PL208287B1 - Polipeptyd fuzyjny, sposób jego wytwarzania oraz kodujący go kwas nukleinowy, komórka gospodarza, rekombinowany wektor oraz sposób jego konstruowania - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd fuzyjny, sposób jego wytwarzania oraz kodujący go kwas nukleinowy, komórka gospodarza, rekombinowany wektor oraz sposób jego konstruowania.

Niniejszy wynalazek dotyczy, w ogólności, polipeptydów fuzyjnych zawierających domeny indukujące trimeryzację. Polipeptydy stanowiące część takich białek fuzyjnych posiadają obniżoną immunogenność i są zdolne do wywoływania tworzenia trimerów w heterologicznych polipeptydach.

Tło wynalazku

Struktura polipeptydu jest istotnym elementem jego aktywności. Często, właściwie pofałdowany polipeptyd wymaga oddziaływania ze sobą lub innymi polipeptydami w celu osiągnięcia aktywności. Najczęściej te oddziaływania występują w postaci homodimerów i dostarczają aktywnych kompleksów, jednakże, występują również heterotrimery. Określone motywy trimeryzacji to zazwyczaj domeny skręconych helis typu „coiled coil (Burkhard i wsp., 2001, Trends in Cell Biol., 11: 82) i obejmują domeny trimeryzujące SP-D (opis patentowy U.S.A. nr nr 5,716,805 i 6,190,886).

Chociaż wykazujące brak wyraźnego motywu typu „coiled coil, znane są dodatkowe cząsteczki wymagające trimeryzacji w celu osiągnięcia pełnej aktywności, obejmujące przedstawicieli nadrodziny czynnika martwicy nowotworu, takich jak, między innymi, TNF-alfa, limfotoksyna alfa i CD40L (TNFSF5). Bez trimeryzacji, wiele polipeptydów nadrodziny TNF wykazuje niską aktywność lub jej brak (Fanslow i wsp., (1994) Seminars Immunology, 6:267-278). CD40 jest przedstawicielem polipeptydów transmembranowych nadrodziny czynnika martwicy nowotworu i jest zaangażowany do pobudzania podziałów i różnicowania limfatycznych komórek odpowiedzi humoralnej i komórkowej. W szczególności, CD40 jest zaangażowany w przełączanie izotypu i jest istotny w aktywacji komórek T i wytwarzaniu cytokin typu 1 w odpowiedzi na antygeny bia ł kowe (Noelle, R, (1996) Immunity, 4:415; oraz Borrow i wsp., (1996) J. Exp. Med., 183:2129).

Wykazano, że CD40L (TNFSF5) jest prawidłowo aktywne w postaci związanej z błoną, jednakże postać ta jest trudna do podawania jako terapeutyk. Stwierdzono, że postać rozpuszczalna CD40L (TNFSF5) ma bardzo słabą aktywność pobudzającą, ale poprzez trimeryzację rozpuszczalnego CD40L (TNFSF5) z użyciem zmutowanej domeny suwaka leucynowego GCN4, osiągnięto znaczną aktywację komórek docelowych (Fanslow i wsp., (1994) Seminars Immunology, 6:267-278; Morris i wsp., (1999) J. Biol. Chem., 274:418-423; opis patentowy U.S.A. nr 5,716,805).

Znaczącym ograniczeniem stosowania trimeryzującej zmutowanej domeny suwaka leucynowego w terapeutycznym polipeptydzie fuzyjnym, jest to, że suwaki leucynowe to zazwyczaj białka jądrowe, tzn. wewnątrzkomórkowe. Zatem, nawet jeśli polipeptyd może być z tego samego gatunku, co osobnik leczony polipeptydem, jako nie prezentowany wcześniej układowi odpornościowemu może doprowadzić do rozpoznania polipeptydu jako obcego, gdy jest wyrażany zewnątrzkomórkowo i wywoływać odpowiedź immunologiczną u osobnika. Ta odpowiedź jest szczególnie szkodliwa przy ciągłym lub długoterminowym podawaniu polipeptydu fuzyjnego pacjentowi. Niniejszy wynalazek podejmuje to zagadnienie przez dostarczenie domen polipeptydowych, które oprócz właściwości trimeryzujących będą wykazywać obniżoną immunogenność.

Streszczenie wynalazku

Podstawą rozwiązań według wynalazku jest polipeptyd, który jest zdolny do wywoływania trimeryzacji, kiedy jest przyłączony do polipeptydu heterologicznego w polipeptydach fuzyjnych, zawierających domenę trimeryzującą. Bardziej szczegółowo, polipeptyd fuzyjny zawiera pierwszy polipeptyd, zdolny do tworzenia trimeru, przyłączony do drugiego heterologicznego polipeptydu posiadającego pożądaną aktywność biologiczną. Uważa się również, że fuzja pierwszego polipeptydu zdolnego do tworzenia trimeru i drugiego polipeptydu heterologicznego wobec pierwszego polipeptydu powoduje wzrost aktywności biologicznej drugiego polipeptydu w porównaniu z aktywnością monomeru drugiego polipeptydu.

W jednym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest polipeptyd fuzyjny zawierający pierwszy polipeptyd składający się z aminokwasów x do y polipeptydu przedstawionego w Sek. nr id.: 10, przy czym x jest wybrany spośród pozycji 110 do 173 Sek. nr id.: 10, a y jest wybrany spośród pozycji 179 do 270 Sek. nr id.: 10, przyłączony do drugiego heterologicznego polipeptydu, przy czym polipeptyd fuzyjny jest zdolny do tworzenia trimeru.

Korzystnie w polipeptydzie fuzyjnym według wynalazku pierwszy polipeptyd składa się z aminokwasów 154 do 203 polipeptydu przedstawionego w Sek. nr id.: 10.

PL 208 287 B1

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest polipeptyd fuzyjny zawierają cy pierwszy polipeptyd przyłączony do drugiego, heterologicznego polipeptydu, przy czym pierwszy polipeptyd składa się z aminokwasów x do y polipeptydu przedstawionego w Sek. nr id.: 10, gdzie x jest wybrany spośród pozycji 110 do 173 Sek. nr id.: 10, a y jest wybrany spośród pozycji 179 do 270 Sek. nr id.: 10, z przynajmniej jednym podstawieniem aminokwasu, sekwencja aminokwasowa pierwszego polipeptydu jest w przynajmniej 80% identyczna na swojej długości z sekwencją aminokwasową polipeptydu przedstawionego w Sek. nr id.: 10 od pozycji x do y Sek. nr id.: 10 oraz polipeptyd fuzyjny jest zdolny do tworzenia trimeru.

Polipeptyd zdolny do tworzenia trimeru, jak opisano powyżej i w niniejszym opisie patentowym, ma przynajmniej trzy powtórzenia heptadowe. Jednakże, jest zrozumiałe, że trimeryzujący polipeptyd może mieć cztery powtórzenia heptadowe, pięć powtórzeń heptadowych, sześć powtórzeń heptadowych, siedem powtórzeń heptadowych lub więcej, jak pożądane przez specjalistę w dziedzinie o przeciętnych umiejętnościach.

W jeszcze innym aspekcie, wynalazek obejmuje kwasy nukleinowe koduj ące polipeptydy według wynalazku. Sposoby wytwarzania rekombinowanych wektorów zawierających kwasy nukleinowe według wynalazku mieszczą sie również w zakresie wynalazku. Korzystnie polipeptydy fuzyjne według wynalazku nie są immunogenne w osobniku, któremu są podawane.

Ponadto, jest rozważane, że kwasy nukleinowe według wynalazku mogą być transfekowane do komórek gospodarza w celu wytwarzania rekombinowanych polipeptydów. W innym aspekcie, wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania polipeptydu fuzyjnego kodowanego przez kwas nukleinowy według wynalazku obejmującego etapy hodowli komórki gospodarza transfekowanej kwasami nukleinowymi według wynalazku w warunkach sprzyjających ekspresji polipeptydu oraz izolowania tego polipeptydu.

W jeszcze innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób konstruowania rekombinowanego wektora ekspresyjnego obejmujący etapy łączenia pierwszego kwasu nukleinowego zawierającego nukleotydy x do y kwasu nukleinowego przedstawionego w Sek. nr id.: 9, przy czym x jest wybrany spośród pozycji 331 do 508 Sek. nr id.: 9, a y jest wybrany spośród pozycji 546 do 808 Sek. nr id.: 9, oraz drugiego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd heterologiczny z pierwszym kwasem nukleinowym w pasujące miejsce do klonowania wektora ekspresyjnego, oraz następnie namnażania i izolowania wektora ekspresyjnego.

Krótki opis rysunków

Fig. 1. Kwasy nukleinowe oligonukleotydów stosowanych do konstruowania polinukleotydu kodującego polipeptyd fuzyjny receptor zmiatający (ang. scavenger receptor) makrofagów - CD40L (TNFSF5) (sekwencja 34 jest Sek. nr id.: 1, sekwencja 33 jest Sek. nr id.: 2, sekwencja 32 jest Sek. nr id.: 3 i sekwencja 35 jest Sek. nr id.: 4).

Fig. 2A-B. Fig. 2A przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego (Sek. nr id.: 5) kodującego peptyd wydzielniczy IL2 przyłączony do domeny trimeryzującej receptora zmiatającego, który jest przyłączony do domeny wiążącej receptora CD40L (TNFSF5). Polipeptyd fuzyjny kodowany przez kwas nukleinowy jest przedstawiony jako Sek. nr id.: 6.

Fig. 2B przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego (Sek. nr id.: 7) kodującego peptyd wydzielniczy ludzkiego hormonu wzrostu przyłączony do domeny trimeryzującej receptora zmiatającego, który jest przyłączony do domeny wiążącej receptora CD40L (TNFSF5). Polipeptyd fuzyjny kodowany przez kwas nukleinowy jest przedstawiony jako Sek. nr id.: 8.

Fig. 3 przedstawia analizę typu western blot pokazującą ekspresję polipeptydu fuzyjnego CD40L (TNFSF5). Strzałki wskazują położenie polipeptydu fuzyjnego w żelu. Ścieżki 1 i 2 to ścieżki kontrole wykorzystujące polipeptyd trimeryzujący izoleucyna-CD40L (TNFSF5), a ścieżki 3-6 to domeny trimeryzujące receptora zmiatającego przyłączone do domeny wiążącej receptora CD40L (TNFSF5).

Fig. 4. Region kodujący kwasu nukleinowego (Sek. nr id.: 9) kodującego ludzki receptor zmiatający A makrofagów jest przedstawiony łącznie z kodowanym polipeptydem (Sek. nr id.: 10).

Szczegółowy opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy polipeptydów fuzyjnych zawierających domenę wywołującą trimeryzację kwasów nukleinowych kodujących polipeptydy i sposobów wytwarzania i stosowania tych polipeptydów.

PL 208 287 B1

W jednym wykonaniu, wynalazek odnosi się do części domeny zewną trzkomórkowej polipeptydu receptora zmiatającego (ang. scavenger receptor) makrofagów (SR-A), odpowiadającej regionowi typu „coiled coil, tzn. domenie trimeryzującej. Region typu coiled coil SR-A ma właściwości trimeryzujące (Frank i wsp., 2000, J. Biol. Chem., 275:11672-11677). Jako taka, domena ta jest użyteczna w rozwiązaniach według wynalazku w celu dostarczenia domeny trimeryzującej, wykazującej brak albo obniżoną immunogenność, przyłączonej do heterologicznego polipeptydu.

Zatem, w jednym wykonaniu, wynalazek odnosi się do polipeptydu fuzyjnego obejmującego sekwencję aminokwasów x do y polipeptydu przedstawionego w Sek. nr id.: 10, przy czym x jest wybrany spośród pozycji 110 do 154, a y jest wybrany spośród pozycji 201 do 270, przyłączoną do drugiego heterologicznego polipeptydu. W innym wykonaniu, wynalazek odnosi się do polipeptydu fuzyjnego obejmującego części polipeptydu SR-A składającego się z sekwencji aminokwasów x do y polipeptydu przedstawionego w Sek. nr id.: 10, przy czym X jest wybrany spośród pozycji 110 do 173, a y jest wybrany spośród pozycji 179 do 270, przyłączonego do drugiego heterologicznego polipeptydu.

W szczególnym wykonaniu, wynalazek dotyczy polipeptydu fuzyjnego obejmuj ą cego aminokwasy 154 do 203 polipeptydu przedstawionego w Sek. nr id.: 10, przyłączone do drugiego heterologicznego polipeptydu. W innym szczególnym wykonaniu, wynalazek odnosi się do polipeptydu fuzyjnego obejmującego aminokwasy 120 do 180 polipeptydu przedstawionego w Sek. nr id.: 10, przyłączone do drugiego heterologicznego polipeptydu.

W innym wykonaniu, wynalazek odnosi się do polipeptydu fuzyjnego obejmuj ą cego pierwszy polipeptyd składający się z x do y aminokwasów polipeptydu przedstawionego w Sek. nr id.: 10, przy czym x jest wybrany spośród pozycji 110 do 154, a y jest wybrany spośród pozycji 201 do 270, z przynajmniej jednym podstawieniem aminokwasu, oraz pierwszy polipeptyd jest w przynajmniej 80% identyczny z polipeptydem przedstawionym w Sek. nr id.: 10, przy czym zachowana jest zdolność trimeryzacji polipeptydu fuzyjnego, a pierwszy polipeptyd jest przyłączony do drugiego heterologicznego polipeptydu. W innym wykonaniu, wynalazek odnosi się do polipeptydu fuzyjnego obejmującego pierwszy polipeptyd składający się z aminokwasów x do y polipeptydu przedstawionego w Sek. nr id.: 10, przy czym x jest wybrany spośród pozycji 110 do 173, a y jest wybrany spośród pozycji 179 do 270, z przynajmniej jednym podstawieniem aminokwasu, oraz pierwszy polipeptyd jest w przynajmniej 80% identyczny z polipeptydem przedstawionym w Sek. nr id.: 10, przy czym zachowana jest zdolność trimeryzacji polipeptydu fuzyjnego, a pierwszy polipeptyd jest przyłączony do drugiego heterologicznego polipeptydu.

W innym wykonaniu, wynalazek odnosi się do polipeptydu fuzyjnego obejmuj ą cego pierwszy polipeptyd składający się z aminokwasów 154 do 203 polipeptydu przedstawionego w Sek. nr id.: 10, z przynajmniej jednym podstawieniem aminokwasu, przy czym pierwszy polipeptyd jest w przynajmniej 80% identyczny z polipeptydem przedstawionym w Sek. nr id.: 10, oraz zachowana jest zdolność trimeryzacji polipeptydu fuzyjnego, a pierwszy polipeptyd jest przyłączony do drugiego heterologicznego polipeptydu. W jeszcze innym wykonaniu, wynalazek odnosi się do polipeptydu fuzyjnego obejmującego pierwszy polipeptyd składający się z aminokwasów 154 do 203 polipeptydu przedstawionego w Sek. nr id.: 10, przy czym pierwszy polipeptyd jest przyłączony do drugiego heterologicznego polipeptydu.

W powyższych wykonaniach, drugi heterologiczny polipeptyd korzystnie ma pożądaną aktywność biologiczną. Biologiczna aktywność, jak będzie zrozumiałe dla osoby o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie, może zostać określona jako wiązanie ligandu do receptora, wiązanie receptora do ligandu, powinowactwo wiązania polipeptydu podobnego do immunoglobuliny do swojego odpowiadającego antygenu, lub tym podobne. Ponadto, aktywnością biologiczną może być aktywność enzymatyczna.

W jednym wykonaniu, polipeptyd fuzyjny wedł ug wynalazku ma obniż oną immunogenność, a w bardziej korzystnym wykonaniu, polipeptyd fuzyjny nie jest immunogenny.

W jednym aspekcie, różne rodzaje receptora zmiatającego makrofagów mogą służyć jako motyw trimeryzujący, w szczególności uważa się, że bydlęcy (nr dostępu w Genbank X54183), mysi (nr dostępu w Genbank L04275), ludzki (nr dostępu w Genbank M005021) i/lub podobne małpie polipeptydy receptorów zmiatających mogą być stosowane zgodnie ze wskazówkami według niniejszego wynalazku. Jest zrozumiałe, że nie jest to wyczerpująca lista i receptory zmiatające różnych gatunków mogą również znaleźć zastosowanie w rozwiązaniach według wynalazku.

Sekwencja zgodności polipeptydu typu coiled coil, w odniesieniu do wynalazku, jest zgodna z zasadniczym wzorem ujawnionym przez Burkhard i wsp. (2001, Trends Cell. Biol., 11: 82). Pozycje

PL 208 287 B1 aminokwasów w powtórzeniach heptadowych są zazwyczaj opisane alfabetycznie jako „a.b.c.d.e.f.g Pozycje a i d to reszty niepolarne i istnieje silna preferencja dla specyficznych aminokwasów w tych pozycjach. Określenie reszta niepolarna jest rozumiane przez specjalistę w dziedzinie jako obejmujące alaninę, izoleucynę, glicynę, prolinę, leucynę, metioninę, fenyloalaninę, tryptofan, walinę i tyrozynę. Poszczególne reszty w każdej z tych pozycji mogą określać charakter drugorzędowej i trzeciorzędowej struktury typu coiled coil, tzn. dimerową względem trimerowej. Rzeczywiście, mutacja docelowa została przeprowadzona w celu przeprojektowania dimerycznych suwaków leucynowych w trimeryczne suwaki leucynowe przez mutację w pozycjach a i d (opis patentowy U.S.A. nr 5,716,805).

Można wymienić programy komputerowe do wspomagania identyfikacji polipeptydów typu coiled coil. Na przykład, FOLDER był stosowany do identyfikacji poszczególnych domen w oparciu o identyczność sekwencji (Srinivasan i wsp., (1993) Prot. Sci., 2:277-289) i moż e być stosowany do identyfikacji lub modyfikacji domeny typu coiled jak stosowane niniejszym. Aminokwasy CD40L (TNFSF5) były analizowane z użyciem programu „folder w celu zbadania i przewidywania skłonności do trimeryzacji szeregu różnych powtórzeń heptadowych w obrębie domen typu coiled coil CD40L (TNFSF5). Dalej, program „multicoil (Harbury i wsp., (1993) Science, 262:1401) może być stosowany do potwierdzenia, że sekwencja, tzn. sekwencja receptora zmiatającego, taka jak polipeptydy ludzkie, mysie i bydlęce, stanowi sekwencję typu coiled coil. Program ten znajduje szczególne zastosowanie, kiedy sekwencja naturalna zostaje zmutowana, aby zmienić właściwości polipeptydu, takie jak, na przykład, zwiększenie trimeryzacji i/lub obniżenie immunogenności. Zatem, zmutowany trimeryzujący polipeptyd może zostać zanalizowany przez program komputerowy w celu określenia, czy zachowuje wymagane właściwości.

W jednym wykonaniu, trimeryzują cy polipeptyd wedł ug wynalazku ma przynajmniej 80% identyczności sekwencji (przynajmniej 85%, przynajmniej 90%, przynajmniej 95%, przynajmniej 97,5%, lub przynajmniej 99%, i/lub przynajmniej 15 99,5%) z naturalnie występującym trimeryzującym polipeptydem takim, jak polipeptyd ujawniony w Sek. nr id.: 10, przy czym taka identyczność sekwencji jest ustalana przez porównywania aminokwasów polipeptydów, kiedy są one zestawione tak, aby osiągnąć najwyższe dopasowanie i identyczność, z jednoczesnym zmniejszeniem przerw w sekwencji. Odsetek identyczności dwóch aminokwasów lub dwóch kwasów nukleinowych może zostać określony przez inspekcję wzrokową i obliczenie matematyczne, lub, bardziej korzystnie, porównanie zostaje przeprowadzone przez porównanie informacji o sekwencji z użyciem programu komputerowego. Przykładowy, korzystny program komputerowy to program Genetics Computer Group (GCG; Madison, WI) Wisconsin package wersja 10.0, „GAP (Devereux i wsp., (1984) Nucl. Acids Res. 12:387). Korzystne domyślne parametry dla programu ‘GAP' zawierają: (1) wprowadzenie GCG jednoargumentowej matrycy porównawczej (zawierającej wartość 1 dla identyczności i 0 dla nie-identyczności) dla nukleotydów oraz ważonej aminokwasowej matrycy porównawczej wg Gribskov i Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, (1986), jak opisano przez Schwartz i Dayhoff, red., (1979) Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, str. 353-358; lub innych podobnych matryc porównawczych; (2) obciążenie 30 za każdą lukę i dodatkowo obciążenie 1 za każdy symbol w każdej luce dla sekwencji aminokwasowych, lub obciążenie 50 za każdą lukę i dodatkowo obciążenie 3 za każdy symbol w każdej luce dla sekwencji nukleotydowych; (3) brak obciążeń za luki na końcach; oraz (4) brak maksymalnego obciążenia za długie luki.

W jednym wykonaniu, trimeryzujący polipeptyd według wynalazku obejmuje sekwencję posiadającą przynajmniej 80% identyczności z aminokwasami x do y polipeptydu przedstawionego w Sek. nr id.: 10, przy czym x jest wybrany spośród pozycji 110 do 154, a y jest wybrany spośród pozycji 201 do 270. W innym wykonaniu, trimeryzujący polipeptyd wynalazku obejmuje sekwencję posiadającą przynajmniej 80% identyczności z aminokwasami x do y polipeptydu przedstawionego w Sek. nr id.: 10, przy czym x jest wybrany spośród pozycji 110 do 173, a y jest wybrany spośród pozycji 179 do 270.

Inne programy porównywania sekwencji stosowane przez specjalistów w dziedzinie również mogą być stosowane, takie jak, na przykład, program BLASTN wersja 2.0.9, dostępny na stronach internetowych National Library of Medicine www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/wblast2.cgi, lub algorytm UW-BLAST 2.0. Standardowe domyślne ustawienia parametrów dla UW-BLAST 2.0 są opisane na stronie internetowej: sapiens.wustl.edu/blast/blast/#Features. Dodatkowo, algorytm BLAST wykorzystuje macierz zapisu aminokwasowego BLOSUM62 i parametry fakultatywne, które mogą zostać użyte, są następujące: (A) włączenie filtru w celu zakrycia segmentów badanej sekwencji, które mają niską złożoność kompozycyjną (jak określone przez program SEG Wootton i Federhen (Computers and Chemistry, 1993); zob. również Wootton i Federhen, 1996, Analysis of compositionally biased

PL 208 287 B1 regions in sequence databases, Methods Enzymol. 266: 554-71) lub segmentów składających się z krótkookresowych wewnętrznych powtórzeń (jak określone przez program XNU Claverie i States (Computers and Chemistry, 1993)), (B) wartość progowa znacząca statystycznie dla zgłoszenia trafień wobec sekwencji w bazie danych, czyli tzw. E-score (oczekiwane prawdopodobieństwo trafień znalezionych wyłącznie przez przypadek, według modelu stochastycznego Karlin i Altschul (1990); jeżeli wartość statystycznie znacząca przypisana do trafienia jest większa niż ta wartość progowa E-score, trafienie nie zostanie zgłoszone); korzystne wartości E-score to 0,5, lub w kolejności rosnącej preferencji, 0,25, 0,1, 0,05, 0,01, 0,001, 0,0001, 1e-5, 1e-10, 1e-15, 1e-20, 1e-25, 1e-30, 1e-40, 1e-50, 1e-75 lub 1e-100.

Domena trimeryzująca może zostać przyłączona do polipeptydu heterologicznego na końcu aminowym, na końcu karboksylowym, i/albo na obydwu końcach. Ponadto, domena trimeryzująca może być wewnętrzna wobec polipeptydu heterologicznego. Niezależnie od położenia fuzji domeny trimeryzującej i polipeptydu heterologicznego, jest zrozumiałe, że domena trimeryzująca zachowuje swoją zdolność do tworzenia trimerów (homotrimerów i/lub heterotrimerów) i polipeptyd heterologiczny również zachowuje swoją aktywność biologiczną.

Jak stosowane niniejszym, określenie „polipeptyd fuzyjny odnosi się do ciągłego polipeptydu ulegającego ekspresji z pojedynczej cząsteczki kwasu nukleinowego, przy czym kwas nukleinowy koduje w tej samej ramce odczytu albo dwa lub więcej polipeptydów heterologicznych, albo domeny polipeptydu ułożone w kolejności nie występującej naturalnie. Oprócz polipeptydów według wynalazku, inne przykłady polipeptydów fuzyjnych obejmują domenę Fc przeciwciała lub suwak leucynowy przyłączone do rozpuszczalnej zewnątrzkomórkowej domeny polipeptydu transbłonowego, np. CD40L (TNFSF5). WO 93/08207 i WO 96/40918 opisują przygotowanie oligomerycznych rozpuszczalnych postaci CD40L (TNFSF5), włączając immunoglobulinowy polipeptyd fuzyjny i polipeptyd fuzyjny ze zmutowanym suwakiem leucynowym, odpowiednio, sposoby konstruowania i badania produktów omówione tamże mogą również znaleźć zastosowanie. Fuzja domeny trimeryzującej do polipeptydu heterologicznego może nastąpić również przez łącznik, taki jak znacznik epitopowy lub łącznik elastyczny, który ułatwia kształtowanie strukturalne.

Jest zrozumiałe, że każda część polipeptydu posiadającego pożądaną aktywność biologiczną może być wytwarzana jako fuzja do polipeptydów multimeryzujących według wynalazku. Przykłady obejmują, ale nie są ograniczone do polipeptydów transbłonowych i polipeptydów nie transbłonowych, takich jak enzymy, hormony i cytokiny. W szczególności, rozważane są polipeptydy fuzyjne GM-CSF, IL3, GM-CSF i IL3, M-CSF oraz przedstawiciele rodziny receptorów hematopoetyny (Cosman i wsp., (1990) Trends Biochem. Sci., 15:265). Homo- i hetero-oligomery są rozważane dalej.

Dodatkowe przykłady polipeptydów heterologicznych, które mogą być trimeryzowane, obejmują, ale nie są ograniczone do nadrodziny czynnika martwicy nowotworów, które są wymienione poniżej. Każda para jest wymieniona najpierw przez ligand, następnie przez odpowiadający receptor, gdzie ligand może mieć więcej niż jeden receptor. Nazewnictwo symboli przedstawicieli nadrodziny TNF jest jak opisano w Locksley i wsp. (2001, Cell, 104: 487 : 501), przy czym ligand jest oznaczony przez nadrodzinę czynnika martwicy nowotworu (TNFSF), a receptory są przez nadrodzinę receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF) w porządku numerycznym.

Symbol przedstawiciela liganda lub receptora nadrodziny TNF jest pierwszy, następnie numer dostępu w Genbank w podwójnych nawiasach, po którym następują różne nazwy stosowane pospolicie dla przedstawiciela rodziny: TNFSF1 ((numer dostępu w Genbank X01393), TNFB, limfotoksyna (LT)-alfa) i jego receptor, receptor czynnika martwicy nowotworu TNFRSF1A ((numer dostępu w Genbank M75866), TNF-R); TNFSF2 ((numer dostępu w Genbank X02910) czynnik martwicy nowotworu (TNF)) i jego receptor TNFRSF1B ((numer dostępu w Genbank M32315) TNF-R); TNFSF3 ((numer dostępu w Genbank L11016) LT-beta) i jego receptor TNFRSF3 ((numer dostępu w Genbank L04270) LTBR, TNFR2-RP, CD18, TNFR-RP, TNFCR, TNF-R-III); TNFSF4 ((numer dostępu w Genbank D90224) OX-40L) i jego receptor TNFRSF4 ((numer dostępu w Genbank X75962) 0X40); TNFSF5 ((numer dostępu w Genbank X67878) CD40L) i jego receptor TNFRSF5 ((numer dostępu w Genbank X60592) CD40); TNFSF6 ((numer dostępu w Genbank U11821) FasL) i jego receptory TNFRSF6 (numer dostępu w Genbank M67454) FAS, CD95) i TNFRSF6B ((numer dostępu w Genbank AF104419) DcR3); TNFSF7 ((numer dostępu w Genbank L08096) CD70, CD27L) i jego receptor TNFRSF7 ((numer dostępu w Genbank M63928) CD27); TNFSF8 ((numer dostępu w Genbank L09753) CD30LG) i jego receptor TNFRSF8 ((numer dostępu w Genbank M83554) CD30); TNFSF9 ((numer dostępu w Genbank U03398) 4-1BB-L) i jego receptor TNFRSF9 ((numer dostępu w GenPL 208 287 B1 bank L12964) 4-1BB); TNFSF10 ((numer dostępu w Genbank U37518) TRAIL) i jego receptory TNFRSF10A ((numer dostępu w Genbank U90875) DR4), TNFRSF10B ((numer dostępu w Genbank AF012628) DR5, KILLER, TRAIL-R2), TNFRSF10C ((numer dostępu w Genbank AF012536) DcR1, TRAILR3), i TNFRSF10D ((numer dostępu w Genbank AF029761) DcR2, TRAILR4); TNFSF1 1 ((numer dostępu w Genbank AF013171) RANKL, OPGL) i jego receptory TNFRSF11A ((numer dostępu w Genbank AF018253 RANK) i TNFRSF11B (numer dostępu w Genbank U94332) OPG); TNFSF12 ((numer dostępu w Genbank AF030099) TWEAK) i jego receptory TNFRSF12 ((numer dostępu w Genbank U72763) DR3, TRAMP) i TNFRSF12L (DR3L); TNFSF13 ((numer dostępu w Genbank NM003808) APRIL) i jego receptory TNFRSF13 i TNFSF13B ((numer dostępu w Genbank AF136293) THANK, BLYS); TNFSF14 ((numer dostępu w Genbank AF036581) LIGHT, LT-gamma, HVEM-L) i jego receptor TNFRSF14 ((numer dostępu w Genbank U70321) HVEM, ATAR, TR2, LIGHTR, HVEA); TNFSF15 ((numer dostępu w Genbank AF039390) TL1, VEGI) i jego receptor TNFRSF15; TNFSF16 i jego receptor TNFRSF16 ((numer dostępu w Genbank M14764) receptor czynnika wzrostu nerwu (NGFR), p75NTR); TNFSF17 i jego receptor TNFRSF17 ((numer dostępu w Genbank Z29574) BCMA); TNFSF18 ((numer dostę pu w Genbank AF125303) AITRL TL6hGITRL) i jego receptor TNFRSF18 ((numer dostę pu w Genbank AF125304) AITR, GITR); TNFSF19 i jego receptor TNFRSF19 (numer dostępu w Genbank AF173166); TNFSF20 i jego receptor TNFRSF20 (Locksley i wsp., 2001, Cell, 104: 487 : 501). W szczególnym wykonaniu CD40L (TNFSF5) jest polipeptydem, który może być wykorzystywany jako polipeptyd heterologiczny w rozwiązaniach według wynalazku.

Dodatkowe polipeptydy mogą być przyłączane do polipeptydu fuzyjnego w celu ułatwienia oczyszczania, takie jak, na przykład, znaczniki epitopowe mogą zostać umieszczone na końcu aminowym, końcu karboksylowym lub wewnętrznie. Dobrze znane znaczniki epitopowe obejmują, między innymi, np. znacznik histydynowy, znacznik FLAG oraz GST. Rozważa się dalej, że znacznik epitopowy może zostać zaprojektowany przez inżynierię genetyczną, aby zawierał miejsce trawienia proteolitycznego pomiędzy znacznikiem i resztą polipeptydu, tak, aby znacznik epitopowy mógł zostać odcięty i usunię ty z polipeptydu fuzyjnego. Przykłady znanych enzymów proteolitycznych rozpoznających unikalne aminokwasy w polipeptydach obejmują czynnik Xa i trombinę, i są dostępne na rynku.

Niniejszym opisano mutlimery polipeptydu fuzyjnego według wynalazku wyższego rzędu, takie, które mają zwiększoną aktywność w odniesieniu do polipeptydu niezmultimeryzowanego. Jak stosowane niniejszym, „multimer lub „multimeryzowany polipeptyd może obejmować dimer, trimer, tetramer, dimer trimeru, trimer trimeru, dimer tetrameru, trimer tetrameru i tak dalej. Przykłady dodatkowych domen multimeryzacyjnych obejmują suwaki leucynowe lub domeny Fc. Zgodnie z tym, polipeptyd zawierający domenę dimeryzującą (np. domenę Fc) i domenę trimeryzującą (np. domenę trimeryzującą receptora zmiatającego alfa) może wywołać dimeryzację trimeru tak, że łączy się sześć polipeptydów. Jest dalej rozważane, że te multimery mają aktywność biologiczną, która jest większa niż monomerów lub mutlimerów niższego rzędu. Na przykład, jest rozważane, że trimer będzie mieć wyższą aktywność niż dimer.

Określenia „obniżona immunogenność lub „nieimmunogenny w zamierzeniu oznaczają, że środek terapeutyczny, taki jak polipeptyd fuzyjny według wynalazku, nie wywołuje znaczącej odpowiedzi immunologicznej u osobnika, korzystnie człowieka, któremu został podany. Znacząca odpowiedź immunologiczna to taka, która jest mierzalna tak, że osoba o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie rozpozna ją jako wywołaną przez polipeptyd fuzyjny według wynalazku. Ta definicja wyklucza normalne odchylenia spowodowane różnicami w odczynnikach stosowanych w oznaczeniach, zmiennością próbek, lub gdzie istnieją innego rodzaju niedoskonałości w procedurach badawczych. Odpowiedź immunologiczna może być mierzona każdą z różnorodnych standardowych technik, takich jak, na przykład, użycie oznaczenia immunoenzymatycznego (ELISA) do wykrywania przeciwciał wytwarzanych w odpowiedzi na środek terapeutyczny, przez pomiar wytwarzania cytokin przez osobnika w odpowiednich okresach czasu następujących po podaniu polipeptydu i/lub przez pomiar podziałów poszczególnych rodzajów komórek układu immunologicznego, spośród innych dobrze znanych metod.

Jednym przykładowym sposobem obniżenia lub wyeliminowania immunogenności w polipeptydzie terapeutycznym, jest stosowanie polipeptydów pochodzących z tych samych gatunków, jak gatunek, który ma być leczony. Na przykład, kiedy polipeptyd ma być podawany człowiekowi, polipeptyd powinien pochodzić od człowieka. Jeżeli w tym przykładzie ludzkie polipeptydy nie są dostępne, polipeptydy mogą być humanizowane, tak, że immunogenność jest obniżona. Humanizowanie polipeptydu może zostać przeprowadzone, na przykład, w sposób analogiczny do humanizowania przeciwciał,

PL 208 287 B1 tak, że sekwencja mysiego przeciwciała jest humanizowana przez mutowanie poszczególnych aminokwasów do odpowiadających sekwencjom ludzkiego polipeptydu, tak, że przeciwciało nie wywołuje silnej ludzkiej anty-mysiej odpowiedzi po podaniu.

Kwasy nukleinowe kodujące wyżej wymienione polipeptydy fuzyjne również mieszczą się w zakresie wynalazku. Kwasy nukleinowe mogą być klonowane i mutowane dobrze znanymi technikami i są powszechnie namnażane w plazmidach i innych wektorach (Sambrook i wsp. red., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, Wyd. II, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Press, Cold Spring Harbor, NY). Wektory mogą również zawierać dodatkowe składniki ułatwiające replikację w komórkach prokariotycznych i/lub eukariotycznych, włączanie konstruktów do chromosomu eukariotycznego oraz znaczniki, aby wspomóc selekcję i/lub przeszukiwanie komórek zawierających konstrukt. Wektory według wynalazku to rekombinacyjne wektory DNA obejmujące, ale nieograniczone do plazmidów, fagów, fagemidów, kosmidów, wirusów, retrowirusów i im podobnych, które są wykorzystywane do włączania heterologicznych polinukleotydów do komórki.

Jak stosowane niniejszym, określenie „połączenie w zamierzeniu oznacza, że dwie cząsteczki są przybliżone jedna do drugiej przez albo oddziaływanie powinowactwa i/lub wiązanie kowalencyjne, takie jak, na przykład, połączenie nukleotydów ze sobą podczas klonowania, przez chemiczne sieciowanie lub przez pewien inny podobny sposób łączenia. Nukleotydy mogą zostać otrzymane ze źródła genomowego, cDNA lub wektora i przyłączone do heterologicznych kwasów nukleinowych, między innymi, przez tradycyjne trawienie i łączenie w klonowaniu lub przez amplifikację pożądanych części sekwencji podczas PCR.

W jednym wykonaniu, czą steczka kwasu nukleinowego kodują ca polipeptyd fuzyjny wedł ug wynalazku jest funkcjonalnie połączona z heterologicznym elementem kontrolnym. Kwas nukleinowy jest „funkcjonalnie połączony, kiedy jest on umieszczony w funkcjonalnym związku z innym kwasem nukleinowym. Funkcjonalnie połączony może również oznaczać, że dwie różne cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące różne polipeptydy mają równocześnie indukowaną transkrypcję. W przypadku funkcjonalnie połączonych kwasów nukleinowych, mogą one być również ciągłe w jednej jednostce transkrypcyjnej, podczas gdy translacja jest kierowana z jednego lub więcej miejsc startowych rybosomów. Ponadto, funkcjonalnie połączony może również oznaczać, że dwa regiony kodujące polipeptydy mogą zostać połączone w ramce, tak, że kodują one pojedynczy ciągły polipeptyd, tzn. polipeptyd fuzyjny.

Wzmacniacz (ang. enhancer) lub wyciszacz (ang. silencer) transkrypcji jest funkcjonalnie połączony z kwasem nukleinowym, kiedy jest on umieszczony względem kwasu nukleinowego w taki sposób, że zwiększa lub obniża transkrypcję kwasu nukleinowego. Wzmacniacze i wyciszacze transkrypcji mogą być umieszczone powyżej, poniżej lub wewnątrz regionów kodujących kwasu nukleinowego.

Wektory ekspresyjne mogą służyć ekspresji polipeptydu fuzyjnego według wynalazku w komórkach prokariotycznych (np. E. coli) lub eukariotycznych (np. komórkach owadzich (z użyciem bakulowirusowych wektorów ekspresyjnych), komórkach drożdżowych, komórkach roślinnych lub komórkach ssaka). Odpowiednie komórki gospodarza obejmują komórki prokariotyczne, eukariotyczne i roślinne i są omówione dalej w Goeddel, (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA. Ekspresja białek u prokariontów jest najczęściej prowadzona w E. coli wektorami zawierają cymi konstytutywne lub indukowalne promotory kierują ce ekspresją białek. Przykłady odpowiednich indukowalnych wektorów ekspresyjnych E. coli obejmują pTrc (Amann i wsp., (1988) Gene 69: 301-315) i pET 11d (Studier i wsp., (1990) Gene Expression Technology: Methods In Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California 60-89).

W innym wykonaniu, wektor ekspresyjny jest ekspresyjnym wektorem drożdżowym. Przykłady wektorów do ekspresji w drożdżach s. cerevisiae obejmują pYepSecl (Baldari i wsp., (1987) EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan i Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz i wsp. (1987) Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) i pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA). Alternatywnie, wektor ekspresyjny jest ekspresyjnym wektorem bakulowirusowym, takim jak, na przykład, seria pAc (Smith i wsp. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165). W innym wykonaniu, kwas nukleinowy według wynalazku ulega ekspresji w komórkach ssaka z użyciem ekspresyjnego wektora ssaczego. Przykłady ssaczych wektorów ekspresyjnych są liczne i obejmują, ale nie są ograniczone do pCDM8 (Seed (1987) Nature 329: 840) i pMT2PC (Kaufman i wsp., (1987) EMBO J. 6: 187-195).

Rekombinowany ssaczy wektor ekspresyjny może zostać tak zaprojektowany, aby był zdolny do kierowania ekspresją kwasu nukleinowego, preferencyjnie w określonym rodzaju komórek (np., do

PL 208 287 B1 ekspresji kwasu nukleinowego są wykorzystywane elementy regulatorowe specyficzne tkankowo). Specyficzne tkankowo elementy regulatorowe są znane w dziedzinie. Nieograniczające przykłady odpowiednich promotorów specyficznych tkankowo obejmują promotor albuminy (specyficzny dla wątroby; Pinkert i wsp., (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotory specyficzne dla komórek limfatycznych (Calame i Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275), w szczególności promotory receptorów komórek T (Winoto i Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733), immunoglobulin (Banerji i wsp. (1983) Cell 33: 729-740; Queen i Baltimore (1983) Celi 33: 741-748), i promotory specyficzne dla gruczołów mlekowych (np. promotor białek serwatki mleka; opis patentowy U.S.A. nr 4,873,316 i publikacja europejskiego zgłoszenia nr 264,166).

Inny aspekt wynalazku odnosi się do komórek gospodarza, do których został wprowadzony rekombinowany wektor ekspresyjny według wynalazku. Określenia „komórka gospodarza i „zrekombinowana komórka gospodarza są niniejszym stosowane wymiennie. Jest zrozumiałe, że takie określenia odnoszą się nie tylko do określonej omawianej komórki, ale do potomstwa lub potencjalnego potomstwa takiej komórki. Ponieważ pewne modyfikacje mogą wystąpić w kolejnych pokoleniach z powodu mutacji lub wpł ywów ś rodowiskowych, takie potomstwo moż e nie być , w rzeczywistoś ci, identyczne z komórką macierzystą, ale jest nadal włączone w zakres określenia stosowanego niniejszym. Komórką gospodarza może być każda komórka prokariotyczna (np. E. coli), eukariotyczna (np. komórki owadzie, drożdżowe, lub komórki ssacze) lub komórki roślinne.

Komórki wykorzystywane w wynalazku mogą być modyfikowane przez inżynierię genetyczną w celu ekspresji polipeptydu fuzyjnego wedł ug wynalazku. Modyfikowane przez inż ynierię genetyczną w zamierzeniu oznacza, ż e komórka został a transfekowana, transformowana lub transdukowana czą steczką rekombinowanego polinukleotydu, i/lub zmieniona inaczej (np. przez rekombinację homologiczną i aktywację genu), tak aby wywołać wyrażanie polipeptydu fuzyjnego przez komórkę. Sposoby i wektory do modyfikowania przez inż ynierię genetyczną komórek i/lub linii komórkowych są dobrze znane specjalistom w dziedzinie; na przykład różne techniki są przedstawione w Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel i wsp., red. (Wiley & Sons, New York, (1988) i kwartalne uzupełnienia) i Sambrook i wsp., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press).

Jest dalej rozważane, że polipeptydy fuzyjne według wynalazku mogą być wytwarzane w zwierzętach transgenicznych, takich, jak na przykład, myszy, kozy lub krowy. W dalszym przykładzie, ekspresja polipeptydu fuzyjnego może zostać tak zaprojektowana, aby był on wydzielany do mleka zwierząt. Zwierzę transgeniczne może zostać wytworzone przez wprowadzenie kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd fuzyjny według wynalazku do zapłodnionej komórki jajowej lub zarodkowej komórki macierzystej. Takie komórki gospodarza mogą następnie być stosowane do wytwarzania zwierząt transgenicznych innych niż ludzie.

DNA wektora może zostać wprowadzone do komórek przez typowe techniki transformacji lub transfekcji. Jak stosowane niniejszym, określenia „transformacja i „transfekcja w zamierzeniu odnoszą się do różnorodnych uznawanych w dziedzinie technik do wprowadzania obcego kwasu nukleinowego do komórki gospodarza, włączając współstrącanie z fosforanem wapnia lub chlorkiem wapnia, transfekcję za pośrednictwem DEAE-dekstranu, lipofekcję lub elektroporację. Odpowiednie sposoby transformacji lub transfekcji komórek gospodarza mogą zostać znalezione w Sambrook i wsp., (op. cit.) i innych podręcznikach laboratoryjnych. Wiadomo, że w przypadku trwałej transfekcji komórki ssaczej, w zależności od wektora ekspresyjnego i stosowanej techniki transfekcji, tylko mała część komórek może włączać transfekowany DNA do swojego genomu. W celu identyfikacji i wyselekcjonowania tych integrantów, gen, który koduje znacznik selekcyjny (np. oporności na antybiotyki) jest na ogół wprowadzany do komórek gospodarza razem z pożądanym genem. Korzystne znaczniki selekcyjne obejmują te nadające oporność na leki, takie jak G418, higromycyna i metotreksat. Komórki trwale transfekowane wprowadzonym kwasem nukleinowym mogą zostać zidentyfikowane przez selekcję lekiem.

Fuzja polipeptydu trimeryzującego z drugim heterologicznym polipeptydem, który jest ligandem, może spowodować wzmożone przekazywanie sygnału przez receptor liganda. Podczas gdy w zamierzeniu nieograniczający, mechanizm tego wzmożenia może wystąpić przez zwiększone wiązanie i pobudzanie receptora, tak, ż e receptor ma zwiększoną aktywność biologiczną. Na przykład, wykazano, że zmultimeryzowany CD40L (TNFSF5), kiedy podany populacji komórek, zwiększa podziały komórek układu immunologicznego w porównaniu do komórek niepoddanych jego działaniu (zob. Przykład, poniżej), a także komórek poddanych działaniu niezmultimeryzowanego CD40L(TNFSF5). Zatem kiedy rozpuszczalny CD40L (TNFSF5) jest przyłączony do domeny trimeryzującego polipepty10

PL 208 287 B1 du, ma on zwiększoną aktywność w porównaniu z rozpuszczalnym CD40L (TNFSF5), który nie jest trimerem.

Określenia „zwiększony lub „podniesiony w zamierzeniu obejmują każde dające się zmierzyć podniesienie aktywności biologicznej jak zmierzone w porównaniu z kontrolą niepoddaną działaniu. Wzrost może wynosić 10%, 20%, 30%, 40% lub więcej i zwiększone aktywności mogą przekroczyć 100% aktywności kontroli. Przykłady oznaczeń do pomiaru zwiększonych aktywności obejmują, ale nie są ograniczone do oceny uwalniania cytokin, indukcji ekspresji cząsteczek powierzchniowych, zwiększonych lub obniżonych podziałów komórkowych, zwiększonej lub obniżonej apoptotycznej śmierci komórkowej i aktywacji biochemicznej, np. wzorów fosforylacji. W szczególnym przykładzie, dodanie trimeryzowanego CD40L (TNFSF5) do komórek może wywołać zahamowanie wydzielania IgE pobudzanego przez IL-4 lub podwyższenie ekspresji CD23 w mieszanych hodowlach limfocytów. W szczególnym wykonaniu wynalazku, multimery trimerów mają aktywność, która jest wyż sza niż aktywność niemultimeryzowanych trimerów.

W jeszcze innym wykonaniu, fuzja multimeryzują cego polipeptydu, takiego jak domena trimeryzująca, z drugim heterologicznym polipeptydem, którym jest receptor, może spowodować obniżone przekazywanie sygnału przez odpowiadający, naturalny receptor. Podczas gdy w zamierzeniu nie jest ograniczający, mechanizm tego obniżenia może występować przez wiązanie kompetycyjne rozpuszczalnego polipeptydu z ligandem receptora, przy czym wiązanie to zapobiega aktywacji receptora przez ligand. Na przykład, podanie TNFR:Fc (tj., Etanercept), dimeru, powoduje obniżone przekazywanie sygnału przez receptor TNF-alfa w porównaniu do komórek niepoddanych jego działaniu, jak zmierzono, częściowo, przez obniżenie objawów choroby (Spencer-Green, 2000, Ann. Rheum. Dis., 59 Dod. 1, str. 46-9). Zatem, multimer TNFR według wynalazku może zahamować zapalenie, w którym pośredniczy TNF-alfa.

Określenie „obniżony w zamierzeniu obejmuje każde dające się zmierzyć zmniejszenie aktywności biologicznej, jak zmierzone w porównaniu z kontrolą niepoddaną działaniu. Bardziej szczegółowo, zmniejszenie może wynosić 10%, 20% lub więcej włączając 100% obniżenie. Przykłady oznaczeń dla pomiaru tego obniżenia obejmują, ale nie są ograniczone do zwiększonego lub obniżonego uwalniania cytokin, wywołania ekspresji cząsteczek powierzchniowych, zwiększonych lub obniżonych podziałów komórkowych, zwiększonej lub obniżonej apoptotycznej śmierci komórkowej i aktywacji biochemicznej, np. wzorów fosforylacji.

Aktywność polipeptydu fuzyjnego jest częściowo określona przez jego powinowactwo do partnera wiążącego (np. receptora lub liganda). Powinowactwo trimeryzowanych cząsteczek do ich odpowiedniego partnera wiążącego może zostać zmierzone z zastosowaniem analizy oddziaływań specyficznych biologicznie (BIA), w której wykorzystywany jest biosensor, tzn. instrument, który łączy mechanizm rozpoznania biologicznego z urządzeniem wykrywającym lub przekaźnikiem. Przykładowym biosensorem jest BlOcore™ (Pharmacia). Wykorzystuje on optyczne zjawisko rezonansu plazmonów powierzchniowych do śledzenia oddziaływań pomiędzy dwiema biologicznymi cząsteczkami. Pary cząsteczek posiadające stałe powinowactwa w zakresie 10⁵ do 10¹⁰ M^-1, i stałe współczynnika dysocjacji w zakresie 10³ do 10⁶ M^-1s^-1 są odpowiednie dla tej metody.

Rozważa się również, że trimery (lub multimery wyższego rzędu) mają więcej miejsc wiążących dla ich partnera wiążącego niż dimery lub monomery, zmultimeryzowane polipeptydy fuzyjne według wynalazku będą mieć również wyższą zdolność wiązania wobec partnerów wiążących, niż monomery lub dimery (lub multimery niższego rzędu). Wyższy stopień zdolności wiązania zwiększa specyficzne wiązanie multimerów do ich partnerów wiążących. Polipeptydy fuzyjne według wynalazku mogą być przyłączone do heterologicznych cząsteczek terapeutycznych w celu wysokiej wydajności dostarczania ich do komórek docelowych wytwarzających partnera wiążącego. Przykłady heterologicznych cząsteczek, które mogą zostać przyłączone, obejmują, ale nie są ograniczone do reszt radioaktywnych, np. I¹²⁵, Y⁹⁰ i/lub toksyn polipeptydowych, np. rycyny, toksyny botulinowej. Połączenie może być realizowane poprzez standardowe techniki sieciowania dobrze znane w dziedzinie.

Preparaty farmaceutyczne i sposoby podawania

Polipeptydy fuzyjne według wynalazku mogą być przygotowywane jako składniki odpowiednie do podawania pacjentowi potrzebującemu leczenia. Takie składniki są użyteczne w leczeniu zaburzeń związanych z układem immunologicznym i/lub w zwiększaniu pobudzenia prawidłowej odpowiedzi immunologicznej. Dawka skuteczna terapeutycznie odnosi się do takiej ilości składnika wystarczającej, aby złagodzić objawy, na przykład, niedoboru immunologicznego lub stanu lub chorób zapalnych. Ponadto, kiedy polipeptyd według wynalazku jest podany łącznie z innych czynnikiem terapeutyczPL 208 287 B1 nym, dawki są zmieniane zgodnie z wszelkimi oddziaływaniami, które mogą wystąpić pomiędzy czynnikami terapeutycznymi.

Skuteczna dawka

Toksyczność i terapeutyczna skuteczność składników może zostać określona przez standardowe procedury farmaceutyczne w hodowlach tkankowych lub na zwierzętach doświadczalnych, np. w celu okreś lenia LD50 (dawki letalnej dla 50% populacji) i ED50 (dawki skutecznej terapeutycznie w 50% populacji). Współczynnik dawki pomiędzy toksycznymi i terapeutycznymi skutkami to indeks terapeutyczny i może zostać on wyrażony jako współczynnik LD50/ED50. Składniki wykazujące wysokie indeksy terapeutyczne są korzystne.

Podczas, gdy składniki, które wykazują toksyczne skutki uboczne mogą być stosowane, należy zwrócić uwagę na zaprojektowanie systemu dostarczania, który kieruje takie składniki do miejsca dotkniętej tkanki w celu zminimalizowania możliwego uszkodzenia dla komórek niezakażonych i, w ten sposób, obniżając skutki uboczne.

Dane otrzymane z oznaczeń w hodowlach komórkowych i doświadczeń na zwierzętach mogą zostać wykorzystane do określania zakresu dawkowania podczas stosowania u ludzi. Dawkowanie takich składników znajduje się korzystnie w zakresie stężeń w krwiobiegu, które obejmują ED50 z małą lub ż adną toksycznoś cią . Dawkowanie moż e wahać się w tym zakresie w zależ noś ci od zastosowanej postaci dawkowania i wykorzystywanej drogi podawania. Dla każdego składnika stosowanego w sposobie według wynalazku, dawka skuteczna terapeutycznie może zostać wyznaczona początkowo z oznaczeń w hodowlach komórkowych. Dawka może zostać określona w modelach zwierzęcych w celu osiągnięcia zakresu stężenia w osoczu krwiobiegu, który obejmuje IC50 (tzn. stężenie badanego składnika, które prowadzi do zahamowania najsilniejszych objawów o połowę) jak określone w hodowli komórkowej przed podaniem pacjentowi.

Kiedy inny środek terapeutyczny jest podawany w kombinacji z polipeptydami według wynalazku (współpodawanie), polipeptydy według wynalazku mogą być dostarczane albo przed, równocześnie lub po dostarczeniu drugiego środka terapeutycznego. Równoczesne podawanie obejmuje mieszanie polipeptydów według wynalazku z drugim środkiem terapeutycznym przed podaniem pacjentowi, lub podanie pacjentowi w oddzielnych zastrzykach, chociaż w tym samym czasie. Jest również rozważane, że dawka drugiego środka terapeutycznego powinna być zgodna z ustalonymi zakresami terapeutycznymi, jednakże, jeżeli występuje podniesienie skuteczności środka terapeutycznego, kiedy jest stosowany w połączeniu z polipeptydami według wynalazku, która jest wyższa niż suma każdego oddzielnie, to mamy do czynienia z synergizmem. Zatem w przypadku synergizmu, będzie zrozumiałe, że dawki mogą zostać obniżone w odniesieniu do polecanych dawek w świetle podniesionej skuteczności.

Polipeptyd według wynalazku może być podawany jeden raz w tygodniu do leczenia różnych zaburzeń zdrowotnych ujawnionych niniejszym, lub w innym wykonaniu przynajmniej raz dziennie. Pacjentem dorosłym jest osoba, która jest w wieku 18 lat lub więcej. Jeżeli wstrzyknięta, skuteczna ilość, na dawkę dla dorosłego, polipeptydu według wynalazku wynosi od około 1-500 mg/m², lub od około 1-200 mg/m², lub od około 1-40 mg/m² lub około 5-25 mg/m². Alternatywnie, może zostać podana niezmienna dawka, której ilość może wynosić od 2-500 mg/dawkę, 2-100 mg/dawkę lub od około 10-80 mg/dawkę. Jeżeli dawka ma być podawana częściej niż jeden raz w tygodniu, przykładowy zakres dawek jest taki sam jak zakresy dawek opisane powyżej lub niższy. Korzystnie, polipeptydy według wynalazku mogą być podawane dwa lub więcej razy w tygodniu w zakresie dawek 25-100 mg/dawkę.

Różne wskazania opisane poniżej są leczone przez podawanie preparatu dopuszczalnego do wstrzyknięcia zawierającego polipeptyd fuzyjny według wynalazku w ilości 80-100 mg/dawkę, lub, alternatywnie, 80 mg/dawkę. Dawka może być podawana raz na dwa tygodnie, co tydzień, lub rozdzielona przez kilka tygodni (na przykład 2 do 8).

Jeżeli jest wykorzystywana inna droga podawania polipeptydów fuzyjnych według wynalazku niż wstrzykniecie, dawka jest odpowiednio dostosowana zgodnie ze standardowymi praktykami medycznymi. Na przykład, jeśli drogą podawania jest inhalacja, dawkowanie może być stosowane jeden do siedmiu razy na tydzień w zakresach dawek 10 mg/dawkę do 50 mg na dawkę.

W wielu przypadkach, poprawa stanu pacjenta zostanie osiągnięta przez wstrzyknięcie dawki do około 100 mg polipeptydów według wynalazku jeden do trzech razy w tygodniu przez okres przynajmniej trzech tygodni, chociaż leczenie przez dłuższe okresy może być konieczne w celu wywołania pożądanego stopnia poprawy. Dla nieuleczalnych stanów przewlekłych, na przykład, pacjentów z uszkodzeniem szpiku kostnego spowodowanym zaburzeniem genetycznym, leczenie może być kontynuowane w nieskończoność.

PL 208 287 B1

Dla pacjentów pediatrycznych (wiek 4-17), odpowiednie leczenie obejmuje wstrzyknięcia podskórne 0,4 mg/kg do 5 mg/kg polipeptydów według wynalazku, podawane jeden lub więcej razy na tydzień.

Preparaty i zastosowanie

Kompozycje farmaceutyczne mogą być opracowane w dogodny sposób z użyciem jednego lub więcej dopuszczalnych fizjologicznie nośników lub wypełniaczy. Zatem, składniki i ich dopuszczalne fizjologicznie sole i rozpuszczalniki mogą być opracowane do podawania przez inhalację lub wziewnie (albo przez usta, albo przez nos), lub podawania doustnego, parenteralnego lub doodbytniczego.

Do podawania doustnego, kompozycje mogą mieć postać tabletek lub pastylek opracowanych w typowy sposób.

Składniki mogą zostać opracowane do podania parenteralnego przez wstrzyknięcie, np. wstrzyknięcie typu bolus lub wstrzykiwania ciągłe. Preparaty do wstrzyknięcia mogą być przygotowane w postaci jednostek dawkowania, np. w ampułkach lub pojemnikach z wieloma dawkami, z dodanym środkiem konserwującym. Kompozycje mogą mieć postać zawiesiny, roztworu, lub emulsji w nośnikach lipidowych lub wodnych, i mogą zawierać czynniki formułujące, takie jak czynniki zawieszające, stabilizujące i/lub rozpraszające. Alternatywnie, aktywny składnik może być w postaci proszku do odtworzenia przed użyciem odpowiednim nośnikiem, np. jałową wodą wolną od pirogenów.

Składniki mogą być również opracowane w kompozycjach doodbytniczych, takich jak czopki lub lewatywy zatrzymujące, np. zawierające typowe wypełniacze czopków, takie jak masło kakaowe lub inne glicerydy.

W dodatku do preparatów opisanych uprzednio, składniki mogą być również opracowywane do wstrzyknięcia. Takie preparaty są zazwyczaj przechowywane jako roztwory wodne, które mogą być zamrażane i rozmrażane, ale mogą zostać również przygotowane jako próbki liofilizowane do przedłużonego przechowywania. Te preparaty są często przygotowywane w roztworze, który jest izotoniczny wobec krwi ludzkiej, konkretnie, około 150 mM i buforowany. Typowe bufory obejmują fosforan sodowy i octan sodowy, a zakres pH moż e wynosić od 1 do 14, ale bardziej typowo pH wynosi okoł o 4,5 do 6. Preparaty te mogą również zawierać poliol (np. sorbitol, trehalozę, sacharozę itp.) i środek powierzchniowo czynny (np. polisorbat, Tween 80 itp.) oraz nie wymagają chlorku sodu w celu uzyskania roztworu izotoniczności.

Polipeptydy według wynalazku mogą zostać również opracowane jako preparaty o długotrwałym uwalnianiu. Takie długo działające preparaty mogą zostać podane przez implantację (na przykład podskórnie lub domięśniowo) lub przez wstrzyknięcie domięśniowe. Zatem, na przykład, składniki mogą zostać opracowane wraz z odpowiednimi materiałami polimerycznymi lub hydrofobowymi (na przykład jako emulsje w dopuszczalnym lipidzie) lub żywicami wymiany jonowej, lub jako słabo rozpuszczalne pochodne, na przykład, jako słabo rozpuszczalna sól.

Kompozycje mogą, jeśli jest to pożądane, być opracowane w opakowaniu lub urządzeniu dawkującym, które mogą zawierać jedną lub więcej jednostek postaci dawkowania zawierających aktywny składnik. Opakowanie może na przykład zawierać folię aluminiową lub z tworzywa sztucznego, taką jak opakowanie blistrowe. Do opakowania lub urządzenia dawkującego mogą być dołączone wskazówki podawania.

Przykłady

Klonowanie

Konstrukty zostały przygotowane przez połączenie trzech różnych kwasów nukleinowych:

1) domeny wiążącej receptora (RBD) ludzkiego CD40L(TNFSF5) jako 0,4 kb XbaI-NotI poprzednio przyłączonego do delecji CD40L(TNFSF5)194W, jak opisano przez Morris i wsp. (1999, J. Biol. Chem., 274: 418-423); 2) fragmentu AvrII-XbaI sekwencji trimeryzacyjnej receptora zmiatającego, jak opisano poniżej; 3) fragmentu 5,5 kb Spel-Notl, składającego się z wektora ekspresyjnego pSMAG zawierającego sekwencje sygnałowe i promotor transkrypcji. Otrzymane kwasy nukleinowe są ujawnione w Sekw. nr Id. : 5 i 7.

Fragment AvrII-XbaI zawierający 7 powtórzeń heptadowych z sekwencji kodującej receptora zmiatającego został wytworzony przez hybrydyzację i połączenie dwóch zestawów syntetycznych oligonukleotydów przedstawionych na Fig. 1 (sekwencje oligo SR). Sekwencja oligonukleotydowa została zaprojektowana tak, aby zawierała jednoniciowy fragment miejsca restrykcyjnego AvrII na końcu 5' i jednoniciowy fragment miejsca restrykcyjnego Xbal (sekwencja kompatybilna) na końcu 3' syntetycznego fragmentu receptora zmiatającego. Miejsce Xbal to TCTAGA, miejsce restrykcyjne AvrII to C/CTAGG i miejsce restrykcyjne Spel to A/CTAGT. Połączenie Spel z AvrII wytwarza sekwenPL 208 287 B1 cję ACTAGG kodującą odpowiednio aminokwasy treoninę i argininę (w jednoliterowym kodzie aminokwasowym T i K).

Oligonukleotydy 33 (Sek. nr id.: 2) i 35 (Sek. nr id.: 4) zostały fosforylowane z użyciem polinukleotydowej kinazy T4 i ATP w 37°C przez 1 godzinę. Odpowiednie preparaty oligonukleotydowe zostały zmieszane razem w dwóch oddzielnych naczyniach reakcyjnych (probówkach Eppendorfa) w stężeniu 2 μ g/ml i połączone przez podgrzewanie każ dej pary oligonukleotydów do 95°C przez 2 minuty, a następnie utrzymywane w 65°C przez 3 minuty i pozostawione do stopniowego schłodzenia do temperatury pokojowej (25°C) przez 45 minut. Oligo 32 (Sek. nr id.: 3) został przyłączony do komplementarnego Oligo 35 i Oligo 33 został przyłączony do komplementarnego oligo 34 (Sek. nr id.: 1). Dwa zestawy reakcji zostały zmieszane razem i ligowane przez 1 godzinę stosując ligazy DNA. Reakcja połączenia została zanalizowana z użyciem preparatywnej elektroforezy w żelu agarozowym 3% NuSieve® i fragment około 150 par zasad odpowiadający fragmentowi AvrII/XbaI receptora zmiatającego został uwidoczniony i wyizolowany z żelu.

Te kwasy nukleinowe zostały sklonowane powyżej (tzn. na N-końcu) domeny wiążącej receptora (RBD) CD40L (TNFSF5) przez połączenie fragmentu XbaI/NotI, zawierającego RBD CD40L (TNFSF5) i fragmentu Notl/Spel, zawierającego wektor pSMAG i sekwencję sygnałową. Te kwasy nukleinowe receptora zmiatającego zastąpiły kwasy nukleinowe kodujące suwak leucynowy muteiny, które były poprzednio stosowane do trimeryzacji/stabilizacji trimerów rozpuszczalnego CD40L (TNFSF5). Wektor ekspresyjny pSMAG stosowany do tych konstruktów zawierał promotor transkrypcji i albo sekwencję sygnał ową IL2, albo sekwencję sygnał ową ludzkiego hormonu wzrostu (GH) dla umożliwienia wydzielania CD40L(TNFSF5).

Kwas nukleinowy końcowych konstruktów został zanalizowany w automatycznym urządzeniu do sekwencjonowania. Sekwencja od sekwencji sygnałowej przez połączenie RBD CD40L (TNFSF5) została otrzymana w celu potwierdzenia prawidłowej ligacji. Fig. 2A przedstawia polipeptyd fuzyjny według wynalazku, w którym aminokwasy 1 do 24 to peptyd sygnałowy IL2, aminokwasy 25 do 39 to sekwencje łącznika, aminokwasy 40 do 88 to domena trimeryzacyjna, aminokwasy 89 do 95 to sekwencje łącznika i aminokwasy 96 do 244 to sekwencje z delecji CD40L(TNFSF5) 194W, a Fig. 2B przedstawia polipeptyd fuzyjny według wynalazku, przy czym aminokwasy 1 do 25 to peptyd sygnałowy IL2, aminokwasy 26 do 29 to sekwencje łącznika, aminokwasy 30 do 78 to domena trimeryzacyjna, aminokwasy 79 do 85 to sekwencje łącznika i aminokwasy 86 do 234 to CD40L(TNFSF5) 194W sekwencje z delecji.

Ekspresja

Komórki COS zostały transfekowane 2 μg DNA plazmidu w każdej studzience w 6-studzienkowym naczyniu transfekcyjnym i wzrostowe podłoże pohodowlane zostało zebrane po 3 dniach i analizowane na SDS PAGE techniką typu western blot z użyciem przeciwciała poliklonalnego anty-CD40L (TNFSF5). Otrzymany western blot, przedstawiony na Fig. 3, pokazuje, że zarówno suwak leucynowy CD40L (TNFSF5) (Morris i wsp., (1999) J. Biol. Chem., 274: 418-423), jak i dwie postacie receptora zmiatającego (SR)-CD40L(TNFSF5), opisane powyżej, są wytwarzane i wydzielane. Ścieżki 1, 3 i 5 zawierają nadsącz pohodowlany w rozcieńczeniu 1:10 i ścieżki 2, 4 i 6 zawierają nadsącz w rozcieńczeniu 1:30. Ścieżki zawierają nadsącz hodowlany z komórek transfekowanych jak następuje: ścieżki 1 i 2 zawierają cDNA suwaka leucynowego CD40L (TNFSF5), ścieżki 4 i 6 zawierają sekwencję sygnałową hormonu wzrostu połączoną z domeną trimeryzacyjną receptora zmiatającego CD40L (TNFSF5) (GH-SR-CD40L), ścieżki 5 i 6 zawierają sekwencję sygnałową połączoną z domeną trimeryzującą receptora zmiatającego CD40L(TNFSF5) (IL2-SR-CD40L).

Aktywność biologiczna

Potransfekcyjne podłoże pohodowlane zostało zanalizowane pod względem aktywności biologicznej jak opisano w Morris i wsp. (1999, J. Biol. Chem., 274: 418-423). Kostymulacja podziałów komórek B ludzkiej krwi została oceniona przez hodowlę komórek T pozbawionych PBMC (E) w okrągłodennych 96-studzienkowych płytkach mikrotitracyjnych (1 x 10⁵ komórek w 200 μθ przez 4 dni w obecności miareczkującego huCD40L (TNFSF5). Komórkom podano pulsowo trytowaną tymidynę (91 μci/studzienkę) w końcowym 18 godz. okresie hodowli. Komórki hodowane z 1 μg/ml suwaka leucynowego CD40L (TNFSF5) zostały włączone jako kontrola dodatnia. Komórki kontrolne zostały włączone jako kontrola ujemna. Komórki B to jedyne komórki w preparacie E, które będą dzielić się w odpowiedzi na CD40L (TNFSF5). Wyniki pokazują, że nadsącze transfekcyjne zawierające domenę trimeryzującą receptora zmiatającego przyłączoną do RBD CD40L (TNFSF5), z sekwencją sygnałową hormonu wzrostu, są w przybliżeniu tak aktywne jak postać CD40L (TNFSF5) z suwakiem leucynowym.

PL 208 287 B1

Ekwiwalenty i odnośniki literaturowe

Zakres niniejszego wynalazku nie ma być ograniczony przez specyficzne wykonania opisane niniejszym, które w zamierzeniu są pojedynczymi zobrazowaniami indywidualnych aspektów wynalazku i funkcjonalnie równoważne sposoby i składniki znajdują się w zakresie wynalazku. Rzeczywiście, różne modyfikacje wynalazku, w dodatku do tych pokazanych i opisanych niniejszym staną się oczywiste dla specjalistów w dziedzinie z poprzedzającego opisu i towarzyszących rysunków.

Lista sekwencji

<110>	Reddy, Pranhitha
<120>	REKOMBINOWANE POLIPEPTYDY
<130>	01017/30002
<140>	US 10/326,186
<141>	2002-12-20
<150>	US 60/343,315
<151>	2001-12-21
<160>	11
<170>	Patentln wersja	3.1
<210>	1
<211>	80
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<400>	1
ctagagctcc tggtgaagat	tggattttgc	cattcagatt	ttctatgttg	agotgcaaat	60
caagcaatgt ggtattcaaa					80
<210>	2
<211>	89
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<400>	2
agtccttaat aagtttgaat	accacattgc	ttgatttgca	gctcaacata	gaaaatctga	60
atggcaaaat ccaatcttca	ccaggagct				89
<210>	3
<211>	81
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<400>	3
ctaggtctga cattcttctg	cagctaagta	ccttgttttc	ctcagtccag	ggacatggga	60
atgcaataga tgaaatctcc	a				81
<210>	4
<211>	90
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<400>	4
cttattaagg acttggagat	ttcatctatt	gcattcccat	gtccctggac	tgaggaaaac	60
aaggtactta gctgcagaag	aatgtcagac				90

PL 208 287 B1 <210> 5 <211> 743 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)..(735) <223>

<400> 5

atg Met 1

gcc Ala

ctg Leu

tgg Trp

atc Ile 5

gac Asp

agg Arg

atg Met

caa Gin

ctc Leu 10

ctg Leu

tet Ser

tgc Cys

att Ile

gca Ala 15

eta Leu

48

agt

ctt

gca

ctt

gtc

aca

aac

agt

gca

cct

act

tea

agt

tet

aca

aag

96

Ser

Leu

Ala

Leu 20

Val

Thr

Asn

Ser

Ala 25

Pro

Thr

Ser

Ser

Ser 30

Thr

Lys

aaa

aca

cag

eta

act

agg

tet

gac

att

ctt

ctg

cag

eta

agt

acc

ttg

144

Lys

Thr

Gin 35

Leu

Thr

Arg

Ser

Asp 40

Ile

Leu

Leu

Gin

Leu 45

Ser

Thr

Leu

ttt

tcc

tea

gtc

cag

gga

cat

ggg

aat

gca

ata

gat

gaa

atc

tcc

aag

192

Phe

Ser 50

Ser

Val

Gin

Gly

His 55

Gly

Asn

Ala

Ile

Asp 60

Glu

Ile

Ser

Lys

tcc

tta

ata

agt

ttg

aat

acc

aca

ttg

ctt

gat

ttg

cag

ctc

aac

ata

240

Ser 65

Leu

Ile

Ser

Leu

Asn 70

Thr

Thr

Leu

Leu

Asp 75

Leu

Gin

Leu

Asn

Ile 80

gaa

aat

ctg

aat

ggc

aaa

atc

caa

tet

tea

cca

gga

get

eta

gaa

atg

288

Glu

Asn

Leu

Asn

Gly 85

Lys

Ile

Gin

Ser

Ser 90

Pro

Gly

Ala

Leu

Glu 95

Met

caa

aaa

ggt

gat

cag

aat

cct

caa

att

gcg

gca

cat

gtc

ata

agt

gag

336

Gin

Lys

Gly

Asp 100

Gin

Asn

Pro

Gin

Ile 105

Ala

Ala

His

Val

Ile 110

Ser

Glu

gcc

agc

agt

aaa

aca

aca

tet

gtg

tta

cag

tgg

get

gaa

aaa

gga

tac

384

Ala

Ser

Ser 115

Lys

Thr

Thr

Ser

Val 120

Leu

Gin

Trp

Ala

Glu 125

Lys

Gly

Tyr

tac

acc

atg

agc

aac

aac

ttg

gta

acc

ctg

gaa

aat

ggg

aaa

cag

ctg

432

Tyr

Thr 130

Met

Ser

Asn

Asn

Leu 135

Val

Thr

Leu

Glu

Asn 140

Gly

Lys

Gin

Leu

acc

gtt

aaa

aga

caa

gga

ctc

tat

tat

atc

tat

gcc

caa

gtc

acc

ttc

480

Thr 145

Val

Lys

Arg

Gin

Gly 150

Leu

Tyr

Tyr

Ile

Tyr 155

Ala

Gin

Val

Thr

Phe 160

tgt

tcc

aat

cgg

gaa

get

tcg

agt

caa

get

cca

ttt

ata

gcc

agc

ctc

528

Cys

Ser

Asn

Arg

Glu 165

Ala

Ser

Ser

Gin

Ala 170

Pro

Phe

Ile

Ala

Ser 175

Leu

tgg

eta

aag

tcc

ccc

ggt

aga

ttc

gag

aga

atc

tta

ctc

aga

get

gca

576

Trp

Leu

Lys

Ser 180

Pro

Gly

Arg

Phe

Glu 185

Arg

Ile

Leu

Leu

Arg 190

Ala

Ala

aat

acc

cac

agt

tcc

gcc

aaa

cct

tgc

ggg

caa

caa

tcc

att

cac

ttg

624

Asn

Thr

His 195

Ser

Ser

Ala

Lys

Pro 200

Cys

Gly

Gin

Gin

Ser 205

Ile

His

Leu

PL 208 287 B1

gga

gga

gta

ttt

gaa

ttg

caa

cca

ggt

gct

tcg

gtg

ttt

gtc

aat

gtg

672

Gly

Gly

Val

Phe

Glu

Leu

Gln

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Phe

Val

Asn

Val

210

215

220

act

gat

cca

agc

caa

gtg

agc

cat

ggc

act

ggc

ttc

acg

tcc

ttt

ggc

720

Thr

Asp

Pro

Ser

Gln

Val

Ser

His

Gly

Thr

Gly

Phe

Thr

Ser

Phe

Gly

225

230

235

240

tta

ctc

aaa

ctc

tga

gcggccgc

743

Leu

Leu

Lys

Leu

<210> 6 <211> 244 <212> PRT

<213> Homo

sapiens

<400> 6

Met

Ala

Leu

Trp

Ile

Asp

Arg

Met

Gln

Leu

Leu

Ser

Cys

Ile

Ala

Leu

1

5

10

15

Ser

Leu

Ala

Leu

Val

Thr

Asn

Ser

Ala

Pro

Thr

Ser

Ser

Ser

Thr

Lys

20

25

30

Lys

Thr

Gln

Leu

Thr

Arg

Ser

Asp

Ile

Leu

Leu

Gln

Leu

Ser

Thr

Leu

35

40

45

Phe

Ser

Ser

Val

Gln

Gly

His

Gly

Asn

Ala

Ile

Asp

Glu

Ile

Ser

Lys

50

55

60

Ser

Leu

Ile

Ser

Leu

Asn

Thr

Thr

Leu

Leu

Asp

Leu

Gln

Leu

Asn

Ile

65

70

75

80

Glu

Asn

Leu

Asn

Gly

Lys

Ile

Gln

Ser

Ser

Pro

Gly

Ala

Leu

Glu

Met

85

90

95

Gln

Lys

Gly

Asp

Gln

Asn

Pro

Gln

Ile

Ala

Ala

His

Val

Ile

Ser

Glu

100

105

110

Ala

Ser

Ser

Lys

Thr

Thr

Ser

Val

Leu

Gln

Trp

Ala

Glu

Lys

Gly

Tyr

115

120

125

Tyr

Thr

Met

Ser

Asn

Asn

Leu

Val

Thr

Leu

Glu

Asn

Gly

Lys

Gln

Leu

130

135

140

Thr

Val

Lys

Arg

Gln

Gly

Leu

Tyr

Tyr

Ile

Tyr

Ala

Gln

Val

Thr

Phe

145

150

155

160

Cys

Ser

Asn

Arg

Glu

Ala

Ser

Ser

Gln

Ala

Pro

Phe

Ile

Ala

Ser

Leu

165 170 175

PL 208 287 B1

Trp

Leu

Lys

Ser 180

Pro

Gly

Arg

Phe

Glu 185

Arg

Ile

Leu

Leu

Arg 190

Ala

Ala

Asn

Thr

His 195

Ser

Ser

Ala

Lys

Pro 200

Cys

Gly

Gin

Gin

Ser 205

Ile

His

Leu

Gly

Gly 210

Val

Phe

Glu

Leu

Gin 215

Pro

Gly

Ala

Ser

Val 220

Phe

Val

Asn

Val

Thr 225

Asp

Pro

Ser

Gin

Val 230

Ser

His

Gly

Thr

Gly 235

Phe

Thr

Ser

Phe

Gly 240

Leu

Leu

Lys

Leu

<210> 7 <211> 713 <212> DNA

<213 > Homo

sapiens

<220>

<221> CDS

<222>

(1) ·

(705)

<223>

<400> ’

7

atg

gct

aca

ggc

tcc

cgg

acg

tcc

ctg

ctc

ctg

gct

ttt

ggc

ctg

ctc

48

Met

Ala

Thr

Gly

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

Leu

Leu

Ala

Phe

Gly

Leu

Leu

1

5

10

15

tgc

ctg

ccc

tgg

ctt

caa

gag

ggc

agt

gca

act

agg

tct

gac

att

ctt

96

Cys

Leu

Pro

Trp

Leu

Gin

Glu

Gly

Ser

Ala

Thr

Arg

Ser

Asp

Ile

Leu

20

25

30

ctg

cag

eta

agt

acc

ttg

ttt

tcc

tea

gtc

cag

gga

cat

ggg

aat

gca

144

Leu

Gin

Leu

Ser

Thr

Leu

Phe

Ser

Ser

Val

Gin

Gly

His

Gly

Asn

Ala

35

40

45

ata

gat

gaa

atc

tcc

aag

tcc

tta

ata

agt

ttg

aat

acc

aca

ttg

ctt

192

Ile

Asp

Glu

Ile

Ser

Lys

Ser

Leu

Ile

Ser

Leu

Asn

Thr

Thr

Leu

Leu

50

55

60

gat

ttg

cag

ctc

aac

ata

gaa

aat

ctg

aat

ggc

aaa

atc

caa

tct

tea

240

Asp

Leu

Gin

Leu

Asn

Ile

Glu

Asn

Leu

Asn

Gly

Lys

Ile

Gin

Ser

Ser

S5

70

75

80

cca

gga

gct

eta

gaa

atg

caa

aaa

ggt

gat

cag

aat

cct

caa

att

gcg

288

Pro

Gly

Ala

Leu

Glu

Met

Gin

Lys

Gly

Asp

Gin

Asn

Pro

Gin

Ile

Ala

85

90

95

gca

cat

gtc

ata

agt

gag

gee

age

agt

aaa

aca

aca

tct

gtg

tta

cag

336

Ala

His

Val

Ile

Ser

Glu

Ala

Ser

Ser

Lys

Thr

Thr

Ser

Val

Leu

Gin

100

105

110

tgg

gct

gaa

aaa

gga

tac

tac

acc

atg

age

aac

aac

ttg

gta

acc

ctg

384

Trp

Ala

Glu

Lys

Gly

Tyr

Tyr

Thr

Met

Ser

Asn

Asn

Leu

Val

Thr

Leu

115

120

12 5

gaa

aat

ggg

aaa

cag

ctg

acc

gtt

aaa

aga

caa

gga

ctc

tat

tat

atc

432

PL 208 287 B1

Glu

Asn 130

Gly Lys

Gin

Leu

Thr 135

Val

Lys

Arg Gin Gly 140

Leu

Tyr

Tyr

Ile

tat

gcc

caa

gtc

acc

ttc

tgt

tcc

aat

cgg

gaa

gct

tcg

agt

caa

gct

480

Tyr

Ala

Gin

Val

Thr

Phe

Cys

Ser

Asn

Arg

Glu

Ala

Ser

Ser

Gin

Ala

145

150

155

160

cca

ttt

ata

gcc

agc

ctc

tgg

eta

aag

tcc

ccc

ggt

aga

ttc

gag

aga

528

Pro

Phe

Ile

Ala

Ser

Leu

Trp

Leu

Lys

Ser

Pro

Gly

Arg

Phe

Glu

Arg

165

170

175

atc

tta

ctc

aga

gct

gca

aat

acc

cac

agt

tcc

gcc

aaa

cct

tgc

ggg

576

Ile

Leu

Leu

Arg

Ala

Ala

Asn

Thr

His

Ser

Ser

Ala

Lys

Pro

Cys

Gly

180

185

190

caa

caa

tcc

att

cac

ttg

gga

gga

gta

ttt

gaa

ttg

caa

caa

ggt

gct

624

Gin

Gin

Ser

Ile

His

Leu

Gly

Gly

Val

Phe

Glu

Leu

Gin

Gin

Gly

Ala

195

200

205

tcg

gtg

ttt

gtc

aat

gtg

act

gat

cca

agc

caa

gtg

agc

cat

ggc

act

672

Ser

Val

Phe

Val

Asn

Val

Thr

Asp

Pro

Ser

Gin

val

Ser

His

Gly

Thr

210

215

220

ggc

ttc

acg

tcc

ttt

ggc

tta

ctc

aaa

ctc

tga

gcggccgc

713

Gly

Phe

Thr

Ser

Phe

Gly

Leu

Leu

Lys

Leu

225

230

<210> 8 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 15 10 15

Cys Leu Pro Trp Leu Gin Glu Gly Ser Ala Thr Arg Ser Asp Ile Leu 20 25 30

Leu Gin Leu Ser Thr Leu Phe Ser Ser Val Gin Gly His Gly Asn Ala 35 40 45

Ile Asp Glu Ile Ser Lys Ser Leu Ile Ser Leu Asn Thr Thr Leu Leu 50 55 60

Asp Leu Gin Leu Asn Ile Glu Asn Leu Asn Gly Lys Ile Gin Ser Ser 65 70 75 80

Pro Gly Ala Leu Glu Met Gin Lys Gly Asp Gin Asn Pro Gin Ile Ala 85 90 95

Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gin 100 105 110

PL 208 287 B1

Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu 115 120 125

Glu Asn Gly Lys Gin Leu Thr Val Lys Arg Gin Gly Leu Tyr Tyr Ile 130 135 140

Tyr Ala Gin Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gin Ala 145 150 155 160

Pro Phe Ile Ala Ser Leu Trp Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg 165 170 175

Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly 180 185 190

Gin Gin Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gin Gin Gly Ala 195 200 205

Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gin Val Ser His Gly Thr 210 215 220

Gly Phe Thr 225
<210>	9
<211>	1077
<212>	DNA
<213>	Homo
<220>
<221>	CDS
<222>	¢1) .
<223>
<400>	9
atg gag cag
Met Glu Gin

230 tgc tcc gaa tct gtg aaa ttt gat gct cgc tca atg aca gct ttg ctt Cys Ser Glu Ser Val Lys Phe Asp Ala Arg Ser Met Thr Ala Leu Leu

25 30 cct ccg aat cet aaa aac agc cet tcc ctt caa gag aaa ctg aag tcc Pro Pro Asn Pro Lys Asn Ser Pro Ser Leu Gin Glu Lys Leu Lys Ser

40 45

144 ttc aaa gct gca ctg att gcc ctt tac ctc ctc gtg ttt gca gtt ctc Phe Lys Ala Ala Leu Ile Ala Leu Tyr Leu Leu Val Phe Ala Val Leu

55 60

192 atc cct ctc att gga ata gtg gca gct caa ctc ctg aag tgg gaa acg Ile Pro Leu Ile Gly Ile Val Ala Ala Gin Leu Leu Lys Trp Glu Thr 65 70 75 80

240 aag aat tgc tca gtt agt tca act aat gca aat gat ata act caa agt

288

PL 208 287 B1

Lys

Asn

Cys

Ser

Val 85

Ser

Ser

Thr

Asn

Ala 90

Asn

Asp

Ile

Thr

Gin 95

Ser

ctc

acg

gga

aaa

gga

aat

gac

agc

gaa

gag

gaa

atg

aga

ttt

caa

gaa

336

Leu

Thr

Gly

Lys 100

Gly

Asn

Asp

Ser

Glu 105

Glu

Glu

Met

Arg

Phe 110

Gin

Glu

gtc

ttt

atg

gaa

cac

atg

agc

aac

atg

gag

aag

aga

atc

cag

cat

att

384

Val

Phe

Met 115

Glu

His

Met

Ser

Asn 120

Met

Glu

Lys

Arg

Ile 125

Gin

His

Ile

tta

gac

atg

gaa

gcc

aac

ctc

atg

gac

aca

gag

cat

ttc

caa

aat

ttc

432

Leu

Asp 130

Met

Glu

Ala

Asn

Leu 135

Met

Asp

Thr

Glu

His 140

Phe

Gin

Asn

Phe

agc

atg

aca

act

gat

caa

aga

ttt

aat

gac

att

ctt

ctg

cag

eta

agt

480

Ser 145

Met

Thr

Thr

Asp

Gin 150

Arg

Phe

Asn

Asp

Ile 155

Leu

Leu

Gin

Leu

Ser 160

acc

ttg

ttt

tcc

tca

gtc

cag

gga

cat

ggg

aat

gca

ata

gat

gaa

atc

528

Thr

Leu

Phe

Ser

Ser 165

Val

Gin

Gly

His

Gly 170

Asn

Ala

Ile

Asp

Glu 175

Ile

tcc

aag

tcc

tta

ata

agt

ttg

aat

acc

aca

ttg

ctt

gat

ttg

cag

ctc

576

Ser

Lys

Ser

Leu 180

Ile

Ser

Leu

Asn

Thr 185

Thr

Leu

Leu

Asp

Leu 190

Gin

Leu

aac

ata

gaa

aat

ctg

aat

ggc

aaa

atc

caa

gag

aat

acc

ttc

aaa

caa

624

Asn

Ile

Glu 195

Asn

Leu

Asn

Gly

Lys 200

Ile

Gin

Glu

Asn

Thr 205

Phe

Lys

Gin

caa

gag

gaa

atc

agt

aaa

tta

gag

gag

cgt

gtt

tac

aat

gta

tca

gca

672

Gin

Glu 210

Glu

Ile

Ser

Lys

Leu 215

Glu

Glu

Arg

Val

Tyr 220

Asn

Val

Ser

Ala

gaa

att

atg

gct

atg

aaa

gaa

gaa

caa

gtg

cat

ttg

gaa

cag

gaa

ata

720

Glu 225

Ile

Met

Ala

Met

Lys 230

Glu

Glu

Gin

Val

His 235

Leu

Glu

Gin

Glu

Ile 240

aaa

gga

gaa

gtg

aaa

gta

ctg

aat

aac

atc

act

aat

gat

ctc

aga

ctg

768

Lys

Gly

Glu

Val

Lys 245

Val

Leu

Asn

Asn

Ile 250

Thr

Asn

Asp

Leu

Arg 255

Leu

aaa

gat

tgg

gaa

cat

tet

cag

acc

ttg

aga

aat

atc

act

tta

att

caa

816

Lys

Asp

Trp

Glu 260

His

Ser

Gin

Thr

Leu 265

Arg

Asn

Ile

Thr

Leu 270

Ile

Gin

ggt

cct

cct

gga

ccc

ccg

ggt

gaa

aaa

gga

gat

ega

ggt

ccc

act

gga

864

Gly

Pro

Pro 275

Gly

Pro

Pro

Gly

Glu 280

Lys

Gly

Asp

Arg

Gly 285

Pro

Thr

Gly

gaa

agt

ggt

cca

ega

gga

ttt

cca

ggt

cca

ata

ggt

cct

ccg

ggt

ctt

912

Glu

Ser 290

Gly

Pro

Arg

Gly

Phe 295

Pro

Gly

Pro

Ile

Gly 300

Pro

Pro

Gly

Leu

aaa

ggt

gat

cgg

gga

gca

att

ggc

ttt

cct

gga

agt

ega

gga

ctc

cca

960

Lys 305

Gly

Asp

Arg

Gly

Ala 310

Ile

Gly

Phe

Pro

Gly 315

Ser

Arg

Gly

Leu

Pro 320

gga

tat

gcc

gga

agg

cca

gga

aat

tet

gga

cca

aaa

ggc

cag

aaa

ggg

1008

Gly

Tyr

Ala

Gly

Arg 325

Pro

Gly

Asn

Ser

Gly 330

Pro

Lys

Gly

Gin

Lys 335

Gly

PL 208 287 B1

gaa

aag

ggg

agt

gga

aac

aca

tta

aga

cca

gta

caa

ctc

act

gat

cat

1056

Glu

Lys

Gly

Ser

Gly

Asn

Thr

Leu

Arg

Pro

Val

Gin

Leu

Thr

Asp

His

340

345

350

att

agg

gca

ggg

ccc

tct

taa

1077

Ile

Arg

Ala

Gly

Pro

Ser

355

<210>	10
<211>	358
<212>	PRT
<213 >	Homo
<400>	10
Met Glu Gin

Cys Ser Glu Ser Val Lys Phe Asp Ala Arg Ser Met Thr Ala Leu Leu 20 25 30

Pro Pro Asn Pro Lys Asn Ser Pro Ser Leu Gin Glu Lys Leu Lys Ser 35 40 45

Phe Lys Ala Ala Leu Ile Ala Leu Tyr Leu Leu Val Phe Ala Val Leu 50 55 60

Ile Pro Leu Ile Gly Ile Val Ala Ala Gin Leu Leu Lys Trp Glu Thr 65 70 75 80

Lys Asn Cys Ser Val Ser Ser Thr Asn Ala Asn Asp Ile Thr Gin Ser 85 90 95

Leu Thr Gly Lys Gly Asn Asp Ser Glu Glu Glu Met Arg Phe Gin Glu 100 105 110

Val Phe Met Glu His Met Ser Asn Met Glu Lys Arg Ile Gin His Ile 115 120 125

Leu Asp Met Glu Ala Asn Leu Met Asp Thr Glu His Phe Gin Asn Phe 130 135 140

Ser Met Thr Thr Asp Gin Arg Phe Asn Asp Ile Leu Leu Gin Leu Ser 145 150 155 160

Thr Leu Phe Ser Ser Val Gin Gly His Gly Asn Ala Ile Asp Glu Ile 165 170 175

Ser Lys Ser Leu Ile Ser Leu Asn Thr Thr Leu Leu Asp Leu Gin Leu 180 185 190

PL 208 287 B1

Asn

Ile

Glu 195

Asn

Leu

Asn

Gly

Lys 200

Ile

Gin

Glu

Asn

Thr 205

Phe

Lys

Gin

Gin

Glu 210

Glu

Ile

Ser

Lys

Leu 215

Glu

Glu

Arg

Val

Tyr 220

Asn

Val

Ser

Ala

Glu 225

Ile

Met

Ala

Met

Lys 230

Glu

Glu

Gin

Val

His 235

Leu

Glu

Gin

Glu

Ile 240

Lys

Gly

Glu

Val

Lys 245

Val

Leu

Asn

Asn

Ile 250

Thr

Asn

Asp

Leu

Arg 255

Leu

Lys

Asp

Trp

Glu 260

His

Ser

Gin

Thr

Leu 265

Arg

Asn

Ile

Thr

Leu 270

Ile

Gin

Gly

Pro

Pro 275

Gly

Pro

Pro

Gly

Glu 280

Lys

Gly

Asp

Arg

Gly 285

Pro

Thr

Gly

Glu

Ser 290

Gly

Pro

Arg

Gly

Phe 295

Pro

Gly

Pro

Ile

Gly 300

Pro

Pro

Gly

Leu

Lys 305

Gly

Asp

Arg

Gly

Ala 310

Ile

Gly

Phe

Pro

Gly 315

Ser

Arg

Gly

Leu

Pro 320

Gly

Tyr

Ala

Gly

Arg 325

Pro

Gly

Asn

Ser

Gly 330

Pro

Lys

Gly

Gin

Lys 335

Gly

Glu

Lys

Gly

Ser 340

Gly

Asn

Thr

Leu

Arg 345

Pro

Val

Gin

Leu

Thr 350

Asp

His

Ile Arg Ala Gly Pro Ser 355 <210> 11 <211> 174 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11

ctaggtctga	cattcttctg	cagctaagta	ccttgttttc	ctcagtccag	ggacatggga	60
atgcaataga	tgaaatctcc	aagtccttaa	taagtttgaa	taccacattg	cttgatttgc	120
agctcaacat	agaaaatctg	aatggcaaaa	tccaatcttc	accaggagct	ctag	174

PL 208 287 B1

Claims (25)

1. Polipeptyd fuzyjny zawierający pierwszy polipeptyd składający się z aminokwasów x do y polipeptydu przedstawionego w Sek. nr id.: 10, przy czym x jest wybrany spośród pozycji 110 do 173 Sek. nr id.: 10, a y jest wybrany spośród pozycji 179 do 270 Sek. nr id.: 10, przyłączony do drugiego heterologicznego polipeptydu, przy czym polipeptyd fuzyjny jest zdolny do tworzenia trimeru.

2. Polipeptyd fuzyjny według zastrz. 1, znamienny tym, że pierwszy polipeptyd składa się z aminokwasów 154 do 203 polipeptydu przedstawionego w Sek. nr id.: 10.

3. Polipeptyd fuzyjny według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że drugim polipeptydem jest rozpuszczalna część polipeptydu nadrodziny receptora czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF).

4. Polipeptyd fuzyjny według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że drugim polipeptydem jest rozpuszczalna część ligandu nadrodziny czynnika martwicy nowotworu (TNFSF).

5. Polipeptyd fuzyjny według zastrz. 3, znamienny tym, że drugim polipeptydem jest rozpuszczalna część polipeptydu wybranego z grupy polipeptydów nadrodziny receptora czynnika martwicy nowotworów składającej się z TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF3, TNFRSF4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFRSF6B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF10C, TNFRSF10D, TNFRSF11A, TNFRSF11B, TNFRSF12, TNFRSF12L, TNFRSF13, TNFRSF13B, TNFRSF14, TNFRSF15, TNFRSF16, TNFRSF17, TNFRSF18, TNFRSF19 i TNFRSF20.

6. Polipeptyd fuzyjny według zastrz. 4, znamienny tym, że drugim polipeptydem jest rozpuszczalna część polipeptydu wybranego z grupy składającej się z TNFSF1, TNFSF2, TNFSF3, TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, TNFSF7, TNFSF8, TNFSF9, TNFSF10, TNFSF11, TNFSF12, TNFSF13, TNFSF14, TNFSF15, TNFSF16, TNFSF17, TNFSF18, TNFSF19 i TNFSF20.

7. Polipeptyd fuzyjny zawierający pierwszy polipeptyd przyłączony do drugiego, heterologicznego polipeptydu, przy czym pierwszy polipeptyd składa się z aminokwasów x do y polipeptydu przedstawionego w Sek. nr id.: 10, gdzie x jest wybrany spośród pozycji 110 do 173 Sek. nr id.: 10, a y jest wybrany spośród pozycji 179 do 270 Sek. nr id.: 10, z przynajmniej jednym podstawieniem aminokwasu, sekwencja aminokwasowa pierwszego polipeptydu jest w przynajmniej 80% identyczna na swojej długości z sekwencją aminokwasową polipeptydu przedstawionego w Sek. nr id.: 10 od 20 pozycji x do y Sek. nr id.: 10 oraz polipeptyd fuzyjny jest zdolny do tworzenia trimeru.

8. Polipeptyd fuzyjny według zastrz. 7, znamienny tym, że drugim polipeptydem jest rozpuszczalna część polipeptydu nadrodziny receptora czynnika martwicy nowotworu (TNFRSF).

9. Polipeptyd fuzyjny według zastrz. 7, znamienny tym, że drugim polipeptydem jest rozpuszczalna część ligandu nadrodziny czynnika martwicy nowotworu (TNFSF).

10. Polipeptyd fuzyjny według zastrz. 8, znamienny tym, że drugim polipeptydem jest rozpuszczalna część polipeptydu wybranego z grupy polipeptydów nadrodziny receptora czynnika martwicy nowotworów składającej się z TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF3, TNFRSF4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFRSF6B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF10C, TNFRSF10D, TNFRSF11A, TNFRSF11B, TNFRSF12, TNFRSF12L, TNFRSF13, TNFRSF13B, TNFRSF14, TNFRSF15, TNFRSF16, TNFRSF17, TNFRSF18, TNFRSF19 i TNFRSF20.

11. Polipeptyd fuzyjny według zastrz. 10, znamienny tym, że polipeptyd fuzyjny jest zdolny do hamowania sygnalizacji receptora z nadrodziny receptora czynnika martwicy nowotworu.

12. Polipeptyd fuzyjny według zastrz. 11, znamienny tym, że pierwszy i drugi polipeptyd polipeptydu fuzyjnego są kodowane przez kwasy nukleinowe pochodzenia ludzkiego.

13. Polipeptyd fuzyjny według jednego z zastrz. 7-8, znamienny tym, że polipeptyd fuzyjny jest nieimmunogenny.

14. Polipeptyd fuzyjny z zastrz. 9, znamienny tym, że drugim polipeptydem jest rozpuszczalna część polipeptydu wybranego z grupy składającej się z TNFSF1, TNFSF2, TNFSF3, TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, TNFSF7, TNFSF8, TNFSF9, TNFSF10, TNFSF11, TNFSF12, TNFSF13, TNFSF14, TNFSF15, TNFSF16, TNFSF17, TNFSF18, TNFSF19 i TNFSF20.

15. Polipeptyd fuzyjny według zastrz. 14, znamienny tym, że polipeptyd fuzyjny jest zdolny do wzmacniana sygnalizacji receptora z nadrodziny receptora czynnika martwicy nowotworu.

16. Polipeptyd fuzyjny według jednego z zastrz. 7-15, znamienny tym, że pierwszy i drugi polipeptyd polipeptydu fuzyjnego są kodowane przez kwasy nukleinowe pochodzenia ludzkiego.

PL 208 287 B1

17. Polipeptyd fuzyjny według zastrz. 16, znamienny tym, że jest zdolny do tworzenia multimeru będącego trimerem.

18. Polipeptyd fuzyjny według zastrz. 17, znamienny tym, że drugi heterologiczny polipeptyd obejmuje aminokwasy przedstawione jako aminokwasy 96 do 244 w Sek. nr id.: 6.

19. Kwas nukleinowy kodujący polipeptyd fuzyjny określony w jednym z zastrz. 1 do 18.

20. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera kwas nukleinowy określony w zastrz. 19, przy czym kwas nukleinowy jest funkcjonalnie przyłączony do heterologicznego elementu kontrolującego.

21. Komórka gospodarza, znamienna tym, że jest transfekowana kwasem nukleinowym określonym w zastrz. 19.

22. Sposób wytwarzania polipeptydu fuzyjnego kodowanego przez kwas nukleinowy określony w zastrz. 19, znamienny tym, że obejmuje etapy wzrostu komórki gospodarza tranfekowanej tym kwasem nukleinowym w warunkach sprzyjających wytwarzaniu polipeptydu fuzyjnego oraz izolowania polipeptydu.

23. Rekombinowany wektor, znamienny tym, że zawiera kwas nukleinowy określony w zastrz. 19.

24. Sposób konstruowania rekombinowanego wektora ekspresyjnego, znamienny tym, że obejmuje etapy łączenia pierwszego kwasu nukleinowego zawierającego nukleotydy x do y kwasu nukleinowego przedstawionego w Sek. nr id.: 9, przy czym x jest wybrany spośród pozycji 331 do 508 Sek. nr id.: 9, a y jest wybrany spośród pozycji 546 do 808 Sek. nr id.: 9, oraz drugiego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd heterologiczny z pierwszym kwasem nukleinowym w pasujące miejsce do klonowania wektora ekspresyjnego, oraz następnie namnażania i izolowania wektora ekspresyjnego.

25. Sposób z zastrz. 24, znamienny tym, że drugi kwas nukleinowy koduje rozpuszczalną część polipeptydu wybranego z grupy składającej się z TNFSF1, TNFRSF1A, TNFSF2, TNFRSF1B, TNFSF3, TNFRSF3, TNFSF4, TNFRSF4, TNFSF5, TNFRSF5, TNFSF6, TNFRSF6, TNFRSF6B, TNFSF7, TNFRSF7, TNFSF8, TNFRSF8, TNFSF9, TNFRSF9, TNFSF10, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF10C, TNFRSF10D, TNFSF11, TNFRSF11A, TNFRSF11B, TNFSF12, TNFRSF12, TNFRSF12L, TNFSF13, TNFRSF13, TNFRSF13B, TNFSF14, TNFRSF14, TNFSF15, TNFRSF15, TNFSF16, TNFRSF16, TNFSF17, TNFRSF17, TNFSF18, TNFRSF18, TNFSF19, TNFRSF19, TNFSF20 i TNFRSF20.