＡ
断片をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含
み、ＳＯＭ生産能を有するエッシェリシア属に属する菌
株を得ることができる。このようにして得られた菌株よ
り純化された新規な組み換え体ＤＮＡを得るには、例え
ばピー・グーリー (P. Guerry)等の方法〔ジェー・バク
テリオロジー(J. Bacteriology)、第116巻、第1064〜10
66頁 (1973年)〕、ディー・ビー・クレウェル (D. B. C
lewell)の方法〔ジェー・バクテリオロジー、第110巻、
第667〜676頁 (1972年) 〕などにより得ることができ
る。

【００３６】上記ＳＯＭ遺伝子を含有するＤＮＡを用い
て、実施例の項目(7) に示すような方法によって、ＳＯ
Ｍ遺伝子の全塩基配列の解析を行ない（配列表の配列番
号２参照）、次いで前記塩基配列を有する遺伝子によっ
て翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を確定する
（配列表の配列番号１参照）。このようにして確定され
たアミノ酸配列をコードする遺伝子が本発明のＳＯＭ遺
伝子である。

【００３７】次に、上記のようにして得られたＳＯＭ遺
伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み
換え体ＤＮＡを含み、ＳＯＭ生産能を有するエッシェリ
シア属に属する菌株を用いてＳＯＭを生産するには、こ
の菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、なるべ
く液体培養法を採用して培養するのが好ましい。また、
上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキ
ス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーある
いは大豆もしくは小麦麹の浸出液等の１種以上の窒素源
に、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫
酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸
第二鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を
添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添
加したものが用いられる。

【００３８】なお、培地の初発pHは、７〜９に調節する
のが適当である。また培養は30〜42℃、好ましくは37℃
前後で４〜24時間、好ましくは６〜８時間、通気攪拌深
部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ま
しい。培養終了後、該培養物よりＳＯＭを採取するに
は、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。

【００３９】例えば、常法により菌体を、超音波処理、
磨砕処理などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素
を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在
下で振盪もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を
菌体外に排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などし
て固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫
酸塩、プロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除
核酸した後、これに硫安、アルコール、アセトン等を添
加して分画し、沈澱物を採取し、これを水に対し透析し
た後、真空乾燥して粗酵素標品を得る。

【００４０】そして本酵素は、必要により酵素の単離精
製の常法に従って、例えば、(1) ＤＥＡＥ−セルロース
のカラムクロマトグラフィー、(2)硫安分画、(3) ＱＡ
Ｅ−セファデックスのカラムクロマトグラフィー、(4)
ＴＳＫ−ＧＥＬブチル−トーヨーパール650 Ｃ〔東洋ソ
ーダ (株) 製〕の疎水クロマトグラフィー、(5) セファ
デックスによるゲル濾過等の方法、またはその他の方法
を必要に応じて組み合わせて用いることにより高度に精
製されたＳＯＭ標品を得ることができる。

【００４１】上記精製手段により得られる組み換え体由
来の精製ＳＯＭの理化学的性質は、前記したバチルス・
エスピーKS-11A由来のＳＯＭの理化学的性質と全く同様
である。

【００４２】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されるも
のではない。 実施例 (1) バチルス・エスピーKS-11A株の染色体ＤＮＡの調製 バチルス・エスピーKS-11A株を、Ｔ−Ｙ培地｛１％(W/
V)バクト−トリプトン(Bacto-trypton)〔ディフコ (Dif
co)社製〕、0.５％(W/V) バクト−イースト・エキスト
ラクト (Bacto-yeast extract)〔ディフコ(Difco)社
製〕、0.５％(W/V) NaCl｝(pH7.2) 200ml に接種し、温
度30℃で16時間振盪培養し、培養物を得た。

【００４３】この培養物を5000r.p.m.で10分間常法によ
り遠心分離処理し、湿潤菌体0.５gを得た後、該菌体か
らカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バ
イオロジー〔Current Protocols in Molecular Biolog
y、第１巻、第２号 (1987年)〕記載の方法により染色体
ＤＮＡを得た。次いで、この染色体ＤＮＡ50μg と制限
酵素BamHＩ（宝酒造社製）50ユニットを20mMトリス塩酸
緩衝液 (１00mM KCl、 10mM MgSO₄ 及び１mMジチオスレ
イトール含有）(pH8.5) に混合し、温度37℃で16時間反
応させた。反応終了液を常法により0.７％(W/V) アガロ
ースゲル（宝酒造社製）電気泳動処理したものより、お
よそ15〜20Kb（キロ・ベース・ペアー）の大きさのＤＮ
Ａ断片をアール・シー・エイ・ヤング(R.C.A.Yang)等の
方法〔メソズ・イン・エンザイモロジー(Methodsin Enz
ymology) 、第68巻、第176〜182頁 (1979年) 〕により
溶出して溶出物を得、これから常法によりフェノール抽
出処理し、更にエタノール沈澱処理して、純化されたBa
mHＩ消化断片を得た。これを１ユニットのアルカリ性フ
ォスファターゼ（宝酒造社製）と共に50mMトリス塩酸緩
衝液 (pH8.０) に添加し、温度37℃で45分間反応して、
5'末端のリン酸を除去した。この反応終了液を常法によ
りフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処理する
ことにより、バチルス・エスピーKS-11A染色体ＤＮＡの
BamHＩ消化断片混合物 (15〜20Kb) （この中にＳＯＭを
コードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片が含まれてい
る。）５μg を得た。 (2) 組み換え体ファージλSOM１の作製 λEMBL４ファージＤＮＡ〔ストラタジーン (STRATAGEN
E) 社製〕２μg 並びに制限酵素BamHＩ及びSalＩ（夫
々、宝酒造社製）を夫々１00ユニットずつを50mMトリス塩
酸緩衝液 (100mM NaCl、 10mM MgSO₄ 及び１mMジチオス
レイトール含有）(pH7.5) に混合し、温度37℃で２時間
反応させた後、15mMエチレンジアミン・四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）(pH8.0) を添加し、温度70℃にて10分間処理するこ
とにより、酵素反応を停止させた。この反応終了液を常
法によりフェノール抽出処理し、更にイソプロパノール
沈澱処理によって小さなＤＮＡ断片を除去した後、エタ
ノール沈澱処理して、BamHＩ断片の取り込み可能となっ
たλEMBL４ファージＤＮＡを得た。

【００４４】次いで、このBamHＩ断片取り込み可能なλ
EMBL４ファージＤＮＡ１μg 、上記項目(1) で得られた
BamHＩで消化されたバチルス・エスピーKS-11Aの染色体
ＤＮＡ断片混合物 (15〜20Kb) ３μg 及び１ユニットの
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ〔ベーリンガー・マンハイム社製〕
を6.6mM MgCl₂ 、10mMジチオスレイトール及び10mMＡＴ
Ｐを含有する66mMトリス塩酸緩衝液 (pH7.５) に添加
し、温度16℃で16時間反応し、ＤＮＡを連結させた。

【００４５】次いで、この組み換え体ファージＤＮＡ１
μg を、通常のインビトロ・パッケージング法により、
先ずファージ粒子内にとりこませ、ファージとして大腸
菌に感染させた後、クロロホルムを加えて菌体を溶か
し、50mMトリス塩酸緩衝液(100mM NaCl、８mM MgSO₄・7
H₂O 及び0.01％(W/V) ゼラチン含有）に溶出させた。こ
のようにして得られた組み換え体ファージの中より、Ｓ
ＯＭ遺伝子を含む BamHＩ断片を保有する組み換え体フ
ァージを検索するため、〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰ〔アマシ
ャム・ジャパン (Amersham Japan) より入手〕で標識し
たザルコシン・オキシダーゼＮ遺伝子（特開平1-168287
号公報）をプローブとして、カレント・プロトコールズ
・イン・モレキュラー・バイオロジー〔Current Protoc
ols inMolecular Biology、第１巻、第６号 (1987年)
〕記載の方法によりプラーク・ハイブリダイゼーショ
ンを行なった。このプローブとハイブリダイズしたＤＮ
Ａを有するファージがＳＯＭ遺伝子を保有する組み換え
体ファージであり、これによって、ＳＯＭ遺伝子を保有
する組み換え体λEMBL４ファージ（λSOM１）を得た。

【００４６】(3) 組み換え体ファージλSOM１ＤＮＡの
単離 大腸菌ＬＥ392 （東洋紡より入手）の培養液１mlを、0.
１％(W/V) グルコースと８mM MgSO₄ を添加したＴ−Ｙ
培地〔１％(W/V) バクト−トリプトン、0.５％(W/V) バ
クト−イースト・エキストラクト、0.５％(W/V) NaCl｝
(pH7.2) 30mlに接種し、温度37℃で２〜３時間振盪培養
し、これに、(2) で調製したＳＯＭ遺伝子を保有する組
み換え体ファージλSOM 1 の平板培養による溶菌液 (2.
０〜2.５×10⁹個のファージを含む）を接種して、ＬＥ3
92 が溶菌するまで（３〜５時間）温度37℃で振盪し、
更に0.３mlのクロロホルムを加えて15分間振盪した。こ
の溶菌液を8000r.p.m.で15分間常法により遠心分離処理
し、その上清に30μg のＲＮase と30μg のＤＮase を
添加して、温度37℃で、30分間反応した後、その溶菌液
と等量の20％(W/V) ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
／2.５ＭNaClを添加し、０℃で１時間ＰＥＧ沈澱処理し
た。この沈澱物を50mMトリス塩酸緩衝液 (100mM NaCl、
８mM MgSO₄・7H₂O 及び0.01％(W/V) ゼラチン含有）に
溶出し、常法によりフェノール抽出処理し、更にイソプ
ロパノール沈澱処理して、組み換え体ファージλSOM１
ＤＮＡを得た。

【００４７】(4) 組み換え体プラスミドpSOM 1の作製 プラスミドpUC119 ＤＮＡ（宝酒造社製）2.５μg 及び
制限酵素BamHＩ（宝酒造社製）10ユニットを、20mMトリ
ス塩酸緩衝液 (１00mM KCl、 10mM MgSO₄ 及び１mMジチ
オスレイトール含有）(pH8.5) に混合し、温度37℃で４
時間反応させて消化液を得、該液を常法によりフェノー
ル抽出及びエタノール沈澱処理した後、１ユニットのア
ルカリ性フォスファターゼ（宝酒造社製）と共に50mMト
リス塩酸緩衝液 (pH8.０) に添加し、温度37℃で45分間
反応して、5'末端のリン酸を除去した。この反応終了液
を常法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈
澱処理することにより、BamHＩで消化されたプラスミド
pUC119 ＤＮＡを得た。

【００４８】次いで、上記項目(3) で得られた組み換え
体ファージλSOM１ＤＮＡ５μg 及びBglII（宝酒造社
製）10ユニットを、50mMトリス塩酸緩衝液 (100mM NaC
l、10mM MgSO₄ 及び１mMジチオスレイトール含有）(pH
7.5) に混合し、温度37℃で16時間反応させて消化液を
得た。該消化液を0.７％(W/V) アガロースゲル電気泳動
したものより約1.５KbのＤＮＡ断片のみをフナコシ社製
のジーンクリーンIIキット (GENECLEAN II KIT) を用い
て精製し、純化されたBglII消化断片0.１μg を得た。
なお、該断片は、ＳＯＭをコードする遺伝子を含有する
約1.５kbのＤＮＡ断片である。

【００４９】このようにして得たＤＮＡ断片0.１μg 、
BamHＩで消化されたプラスミドpUC119 ＤＮＡ0.１μg
及びＴ４ＤＮＡリガーゼ〔ベーリンガー・マンハイム社
製〕１ユニットを、66mMトリス塩酸緩衝液 (6.6mM MgCl
₂ 、10mMジチオスレイトール及び10mMＡＴＰを含有）(p
H7.5) に混和し、温度16℃で16時間反応させてＤＮＡを
連結させた。

【００５０】次いで、ディー・エム・モーリソン (D.
M. Morrison) の方法〔メソズ・イン・エンザイモロジ
ー (Methods in Enzymology)、第68巻、第326〜331頁
(1979年) 〕で、塩化カルシウム処理した大腸菌ＪＭ109
（宝酒造 (株) より入手）を、上記のようにして得た
組み換え体プラスミドＤＮＡで形質転換し、得られた形
質転換株を50μg ／mlアンピシリン、0.5mM イソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトシド及び 0.004％(W/V) ５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トシドを、夫々含有するＴ−Ｙ寒天平板培地を用いて温
度37℃で24時間培養し、白色のコロニーを形成するもの
がＳＯＭを生産する株であるので、白色のコロニーを形
成する大腸菌ＪＭ109 (pSOM１) を得た。

【００５１】このようにして得られたＳＯＭ生産能を有
する形質転換株である大腸菌 (E.coli) ＪＭ109 (pSOM
１)は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄
第3604号 (FERM BP-3604) として寄託されている。 (5) 組み換え体プラスミドpSOM１ＤＮＡの単離 バクト−トリプトン１％(W/V) 、バクト−イースト・エ
キストラクト0.５％(W/V) 、及びNaCl 0.5％(W/V) から
なるＴ−Ｙ培地 (pH7.２) 250ml に12.5mgのアンピシリ
ンを添加し、これに大腸菌 (E.coli) ＪＭ109 (pSOM１)
を接種して、温度37℃で20〜24時間振盪培養し、培養
液を得た。

【００５２】次いで、この培養液を、常法により5000r.
p.m.で10分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、これを50
mMグルコース及び10mMＥＤＴＡを含有する25mMトリス塩
酸緩衝液 (pH8.０) ５mlに懸濁した後、更に、これに、
リゾチーム25mgを添加し、室温で５分間溶菌して溶菌液
を得た。この溶菌液に、１％(W/V) ドデシル硫酸ナトリ
ウムを含む0.２Ｎ−NaOH溶液10mlを添加し、０℃で10分
間放置してＤＮＡを変性させた。更に、これに、５Ｍ酢
酸カリウム−酢酸緩衝液 (pH4.８) 7.５mlを加え、０℃
で10〜30分間放置してプラスミドＤＮＡのみを再生さ
せ、常法により9000r.p.m.で20分間遠心分離して抽出液
を得、常法によりクロロホルム抽出処理した後、常法に
よりエタノール沈澱処理し、沈澱物を得た。

【００５３】次いで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理
したものを１mMＥＤＴＡを含有する10mMトリス塩酸緩衝
液６ml (pH7.５) に溶解し、これに塩化セシウム６ｇ及
び10mg／mlエチジウム・ブロマイド0.３mlを添加したも
のを、常法により50000r.p.m. で20時間、超遠心分離機
を用いて平衡密度勾配遠心処理を行ない、組み換え体プ
ラスミドpSOM１ＤＮＡを単離し、更に、ｎ−ブタノール
を使用してエチジウム・ブロマイドを抽出除去した後、
１mMＥＤＴＡを含有する10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.５)
に対して透析を行ない、純化された組み換え体プラス
ミドpSOM１ＤＮＡ（大きさは、約4.７Kb) １00μg を得
た。

【００５４】(6) 大腸菌 (E.coli) ＪＭ109(pSOM１) に
よるＳＯＭの生産及び該酵素の分離、精製 １％(W/V) バクト−トリプトン、0.5 ％(W/V) バクト−
イースト・エキストラクト、１mMイソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトシド、及び0.５％(W/V) NaClからなる培
地２Ｌ(pH7.2) を攪拌式小型培養装置（いわしや社製）
の培養槽に分注し、常法により高圧滅菌処理したもの
に、上記と同一組成の培地で予め温度37℃で24時間振盪
培養した大腸菌 (E.coli) ＪＭ109(pSOM１) の培養液20
mlを接種し、温度37℃で８時間通気攪拌培養する操作を
５回繰り返して湿潤菌体37g を得た。

【００５５】この菌体を0.01Ｍリン酸緩衝液 (pH8.０)
120ml に懸濁し、常法により超音波破砕処理した後、15
000r.p.m. で30分間通常の遠心分離処理し、ＳＯＭの粗
酵素液130ml (3.２ユニット／ml) を得た。このように
して得た粗酵素液に硫酸ストレプトマイシンを用いて除
核酸処理を施したものを、温度50℃で１時間加熱処理を
行なった後、不溶性物質を10000r.p.m. で10分間遠心分
離処理して除去した。

【００５６】次いで、この粗酵素液を0.01Ｍリン酸緩衝
液で平衡化済みのＱＡＥ−セファデックスA-50カラム
(1.４×40cm) に吸着させ、0.27Ｍ塩化カリウムを含有
する0.01Ｍリン酸緩衝液で洗浄した後、0.37Ｍ塩化カリ
ウムを含有する0.01Ｍリン酸緩衝液を用いて溶出し、Ｓ
ＯＭ含有溶出液を得た。このＳＯＭ含有溶出液を、常法
により濃縮した後、凍結乾燥することにより純化された
ＳＯＭ粉末を得た。

【００５７】(7) ＳＯＭ遺伝子を含有するＤＮＡの塩基
配列の解析 前記項目(5) で得られたプラスミドpSOM１ＤＮＡに組込
んだBglII断片内の種々の制限酵素切断部位を利用し、
図５に示した手順にて、ＳＯＭ遺伝子の塩基配列の解析
を行なった。pSOM１より種々の制限酵素にて切り出した
各種ＤＮＡ断片を、プラスミドpUC118またはpUC119 Ｄ
ＮＡ（夫々、宝酒造社製）のマルチクローニングサイト
にクローニングし、得られた組み換え体プラスミドＤＮ
Ａを用いて大腸菌ＪＭ109 （宝酒造 (株) より入手）を
形質転換し、夫々の形質転換株を得た。

【００５８】なお、ＤＮＡの制限酵素による切断、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼによる連結及び形質転換方法、並びにＤ
ＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動による単離・精製法
は、前記項目(4) に記載の方法に準拠した。このように
して得られた形質転換株に、ヘルパーファージＭ13Ｋ07
（宝酒造社製）を感染させメッシング (Messing)の方法
〔メソズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymo
logy)、第101巻、第20〜78頁 (1983年) 〕に従い一本鎖
ＤＮＡを調製した。

【００５９】得られた一本鎖ＤＮＡによるシーケンシン
グは、ダイ・プライマー・ターク・シーケンシング・キ
ット (Dye Primer Taq Sequencing Kit)〔アプライド・
バイオシステムズ (Applied Biosystems) 社製〕を用
い、上記メッシングの方法に従って行なった。更に、塩
基配列の解析のためのゲル電気泳動は、50％(W/V) の尿
素を含む、６％(W/V) ポリアクリルアミドゲル (Nation
al Diagnostics社製）を用い、ＤＮＡシーケンサ 370A
（アプライド・バイオシステムズ社製）にて行なった。

【００６０】得られたＳＯＭ遺伝子の全塩基配列を配列
表の配列番号２に、また、該遺伝子から翻訳されるポリ
ペプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示し
た。

【００６１】

【発明の効果】本発明の新規ＳＯＭは、ザルコシンに対
する高い基質特異性と熱安定性を同時に有しており、ク
レアチニンあるいはクレアチンの高感度で特異性の高い
酵素的測定法に好適である。更に、本発明ＳＯＭ遺伝子
の組み込まれた新規な組み換え体ＤＮＡを含むエッシェ
リシア属に属する菌株を培地に培養すると、クレアチニ
ン、クレアチン、ザルコシン等を添加使用することな
く、ＳＯＭを効率よく得ることができるので、本発明は
産業上極めて有用なものである。

【００６２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３８７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列： Met Ser Thr His Phe Asp Val Ile ValVal 10 Gly Ala Gly Ser Met Gly Met Ala AlaGly 20 Tyr Tyr Leu Ala Lys Gln Gly Val LysThr 30 Leu Leu Val Asp Ala Phe Asp Pro ProHis 40 Thr Glu Gly Ser His His Gly Asp ThrArg 50 Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu GlyArg 60 Glu Tyr Val Pro Phe Ala Leu Arg AlaGln 70 Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Asn GluThr 80 His Asn Lys Ile Phe Thr Lys Thr GlyVal 90 Leu Val Phe Gly Pro Lys Gly Glu SerAsp 100 Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala AlaAla 110 Glu His Ser Leu Thr Val Asp Leu LeuGlu 120 Gly Asp Glu Ile Asn Thr Arg Trp ProGly 130 Ile Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn AlaIle 140 Phe Glu Pro Asn Ser Gly Val Leu PheSer 150 Glu Asn Cys Ile Arg Ser Tyr Arg GluLeu 160 Ala Val Ala Lys Gly Ala Lys Ile LeuThr 170 Tyr Thr Arg Val Glu Asp Phe Glu ValSer 180 Gln Asp Gln Val Lys Ile Gln Thr AlaAsn 190 Gly Ser Tyr Thr Ala Asp Lys Leu IleVal 200 Ser Met Gly Ala Trp Asn Ser Lys LeuLeu 210 Ser Lys Leu Asn Leu Asp Ile Pro LeuGln 220 Pro Tyr Arg Gln Val Val Gly Phe PheAsp 230 Ser Asn Glu Ala Lys Tyr Ser Asn AspVal 240 Asp Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu ValPro 250 Lys Gly Ile Tyr Tyr Gly Phe Pro SerPhe 260 Gly Gly Cys Gly Leu Lys Ile Gly TyrHis 270 Thr Tyr Gly Gln Gln Ile Asp Pro AspThr 280 Ile Asn Arg Glu Phe Gly Ala Tyr GlnGlu 290 Asp Glu Ser Asn Leu Arg Asp Phe LeuGlu 300 Lys Tyr Met Pro Glu Ala Asn Gly GluLeu 310 Lys Arg Gly Ala Val Cys Met Tyr ThrLys 320 Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile AspThr 330 His Pro Glu His Ser Asn Val Phe ValAla 340 Ala Gly Phe Ser Gly HIs Gly Phe LysPhe 350 Ser Ser Val Val Gly Glu Val Leu SerGln 360 Leu Ala Thr Thr Gly Lys Thr Glu HisAsp 370 Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg ProAla 380 Leu Lys Gln Lys Thr Thr Ile 配列番号：２ 配列の長さ：１１６４ 配列の型：核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー： 線状 配列の種類： genomic DNA 起源 生物名：バチルス・エスピー（Bacillus sp.) 株 名：KS-11A株 配列： ATG AGT ACA CAT TTT GAT GTG ATT GTTGTT 30 GGA GCA GGA TCA ATG GGA ATG GCT GCAGGG 60 TAC TAT TTA GCA AAA CAA GGA GTC AAAACA 90 TTA TTG GTG GAT GCA TTC GAT CCG CCGCAT 120 ACA GAA GGA AGC CAT CAC GGT GAT ACTCGC 150 ATT ATC CGC CAT GCT TAC GGT GAA GGAAGA 180 GAA TAT GTT CCA TTT GCA CTA AGA GCACAA 210 GAA TTA TGG TAT GAA CTT GAA AAT GAAACA 240 CAC AAT AAG ATT TTT ACA AAA ACA GGCGTT 270 CTA GTT TTT GGT CCG AAA GGT GAA TCCGAT 300 TTC GTT GCC GAA ACA ATG GAG GCA GCTGCA 330 GAA CAT TCA TTG ACT GTG GAT TTA CTTGAG 360 GGT GAT GAA ATC AAT ACG CGC TGG CCCGGC 390 ATA ACG GTT CCT GAA AAC TAT AAT GCAATT 420 TTT GAA CCA AAT TCA GGC GTA TTG TTCAGT 450 GAG AAT TGT ATT CGT TCA TAC CGT GAGCTG 480 GCT GTA GCA AAA GGA GCA AAA ATT TTAACA 510 TAT ACT CGT GTT GAG GAT TTT GAA GTTTCT 540 CAA GAC CAA GTT AAA ATC CAA ACG GCAAAT 570 GGA TCG TAC ACA GCT GAT AAA TTA ATCGTA 600 AGT ATG GGT GCT TGG AAT AGT AAA CTACTT 630 TCT AAA TTA AAT CTT GAC ATC CCA TTACAG 660 CCA TAC CGC CAA GTT GTA GGA TTT TTTGAT 690 TCT AAT GAA GCA AAG TAC AGC AAT GATGTG 720 GAT TAT CCA GCA TTC ATG GTA GAA GTACCA 750 AAA GGT ATT TAT TAC GGA TTC CCA AGCTTC 780 GGT GGC TGC GGT TTG AAA ATA GGG TATCAT 810 ACG TAT GGT CAA CAA ATC GAC CCT GATACG 840 ATT AAC CGT GAA TTT GGT GCT TAT CAAGAG 870 GAT GAA AGT AAT CTT CGC GAT TTC TTGGAA 900 AAA TAT ATG CCA GAA GCA AAT GGC GAGTTA 930 AAA CGA GGC GCA GTC TGT ATG TAC ACGAAA 960 ACA CCA GAT GAA CAT TTC GTG ATT GATACT 990 CAT CCA GAA CAT TCC AAT GTT TTC GTAGCA 1020 GCT GGT TTC TCT GGA CAC GGC TTT AAATTT 1050 TCA AGT GTA GTC GGT GAA GTG TTA AGTCAA 1080 TTA GCG ACA ACA GGT AAA ACA GAA CATGAT 1110 ATT TCA ATT TTC TCA ATA AAT CGT CCTGCT 1140 TTA AAA CAG AAA ACA ACG ATT TAA

【図面の簡単な説明】

【図１】本酵素の至適pHを示す図。

【図２】本酵素の作用適温の範囲を示す図。

【図３】本酵素の熱安定性を示す図。

【図４】本酵素のpH安定性を示す図。

【図５】本酵素ＳＯＭをコードする遺伝子を含有するＤ
ＮＡ断片の主な制限酵素による切断地図を示す図（塩基
配列解析の手順付記）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:185） (72)発明者 小山 泰二 千葉県野田市野田339番地 キツコーマン 株式会社内 (72)発明者 中野 衛一 千葉県野田市野田339番地 キツコーマン 株式会社内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１のアミノ酸配列で
   示される新規なザルコシン・オキシダーゼＭ。
2. 【請求項２】 バチルス属に属する微生物に由来し、
   下記の制限酵素開裂地図で規定される新規なザルコシン
   ・オキシダーゼＭ遺伝子。 【化１】 (式中、PsはPstＩ、PvはPvuII、H はHindIII、N はNru
   Ｉを表す。)
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１のアミノ酸配列を
   コードする請求項２記載の新規なザルコシン・オキシダ
   ーゼＭ遺伝子。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号２の塩基配列で示さ
   れる請求項２又は３記載の新規なザルコシン・オキシダ
   ーゼＭ遺伝子。
5. 【請求項５】 請求項２記載の新規なザルコシン・オ
   キシダーゼＭ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを
   特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ。
6. 【請求項６】 ザルコシン・オキシダーゼＭ遺伝子が
   配列表の配列番号１のアミノ酸配列をコードすることを
   特徴とする請求項５記載の新規な組み換え体ＤＮＡ。
7. 【請求項７】 ザルコシン・オキシダーゼＭ遺伝子が
   配列表の配列番号２の塩基配列で示されることを特徴と
   する請求項５又は６記載の新規な組み換え体ＤＮＡ。
8. 【請求項８】 請求項５記載の新規な組み換え体ＤＮ
   Ａを含み、ザルコシン・オキシダーゼＭ生産能を有する
   エッシェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養
   物よりザルコシン・オキシダーゼＭを採取することを特
   徴とするザルコシン・オキシダーゼＭの製造法。
9. 【請求項９】 ザルコシン・オキシダーゼＭ遺伝子が
   配列表の配列番号１のアミノ酸配列をコードすることを
   特徴とする請求項８記載のザルコシン・オキシダーゼＭ
   の製造法。
10. 【請求項10】 ザルコシン・オキシダーゼＭ遺伝子が
    配列表の配列番号２の塩基配列で示されることを特徴と
    する請求項８又は９記載のザルコシン・オキシダーゼＭ
    の製造法。