JP4660092B2

JP4660092B2 - 組換えポリペプチド

Info

Publication number: JP4660092B2
Application number: JP2003560159A
Authority: JP
Inventors: レデイー，プラニーサ
Original assignee: イミユネツクス・コーポレイシヨン
Priority date: 2001-12-21
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2011-03-30
Anticipated expiration: 2022-12-20
Also published as: JP2005514061A; US20030119149A1; PL374266A1; ATE399180T1; ES2309224T3; AU2002359780B2; US7238499B2; EP1463755A2; PL208287B1; CA2470564C; AU2002359780A1; WO2003060072A3; WO2003060072A2; EP1463755B1; DE60227285D1; CA2470564A1; MXPA04005909A; EP1463755A4

Description

本発明は異種ポリペプチドに三量体を誘導することが可能な低免疫原性ポリペプチドドメイン、前記三量体誘導ドメインを含む融合ポリペプチド、本発明のポリペプチドをコードする核酸、並びにその製造及び使用方法等に関する。

ポリペプチドの構造はその活性の要因である。多くの場合、正しく折り畳まれたポリペプチドが活性化するためには自己会合するか又は他のポリペプチドと会合する必要がある。これらの相互作用はホモ二量体として活性な会合体を形成することが最も多いが、ヘテロ三量体を形成する場合もある。既定三量体化モチーフは一般にコイルドコイルドメイン（Ｂｕｒｋｈａｒｄら，２００１，ＴｒｅｎｄｓｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１１：８２）であり、例えばＳＰ−Ｄ三量体化ドメインが挙げられる（米国特許第５，７１６，８０５号及び６，１９０，８８６号）。

特徴的コイルドコイルモチーフをもたないが、最適活性に三量体化を必要とすることが知られている他の分子としては特にＴＮＦ−α、リンホトキシンα、及びＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）等の腫瘍壊死因子スーパーファミリーが挙げられる。多くのＴＮＦスーパーファミリーポリペプチドは三量体化されないと低活性又は不活性である（Ｆａｎｓｌｏｗら，（１９９４）ＳｅｍｉｎａｒｓＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６：２６７−２７８）。ＣＤ４０は腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの膜貫通ポリペプチドメンバーであり、体液性及び細胞性免疫細胞の増殖と分化の刺激に関与している。特に、ＣＤ４０はアイソタイプ変換に関与しており、蛋白質抗原に応答するＴ細胞活性化と１型サイトカインの産生に重要である（Ｎｏｅｌｌｅ，Ｒ，（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４：４１５；及びＢｏｒｒｏｗら，（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３：２１２９）。

ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）は一般に膜結合形態で活性であるが、この形態は治療薬として投与しにくいことが分かっている。ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）の可溶形は刺激活性が極めて少ないが、突然変異ＧＣＮ４ロイシンジッパードメインを使用して可溶性ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）を三量体化することによりターゲット細胞の有意活性化が達成されることが判明した（Ｆａｎｓｌｏｗら，（１９９４）ＳｅｍｉｎａｒｓＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６：２６７−２７８；Ｍｏｒｒｉｓら，（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：４１８−４２３；米国特許第５，７１６，８０５号）。

突然変異ロイシンジッパー三量体化ドメインを治療用融合ポリペプチドで使用する際に付随する大きな問題は、ロイシンジッパーが一般に核蛋白質であり、即ち細胞内蛋白質であるという点である。即ち、対象と同一種のポリペプチドで治療する場合であっても、免疫系により検出されていないのでポリペプチドは細胞外発現されると外来種として認識され、対象に免疫応答を引き起こす可能性がある。この応答は融合ポリペプチドを患者に連続又は長期投与する場合に特に有害である。本発明は三量体化能をもつと共に免疫原性の低いポリペプチドドメインを提供することによりこの問題に対処する。

本発明は異種ポリペプチドと融合した場合に三量体化を誘導することが可能なポリペプチド、三量体化ドメインを含む融合ポリペプチド、本発明のポリペプチドをコードする核酸、並びにその製造及び使用方法等に関する。より詳細には、本発明は三量体を形成することが可能な第１のポリペプチドと所望生物活性をもつ第２の異種ポリペプチドを融合した融合ポリペプチドに関する。三量体を形成することが可能な第１のポリペプチドと第１のポリペプチドに対して異種の第２のポリペプチドと融合する結果、第２のポリペプチドの生物活性が第２のポリペプチドの単量体の活性と比較して増加することも意図される。

１側面において、本発明は配列番号１０に示すポリペプチドのアミノ酸ｘ〜ｙ（但し、ｘは１１０〜１５４であり、ｙは２０１〜２７０である）から構成される第１のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは第２の異種ポリペプチドと融合していて、および三量体を形成することが可能である融合ポリペプチドに関する。

別の側面において、本発明は配列番号１０に示すポリペプチドのアミノ酸ｘ〜ｙ（但し、ｘは１１０〜１７３であり、ｙは１７９〜２７０である）から構成される第１のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは異種ポリペプチドと融合していて、および三量体を形成することが可能である融合ポリペプチドに関する。

別の側面において、本発明は配列番号１０に示すポリペプチドのアミノ酸ｘ〜ｙ（但し、ｘは１１０〜１５４であり、ｙは２０１〜２７０である）から構成される第１のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、少なくとも１カ所にアミノ酸置換を含み、配列番号１０に示すポリペプチドと少なくとも８０％一致し、第１のポリペプチドは第２の異種ポリペプチドと融合していて、三量体化能を維持する融合ポリペプチドに関する。

別の側面において、本発明は配列番号１０に示すポリペプチドのアミノ酸ｘ〜ｙ（但し、ｘは１１０〜１７３であり、ｙは１７９〜２７０である）から構成される第１のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、少なくとも１カ所にアミノ酸置換を含み、配列番号１０に示すポリペプチドと少なくとも８０％一致しており、および三量体化能を維持し、第１のポリペプチドは第２の異種ポリペプチドと融合しているポリペプチドドメインに関する。

更に別の側面において、本発明は配列番号１０に示すポリペプチドのアミノ酸１５４〜２０３を含む融合ポリペプチド又は配列番号１０に示すポリペプチドのアミノ酸１２０〜１８０を含む融合ポリペプチドに関する。

本発明は更に上記及び本明細書全体に記載する三量体を形成することが可能なポリペプチドは少なくとも３個の７塩基反復配列を有することを意図する。しかし、当然のことながら三量体化ポリペプチドは当業者の所望に応じて４、５、６、７又は８個以上の７塩基反復配列を有することができる。

更に別の側面において、本発明は本発明のポリペプチドをコードする核酸に関する。本発明の核酸を含む組換えベクターの作製方法も本発明の範囲に含まれる。更に別の側面において、本発明の核酸分子によりコードされるポリペプチドはその投与対象に非免疫原性である。

更に、本発明の核酸を宿主細胞にトランスフェクトして、組換えポリペプチドを生産することを意図する。別の側面において、本発明は本発明の核酸によりコードされるポリペプチドの製造方法として、ポリペプチドの発現に好適な条件下で本発明の核酸をトランスフェクトした宿主細胞を増殖させる段階と、場合により前記ポリペプチドを単離する段階を含む方法に関する。

更に別の側面において、本発明は組換え発現ベクターの構築方法として、配列番号９に示す核酸のヌクレオチドｘ〜ｙ（但し、ｘはヌクレオチド３３１〜４６０であり、ｙはヌクレオチド６０１〜８０８である）を含む第１の核酸と第１の核酸に対して異種のポリペプチドをコードする第２の核酸を発現ベクターの適合可能なクローニング部位に連結する段階と、その後、前記組換え発現ベクターを増幅及び単離する段階を含む方法に関する。

更に別の側面において、本発明は組換え発現ベクターの構築方法として、配列番号９に示す核酸のヌクレオチドｘ〜ｙ（但し、ｘはヌクレオチド３３１〜５０８であり、ｙはヌクレオチド５４６〜８０８である）を含む第１の核酸と第１の核酸に対して異種のポリペプチドをコードする第２の核酸を発現ベクターの適合可能なクローニング部位に連結する段階と、その後、前記組換え発現ベクターを増幅及び単離する段階を含む方法に関する。

本発明は異種ポリペプチドに三量体を誘導することが可能なポリペプチドドメイン、前記三量体誘導ドメインを含む融合ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする核酸、並びにその製造及び使用方法等に関する。

１態様において、本発明はコイルドコイル領域即ち三量体化ドメインに対応するマクロファージスカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ）ポリペプチドの細胞外ドメインの一部に関する。ＳＲ−Ａのコイルドコイル領域は三量体化能をもつ（Ｆｒａｎｋら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：１１６７２−１１６７７）。従って、このドメインは異種ポリペプチドと融合した非免疫原性又は低免疫原性の三量体化ドメインを提供するために本発明で有用である。

即ち、１態様において本発明は配列番号１０に示すポリペプチドのアミノ酸ｘ〜ｙ（但し、ｘは１１０〜１５４であり、ｙは２０１〜２７０である）から構成される第１のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは第２の異種ポリペプチドと融合している融合ポリペプチドに関する。別の態様において、本発明は配列番号１０に示すポリペプチドのアミノ酸ｘ〜ｙ（但し、ｘは１１０〜１７３であり、ｙは１７９〜２７０である）から構成されるＳＲ−Ａポリペプチドの一部を含み、ＳＲ−Ａポリペプチドの一部は第２の異種ポリペプチドと融合している融合ポリペプチドに関する。

特定態様において、本発明は第２の異種ポリペプチドと融合した配列番号１０に示すポリペプチドのアミノ酸１５４〜２０３を含む融合ポリペプチドに関する。別の特定態様において、本発明は第２の異種ポリペプチドと融合した配列番号１０に示すポリペプチドのアミノ酸１２０〜１８０を含む融合ポリペプチドに関する。

別の態様において、本発明は配列番号１０に示すポリペプチドのアミノ酸ｘ〜ｙ（但し、ｘは１１０〜１５４であり、ｙは２０１〜２７０である）から構成される第１のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、少なくとも１カ所にアミノ酸置換を含み、配列番号１０に示すポリペプチドと少なくとも８０％一致しており、および三量体化能を維持し、ならびに第１のポリペプチドは第２の異種ポリペプチドと融合している融合ポリペプチドに関する。更に別の態様において、本発明は配列番号１０に示すポリペプチドのアミノ酸ｘ〜ｙ（但し、ｘは１１０〜１７３であり、ｙは１７９〜２７０である）から構成される第１のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、少なくとも１カ所にアミノ酸置換を含み、配列番号１０に示すポリペプチドと少なくとも８０％一致しており、および三量体化能を維持し、ならびに第１のポリペプチドは第２の異種ポリペプチドと融合している融合ポリペプチドに関する。

別の態様において、本発明は配列番号１０に示すポリペプチドのアミノ酸１５４〜２０３から構成される第１のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、少なくとも１カ所にアミノ酸置換を含み、配列番号１０に示すポリペプチドと少なくとも８０％一致しており、および三量体化能を維持し、ならびに第１のポリペプチドは第２の異種ポリペプチドと融合している融合ポリペプチドに関する。更に別の態様において、本発明は第２の異種ポリペプチドと融合した配列番号１０に示すポリペプチドのアミノ酸１５４〜２０３から構成される第１のポリペプチドを含む融合ポリペプチドに関する。

上記態様において、第２の異種ポリペプチドは所望生物活性をもつことが好ましい。生物活性とは当業者に自明の通り、リガンドと受容体の結合、受容体とリガンドの結合、免疫グロブリン様ポリペプチドとそのコグネイト抗原の結合親和性等として定義することができる。更に、生物活性は酵素活性でもよい。

１態様において、本発明の融合ポリペプチドは低免疫原性であり、より好ましい態様では、融合ポリペプチドは非免疫原性である。

１側面では、多様な種のマクロファージスカベンジャー受容体を融合ポリペプチドの三量体化モチーフとして使用することができ、特に、本発明の教示に従ってウシ（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｘ５４１８３）、マウス（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｌ０４２７５）、ヒト（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＸＭ００５０２１）及び／又はサルスカベンジャー受容体ポリペプチドを使用できると考えられる。当然のことながら、上記の例に限定されず、他の種のマクロファージスカベンジャー受容体も本発明の範囲に含まれる。

本発明に関連するコンセンサスコイルドコイルポリペプチド配列はＢｕｒｋｈａｒｄら（２００１，ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１１：８２）に記載されている塩基パターンに従う。７塩基反復配列におけるアミノ酸の位置は一般にアルファベットにより「ａ．ｂ．ｃ．ｄ．ｅ．ｆ．ｇ」で示される。位置ａ及びｄは非極性残基であり、これらの位置の特定アミノ酸に強い選択性がある。当業者に自明の通り、非極性残基としてはアラニン、イソロイシン、グリシン、プロリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン及びチロシンが挙げられる。これらの位置の各々の特定残基はコイルドコイル即ち二量体と三量体の二次構造と三次構造の性質を決定することができる。実際に、位置ａ及びｄの残基の突然変異により二量体ロイシンジッパーを三量体イソロイシンジッパーに設計し直すために標的突然変異が実施されている（米国特許第５，７１６，８０５号）。

本発明に有用なコイルドコイルポリペプチドを同定し易くするためにはコンピュータープログラムを利用することができる。例えば、配列一致度に基づいて特定ドメインを同定するためにＦＯＬＤＥＲが使用されており（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら，（１９９３）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．，２：２７７−２８９）、本発明で使用するコイルドメインを同定又は修飾するために使用することができる。ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）コイルドコイルドメイン内の数個の異なる７塩基反復配列の三量体化傾向を試験及び予測するためにフォルダープログラムを使用してＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）のアミノ酸を分析した。更に、多重コイルプログラム（Ｈａｒｂｕｒｙら，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２：１４０１）を使用して配列即ちヒト、マウス及びウシポリペプチド等のスカベンジャー受容体配列がコイルドコイルであることを確認することができる。このプログラムは天然配列を突然変異させて例えば三量体化を増加及び／又は免疫原性を低下するなどポリペプチドの性質を改変する場合に特に有用である。このように突然変異三量体化ポリペプチドをコンピュータープログラムにより分析し、必要な特性を維持しているか否かを調べることができる。

１態様において、本発明の三量体化ポリペプチドは例えば配列番号１０に示すポリペプチド等の天然三量体化ポリペプチドと少なくとも８０％（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、又は少なくとも９９％、及び／又は少なくとも９９．５％）の配列一致度をもち、前記配列一致度は配列ギャップを最小にしながらオーバーラップと一致度を最大にするように整列した場合のポリペプチドのアミノ酸を比較することにより決定する。２種のアミノ酸又は２種の核酸の一致度百分率は目視と算術計算により決定することができるが、コンピュータープログラムを使用して配列情報を比較するとより好ましい。好適コンピュータープログラムの１例はＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージバージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，（１９８４）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：３８７）である。「ＧＡＰ」プログラムの好適デフォルトパラメーターとしては（１）ヌクレオチドの一元比較マトリックス（一致に１と不一致に０の値を含む）、及びＳｃｈｗａｒｔｚとＤａｙｈｏｆｆ編，（１９７９）ＡｔｌａｓｏｆＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８により記載されているようなＧｒｉｂｓｋｏｖとＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４：６７４５，（１９８６）の加重アミノ酸比較マトリックス、又は他の同等の比較マトリックスのＧＣＧ実行、（２）アミノ酸配列の各ギャップのペナルティ３０と各ギャップにおける各記号の付加ペナルティ１、又はヌクレオチド配列の各ギャップのペナルティ５０と各ギャップにおける各記号の付加ペナルティ３、（３）末端ギャップのペナルティなし、並びに（４）長いギャップの最大ペナルティなしが挙げられる。

１態様において、本発明の三量体化ポリペプチドは配列番号１０に示すポリペプチドのアミノ酸ｘ〜ｙ（但し、ｘは１１０〜１５４であり、ｙは２０１〜２７０である）に対して少なくとも８０％の一致度をもつ配列を含む。別の態様において、本発明の三量体化ポリペプチドは配列番号１０に示すポリペプチドのアミノ酸ｘ〜ｙ（但し、ｘは１１０〜１７３であり、ｙは１７９〜２７０である）に対して少なくとも８０％の一致度をもつ配列を含む。

例えばＮａｔｉｏｎａｌＬｉｂｒａｒｙｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅウェブサイトｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉから入手可能なＢＬＡＳＴＮプログラムバージョン２．０．９又はＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム等の当業者により使用される他の配列比較プログラムも使用することができる。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０の標準デフォルトパラメーター設定はインターネットサイトｓａｐｉｅｎｓ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ／＃Ｆｅａｔｕｒｅｓに記載されている。更に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコアリングマトリックスを使用し、場合により使用可能なパラメーターとしては、（Ａ）組成複雑度の低いクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎとＦｅｄｅｒｈｅｎ（ＣｏｍｐｕｔｅｒｓａｎｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＳＥＧプログラムにより決定；ＷｏｏｔｔｏｎｓとＦｅｄｅｒｈｅｎ，１９９６，Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙｂｉａｓｅｄｒｅｇｉｏｎｓｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｔａｂａｓｅｓ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２６６：５５４−７１も参照）又は短周期性内部反復配列から構成されるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅとＳｔａｔｅｓ（ＣｏｍｐｕｔｅｒｓａｎｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定）をマスクするためのフィルターの挿入と、（Ｂ）データベース配列に対する一致を報告するための統計的有意閾値、又はＥスコア（ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）の確率論的モデルにより偶然にしか検出されない一致の予想確率；一致に割り当てられる統計的有意がこのＥスコア閾値よりも大きい場合には、一致は報告されない）が挙げられ、好適Ｅスコア閾値は０．５であるか、あるいは優先度の低いほうから高いほうへと順に０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、又は１ｅ−１００である。

三量体化ドメインはアミノ末端、カルボキシル末端及び／又はその両者で異種ポリペプチドと融合することができる。更に、三量体化ドメインは異種ポリペプチドの内側に配置してもよい。三量体化ドメインと異種ポリペプチドの融合位置に関係なく、当然のことながら三量体化ドメインは三量体（ホモ三量体及び／又はヘテロ三量体）を誘導する能力を維持し、異種ポリペプチドもその生物活性を維持する。

本明細書で使用する「融合ポリペプチド」なる用語は同一読み枠で２種もしくは３種以上の異種ポリペプチドをコードする単一核酸分子から発現される連続ポリペプチド又は天然には存在しない順序に配置されたポリペプチドのドメインを意味する。本発明のポリペプチド以外に融合ポリペプチドの他の例としては膜貫通ポリペプチドの可溶性細胞外ドメイン（例えばＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５））と融合した抗体のＦｃドメイン又はロイシンジッパードメインが挙げられる。ＷＯ９３／０８２０７及びＷＯ９６／４０９１８は夫々免疫グロブリン融合ポリペプチドと突然変異ロイシンジッパー融合ポリペプチドを含むＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）のオリゴマー可溶性形態の作製について記載しており、同明細書に記載されている産物の構築及びアッセイ方法も本発明の組成物に適用可能である。三量体化ドメインと異種ポリペプチドの融合はエピトープタグ又は構造形成を助長するフレキシブルリンカー等のリンカーを介して行うこともできる。

当然のことながら、所望生物活性をもつポリペプチドの任意部分を本発明の多量化ポリペプチドとの融合体として発現させることができる。例としては限定されないが、膜貫通ポリペプチドや、酵素、ホルモン及びサイトカイン等の非膜貫通ポリペプチドが挙げられる。特に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ３、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ３、Ｍ−ＣＳＦ、及びヘマトポエチン受容体ファミリーメンバーの融合ポリペプチドが考えられる（Ｃｏｓｍａｎら，（１９９０）ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１５：２６５）。ホモ及びヘテロオリゴマーも予想される。

三量体化することができる異種ポリペプチドの例としては限定されないが、以下の腫瘍壊死因子スーパーファミリーが挙げられる。各対は先にリガンドを記載し、後に対応する受容体を記載し、１種のリガンドが２種以上の受容体をもつ場合もある。ＴＮＦファミリーメンバーの記号の命名法はＬｏｃｋｓｌｅｙら（２００１，Ｃｅｌｌ，１０４：４８７：５０１）に記載されており、リガンドを腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）、受容体を腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）により番号順に示す。

先にＴＮＦファミリーメンバーリガンド又は受容体の記号を記載し、次にＧｅｎｂａｎｋアクセション番号を二重括弧に示した後に適用可能なファミリーメンバーの種々の一般名を記載する。ＴＮＦＳＦ１（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｘ０１３９３），ＴＮＦＢ，リンホトキシン（ＬＴ）−α）とその受容体腫瘍壊死因子受容体ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｍ７５８６６），ＴＮＦ−Ｒ）；ＴＮＦＳＦ２（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｘ０２９１０）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ））とその受容体ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｍ３２３１５）ＴＮＦ−Ｒ）；ＴＮＦＳＦ３（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｌ１１０１６）ＬＴ−β）とその受容体ＴＮＦＲＳＦ３（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｌ０４２７０）ＬＴＢＲ，ＴＮＦＲ２−ＲＰ，ＣＤ１８，ＴＮＦＲ−ＲＰ，ＴＮＦＣＲ，ＴＮＦ−Ｒ−ＩＩＩ）；ＴＮＦＳＦ４（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｄ９０２２４）ＯＸ−４０Ｌ）とその受容体ＴＮＦＲＳＦ４（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｘ７５９６２）ＯＸ４０）；ＴＮＦＳＦ５（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｘ６７８７８）ＣＤ４０Ｌ）とその受容体ＴＮＦＲＳＦ５（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｘ６０５９２）ＣＤ４０）；ＴＮＦＳＦ６（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｕ１１８２１）ＦａｓＬ）とその受容体ＴＮＦＲＳＦ６（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｍ６７４５４）ＦＡＳ，ＣＤ９５）及びＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ１０４４１９）ＤｃＲ３）；ＴＮＦＳＦ７（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｌ０８０９６）ＣＤ７０，ＣＤ２７Ｌ）とその受容体ＴＮＦＲＳＦ７（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｍ６３９２８）ＣＤ２７）；ＴＮＦＳＦ８（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｌ０９７５３）ＣＤ３０ＬＧ）とその受容体ＴＮＦＲＳＦ８（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｍ８３５５４）ＣＤ３０）；ＴＮＦＳＦ９（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｕ０３３９８）４−１ＢＢ−Ｌ）とその受容体ＴＮＦＲＳＦ９（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｌ１２９６４）４−１ＢＢ）；ＴＮＦＳＦ１０（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｕ３７５１８）ＴＲＡＩＬ）とその受容体ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｕ９０８７５）ＤＲ４）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ０１２６２８）ＤＲ５，ＫＩＬＬＥＲ，ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ０１２５３６）ＤｃＲｌ，ＴＲＡＩＬＲ３）、及びＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ０２９７６１）ＤｃＲ２，ＴＲＡＩＬＲ４）；ＴＮＦＳＦ１１（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ０１３１７１）ＲＡＮＫＬ，ＯＰＧＬ）とその受容体ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ０１８２５３ＲＡＮＫ）及びＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｕ９４３３２）ＯＰＧ）；ＴＮＦＳＦ１２（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ０３００９９）ＴＷＥＡＫ）とその受容体ＴＮＦＲＳＦ１２（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｕ７２７６３）ＤＲ３，ＴＲＡＭＰ）及びＴＮＦＲＳＦ１２Ｌ（ＤＲ３Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１３（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ００３８０８）ＡＰＲＩＬ）とその受容体ＴＮＦＲＳＦ１３及びＴＮＦＳＦ１３Ｂ（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ１３６２９３）ＴＨＡＮＫ，ＢＬＹＳ）；ＴＮＦＳＦ１４（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ０３６５８１）ＬＩＧＨＴ，ＬＴ−γ，ＨＶＥＭ−Ｌ）とその受容体ＴＮＦＲＳＦ１４（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｕ７０３２１）ＨＶＥＭ，ＡＴＡＲ，ＴＲ２，ＬＩＧＨＴＲ，ＨＶＥＡ）；ＴＮＦＳＦ１５（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ０３９３９０）ＴＬ１，ＶＥＧＩ）とその受容体ＴＮＦＲＳＦ１５；ＴＮＦＳＦ１６とその受容体ＴＮＦＲＳＦ１６（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｍ１４７６４）神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ），ｐ７５ＮＴＲ）；ＴＮＦＳＦ１７とその受容体ＴＮＦＲＳＦ１７（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｚ２９５７４）ＢＣＭＡ）；ＴＮＦＳＦ１８（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ１２５３０３）ＡＩＴＲＬＴＬ６ｈＧＩＴＲＬ）とその受容体ＴＮＦＲＳＦ１８（（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ１２５３０４）ＡＩＴＲ，ＧＩＴＲ）；ＴＮＦＳＦ１９とその受容体ＴＮＦＲＳＦ１９（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＦ１７３１６６）；ＴＮＦＳＦ２０とその受容体ＴＮＦＲＳＦ２０（Ｌｏｃｋｓｌｅｙら，２００１，Ｃｅｌｌ，１０４：４８７：５０１）。１特定態様では、本発明の方法及び組成物により異種ポリペプチドとして使用することができるポリペプチドはＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）である。

精製を容易にするために更なるポリペプチドを融合ポリペプチドと融合させることもでき、例えばアミノ末端、カルボキシル末端又は内部にエピトープタグを配置することができる。周知エピトープタグとしては例えば特にヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ及びＧＳＴが挙げられる。更に、エピトープタグを開裂して融合ポリペプチドから除去できるようにタグとポリペプチドの残余の間に蛋白分解開裂部位を挿入するようにエピトープタグを遺伝子操作することも考えられる。ポリペプチドでユニークアミノ酸を認識することが知られている蛋白分解酵素の例としてはＸａ因子やスロンビンが挙げられ、市販されている。

本発明は、非多量化ポリペプチドに比較して活性を増加するような本発明の融合ポリペプチドの高次多量体を意図する。本明細書で使用する「多量体」又は「多量体化ポリペプチド」としては二量体、三量体、四量体、三量体の二量体、三量体の三量体、四量体の二量体、四量体の三量体等を挙げることができる。付加多量化ドメインの例としてはロイシンジッパー又はＦｃドメインを挙げることができる。従って、二量体化ドメイン（例えばＦｃドメイン）と三量体化ドメイン（例えばスカベンジャー受容体α三量体化ドメイン）を含むポリペプチドは６個のポリペプチドが会合するように三量体の二量体を誘導することができる。更に、これらの多量体は単量体又は低次多量体よりも高い生物活性をもち得ると考えられる。例えば、三量体は二量体よりも高い活性をもつと考えられる。

「低免疫原性」又は「非免疫原性」なる用語は本発明のポリペプチド等の治療薬がこれを投与した対象、好ましくはヒトに明白な免疫応答を誘導できないことを意味するものとする。明白な免疫応答とは当業者が本発明のポリペプチドにより誘導されたとみなすような測定可能な免疫応答である。この定義はアッセイで使用される試薬の差による通常の変動、試料の変動、又は試験手順に不備がある場合の変動を除外する。免疫応答は任意種の標準技術により測定することができ、例えば周知方法としては特に酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して治療薬に応答して産生された抗体を検出したり、ポリペプチドの投与後の適当な期間にわたり対象によるサイトカイン産生を測定したり、及び／又は特定免疫細胞型の増殖を測定する方法等が挙げられる。

治療用ポリペプチドの免疫原性を低下又は除去する方法の１例は治療する種と同一種に由来するポリペプチドを使用することである。例えば、ポリペプチドをヒトに投与しようとする場合には、ポリペプチドはヒトに由来するものを使用すべきである。この例でヒトポリペプチドを入手できない場合には、免疫原性を低下するようにポリペプチドをヒト化することができる。マウス抗体配列をヒト化するには、投与時に抗体が強いヒト抗マウス応答を誘導しないようにヒトポリペプチド配列に対応するように個々のアミノ酸を突然変異させる、ポリペプチドのヒト化も抗体のヒト化と同様に実施することができる。

上記ポリペプチドをコードする核酸も本発明の範囲に含まれる。これらの核酸は周知技術によりクローニング及び突然変異させることができ、通常通りにプラスミド又は他のベクターで増殖させる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ）。ベクターは更に原核及び／又は真核細胞での複製、真核染色体への構築物組込みを助長するための付加成分、構築物を含む細胞の選択及び／又はスクリーニングを助長するためのマーカーを加えることができる。本発明のベクターは組換えＤＮＡベクターであり、限定されないが、例えば異種ポリヌクレオチドを細胞に挿入するために使用されるプラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、レトロウイルス等が挙げられる。

本明細書で使用する「連結」なる用語は例えばクローニングにおけるヌクレオチド相互のライゲーション等のアフィニティー相互作用及び／又は共有結合、化学架橋、又は他の何らかの同様の連結法により２個の分子を相互に近接させることを意味する。ヌクレオチドはゲノム、ｃＤＮＡ又はベクター源から取得し、特に慣用消化とクローニングでのライゲーション、又はＰＣＲ中の所望配列部分の増幅により異種核酸に連結することができる。

１態様では、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸分子は異種制御因子と機能的に連結されている。核酸は別の核酸と機能的関係に配置されているときに「機能的に連結」されている。機能的に連結とは異なるポリペプチドをコードする２個の異なる核酸分子が同時に転写を誘導されることを意味する場合もある。機能的に連結された核酸の場合には、単一転写単位で連続していてもよいが、翻訳は１以上のリボソーム開始部位から開始する。更に、機能的に連続とは単一連続ポリペプチド即ち融合ポリペプチドをコードするように２個のポリペプチドコーディング領域をインフレーム結合することを意味する場合もある。

エンハンサー又はサイレンサーは核酸の転写を増加又は減少させるように核酸に対して配置されている場合に核酸に機能的に連結されている。エンハンサーとサイレンサーは核酸のコーディング領域の上流、下流又はその内部のいずれに配置してもよい。

発現ベクターは本発明の融合ポリペプチドを原核（例えば大腸菌）又は真核細胞（例えば昆虫細胞（パキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞）で発現させることができる。適切な宿主細胞としては原核、真核及び植物細胞が挙げられ、Ｇｏｅｄｄｅｌ，（１９９０）ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡに詳細に記載されている。原核細胞における蛋白質の発現は蛋白質発現を誘導する構成的又は誘導的プロモーターを含むベクターを使用して大腸菌で実施することが最も多い。適切な誘導型大腸菌発現ベクターの例としてはｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら，（１９８８）Ｇｅｎｅ６９：３０１−３１５）とｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら，（１９９０）ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ６０−８９）が挙げられる。

別の態様では、発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現用ベクターの例としてはｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉら，（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，（１９８２）Ｃｅｌｌ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９８７）Ｇｅｎｅ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）、及びｐＰｉｃＺ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。あるいは、発現ベクターは例えばｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）等のバキュロウイルス発現ベクターである。別の態様では、本発明の核酸は哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞で発現される。哺乳動物発現ベクターの例は多く、限定されないが、例えばｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２９：８４０）やｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら，（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：１８７−１９５）が挙げられる。

特定細胞型で優先的に核酸の発現を誘導できるように組換え哺乳動物発現ベクターを設計することもできる（例えば組織特異的調節因子を使用して核酸を発現させる）。組織特異的調節因子は当分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの例としては限定されないが、アルブミンプロモーター（肝特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら，（１９８７）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅとＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（ＷｉｎｏｔｏとＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯＪ．８：７２９−７３３）、免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎとＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ３３：７４１−７４８）、及び乳腺特異的プロモーター（例えば乳漿プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号及びヨーロッパ出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。

本発明の別の側面は本発明の組換え発現ベクターを導入した宿主細胞に関する。「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」なる用語は本明細書では同義に使用する。当然のことながらこれらの用語は特定対象細胞のみならず、このような細胞の子孫又は潜在的子孫も意味する。突然変異又は環境の影響により後続世代に所定変異が生じる場合もあるので、このような子孫は実際には親細胞と一致しない場合もあるが、本明細書で使用する用語の範囲に含むものとする。宿主細胞は任意原核（例えば大腸菌）、真核細胞（例えば昆虫細胞、酵母又は哺乳動物細胞）又は植物細胞とすることができる。

本発明で使用する細胞は本発明の融合ポリペプチドを発現するように遺伝子操作することができる。遺伝子操作とは、細胞に組換えポリヌクレオチド分子をトランスフェクト、形質転換もしくは形質導入するか、及び／又は（例えば相同組換えや遺伝子活性化により）他の方法で改変して細胞に融合ポリペプチドを発現させるようにすることを意味する。細胞及び／又は細胞株を遺伝子操作するための方法とベクターは当業者に周知であり、例えばＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編（Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９８８）と定期更新版）やＳａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）に種々の技術が例示されている。

更に、本発明の融合ポリペプチドは例えばマウス、ヤギ又はウシ等のトランスジェニック動物で発現させることを意図する。ウシの場合には、動物乳汁に分泌されるように融合ポリペプチドを発現させることができる。トランスジェニック動物は本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸を受精卵母細胞又は胚幹細胞に導入することにより作出することができる。その後、このような宿主細胞を使用して非ヒトトランスジェニック動物を作出することができる。

ベクターＤＮＡは慣用形質転換又はトランスフェクション技術により細胞に導入することができる。本明細書で使用する「形質転換」及び「トランスフェクション」なる用語は外来核酸を宿主細胞に導入するために当分野で認められている種々の技術を意味するものであり、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、リポフェクション、又はエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞の形質転換又はトランスフェクションに適切な方法はＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）や他の実験マニュアルに記載されている。哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションには、使用する発現ベクターとトランスフェクション技術に応じて、細胞の小フラクションだけにＤＮＡをトランスフェクトしてそのゲノムに組込めることが知られている。これらの組込みを特定及び選択するためには、一般に目的遺伝子と共に選択マーカー（例えば抗生物質耐性）をコードする遺伝子を宿主細胞に導入する。好適選択マーカーとしてはＧ４１８、ハイグロマイシン及びメトトレキセート等の薬剤に対する耐性を付与するマーカーが挙げられる。導入した核酸を安定にトランスフェクトした細胞は薬剤選択により特定することができる。

別の態様では、本発明の三量体化ポリペプチドとリガンドである第２の異種ポリペプチドとの融合は、リガンドの受容体を介するシグナル伝達の強化をもたらす。制限する意図はないが、この増加のメカニズムは受容体の生物活性が増加するように受容体の結合と活性化が増加することに起因すると考えられる。例えば多量体化ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）は、細胞集団に投与すると、未処理細胞に比較して免疫細胞増殖が増加し（下記実施例参照）、また非多量体化ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）で処理した細胞に比較しても増加することが判明した。すなわち、本発明によると、可溶性ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）を本発明の三量体化ポリペプチドドメインと融合させると、三量体化していない可溶性ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）に比較して活性が増加する。

「強化」又は「増加」なる用語は未処理対照に対して測定した場合の生物活性の測定可能ななんらかの上昇を意味する。増加は対照の活性の１０％、２０％、３０％、４０％又はそれ以上であり得、１００％以上でもあり得る。増加を測定するためのアッセイの例としては限定されないが、サイトカイン放出、表面分子発現の誘導、細胞増殖の増減、アポトーシス細胞死の増減、及び生化学的活性化（例えばリン酸化パターン）の評価が挙げられる。特定例では、三量体化ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）を細胞に加えると、ＩＬ−４により誘導されるＩｇＥ分泌又は混合リンパ球培養におけるＣＤ２３の発現増加を阻害することができる。本発明の特定態様では、本発明の三量体の多量体は非多量体化三量体の活性よりも高い活性をもつ。

更に別の態様では、三量体化ドメイン等の多量体化ポリペプチドを受容体である第２の異種ポリペプチドと融合させると、対応する天然受容体へのシグナル伝達を低下させることができる。制限する意図はないが、この低下のメカニズムは可溶性ポリペプチドと受容体のリガンドの競合的結合に起因し、この結合によりリガンドが受容体を活性化できなくなると考えられる。例えば二量体であるＴＮＦＲ：Ｆｃ（即ちエタナーセプト）を投与すると、症状の緩和等により測定した場合に未処理細胞に比較してＴＮＦ−α受容体へのシグナル伝達が低下する（Ｓｐｅｎｃｅｒ−Ｇｒｅｅｎ，２０００，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．，５９Ｓｕｐｐｌ１，ｐｐ．４６−９）。このように、本発明のＴＮＦＲの多量体はＴＮＦ−αにより媒介される炎症を抑制することができる。

「低下」なる用語は未処理対照に対して測定した場合の生物活性の測定可能ななんらかの減少を意味する。より具体的に言うと、減少は１０％、２０％又はそれ以上であり得、１００％までの減少を含む。この低下を測定するためのアッセイの例としては限定されないが、サイトカイン放出の増減、表面分子発現の誘導、細胞増殖の増減、アポトーシス細胞死の増減、及び生化学的活性化（例えばリン酸化パターン）が挙げられる。

融合ポリペプチドの活性は結合パートナー（例えば受容体又はリガンド）に対するその親和性によっても測定される。三量体化分子の夫々の結合パートナーに対する親和性はバイオセンサー即ち生体認識メカニズムを感知装置又はトランスデューサーと組合せた計器である生体特異的相互作用分析（ＢＩＡ）を使用して測定することができる。バイオセンサーの１例はＢＩＯｃｏｒｅ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。これは光学現象である表面プラズモン共鳴を使用して２個の生体分子間の相互作用を監視するものである。この方法には１０^５〜１０^１０Ｍ^−１の範囲の親和性定数と１０^３〜１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の範囲の会合速度定数をもつ分子対が適している。

三量体（又はより高次の多量体）は二量体又は単量体よりもその結合パートナーに対して多くの結合部位をもつので、本発明の多量化ポリペプチドは単量体又は二量体（又はより低次の多量体）よりも結合パートナーに対するアビディティーも高いと考えられる。このようにアビディティーが高いと、多量体とその結合パートナーの特異的結合が増加する。従って、１態様では、結合パートナーを発現する標的細胞へ高い効率で送達するために本発明のポリペプチドを異種治療用分子に連結することが意図される。連結することができる異種分子の例としては限定されないが、放射性部分（例えばＩ^１２５、Ｙ^９０）及び／又はポリペプチド毒素（例えばリシン、ボツリヌス毒素）が挙げられる。連結は当分野で周知の標準架橋技術により実施することができる。

医薬製剤と投与方法
本発明のポリペプチドは治療を必要とする患者に投与するのに適した化合物として処方することができる。このような化合物は免疫関連疾患の治療及び／又は正常免疫応答の刺激を増加するのに有用である。治療に有効な用量とは例えば免疫不全症又は炎症性症状もしくは疾患等の症状を緩和するために十分な化合物の量を意味する。更に、本発明のポリペプチドを別の治療剤と併用投与するする場合には、治療剤間に生じる可能性のある相互作用に応じて用量を変える。

有効用量
化合物の毒性と治療効力は例えばＬＤ５０（集団の５０％の致死用量）とＥＤ５０（集団の５０％で治療に有効な用量）を決定するための標準医薬手順により細胞培養又は実験動物で測定することができる。毒性作用と治療作用の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。治療指数の高い化合物が好ましい。

毒性副作用を示す化合物を使用してもよいが、未感染細胞への潜在的損傷を最小限にして副作用を減らすように疾患組織の部位にこのような化合物を標的送達する送達システムを設計するように注意する必要がある。

細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータを使用して種々のヒト用製剤を処方することができる。このような化合物の用量は毒性を殆ど又は全く生じることなしにＥＤ５０を含む循環濃度範囲内とすることが好ましい。用量は使用する剤形と使用する投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。本発明の方法で使用する任意化合物において、治療に有効な用量は細胞培養アッセイから初期概算することができる。患者に投与する前に細胞培養で測定したＩＣ５０（即ち症状の最大の５０％の阻害を達成する試験化合物の濃度）等の循環血漿濃度を達成するように動物モデルで用量を決定することができる。

別の治療薬を本発明のポリペプチドと併用投与する場合には（併用投与）、本発明のポリペプチドを第２の治療薬の前に投与してもよいし、同時でもよいし、後に投与してもよい。同時投与の場合には患者に投与する前に本発明のポリペプチドを第２の治療薬と混合するか、又は別々の輸液で患者に同時に投与する。第２の治療薬の用量は設定治療薬範囲に合致すべきであるが、本発明のポリペプチドと併用して単独の合計よりも治療薬の効力が増す場合には相乗作用があるとも考えられる。従って、相乗作用の場合には、当然のことながら効力の増加に照らして推奨範囲よりも用量を減らすことができる。

本発明の１態様では、本明細書に開示する種々の疾患を治療するために本発明のポリペプチドを週１回投与し、別の態様では少なくとも週２回投与し、別の態様では少なくとも週１回投与する。成人患者とは１８歳以上を言う。注射の場合、本発明のポリペプチドの成人用量当たりの有効量は約１〜５００ｍｇ／ｍ^２、又は約１〜２００ｍｇ／ｍ^２、又は約１〜４０ｍｇ／ｍ^２又は約５〜２５ｍｇ／ｍ^２である。あるいは、２〜５００ｍｇ／用量、２〜１００ｍｇ／用量又は約１０〜８０ｍｇ／用量の定用量を投与してもよい。週２回以上投与する場合には、用量範囲は上記範囲以下とする。本発明のポリペプチドは２５〜１００ｍｇ／用量の用量範囲で週２回以上投与することが好ましい。

本発明の１態様では、８０〜１００ｍｇ／用量、又は８０ｍｇ／用量の本発明のポリペプチドを含有する注射に許容可能な製剤を投与することにより以下に記載する種々の適応症を治療する。用量は週２回、週１回、又は数週間（例えば２〜８週間）置きに投与することができる。

注射以外の投与経路を使用して本発明のポリペプチドを投与する場合には、標準医療プラクティスに従って用量を適宜調節する。例えば、投与経路が吸入の場合には、１０ｍｇ／用量〜５０ｍｇ／用量の用量範囲で週１〜７回投与することができる。

多くの場合には、約１００ｍｇまでの用量の本発明のポリペプチドを週１〜３回少なくとも３カ月にわたって注射することにより患者の症状の改善が得られるが、所望程度の改善を誘導するために更に長期の治療が必要な場合もある。例えば遺伝病に起因する骨髄不全患者等の治癒し難い慢性症状には、投薬計画を無期限に連続する場合もある。

小児患者（４〜１７歳）の場合には、適切な投薬計画は本発明のポリペプチド０．４ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇを週１回以上皮下注射する。

処方と使用
本発明の組成物を使用するための医薬組成物は１種以上の生理的に許容可能なキャリヤー又は賦形剤を使用して常法で処方することができる。例えば、吸入（口又は鼻）、舌下、非経口又は直腸投与に適合するように化合物及びその生理的に許容可能な塩と溶媒を処方することができる。

舌下投与の場合には、組成物は常法で処方した錠剤又はトローチの形態とすることができる。

化合物は注射（例えばボーラス注射又は連続輸液）による非経口投与用に処方することができる。注射用製剤は防腐剤を加えた単位剤形（例えばアンプル又は多用量容器）とすることができる。組成物は坐剤、溶液剤又は油性もしくは水性基剤エマルション等の形態とすることができ、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤等の助剤を加えることができる。あるいは、活性成分を粉末形態とし、使用時に適当な基剤（例えば発熱性物質を含まない滅菌水）で再構成してもよい。

化合物は例えばカカオバターや他のグリセリド等の慣用座剤基剤を加えて座剤や保留浣腸剤等の直腸組成物に処方することもできる。

上記製剤に加え、化合物は注射用に処方することもできる。このような製剤は一般に凍結融解可能な水溶液として保存されるが、長期保存用に凍結乾燥サンプルとして製造してもよい。これらの製剤はヒト血液と等張の溶液即ち約１５０ｍＭの緩衝溶液とすることが多い。慣用緩衝液としてはリン酸ナトリウムと酢酸ナトリウムが挙げられ、ｐＨ範囲は１〜１４とすることができるが、一般には約４．５〜６である。これらの製剤は更にポリオール（例えばソルビトール、トレハロース、スクロース等）や界面活性剤（例えばポリソルベート、Ｔｗｅｅｎ８０等）を加えてもよく、溶液を等張にするのに塩化ナトリウムは不要である。

本発明のポリペプチドはデポー製剤として処方することもできる。このような持続型製剤は移植（例えば皮下又は筋肉内）又は筋肉内注射により投与することができる。例えば、化合物に適当なポリマー又は疎水性材料（例えば許容可能な油中エマルション）又はイオン交換樹脂を加えて処方してもよいし、やや溶けにくい誘導体（例えばやや溶けにくい塩）として処方してもよい。

組成物は所望によりパック又はディスペンサー装置の形態とし、活性成分を含む１種以上の単位剤形を収容してもよい。パックは例えば金属又はプラスチック箔（例えばサランラップ包装）から形成することができる。パック又はディスペンサー装置には投与説明書を添付することができる。

クローニング
１）Ｍｏｒｒｉｓら（１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：４１８−４２３）に記載されているように従来ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）１９４Ｗ欠失体に融合されている０．４ｋｂＸｂａＩ−ＮｏｔＩとしてのヒトＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）と、２）以下に記載するように作製したスカベンジャー受容体三量体化配列ＡｖｒＩＩ−ＸｂａＩフラグメントと、３）シグナル配列と転写プロモーターを含むｐＳＭＡＧ発現ベクターから構成される５．６ｋｂＳｐｅＩ−ＮｏｔＩフラグメントの３種の異なる核酸を連結することにより構築物を作製した。得られた核酸を配列番号５及び７に示す。

スカベンジャー受容体コーディング配列に由来する７個の７塩基反復配列から構成されるＡｖｒＩＩ−ＸｂａＩフラグメントは図１に示す２組の合成オリゴヌクレオチド（ＳＲオリゴ配列）のハイブリダイゼーションと連結により作製した。オリゴヌクレオチド配列は合成スカベンジャー受容体フラグメントの５’末端突出ＡｖｒＩＩ制限部位と３’末端突出ＸｂａＩ制限部位（相補的配列）を含むように設計した。ＸｂａＩ部位はＴＣＴＡＧＡであり、ＡｖｒＩＩ制限部位はＣ／ＣＴＡＧＧであり、ＳｐｅＩ制限部位はＡ／ＣＴＡＧＴである。ＳｐｅＩをＡｖｒＩＩに連結すると、夫々アミノ酸スレオニン及びアルギニン（１文字アミノ酸コードＴ及びＲ）をコードする配列ＡＣＴＡＧＧが得られる。

Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとＡＴＰを３７℃で１時間使用してオリゴ３３（配列番号２）及び３５（配列番号４）をリン酸化した。適当なオリゴヌクレオチド調製物を２個の別個の反応容器（エッペンドルフチューブ）にて２μｇ／ｍｌ濃度で混合し、各オリゴヌクレオチド対を９５℃まで２分間加熱した後に６５℃に３分間維持し、４５分間かけて室温（２５℃）まで徐冷することによりアニールした。オリゴ３２（配列番号３）を相補的オリゴ３５にアニールし、オリゴ３３を相補的オリゴ３４（配列番号１）にアニールした。２組の反応混合物を混合し、ＤＮＡリガーゼを使用して１時間連結した。分取用３％Ｎｕｓｉｅｖｅ（登録商標）アガロースゲル電気泳動を使用して連結反応を分析し、スカベンジャー受容体ＡｖｒＩＩ／ＸｂａＩフラグメントに対応する約１５０塩基対フラグメントを可視化し、ゲルから分離した。

ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）ＲＢＤを含むＸｂａＩ／ＮｏｔＩフラグメントとｐＳＭＡＧベクターとシグナル配列を含むＮｏｔＩ／ＳｐｅＩフラグメントに連結することにより、これらの核酸をＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の上流（即ちＮ末端側）にクローニングした。これらのスカベンジャー受容体核酸は可溶性ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）の三量体を三量体化／安定化するために従来使用されているムテインロイシンジッパーをコードする核酸の代わりに使用した。これらの構築物に使用した発現ベクターｐＳＭＡＧは転写プロモーターとＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）の分泌を可能にするためのＩＬ２シグナル配列又はヒト成長ホルモン（ＧＨ）シグナル配列を２含むものを使用した。

最終構築物の核酸を自動シーケンサーで分析した。ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）のＲＢＤの結合部のシグナル配列からの配列を取得し、連結が正しいことを確認した。図２Ａはアミノ酸１〜２４がＩＬ２シグナルペプチドであり、アミノ酸２５〜３９がリンカー配列であり、アミノ酸４０〜８８が三量体化ドメインであり、アミノ酸８９〜９５がリンカー配列であり、アミノ酸９６〜２４４がＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）１９４Ｗ欠失体配列である本発明の融合ポリペプチドを示し、図２Ｂはアミノ酸１〜２５がＧＨシグナルペプチドであり、アミノ酸２６〜２９がリンカー配列であり、アミノ酸３０〜７８が三量体化ドメインであり、アミノ酸７９〜８５がリンカー配列であり、アミノ酸８６〜２３４がＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）１９４Ｗ欠失体配列である本発明の融合ポリペプチドを示す。

発現
６ウェルトランスフェクション容器でプラスミドＤＮＡ２μｇ／ウェルをＣＯＳ細胞にトランスフェクトし、３日後に増殖／馴化培地を回収し、ポリクローナル抗ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）抗体を使用してＳＤＳＰＡＧＥウェスタンブロットで分析した。得られたウェスタンブロット（図３）から明らかなように、イソロイシンジッパーＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）（Ｍｏｒｒｉｓら，（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：４１８−４２３）と共に上記２形態のスカベンジャー受容体（ＳＲ）−ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）が発現及び分泌される。レーン１、３及び５は回収上清の１０倍希釈液であり、レーン２、４及び６は上清の３０倍希釈液である。各レーンの上清は以下のトランスフェクト細胞から回収した。レーン１及び２はイソロイシンジッパーＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）ｃＤＮＡであり、レーン３及び４は成長ホルモンシグナル配列に連結したスカベンジャー受容体三量体化ドメイン−ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）（ＧＨ−ＳＲ−ＣＤ４０Ｌ）であり、レーン５及び６はＩＬ２シグナル配列に連結したスカベンジャー受容体三量体化ドメイン−ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）（ＩＬ２−ＳＲ−ＣＤ４０Ｌ）である。

生物活性
Ｍｏｒｒｉｓら（１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：４１８−４２３）により記載されているようなＢ細胞増殖バイオアッセイでトランスフェクション回収培地の生物活性を分析した。丸底９６ウェルマイクロタイタープレートで４日間ｈｕＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）を滴定しながらＴ細胞枯渇ＰＢＭＣ（Ｅ）（２００μｌ中細胞１ｘ１０^５個）を培養することによりヒト血液Ｂ細胞増殖の同時刺激を調べた。１８時間の最終培養時間にわたって細胞をトリチウムチミジン（９１μｃｉ／ウェル）でパルスラベルした。イソロイシンジッパーＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）１μｇ／ｍｌをトランスフェクトして培養した細胞を陽性対照とした。対照細胞を陰性対照とした。Ｅ調製物でＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）に応答して増殖するのはＢ細胞のみである。この結果、成長ホルモンシグナル配列を連結したスカベンジャー受容体三量体化ドメインとＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）のＲＢＤの融合体を含むトランスフェクション上清はロイシンジッパーとＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）の融合体とほぼ同程度に活性であることが判明した。

等価物及び参考資料
本明細書に記載する特定態様は本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の個々の側面の例証のみを目的とし、機能的に等価の方法と構成要素も本発明の範囲に含まれる。実際に、本明細書に教示及び記載する以外の種々の本発明の変形が上記記載と添付図面から当業者に自明である。このような変形も特許請求の範囲に含むものとする。

本明細書に引用する全刊行物、特許及び特許出願は参照により本明細書に組込み、個々の刊行物、特許又は特許出願を参照により本明細書に組込むと個別に記載しているものとして扱う。

マクロファージスカベンジャー受容体−ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの構築に使用したオリゴヌクレオチドの核酸（配列３４は配列番号１、配列３３は配列番号２、配列３２は配列番号３、配列３５は配列番号４である）。図２ＡはＩＬ２分泌ペプチドとスカベンジャー受容体三量体化ドメインとＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）の受容体結合ドメインの融合体をコードする核酸配列（配列番号５）を示す。前記核酸によりコードされる融合ポリペプチドを配列番号６として示す。図２Ｂはヒト成長ホルモン分泌ペプチドとスカベンジャー受容体三量体化ドメインとＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）の受容体結合ドメインの融合体をコードする核酸配列（配列番号７）を示す。前記核酸によりコードされる融合ポリペプチドを配列番号８として示す。ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）融合ポリペプチドの発現を示すウェスタンブロットを示す。矢印はゲル中の融合ポリペプチドの位置を示す。レーン１及び２はイソロイシン−ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）三量体化ポリペプチドを使用した対照であり、レーン３〜６はＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）の受容体結合ドメインに融合したスカベンジャー受容体三量体化ドメインである。ヒトマクロファージスカベンジャー受容体Ａをコードする核酸のコーディング領域（配列番号９）とコードされるポリペプチド（配列番号１０）を示す。ヒトマクロファージスカベンジャー受容体Ａをコードする核酸のコーディング領域（配列番号９）とコードされるポリペプチド（配列番号１０）を示す。ヒトマクロファージスカベンジャー受容体Ａをコードする核酸のコーディング領域（配列番号９）とコードされるポリペプチド（配列番号１０）を示す。

Claims

配列番号１０に示すポリペプチドのアミノ酸ｘからｙまでから構成される第１のポリペプチドを含み、ｘは配列番号１０の１１０位から１５４位までのいずれかから選択され、ｙは配列番号１０の２０２位から２７０位までのいずれかから選択され、第１のポリペプチドは第２の異種ポリペプチドと融合している、三量体を形成することができる融合ポリペプチド。
第２の異種ポリペプチドと融合している第１のポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、第１のポリペプチドは配列番号１０に示すポリペプチドのアミノ酸ｘからｙまでから構成され、ｘは配列番号１０の１１０位から１５４位までのいずれかから選択され、ｙは配列番号１０の２０２位から２７０位までのいずれかから選択され、少なくとも１カ所にアミノ酸置換を有し、第１のポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号１０のｘ位からｙ位に示すポリペプチドのアミノ酸配列と全長で少なくとも９５％一致している、三量体を形成することができる前記融合ポリペプチド。
第１のポリペプチドが配列番号１０に示すポリペプチドのアミノ酸１５４位から２０３位までから構成される請求項１に記載の融合ポリペプチド。
第２のポリペプチドが腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）の可溶性部分である請求項１、２又は３に記載の融合ポリペプチド。
第２のポリペプチドが腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）リガンドの可溶性部分である請求項１、２又は３に記載の融合ポリペプチド。
第２のポリペプチドがＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ３、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ６、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ７、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ｌ、ＴＮＦＲＳＦ１３、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１５、ＴＮＦＲＳＦ１６、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１９、及びＴＮＦＲＳＦ２０から構成される腫瘍壊死因子スーパーファミリーポリペプチドの群から選択されるポリペプチドの可溶性部分である請求項４に記載の融合ポリペプチド。
第２のポリペプチドが腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーからのレセプターのシグナル伝達を阻害することが可能である請求項６に記載の融合ポリペプチド。
前記融合ポリペプチドの前記第１及び第２のポリペプチドがヒトに由来する核酸によりコードされる請求項７に記載の融合ポリペプチド。
前記融合ポリペプチドが非免疫原性である請求項８に記載の融合ポリペプチド。
第２のポリペプチドがＴＮＦＳＦ１、ＴＮＦＳＦ２、ＴＮＦＳＦ３、ＴＮＦＳＦ４、ＴＮＦＳＦ５、ＴＮＦＳＦ６、ＴＮＦＳＦ７、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＳＦ１１、ＴＮＦＳＦ１２、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ１６、ＴＮＦＳＦ１７、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ１９、及びＴＮＦＳＦ２０から構成される群から選択されるポリペプチドの可溶性部分である請求項５に記載の融合ポリペプチド。
第２のポリペプチドが腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーからのレセプターのシグナル伝達を強化し得る請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
前記融合ポリペプチドの前記第１及び第２のポリペプチドがヒトに由来する核酸によりコードされる請求項１１に記載の融合ポリペプチド。
前記融合ポリペプチドが三量体の多量体を形成することが可能である請求項１２に記載の融合ポリペプチド。
第２の異種ポリペプチドが配列番号６のアミノ酸９６位から２４４位として示されるアミノ酸を含む請求項１３に記載の融合ポリペプチド。
請求項１、２又は３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸。
請求項１５に記載の核酸を含む宿主細胞であって、前記核酸が異種制御因子に機能的に連結されている前記宿主細胞。
請求項１５に記載の核酸をトランスフェクトした宿主細胞。
請求項１５に記載の核酸によりコードされる融合ポリペプチドの製造方法であって、融合ポリペプチドの発現に好適な条件下で前記核酸をトランスフェクトした宿主細胞を増殖させる段階と、前記融合ポリペプチドを単離する段階を含む前記方法。
請求項１５に記載の核酸を含む組換えベクター。
組換え発現ベクターの構築方法であって、配列番号９に示す核酸のヌクレオチドｘからｙまで（但し、ｘは配列番号９の３３１位から５０８位までのいずれかから選択され、ｙは配列番号９の５４６位から８０８位までのいずれかから選択される）を含む第１の核酸と第１の核酸に対して異種のポリペプチドをコードする第２の核酸を発現ベクターの適合可能なクローニング部位に連結する段階と、その後、前記組換え発現ベクターを増幅及び単離する段階を含む前記方法。
第２の核酸がＴＮＦＳＦ１、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＳＦ２、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＳＦ３、ＴＮＦＲＳＦ３、ＴＮＦＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＳＦ６、ＴＮＦＲＳＦ６、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦＳＦ７、ＴＮＦＲＳＦ７、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＴＮＦＳＦ１１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＮＦＳＦ１２、ＴＮＦＲＳＦ１２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ｌ、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＲＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＲＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ１６、ＮＦＲＳＦ１６、ＴＮＦＳＦ１７、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＳＦ２０、及びＴＮＦＲＳＦ２０から構成される群から選択されるポリペプチドの可溶性部分をコードする請求項２０に記載の方法。