PL206832B1 - Zastosowanie związków opartych na mono- i disacharydach - Google Patents

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 365169 (22) Data zgłoszenia: 18.05.2001 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

18.05.2001, PCT/US01/016327 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

29.11.2001,WO01/90129 (11) 206832 (13) B1 (51) Int.Cl.

A61K 31/7024 (2006.01) A61P 31/04 (2006.01) A61P 11/06 (2006.01) A61P 37/00 (2006.01)

Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważ one błędy (54)

Zastosowanie związków opartych na mono- i disacharydach

	(73) Uprawniony z patentu: CORIXA CORPORATION, Seattle, US
(30) Pierwszeństwo: 19.05.2000, US, 60/205,820	(72) Twórca(y) wynalazku: DAVID H. PERSING, Redmond, US
(43) Zgłoszenie ogłoszono:	RICHARD THOMAS CRANE, Hamilton, US GARY T. ELLIOTT, Stevensville, US J.TERRY ULRICH, Corvallis, US
27.12.2004 BUP 26/04	MICHAEL J. LACY, Hamilton, US
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:	DAVID A. JOHNSON, Hamilton, US JORY R. BALDRIDGE, Victor, US RONG WANG, Missoula, US
30.09.2010 WUP 09/10	(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Wojciech Jacek Tykarski

PL 206 832 B1

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy zastosowania związków opartych na mono- i disacharydach do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania chorobie zakaźnej, chorobie autoimmunologicznej lub stanowi alergicznemu u osobnika, w terapii bez stosowania egzogennego antygenu.

Wrodzony układ odpornościowy koordynuje odpowiedź zapalną na patogeny poprzez układ, który odróżnia tkanki własne od obcych dzięki receptorom identyfikującym grupy cząsteczek syntetyzowanych wyłącznie przez drobnoustroje. Te grupy nazywa się czasem wzorcami cząsteczkowymi związanymi z patogenem (PAMP) i należą do nich np. lipopolisacharyd (LPS), peptydoglikany, kwasy lipotechowe i lipoproteiny bakteryjne (BLP).

LPS jest powszechnie występującym składnikiem zewnętrznej części ściany komórkowej bakterii gram-ujemnych, który jest rozpoznawany przez wrodzony układ odpornościowy. Chociaż struktura chemiczna LPS znana jest od pewnego czasu, zasadę rozpoznawania LPS przez białka surowicy i/lub komórki na poziomie cząsteczki zaczęto wyjaśniać dopiero niedawno. W serii niedawnych doniesień silną wrodzoną odpowiedź immunologiczną na LPS i inne składniki drobnoustrojów powiązano z grupą receptorów zwanych receptorami typu Toll (TLR). Wszyscy członkowie rodziny TLR to białka błonowe posiadające pojedynczą domenę przezbłonową. Domeny cytoplazmatyczne składają się z około 200 aminokwasów i wykazują podobieństwo do cytoplazmatycznej domeny receptora IL-1. Zewnątrz komórkowe domeny białek z rodziny Toll są dość duże (około 550-980 aminokwasów) i mogą zawierać wiele miejsc wiążących ligand.

Znaczenie TLR w odpowiedzi immunologicznej na LPS wykazano specyficznie dla co najmniej dwóch receptorów typu Toll, Tlr2 i Tlr4. Przykładowo badania transfekcji z użyciem komórek nerki płodowej wykazały, że ludzki Tlr2 wystarczał do wywołania odpowiedzi na LPS (Yang i inni. Nature 395: 284-288 (1998); Kirschning i inni, J Exp Med. 11: 2091-97 (1998)). Silna odpowiedź na LPS wydaje się wymagać zarówno białka wiążącego LPS (LBP), jak i CD14, która wiąże LPS z dużym powinowactwem. Obserwowano bezpośrednie wiązanie LPS z Tlr2 o względnie niskim powinowactwie, co sugeruje, że wiązanie i/lub aktywację Tlr2 przez LPS w warunkach in vivo mogą ułatwiać białka akcesorowe.

Znaczenie Tlr4 w odpowiedzi immunologicznej na LPS wykazano z użyciem pozycyjnego klonowania w zmutowanych mysich szczepach Ips. Zidentyfikowano dwa zmutowane allele mysiego genu Ips, allel semi-dominujący, który pojawił się w szczepie C3H/HeJ, oraz drugi, recesywny allel obecny w szczepach C57BL/10ScN i C57BL/10ScCr. Myszy homozygotyczne względem zmutowanych alleli Ips są wrażliwe na zakażenie bakteriami gram-ujemnymi i są oporne na wstrząs septyczny wywoływany przez LPS. Sklonowano locus Ips od tych szczepów i wykazano, że w obu przypadkach mutacje powodowały zmianę mysiego genu Tlr4 (Portorak i inni. Science 282: 2085-2088 (1998); Qureshi i inni, J Exp Med 4: 615-625 (1999)). Na podstawie tych doniesień wysunięto wniosek, że do odpowiedzi na LPS konieczny jest Tlr4.

Aktywną biologicznie endotoksyczną substrukturalną domeną LPS jest lipid A, czyli fosforylowany, wielokrotnie acylowany kwasami tłuszczowymi disacharyd glukozaminowy, kotwiczący całą strukturę w zewnętrznej błonie bakterii gram-ujemnych. Poprzednio wykazano, że toksyczne działania lipidu A można złagodzić poprzez selektywną modyfikację chemiczną lipidu A w taki sposób, aby wytworzyć związki typu monofosforylo-lipid-A (związek o działaniu immunostymulującym MPL®, Corixa Corporation, Seattle, WA). Opisano sposoby wytwarzania i stosowania związku o działaniu immunostymulującym MPL®, a także pokrewnych strukturalnie związków jako adiuwantów szczepionek i w innych zastosowaniach (patrz np. opisy patentowe US 4436727, US 4877611, US 4866034, US 4912094, US 4987237, Johnson i inni, J Med Chem 42: 4640-4649 (1999); Ulrich i Myers, w: Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach; Powell i Newman, red.; Plenum: Nowy Jork, 495-524, 1995;). W szczególności te oraz inne pozycje piśmiennictwa wykazały, że substancja o działaniu immunostymulującym, MPL®, oraz związki pokrewne charakteryzują się istotnymi właściwościami adiuwantów w przypadku stosowania w preparatach szczepionek wraz z białkowymi i cukrowymi antygenami dla wzmocnienia odporności humoralnej i/lub pośredniczonej przez komórki na antygeny.

Ponadto opisano już grupę syntetycznych mono- i disacharydowych mimetyków monofosforylolipidu-A, znaną pod nazwą aminoalkilo-glukozaminido-fosforanów (AGP), np. w zgłoszeniach patentowych US 08/853826, US 09/074720 i US 09/439839 oraz w PCT/US98/09385,. Wykazano, że związki te, podobnie jak monofosforylo-lipid-A, zachowują znaczące działanie adiuwantów gdy formułuje się je w szczepionki wraz z antygenami oraz, dodatkowo, charakteryzują się podobnym lub lepPL 206 832 B1 szym profilem toksyczności w porównaniu z monofosforylo-lipidem-A. Istotną zaletą AGP jest łatwość produkcji na skalę przemysłową drogą syntezy.

Zastosowanie monofosforylo-lipidu-A i AGP opisano przede wszystkim w odniesieniu do połączeń z antygenami w preparatach szczepionek, natomiast do chwili obecnej brak jest doniesień na temat ich stosowania w monoterapii, pod nieobecność antygenu, dla profilaktycznego i/lub terapeutycznego leczenia chorób roślin i zwierząt oraz takich stanów jak choroby zakaźne, autoimmunologiczne i alergie.

W opisie patentowym PL 188046 B1 (WO 9850399) ujawniono fosforany aminoalkiloglukozamin będące adiuwantami poprawiającymi wydajność i bezpieczeństwo szczepionek. Jednakże brak jest odwołania do stosowania tych związków w monoterapii, tj. pod nieobecność egzogennego antygenu.

Opis patentowy US 5762943 dotyczy metod i kompozycji do leczenia nadwrażliwości typu I z uż yciem monofosforylo-lipidu-A.

Opis patentowy US 4844894 ujawnia sposób hamowania stadium początkowego posocznicy i endotoksemii z użyciem środka farmaceutycznego zawierającego monofosforylo-lipid-A.

Niniejszy wynalazek, w wyniku coraz lepszego zrozumienia pewnych mechanizmów leżących u podł oż a dział a ń monofosforylo-lipidu-A i zwią zków AGP, otwiera drogę dla nowych moż liwoś ci terapeutycznych, przedstawionych w niniejszym opisie.

Wynalazek dotyczy zastosowania jednego lub większej liczby związków na bazie mono- i disacharydów o wzorze:

i ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, gdzie

X oznacza -O- lub -NH-;

R¹ i R² niezależnie oznaczają (C2-C24)acyl;

R³ oznacza -H lub -PO3R¹¹R¹² gdzie R¹¹ i R¹² niezależnie oznaczają -H lub (C1-C₄)alkil;

R⁴ oznacza -H, -CH3 lub -PO3R¹³R¹⁴ gdzie R¹³ i R¹⁴ niezależnie oznaczają -H lub (C1-C4)alkil; a Y oznacza

ch₃

PL 206 832 B1 gdzie dolne indeksy n, m, p i q niezależnie oznaczają liczby całkowite 0 - 6; R⁵ oznacza (C2-C24)acyl;

R⁶ i R⁷ niezależnie oznaczają H lub CH3;

R⁸ i R⁹ są niezależnie wybrane z grupy obejmującej H, OH, (C1-C4)alkoksyl,

-SO3H, -OSO3H, ₃R¹⁵ i -OSO₃

-NR¹⁵R¹⁶,

-SR¹⁵, -CN, -NO2, -CHO, -CO2R

-CONR¹⁵R¹⁶,

-SO3R¹⁵ i -OSO3R¹⁵, gdzie R¹⁵ i R¹⁶ niezależnie oznaczają H lub (C1-C4)alkil;

PO3H2, -OPO3H

-PO₃R¹⁵R¹⁶, -OPO₃R¹⁵R

Z oznacza -O- lub -S-;

11 12 4 13 14 przy czym gdy R³ oznacza -PO3R¹¹R¹², to R⁴ ma znaczenie inne niż -PO3R¹³R¹⁴, do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania chorobie zakaźnej, chorobie autoimmunologicznej lub stanowi alergicznemu u osobnika, w terapii bez stosowania egzogennego antygenu.

Korzystne jest zastosowanie, w którym chorobą lub stanem jest zakażenie bakteryjne lub wirusowe.

Korzystne jest zastosowanie, w którym chorobą lub stanem jest zapalenie płuc.

Korzystne jest zastosowanie, w którym pacjent jest pacjentem HIV-pozytywnym.

Korzystne jest zastosowanie, w którym chorobą lub stanem jest zakażenie przewlekłe.

Korzystne jest zastosowanie, w którym chorobą lub stanem jest obniżona odporność.

Najkorzystniejsze jest zastosowanie, w którym chorobą jest przewlekła czopująca choroba płuc.

Korzystne jest zastosowanie, w którym choroba autoimmunologiczna jest wybrana z grupy obejmującej zapalną chorobę jelit, reumatoidalne zapalenie stawów, przewlekłe zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane i łuszczycę.

Korzystne jest zastosowanie, w którym chorobą jest zapalna choroba jelit.

Korzystne jest zastosowanie, w którym stan alergiczny jest wybrany z grupy obejmującej astmę, atopowe zapalenie skóry, sezonowe zaburzenie alergiczne i przewlekłe zapalenie zatok nosa.

Korzystne jest zastosowanie, do modulacji wytwarzania cytokin.

Korzystne jest zastosowanie, do zwiększania wytwarzania cytokin.

Korzystne jest zastosowanie, do hamowania wytwarzania cytokin.

Korzystne jest zastosowanie, do modulacji aktywności receptora typu Toll.

Korzystne jest zastosowanie, w którym aktywność jest regulowana w górę.

Korzystne jest zastosowanie, w którym aktywność jest regulowana w dół.

Korzystne jest zastosowanie związku, w którym co najmniej dwa spośród R¹, R² i R⁵ są wybrane spośród (C2-C6)acyli.

Korzystne jest zastosowanie związku, w którym dwa spośród R¹, R² i R⁵ są wybrane spośród (C2-C6)acyli, a całkowita liczba atomów węgla w R¹, R² i R⁵ wynosi 6 - 22.

Korzystne jest zastosowanie związku, w którym dwa spośród R¹, R² i R⁵ są wybrane spośród (C2-C6)acyli, a całkowita liczba atomów węgla w R¹, R² i R⁵ wynosi 12 - 18.

Korzystne jest zastosowanie związku, w którym R¹, R² i R⁵ są niezależnie wybrane spośród (C12-C24)acyli, przy czym całkowita liczba atomów węgla w R¹, R² i R⁵ wynosi 44 - 60.

Korzystne jest zastosowanie związku, w którym ta całkowita liczba atomów węgla wynosi 46 - 52.

Korzystne jest zastosowanie związku, w którym obydwa X i Z oznaczają -O-.

Korzystne jest zastosowanie, w którym ten lek podaje się drogą pozajelitową, doustną, dożylną, drogą wlewu, drogą donosową, drogą inhalacji, przezskórnie i przez śluzówkę.

Korzystne jest zastosowanie, w którym ten lek podaje się drogą donosową.

Korzystne jest zastosowanie, w którym ten związek lub związki stosuje się w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych soli.

Korzystne jest zastosowanie, w którym ten lek stosuje się w postaci kompozycji zawierającej ponadto jeden lub większą liczbę farmaceutycznie dopuszczalnych nośników.

Korzystne jest zastosowanie, w którym ten lek stosuje się w postaci wodnej kompozycji zawierającej wodę i jeden lub większą liczbę środków powierzchniowo czynnych.

Korzystne jest zastosowanie, w którym ten jeden lub większa liczba środków powierzchniowo czynnych wybrana jest z grupy obejmującej dimirystoilofosfatydyloglicerynę (DPMG), dipalmitoilofosfatydyloglicerynę (DPPG), distearoilofosfatydyloglicerynę (DSPG), dimirystoilofosfatydylocholinę (DPMC), dipalmitoilofosfatydylocholinę (DPPC), distearoilofosfatydylocholinę (DSPC); kwas dimirystoilofosfatydowy (DPMA), kwas dipalmitoilofosfatydowy (DPPA), kwas distearoilofosfatydowy (DSPA); dimirystoilofosfatydyloetanoloaminę (DPME), dipalmitoilofosfatydyloetanoloaminę (DPPE) i distearoilofosfatydyloetanoloaminę (DSPE).

Najkorzystniejsze jest zastosowanie, w którym stosunek molowy związku lub związków do środka powierzchniowo czynnego wynosi 10:1 do 1:10.

PL 206 832 B1

Dzięki wynalazkowi możliwe jest zatem wytworzenie środków farmaceutycznych zawierających jeden lub większą liczbę opisanych powyżej związków w odpowiedniej zaróbce, formułowane i/lub podawane bez egzogennego antygenu.

Skrócony opis figur

Fig. 1 stanowi wykres przedstawiający niespecyficzne działanie ochronne na myszy przeciw śmiertelnej ekspozycji na grypę po podaniu lub równocześnie z podaniem monofosforylo-lipidu-A (MPL).

Fig. 2 stanowi wykres przedstawiający kliniczne objawy po podaniu L-serylo-aminoalkiloglukozaminido-fosforanów (AGP) myszom do nosa.

Fig. 3 stanowi wykres przedstawiający kliniczne objawy po monoterapii L-serylo-aminoalkilo-glukozaminido-fosforanami (AGP) i ekspozycji na grypę.

Fig. 4-6 stanowią wykresy przedstawiające indukcję cytokin przez RC522 w porównaniu do MPL we wzrastających przez noc hodowlach z pełnej krwi od trzech ludzkich dawców (odpowiednio dawców A-C).

Fig. 7 stanowią wykresy przedstawiające indukcję cytokin przez RC522 w porównaniu do MPL w krótkoterminowych hodowlach pełnej krwi od dawcy A.

Fig. 8 stanowią wykresy przedstawiające indukcję cytokin przez RC522 w porównaniu z MPL w mysich (Balb/c i C3H/HEJ) hodowlach ś ledziony.

Fig. 9 stanowią wykresy przedstawiające indukcję cytokin przez RC529 i RC552 w porównaniu z MPL w ludzkich komórkach jednoją drzastych krwi obwodowej (PBMC).

Przykładowe zastosowania profilaktyczne i lecznicze

Możliwe są w szerokim aspekcie profilaktyczne i terapeutyczne sposoby leczenia pewnych chorób i innych stanów medycznych poprzez podawanie skutecznej ilości jednego lub większej liczby opisanych tutaj związków mono- lub disacharydowych lub środka farmaceutycznego zawierającego jeden lub większą liczbę takich związków. Chociaż opisano zastosowanie pewnych związków monoi disacharydowych jako adiuwantów w połączeniu z egzogennie podawanymi antygenami w preparatach szczepionek, a także ich zastosowanie w pewnych innych przypadkach, dzięki wynalazkowi możliwe są nowe sposoby terapeutyczne, wykorzystujące związki korzystnie w monoterapii, tzn. w nieobecności egzogennie podawanego antygenu.

Możliwe są zatem sposoby leczenia, łagodzenia i/lub zasadniczo profilaktyki chorób zakaźnych u organizmów eukariotycznych, szczególnie u zwierząt, korzystnie u ludzi. Biorąc pod uwagę znaczenie pośredniczonej przez TLR sygnalizacji we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na stymulację drobnoustrojem, zdolność selektywnej stymulacji takich szlaków przy minimalnej toksyczności stanowi potencjalnie znakomity sposób profilaktyki i/lub leczenia całego szeregu czynników infekcyjnych.

Opisane tutaj sposoby mają zastosowanie w przypadku zasadniczo wszystkich rodzajów czynników infekcyjnych, w tym bakterii, wirusów, pasożytów i grzybów. Przykładowo wynalazek jest użyteczny w profilaktyce i/lub leczeniu zakażeń bakteryjnych wywoływanych przez Pseudomonas, Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Serratia, Candida, Staphylococci, Streptococci, Chlamydia, Mycoplasma i szereg innych. Do przykładowych chorób wirusowych, które można leczyć, należą choroby powodowane przez np. wirusy grypy, adenowirusy, wirusy grypy rzekomej, rinowirusy, wirusy zespólni układu oddechowego (RSV), wirusy opryszczki, cytomegalowirusy, wirusy zapalenia wątroby, np. wirusy zapalenia wątroby typu B i C, a także inne. Do przykładowych grzybów należą Aspergillis, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitus oraz inne.

Możliwe jest leczenie osobników, w szczególności osobników z upośledzeniem odporności, u których rozwinęły się zakażenia, takie jak szpitalne zakażenia bakteryjne b ądź wirusowe, lub którzy są na rozwój takiego zakażenia narażeni. U około 2 milionów z 40 milionów osób hospitalizowanych rocznie rozwijają się zakażenia podczas pobytu w szpitalu, a u około 1% z nich, czyli u około 400000 pacjentów, rozwija się wewnątrzszpitalne zapalenie płuc; spośród nich ponad 7000 osób umiera. Sprawia to, że wewnątrzszpitalne zapalenie płuc stanowi wiodącą przyczynę zgonu wśród zakażeń nabytych podczas pobytu w szpitalu. Zatem wynalazek spełnia wyraźne zapotrzebowanie na skuteczne środki profilaktyczne w leczeniu zakażeń szpitalnych.

Dzięki wynalazkowi możliwy jest sposób profilaktycznego leczenia u pacjentów z upośledzeniem odporności, takich jak pacjentów HIV-pozytywnych, u których rozwinęło się, lub którzy narażeni są na zapalenie płuc wywoływane oportuniestycznym zakażeniem lub reaktywacją stłumionego lub utajonego zakażenia. W roku 1992 w samych tylko Stanach Zjednoczonych Ameryki zarejestrowano około 20000 zakażeń Pneumocystis carinii u pacjentów z AIDS. Ponadto 60-70% wszystkich pacjentów z AIDS nabywa P. carinii na jakimś etapie choroby.

PL 206 832 B1

Takie sposoby można stosować do leczenia innych grup pacjentów, u których może występować upośledzenie odporności i/lub narażonych na rozwój chorób zakaźnych, w tym np. pacjentów z mukowiscydozą , przewlekłą obturacyjną chorobą płuc oraz innych pacjentów z upośledzeniem odporności i/lub innych pacjentów szpitalnych.

Na poparcie postaci wynalazku wykazano, że podanie przed ekspozycją przykładowego związku opartego na mono- i disacharydach zdefiniowanego powyżej myszom z upośledzeniem odporności zapewnia istotne działanie ochronne przeciwko zakażeniu Pneumocystis carinii (patrz przykład 1).

W sposobach leczenia, łagodzenia lub zapobiegania w znacznym stopniu chorobom i stanom alergicznym, takim jak zapalenie zatok, przewlekły nieżyt nosa z zapaleniem zatok, dychawica, atopowe zapalenie skóry i łuszczyca można stosować opisane tutaj związki mono- i disacharydowe. Podejście to opiera się przynajmniej częściowo na zdolności związków mono- i disacharydowych do aktywacji wytwarzania cytokin przez komórki docelowe, które mogą konkurować z serotypowymi odpowiedziami cytokinowymi typu alergicznego, charakteryzującymi się nasilonym wytwarzaniem IL-4 lub nadwrażliwością na aktywność IL-4. Podawanie pewnych ujawnionych tutaj związków mono- i disacharydowych skutkuje ekspresją IFN-γ i IL-12 przez komórki przetwarzające i prezentujące antygen, a także inne komórki, co prowadzi do „regulacji w dół cytokin związanych z odpowiedziami alergicznymi, takich jak IL-4, 5, 6, 10 i 13.

Związki mono- i disacharydowe można stosować w sposobach leczenia chorób i stanów autoimmunologicznych. Związki mono- i disacharydowe, jakie można stosować w tej postaci wynalazku będą zazwyczaj wybierane spośród związków zdolnych do antagonizowania, hamowania lub wywierania innego ujemnego wpływu na jeden lub większą liczbę receptorów typu Toll, zwłaszcza Tlr1 i/lub Tlr4, dzięki czemu zapobiega się lub łagodzi rozwój odpowiedzi autoimmunologicznej związanej z danym stanem. Przykładowo sposoby można wykorzystać w leczeniu takich stanów jak zapalna choroba jelit, reumatoidalne zapalenie stawów, przewlekłe zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane i łuszczyca.

Nie chcąc wiązać się z żadną teorią uważa się, że skuteczność opisanych tutaj profilaktycznych i terapeutycznych zastosowań opiera się - przynajmniej częściowo - na zaangażowaniu związków mono- i disacharydowych w modulację aktywności receptorów typu Toll. W szczególności uważa się, że receptory typu Toll, Tlr2, Tlr4 oraz inne ulegają specyficznej aktywacji, kompetycyjnemu zahamowaniu lub podlegają innemu działaniu ze strony ujawnionych tutaj nietoksycznych pochodnych LPS oraz mimetyków. W związku z tym sposoby te dostarczają potężnych i selektywnych możliwości modulacji szlaków wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u zwierząt bez powodowania działań toksycznych, często związanych z natywnymi składników bakteryjnych, stymulującymi w zwykłych warunkach te szlaki.

Przykładowe związki mono- i disacharydowe

Przykładowymi związkami mono- i disacharydowymi stosowanymi w powyższych zastosowaniach profilaktycznych i terapeutycznych są związki o wzorze:

i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, gdzie X oznacza -O- lub -NH-;

PL 206 832 B1

R¹ i R² niezależnie oznaczają (C2-C24)acyl;

R³ oznacza -H lub -PO3R¹¹R¹², gdzie R¹¹ i R¹² niezależnie oznaczają -H lub (C1-C₄)alkil;

R⁴ oznacza -H, -CH3 lub -PO3R¹³R¹⁴ gdzie R¹³ i R¹⁴ niezależnie oznaczają -H lub (C1-C4)alkil; a Y oznacza

gdzie dolne indeksy n, m, p i q niezależnie oznaczają liczby całkowite 0 - 6;

R⁵ oznacza (C2-C24)acyl;

R⁶ i R⁷ niezależnie oznaczają H lub CH3;

R⁸ i R⁹ są niezależnie wybrane z grupy obejmującej H, OH, (C1-C4)alkoksyl, -PO3H2, -OPO3H2, -SO3H, -OSO3H, -NR¹⁵R¹⁶, -SR¹⁵, -CN, -NO2, -CHO, -CO₂R¹⁵, -CONR¹⁵R¹⁶, -PO3R¹⁵R¹⁶, -OPO3R¹⁵R¹⁶, -SO3R¹⁵ i -OSO3R¹⁵, gdzie R¹⁵ i R¹⁶ niezależnie oznaczają H lub (C1-C4)alkil;

Z oznacza -O- lub -S-;

11 12 4 13 14 przy czym gdy R³ oznacza -PO3R¹¹R¹², to R⁴ ma znaczenie inne niż -PO3R¹³R¹⁴.

W powyższym ogólnym wzorze, konfiguracja centrów stereogenicznych 3', do których przyłączone są grupy acylowe nierozgałęzionego kwasu tłuszczowego jest R lub S, ale korzystnie R. Stereochemia tych atomów węgla, do których przyłączone są R⁶ i R⁷, może być R lub S. Wszystkie stereoizomery, enancjomery, diastereizomery i ich mieszaniny są objęte zakresem wynalazku.

W jednej z grup korzystnych postaci związków o wzorze (I), grupy acylowe R¹, R² i R⁵ będą wybrane tak, aby co najmniej dwie z tych grup oznaczały (C2-C6)acyl. Korzystnymi są ponadto te postacie, w których całkowita liczba atomów węgla w R¹, R² i R⁵ wynosi około 6 - 22, korzystniej około 12 -18.

W innych korzystnych postaciach, X oznacza O i Z oznacza O. Dolne indeksy n, m, p i q oznaczają korzystnie liczby całkowite 0 - 3, korzystniej 0 - 2. Z pozostałych podstawników, R⁶ i R⁷ oznaczają korzystnie H. Wynalazek dotyczy także tych postaci, w których korzystne znaczenia podstawników są połączone w jednej cząsteczce.

W innej grupie postaci, R¹, R² i R⁵ są wybrane spoś ród (C12-C20) acylu, przy czym cał kowita liczba atomów węgla w R¹, R² i R⁵ wynosi około 44 - 60. Korzystniej, ta całkowita liczba atomów węgla w R¹, R² i R⁵ wynosi okoł o 46 - 52. Jeszcze dalej korzystne są te postacie, w których ka ż dy z X i Z oznacza -O-.

W innej grupie postaci, R¹, R² i R⁵ są wybrane spoś ród (C12-C24) acylu, przy czym cał kowita liczba atomów węgla w R¹, R² i R⁵ wynosi około 44 - 60. Korzystniej, ta całkowita liczba atomów węgla w R¹, R² i R⁵ wynosi okoł o 46 - 52. Szczególnie korzystnymi grupami kwasów tł uszczowych dla R¹, R² i R⁵ są grupy C14, C16 i C18 nierozgałęzionych kwasów tłuszczowych. Jeszcze dalej korzystne są te postacie, w których X oznacza -O-. Podobnie do postaci z krótszymi łańcuchami acylowymi, określonych powyżej, R³ korzystnie oznacza grupę fosfono (-PO3H2), a R⁴ korzystnie oznacza H.

Określenie „alkil jako taki lub jako część innego podstawnika oznacza, jeżeli nie zaznaczono inaczej, prostołańcuchową, rozgałęzioną lub cykliczną grupę węglowodorową albo ich połączenie, która może być całkowicie nasycona, mono- lub polinienasycona i może obejmować grupy di- oraz wielowartościowe, zawierające oznaczoną liczbę atomów węgla (np. C1-C10 oznacza 1 - 10 atomów węgla). Przykładami nasyconych grup węglowodorowych są grupy takie jak metyl, etyl, n-propyl, izopropyl, n-butyl, t-butyl, izobutyl, s-butyl, cykloheksyl, (cykloheksylo)metyl, cyklopropylometyl, oraz homologi i izomery np. n-pentylu, n-heksylu, n-heptylu, n-oktylu i tym podobnych. Nienasyconym alkilem jest grupa zawierająca jedno lub większą liczbę podwójnych lub potrójnych wiązań. Przykładami nienasyconych alkili są winyl, 2-propenyl, krotyl, 2-izopentenyl, 2-(butadienyl), 2,4-pentadienyl, 3-(1,4-pen8

PL 206 832 B1 tadienyl), etynyl, 1- i 3-propynyl, 3-butynyl i wyższe homologi oraz izomery. Typowo, alkil będzie zawierał 1-24 atomy węgla. Określenie „niższy alkil oznacza alkil z krótszym łańcuchem, ogólnie zawierającym 8 lub mniejszą liczbę atomów węgla.

Określenia „alkoksyl „grupa alkiloaminowa i „grupa alkilotio (czyli tioalkoksyl) są stosowane tutaj w ich zwykłym znaczeniu i odnoszą się do tych alkili, które są przyłączone do reszty cząsteczki odpowiednio przez atom tlenu, grupę aminową lub atom siarki.

Określenie „acyl odnosi się do grup pochodzących z kwasów organicznych powstałych przez usunięcie grupy hydroksylowej. Przykładami grup acylowych są acetyl, propionyl, dodekanoil, tetradekanoil, izobutyryl i tym podobne. Zatem, oznacza to, że określenie „acyl obejmuje grupy w inny sposób określane jako -C(O)-alkil.

Każde z znaczeń powyższych określeń (np. „alkil, „acyl) obejmuje zarówno podstawione, jak i niepodstawione postacie wskazanej grupy. Korzystne znaczenia każ dego z typów podstawników przedstawiono poniżej.

Włączone są także sole aminokwasów, takie jak arginian i tym podobne, i sole kwasów organicznych, takich jak kwas glukuronowy lub galakturonowy i tym podobne (patrz np. Berge, S.M., i inni, „Pharmaceutical Salts, Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19, 1977). Pewne, konkretne związki zdefiniowane powyżej zawierają zarówno zasadowe, jak i kwasowe grupy funkcyjne, zatem umożliwia to przeprowadzenie tych związków w sole addycyjne zarówno z kwasami, jak i zasadami.

Obojętne postacie związków można odzyskiwać przez działanie na sole zasadą lub kwasem i wydzielanie związku macierzystego w zwykły sposób. Macierzysta postać związku różni się od wielu postaci soli pewnymi właściwościami fizycznymi, takimi jak rozpuszczalność w rozpuszczalnikach polarnych, jednak, poza tym sole te są równoważne macierzystej postaci związku z punktu widzenia wynalazku.

Dodatkowo, poza postaciami soli, dzięki wynalazkowi można otrzymać związki będące w postaci proleku. Prolekami opisanych tu związków, są takie związki, które łatwo ulegają chemicznym przemianom w warunkach fizjologicznych i dostarczają związki zdefiniowane powyżej. Dodatkowo, proleki można przeprowadzać w związki zdefiniowane powyżej sposobami chemicznymi lub biochemicznymi w warunkach ex vivo. Przykładowo, proleki mogą powoli przechodzić w związki zdefiniowane powyżej, gdy są umieszczone w zbiorniczku plastra przezskórnego, wraz z odpowiednim enzymem lub odczynnikiem chemicznym.

Pewne związki zdefiniowane powyżej mogą występować w postaciach niesolwatowanych, jak również w postaciach solwatowanych, w tym w postaciach hydratowanych. Ogólnie, postacie solwatowane są równoważne postaciom niesolwatowanym. Pewne związki zdefiniowane powyżej mogą występować w wielu postaciach krystalicznych lub amorficznych.

Pewne związki zdefiniowane powyżej mają asymetryczne atomy węgla (centra optyczne) lub podwójne wiązania.

Związki zdefiniowane powyżej mogą również zawierać w nienaturalnej proporcji izotopy jednego lub większej liczby atomów będących w strukturze tych związków. Przykładowo, związki mogą być znakowane izotopami radioaktywnymi, takimi jak np. tryt (³H), jod-125 (¹²⁵I) lub węgiel-14 (¹⁴C).

Związki mono- i disacharydowe można wytworzyć dowolnymi odpowiednimi sposobami, z których wiele zostało opisanych. Przykładowo pewne związki użyteczne w niniejszym wynalazku opisano w bę dących w trakcie badań zgłoszeniach nr 08/853826, 09/439839 (z 12 listopada 1999 r.) oraz w PCT/US98/09385, których ujawnienia należy w całości traktować jako źródła literaturowe. Inne związki można wytworzyć w sposób zbliżony do opisanego w odniesieniu do RC-552 (L34) w opisie patentowym US 6013640. Jeszcze inne związki można wytworzyć z wykorzystaniem sposobów przedstawionych przez Johnson i inni, J. Med. Chem. 42:4640-4649 (1999); Johnson i inni, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2273-2278 (1999) oraz PCT/US98/50399. Jeszcze inne związki można wytworzyć wg np. opisów patentowych US 4436727, US 4877611, US 4866034, US 4912094 i US 4987237. Ogólnie sposoby syntezy opisane w powyższych pozycjach oraz inne sposoby, skądinąd znane fachowcom, znajdują szerokie zastosowanie w wytwarzaniu tych związków. Przykładowo przy wytwarzaniu związków zawierających różne grupy acylowe i podstawniki, fachowiec zauważy, że opisane tutaj zbieżne sposoby można zmodyfikować przez zastosowanie wariantowych środków acylujących, lub też można je rozpocząć z zastosowaniem dostępnych na rynku związków z dołączonymi odpowiednimi grupami acylowymi.

PL 206 832 B1

Przykładowe środki farmaceutyczne oraz ich dostarczanie

Możliwe są do uzyskania środki farmaceutyczne zawierające jeden lub większą liczbę ujawnionych tutaj mono- lub disacharydowych związków, w farmaceutycznie dopuszczalnych nośnikach/zarobkach dla podawania do komórki, tkanki, zwierzęcia lub rośliny, samych bądź w połączeniu z jednym lub większą liczbą sposobów terapii. W korzystnej postaci ś rodki farmaceutyczne nie zawierają egzogennego antygenu, tzn. stosuje się je w monoterapii. W przypadku wielu takich postaci środki farmaceutyczne będą zawierały jeden lub większą liczbę opisanych tutaj związków monosacharydowych.

Do przykładowych nośników dla stosowania w formułowaniu środków farmaceutycznych należą np. emulsje typu olej w wodzie lub woda w oleju, kompozycje wodne ewentualnie zawierające organiczne współrozpuszczalniki odpowiednie do podawania dożylnie (iv), liposomy lub pęcherzyki zawierające środek powierzchniowo czynny, mikrosfery, mikroperełki i mikrosomy, proszki, tabletki, kapsułki, czopki, zawiesiny wodne, aerozole oraz inne nośniki znane fachowcom.

W pewnych postaciach środki farmaceutyczne będą zawierały jeden lub wię kszą liczbę buforów (np. obojętny buforowany fizjologiczny roztwór soli lub buforowany fosforanem fizjologiczny roztwór soli), węglowodany (np. glukozę, mannozę, sacharozę lub dekstrany), mannit, białka, polipeptydy lub aminokwasy, takie jak glicyna, przeciwutleniacze, substancje o działaniu bakteriostatycznym, środki chelatujące, takie jak EDTA lub glutation, adiuwanty (np. wodorotlenek glinu), substancje rozpuszczone, dzięki którym preparat staje się izotoniczny, hipotoniczny lub lekko hipertoniczny w stosunku do krwi biorcy, środki suspendujące, środki zagęszczające i/lub konserwujące.

W pewnych zastosowaniach korzystne bę d ą preparaty wodne, zwł aszcza te zawierające skuteczną ilość jednego lub większej liczby środków powierzchniowo czynnych. Kompozycja może mieć np. postać dyspersji micelarnej, zawierającej co najmniej jeden odpowiedni środek powierzchniowo czynny, np. fosfolipidowy środek powierzchniowo czynny. Do przykładów fosfolipidów należą diacylofosfatydylogliceryny, takie jak dimirystoilofosfatydylogliceryna (DPMG), dipalmitoilofosfatydylogliceryna (DPPG) oraz distearoilofosfatydylogliceryna (DSPG), diacylofosfatydylocholiny, takie jak dimirystoilofosfatydylocholina (DPMC), dipalmitoilofosfatydylocholina (DPPC) i distearoilofosfatydylocholina (DSPC); kwasy diacylofosfatydowe, takie jak kwas dimirystoilofosfatydowy (DPMA), kwas dipalmitoilofosfatydowy (DPPA) i kwas distearoilofosfatydowy (DSPA); oraz diacylofosfatydyloetanoloaminy, takie jak dimirystoilofosfatydyloetanoloamina (DPME), dipalmitoilofosfatydyloetanoloamina (DPPE) oraz distearoilofosfatydyloetanoloamina (DSPE). Stosunek molowy środek powierzchniowo czynny: mono/disacharyd w preparacie wodnym będzie wynosił typowo około 10:1 - 1:10, częściej około 5:1 - 1:5; z tym że stosować można dowolną skuteczną ilość środka powierzchniowo czynnego w preparacie wodnym, aby jak najlepiej dopasować się do konkretnego celu.

Związki i środki farmaceutyczne opisane powyżej można formułować w preparaty przeznaczone do podawania zasadniczą dowolną drogą, np. poprzez iniekcję, inhalację przez usta lub przez nos, doodbytniczo, dopochwowo lub dotchawiczo poprzez zakroplenie lub spożycie, drogą przezskórną lub przezśluzówkową itp. Dzięki temu efekty terapeutyczne uzyskiwane dzięki sposobom i kompozycjom opisanym powyżej mogą mieć charakter np. ogólno-ustrojowy, miejscowy, specyficzny tkankowo itp., w zależ noś ci od konkretnych potrzeb danego stosowania.

Przykładowe preparaty można wytwarzać i podawać drogą pozajelitową, np. dootrzewnową, podskórną, domięśniową lub dożylną. Jednym z przykładów nośnika do stosowania dożylnego jest mieszanina 10% etanolu USP, 40% glikolu propylenowego USP lub glikolu polietylenowego 600 oraz jako reszta woda do iniekcji (WFI) USP, Do innych przykładowych nośników należą 10% etanol USP i WFI USP; 0,01-0,1% trietanoloamina w WFI USP bą dź 0,01-0,2% dipalmitoilodifosfatydylocholina w WFI USP; a takż e 1-10% skwalen lub stosowana pozajelitowo emulsja oleju roś linnego w wodzie.

Farmaceutycznie dopuszczalne rozpuszczalniki do stosowania drogą pozajelitową będą ogólnie wybierane w taki sposób, aby uzyskać roztwór lub dyspersję, które można poddać filtracji przez filtr 0,22 μm, bez usunięcia aktywnego składnika.

Do przykładowych nośników przeznaczonych do stosowania podskórnego lub domięśniowego należą fizjologiczny roztwór soli buforowany fosforanem (PBS), 5% dekstroza w WFI oraz 0,01-0,1% trietanoloamina w 5% dekstrozie lub 0,9% chlorku sodu w WFI USP lub mieszanina 10% etanolu USP i 40% glikolu propylenowego w stosunku 1:2 lub 1:4; uzupełniona izotonicznym roztworem, takim jak 5% dekstroza lub 0,9% chlorek sodu; 0,01-0,2% dipalmitoilodifosfatydylocholina w WFI USP oraz 1-10% skwalen lub stosowana pozajelitowo emulsja oleju roślinnego w wodzie.

PL 206 832 B1

Przykładowe nośniki stosowane do podawania poprzez błony śluzowe zależą od konkretnej drogi podawania, np. doustnej, podjęzykowej, donosowej itp. W przypadku podawania doustnego do przykładów należą farmaceutyczne gatunki mannitu, skrobi, laktozy, stearynianu magnezu, soli sodowej sacharyny, celulozy, węglanu magnezu itp., przy czym korzystny jest mannit. W przypadku podawania donosowego, do przykładów należą: glikol polietylenowy, fosfolipidy, glikole i glikolipidy, sacharoza i/lub metyloceluloza, zawiesiny proszków ewentualnie z wypełniaczami, takimi jak laktoza, oraz środki konserwujące, takie jak chlorek benzalkonium, EDTA. W konkretnym przykładzie stosuje się fosfolipid 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (DPPC) jako izotoniczny wodny nośnik w stężeniu około 0,01-0,2% dla donosowego podawania związku zdefiniowane powyżej w stężeniu około 0,1-3,0 mg/ml.

W przypadku podawania poprzez inhalację, do przykładowych nośników należą glikol polietylenowy lub glikole, DPPC, metyloceluloza, sproszkowane środki dyspergujące oraz środki konserwujące, przy czym korzystne są glikole polietylenowe i DPPC. W wielu przypadkach korzystne jest, aby dla podawania poprzez inhalację związki mono- lub disacharydowe znajdowały się w postaci nebulizowanej. Dla przykładu, dostarczanie może odbywać się z zastosowaniem jednorazowego urządzenia do dostarczania, rozpylacza aerozolowego, aktywowanego oddychaniem inhalatora proszku, inhalatora aerozolowego z odmierzaniem dawki (MDI) lub innego z wielu dostępnych rozpylających urządzeń do dostarczania. Dodatkowo zastosować można również namioty z mgłą lub bezpośrednie podawanie poprzez rurki wewnątrztchawicze. W pewnych wskazaniach skuteczne będzie również podawanie drogą dotchawiczą lub nosowo-gardłową.

Fachowiec dostrzeże, że powyższy opis ma charakter ilustrujący, a nie wyczerpujący zagadnienie. Fachowcom dobrze znany jest szereg innych technik formułowania preparatów, jak również wiele farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek oraz nośników w postaci roztworów, podobnie jak opracowanie odpowiednich schematów dawkowania i leczenia w przypadku stosowania konkretnych kompozycji opisanych tutaj w szeregu schematów leczenia.

Celem zidentyfikowania i wybrania związków o najlepszych właściwościach dla danego zastosowania według wynalazku stosować można szereg różnych analiz. Przykładowo w celu zidentyfikowania i oceny profili uwalniania cytokin do krążenia ogólnego po podaniu związku mono- i/lub disacharydowego zastosować można modele zwierzęce. Istnieje ponadto wiele modeli in vitro i in vivo, pozwalających na zbadanie zmian w jednym lub wielu aspektach odpowiedzi immunologicznej na różne składniki antygenowe celem zidentyfikowania związków najlepszych pod względem indukowania danego rodzaju odpowiedzi immunologicznej. Przykładowo doprowadzić można do kontaktu związku z komórkami docelowymi np. makrofagami, komórkami dendrytycznymi lub komórkami Langerhansa w warunkach in vitro i mierzyć wytwarzane cytokiny. Ponadto dla zidentyfikowania specyficznych szlaków aktywowanych lub hamowanych przez konkretny związek mono- lub disacharydowy można stosować zestawy ekspresji genowej.

Należy zdawać sobie sprawę, że w razie potrzeby, ujawnione tutaj związki można podawać w połączeniu z innymi ś rodkami terapeutycznymi, takimi jak substancje przeciwdrobno-ustrojowe, antywirusowe i przeciwgrzybicze, różne środki terapeutyczne na bazie DNA, środki terapeutyczne na bazie RNA, środki terapeutyczne na bazie polipeptydów i/lub wraz z innymi substancjami wpływającymi na układ immunologiczny. W istocie zastosować można dowolny dodatkowy składnik, pod warunkiem, że ten dodatkowy składnik(i) nie prowadzi do wystąpienia istotnego działania niepożądanego po kontakcie z komórkami docelowymi lub tkankami gospodarza. Kompozycje można zatem stosować w połączeniu z róż nymi innymi środkami, w zależności od potrzeb wynikających z konkretnej zastosowanej postaci według wynalazku.

Przykładowo, środki farmaceutyczne mogą zawierać lub mogą być stosowane w połączeniu z DNA kodującym jedno lub większą liczbę terapeutycznych białek, antysensownym RNA, rybosomami itp. DNA może występować w szeregu układów dostarczania znanych fachowcom, obejmujących układy ekspresji kwasów nukleinowych oraz bakteryjne i wirusowe układy ekspresji. Fachowcom dobrze znanych jest szereg technik dostarczania genów, takich jak te opisane przez Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998 oraz w cytowanych tam odnośnikach. Odpowiednie układy ekspresji kwasów nukleinowych zawierają niezbędne sekwencje DNA dla ekspresji u pacjenta (takie jak odpowiedni promotor i sygnał terminacji). W korzystnej postaci DNA może zostać wprowadzony poprzez wirusowy układ ekspresji (np. poprzez wirus krowianki lub inne wirusy ospy, retrowirusy lub adenowirusy), co może obejmować stosowanie niepatogennego (zdefektowanego), zdolnego do replikacji wirusa. Odpowiednie systemy ujawniono np. w następujących pozycjach: Fisher-Hoch i inni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321, 1989; Flexner i inni, Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86-103, 1989; Flexner i inni,

PL 206 832 B1

Vaccine 8:17-21; opisy patentowe US 4603112, US 4769330 i US 5017487; WO 89/01973; opis patentowy US 4777127; GB 2200651; EP 0345242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Rosenfeld i inni. Science 252:431-434, 1991; Kolls i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994; Kass-Eisler i inni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502, 1993; Guzman i inni, Circulation 88:2838-2848, 1993 oraz Guzman i inni, Cir. Res. 73:1202-1207, 1993. Techniki inkorporacji DNA do takich układów ekspresji są dobrze znane fachowcom.

DNA może być również „nagi, jak opisano np. w Ulmer i inni. Science 259:1745-1749, 1993 i omówiono w pracy przeglądowej przez Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. Wychwyt nagiego DNA można nasilić poprzez powleczenie DNA na ulegających biodegradacji kulkach, które są efektywnie transportowane do komórek. Oczywiste jest, że środek farmaceutyczny może zawierać składnik zarówno polinukleotydowy, jak i białkowy.

W skład kompozycji wchodzić może dowolna z szeregu dodatkowych substancji o działaniu immunostymulującym, jak np. cytokiny, takie jak GM-CSF, interferony lub interleukiny, w celu dalszego modulowania danej odpowiedzi immunologicznej. Przykładowo w pewnych postaciach w skład kompozycji mogą wchodzić dodatkowe składniki dla nasilenia indukcji wysokich poziomów cytokin typu Th1 (np. IFN-γ, TNF -α, IL-2 i IL-12). Alternatywnie lub dodatkowo pożądane może być - w pewnych zastosowaniach terapeutycznych - osiąganie wysokiego poziomu cytokin typu Th2 (np. IL-4, IL-5, IL-6 i IL-10). Poziomy tych cytokin można w łatwy sposób ocenić przy pomocy standardowych oznaczeń. Przegląd rodzin cytokin znaleźć można w pozycji Mosmann i Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989.

Do przykładowych kompozycji do stosowania celem indukcji cytokin typu Th1 należy połączenie oligonukleotydów zawierających CpG (w którym dinukleotyd CpG nie jest metylowany), jak opisano np. w WO 96/02555, WO 99/33488 oraz opisach patentowych US 6008200 i US 5856462. Immunostymulujące sekwencje DNA opisali również np. Sato i inni. Science 273:352, 1996. Do innych odpowiednich substancji immunostymulujących należą saponiny, takie jak QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA) oraz pokrewne pochodne saponinowe i ich mimetyki.

Do innych przykładowych substancji immunostymulujących, jakie można zastosować w połączeniu ze związkami opartymi na mono- i disacharydach, należą Montanide ISA 720 (Seppic, Francja), SAF (Chiron, Kalifornia, Stany Zjednoczone Ameryki), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron) oraz seria adiuwantów SBAS (np. SBAS-2 lub SBAS-4 dostępne od SmithKline Beecham, Rixensart, Belgia) oraz immunostymulator Enhanzyn™ (Corixa, Hamilton, MT). Immunostymulatory typu eterów polioksyetylenowych opisano w WO 99/52549A1.

Ogólne definicje:

Stosowane tutaj określenie „skuteczna ilość oznacza ilość, która prowadzi do uzyskania odpowiedzi większej niż nośnik lub kontrola negatywna. Jak omówiono powyżej precyzyjne dawkowanie związku opisanego powyżej, podawanego pacjentowi, będzie uzależnione od drogi podawania, kompozycji farmaceutycznej oraz pacjenta.

Określenie „farmaceutycznie dopuszczalna dotyczy cząsteczek i kompozycji, które nie prowadzą do wystąpienia reakcji alergicznych lub innych podobnych reakcji niepożądanych w przypadku stosowania u ludzi.

Stosowane tutaj określenie „nośnik lub „zaróbka obejmuje dowolne i wszystkie rozpuszczalniki, ośrodki dyspersyjne, nośniki, powłoki, rozcieńczalniki, środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, środki izotoniczne i opóźniające absorpcję, bufory, roztwory nośnikowe, zawiesiny, koloidy itp. Stosowanie takich ośrodków i środków dla farmaceutycznie aktywnych substancji jest dobrze znane. O ile którykolwiek z konwencjonalnych ośrodków lub środków nie jest niezgodny z aktywnym składnikiem, można go stosować w kompozycjach terapeutycznych.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1

Ochrona przed zakażeniem P. carinii poprzez profilaktyczne podawanie monofosforylo-lipidu-A

Myszy traktowano wstępnie przeciwciałem L3T4 przeciwko CD4 przez minimum 2 tygodnie (2 iniekcje tygodniowo, 0,2 mg/iniekcję) aż do chwili, gdy liczba obwodowych komórek CD4 zmniejszyła się o co najmniej 50%.

Przygotowano preparat wodny zawierający 1 mg/ml 3-O-deacetylowanego monofosforylo-lipidu-A oraz 108 μg/ml środka powierzchniowo czynnego (DPPC) w wodzie. Preparat podawany do tchawicy poprzez niewielką kaniulę przez ~24 godziny, a następnie dwa razy w tygodniu przez pozostały okres badania. Podawane stężenia przedstawiono w poniższej tabeli 1. W dniu 0 zaszczepiano milion P. carinii drogą przeztchawiczą. Stosowane dwa razy w tygodniu leczenie trwało przez 7 tygodni; na12

PL 206 832 B1 stępnie usuwano płuca i wykonywano rozmaz wyciskowy. Preparaty barwiono metodą Giemsy i srebrem i w następujący sposób ilościowo przedstawiano obecność P. carinni:

Wynik 5 >100/1000x pole 4 10-100/pole 3 1-10/pole

1-10/10 pól 1 1-10/50 pól 0 0/50 pól

Wyniki tych doświadczeń zestawiono w poniższej tabeli 1:

T a b e l a 1

	Giemsa	srebro
Grupa placebo	3,3 ± 0,7	2,5 ± 0,4
25 pg/kg	3,4 ± 0,5	3,3 ± 0,1
100 pg/kg	2,7 ± 0,5	3,2 ± 0,1
250 pg/kg	1,8 ± 0,8	1,6 ± 0,2

Badanie powtórzono i otrzymano następujące wyniki (tabela 2) T a b e l a 2

	Giemsa
Grupa placebo	3,3 ± 0,2
Nieleczona kontrola	3,1 ± 0,3
100 pg/kg	1,3 ± 0,3
200 pg/kg	1,0 ± 0,3

Wyniki te wskazują, że dostarczanie monofosforylo-lipidu-A do płuc promuje niespecyficzną oporność na zakażenie Pneumocystis carinii u myszy z upośledzeniem odporności. Inhalacja monofosforylo-lipidu-A prowadziła do aktywacji miejscowej (i dystalnej) wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, co skutkowało zwiększeniem niespecyficznej ochrony. Monofosforylo-lipid-A pośredniczył w tym ochronnym działaniu przede wszystkim poprzez aktywację komórek prezentujących antygen, co powodowało wzrost aktywności fagocytarnej oraz uwalniania cytokin o działaniu immunostymulującym. Analiza FACS komórek wypłukanych z płuc ujawniła obecność markerów aktywowanych granulocytów obojętnochłonnych, ale nie naciek leukocytów charakterystycznych dla masywnej odpowiedzi zapalnej (ARDS). Analiza komórek śledziony wykazała negatywną ekspresję CD11b lub CD69, co sugeruje, że preparaty zawierające monofosforylo-lipid-A oraz efekty ich stosowanie nie były ogólnoustrojowe, lecz ograniczały się do płuc.

P r z y k ł a d 2

Ochrona przed śmiertelną ekspozycją na wirus grypy poprzez profilaktyczne podawanie monofosforylo-lipidu-A

Dawkę 20 μg monofosforylo-lipidu-A (MPL) podano grupom samic myszy BALB/c drogą donosową (i.n.) na 2 dni przed lub w dniu śmiertelnej ekspozycji na grypę. Wszystkie myszy eksponowano około 2 LD50 wirusa grypy A/HK/68, podawanego i.n. Śmiertelność monitorowano przez 21 dni po ekspozycji na wirusa grypy. Wyniki tych doświadczeń przedstawiono na fig. 1. Dane te wskazują, że donosowe podawanie monofosforylo-lipidu-A promuje niespecyficzną oporność na zakażenie drogą śmiertelnej ekspozycji na wirusa grypy u myszy.

P r z y k ł a d 3

Objawy kliniczne po podaniu do nosa L-serylo-amino-alkilo-glukozaminido-fosforanów (AGP)

Serię związków L-serylo-aminoalkilo-glukozaminido-fosforanowych (AGP) wytworzono w sposób opisany w opisie patentowym US 6113918, z 5 września 2000 r. oraz zgłoszeniu patentowym US 09/439839, z 12 listopada 1999 r., przy czym obie te pozycje należy w całości traktować jako źródła literaturowe.

Dawkę 20 μg różnych L-serylo AGP (RC-526, RC-554, RC-555, RC-537, RC-527, RC-538, RC-560, RC-512 oraz sam nośnik) podano grupom samic myszy BALB/c do nosa (i.n.) Podczas

PL 206 832 B1 pierwszych dni po podaniu AGP monitorowano myszy pod ką tem subiektywnych oznak choroby (tzn. wskaźnika choroby), w tym obserwowano zmierzwienie sierści, zgarbioną postawę oraz oddychanie z wysiłkiem. Wyniki tych doświadczeń przedstawia fig. 2. Uzyskane dane wskazują, że podawanie do nosa RC-537, RC-527, RC-538 i RC-560 wywołuje pewną toksyczność u myszy w zastosowanej dawce 20 μg.

P r z y k ł a d 4

Objawy kliniczne donosowego podania L-serylo-aminoalkilo-glukozaminido-fosforanów (AGP) oraz ekspozycji na wirusa grypy

Dawkę 20 μg różnych L-serylo AGP (RC-526, RC-554, RC-555, RC-537, RC-527, RC-538, RC560, RC-512 oraz sam nośnik) podano grupom samic myszy BALB/c drogą donosową (i.n.) 2 dni przed lub w dniu śmiertelnej ekspozycji na grypę. Wszystkie myszy eksponowano na około 2 LD50 wirusa grypy A/HK/68, podawanym i.n. W dniach 4 - 19 po stymulacji wirusem grypy monitorowano wskaźnik choroby (zmierzwienie sierści, zgarbienie postawy oraz oddychanie z wysiłkiem). Spadek masy ciała i śmiertelność monitorowano przez 21 dni po ekspozycji na wirus grypy. Wyniki tych doświadczeń przedstawia fig. 3.

Dane te wykazują skuteczność związków AGP (RC-538, RC-560 i RC-512) w wywoływaniu istotnego działania ochronnego po ekspozycji na wirus grypy.

P r z y k ł a d 5

Porównanie RC-552 i MPL z zastosowaniem hodowli pełnej ludzkiej krwi oraz mysich hodowli śledziony

Przykład ten ujawnia indukcję cytokin poprzez syntetyczny lipid A (RC-552) w porównaniu ze zmodyfikowanym naturalnym monofosforylolipidem A (MPL) z zastosowaniem hodowli pełnej ludzkiej krwi oraz mysich hodowli śledziony.

Związki typu lipid A badano poprzez roztworzenie w 0,2% trietanoloaminie w sterylnej wodzie do irygacji, inkubowano w temperaturze 56°C oraz rozbijano ultradźwiękami 2 x 10 minut w temperaturze 37°C. LPS 055B5 (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) rozcieńczano w PBS.

Związki dodano do 450 μl pełnej ludzkiej krwi i inkubowano w trakcie mieszania przez 5-24 godziny. Wybrano trzy donory (fig. 4-6, donory odpowiednio A-C). Supernatanty zbierano poprzez wirowanie i rozcieńczano do 1/2 równą objętością PBS. (Tego rozcieńczenia nie traktowano jako czynnika rozcieńczającego w obliczeniach cytokin). Powstawanie cytokin mierzono metodą ELISA (R&D Systems; Minneapolis, MN) z użyciem koniecznej objętości supernatantu w pełnej sile lub rozcieńczonego aż dziesięciokrotnie.

Myszy BALB/c, DBA/2 i C3H/HEJ pozyskiwano od The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Śledziony pobierano od myszy pomiędzy godziną 14 a 15, i z każdego szczepu myszy przygotowano oddzielne zawiesiny komórek. Krwinki czerwone poddawano lizie z użyciem roztworu Tris-chlorek amonu (Sigma-Aldrich), komórki płukano i liczono przy pomocy testu wykluczenia błękitu trypanu (Sigma-Aldrich). Komórki śledziony hodowano w ilości 1 milion/studzienkę w 1,0 ml podłoża do hodowli. Podłoże do hodowli śledziony (SCM) było przeznaczone do hodowli 5-dniowych lub dłuższych komórek śledziony myszy i zawierało RPMI 1640 (Sigma-Aldrich) z dodatkiem 5% płodowej surowicy bydlęcej (HyClone; Logan, UT), 100 μg/ml gentamycyny (Sigma-Aldrich), 250 ng/ml amfoterycyny (InVitrogen Life Technologies; Carlsbad, Kalifornia), 1 x ITS (insulina bydlęca 500 ng/ml, ludzka transferryna 500 ng/mLg, selenin sodu 250 ng/ml (Sigma), β-merkaptoetanol 43 nM (Sigma-Aldrich), kwas pirogronowy 1 mM (Sigma-Aldrich), HEPES 10 mM (Sigma-Aldrich). Dane z tych doświadczeń przedstawiono na fig. 8.

Z użyciem hodowli pełnej krwi ludzkiej zmierzono cztery cytokiny: IL-10, MIP-1e, TNFa oraz IL-8. Dwa donory zbadano jeden raz, a jeden donor dwukrotnie. Należy zauważyć, że donor, który badano dwukrotnie, miał bardzo wysoki poziom TNFa tła w jednym teście, ale bardzo niski poziom TNFa tła miesiąc później. Niemniej jednak istotny jest przedział czasowy hodowli. Wysokie TNFa tła uzyskiwano w hodowli 5,5-godzinnej, a niski poziom TNFa tła uzyskiwano w hodowli pozostawionej na noc, trwającej około 24 godzin. Niemniej jednak niska wartość tła stwierdzana w 5,5-godzinnej hodowli była wyższa (około 600 pg/ml) niż uzyskiwana w niektórych poprzednich hodowlach (518,2 pg/ml w teście 5-godzinnym, 417 pg/ml w teście 4-godzinnym, 0 pg/ml, 4 godz., osoba z niską odpowiedzią).

RC552 był podobny do MPL pod względem wytwarzania TNFa w dwóch z trzech hodowli 24-godzinnych oraz jednej hodowli 5,5-godzinnej. Niemniej jednak indukcja IL-8 przez RC552 różniła się od indukcji obserwowanej dla MPL w trzech spośród trzech przypadków. Indukcja IL-8 poprzez

PL 206 832 B1

RC552 malała w dwóch hodowlach pozostawianych na noc w porównaniu z MPL, ale w jednej hodowli pozostawionej na noc była wyższa niż MPL.

W przypadku hodowli pozostawianych na noc indukcja IL-10 przez RC552 był a niż sza niż w przypadku MPL. Indukcja MIP-Ιβ malała w jednej z 3 hodowli pozostawianych na noc.

Porównano odpowiedzi BALB/c i C3H/HEJ dla MPL i RC522.

Myszy C3H/HEJ mają genetycznie zdeterminowaną zmniejszoną odpowiedź na LPS ze względu na mutację receptora toll-4. W tych hodowlach jako pozytywną kontrolę stosowano oligonukleotydowy stymulator dla C3H/HEJ. Ten oligonukleotyd powodował indukcję dużej ilości IL-6 u myszy BALB/c (1000 pg/ml) oraz myszy C3H/HEJ (488,5 pg/ml). Podobnie, MIP-1e był indukowany w hodowlach BALB/c i C3H/HEJ (589 pg/ml i 554 pg/ml), podobnie IL-10 (342 pg/ml i 609 pg/ml) i TNFa (204 pg/ml i 30 pg/ml) w odpowiedzi na 10 μg/ml odpowiednio MPL lub RC552.

Ani MPL, ani RC552 nie powodowały indukcji odpowiedzi cytokinowej przy użyciu komórek śledziony C3H/HEJ. W hodowlach komórek śledziony BALB/c stwierdzano natomiast indukcję IL-10, MIP-1e, TNFa i IL-6. RC552 powodował mniejszą indukcję MIP-1e, TNFa i IL-6 niż MLP w tych samych stężeniach. RC552 powodował indukcję bardzo niewielkiej ilości IL-10 (10,4 -11,6 pg/ml) w porównaniu z MPL (1144,1 - 176,6 pg/ml).

W przypadku badania w roztworze 0,2% trietanoloaminy RC552 wykazywał podobny, chociaż nie identyczny profil prozapalny w odniesieniu do indukcji TNFa, jak MPL w dwóch z trzech hodowli pozostawionych na noc oraz jednej krótkotrwałej hodowli ludzkiej pełnej krwi. Patrz fig. 4-6 (pozostawione na noc hodowle dla dawców odpowiednio A-C) oraz fig. 7 (krótkotrwała hodowla dla dawcy A). Ponadto indukcja MIP-1e przez RC552 była podobna w dwóch z trzech hodowli pozostawionych na noc. RC552 indukował mniej IL-10 niż MPL w jednej hodowli pozostawionej na noc. Indukcja IL-8 była różna w porównaniu z MPL we wszystkich badanych przypadkach.

Z zastosowaniem myszy, u których brak było receptora, było jasne, że RC552 przekazuje sygnały poprzez receptor typu toll-4. U myszy BALB/c odpowiadających na lipid A RC552 indukował w badanych stężeniach obniżony profil cytokinowy. Co interesujące, badane stężenia znajdowały się na górnym końcu zależności dawka-odpowiedź, a RC552 indukował nieco więcej MIP-1e i TNFa w niższym badanym stężeniu (10 μg/ml) niż w stężeniu wyższym (20 μg/ml).

Porównując profile cytokinowe ludzkie i mysie syntetyczny lipid A (związek RC552) zmniejszał zdolność indukcji IL-10 w 2-dniowych hodowlach mysich komórek śledziony oraz w 1 z 3 ludzkich hodowli krwi pozostawionych na noc, gdy badano wysokie stężenia stymulatora. Ogólnie w hodowlach ludzkiej krwi pozostawionych na noc dochodziło do mniejszej indukcji TNFa pod wpływem RC552 niż MPL. Porównywalne poziomy TNFa były indukowane w krótkotrwałych (5,5 godziny) hodowlach ludzkiej krwi pod wpływem RC552 w porównaniu z MPL. Dane z mikrozestawów z zastosowaniem RNA uzyskanego od ludzkich makrofagów stymulowanych RC552 oraz MPL wskazują na wczesne (1 godz.) RNA dla TNFa dla obu związków, oraz brak późnego RNA dla TNFa dla obu związków. Niemniej jednak RC552 indukował bardzo niewiele TNFa po 6 godzinach, w przeciwieństwie do MPL, który prowadził do mierzalnego RNA po 6 godzinach.

P r z y k ł a d 6

Zdolność stymulująca RC529 w porównaniu z MPL i RC552

Przykład ten wykazuje, że RC529 charakteryzuje się lepszymi właściwościami stymulującymi układ immunologiczny niż MPL, przy ocenie wytwarzania IL-6, IL-10 i MIP-1e przez ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC). Natomiast wytwarzanie IL-8 było podobne jak w odpowiedzi na MPL.

PBMC przechowywano w postaci zamrożonej do momentu użycia. Donor PBMC oznaczono jako AD112. PBMC przy gęstości 6,26 X 10⁵ umieszczano w studzienkach na płytce 48-studzienkowej w 1,0 ml podłoża. Podłoże zawierało RPMI-1640 plus wodorowęglan sodu, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 4 mM glutaminy, 100 μg/ml gentamycyny i 10 mM HEPES. PBMC hodowano przez 22 godziny w temperaturze 37°C w inkubatorze z ditlenkiem węgla. Supernatanty zbierano i przy pomocy ELISA (R&D Systems) oznaczano w nich stężenie IL-6, IL-8, IL-10 i MIP-1e. Stężenia cytokin w supernatantach były porównywalne do stężenia w supernatantach pochodzących od niestymulowanych PBMC, hodowanych w ten sam sposób.

W badanych dawkach nie stwierdzono zależności dawka-odpowiedź RC529 dla najniższej dawki w stosunku do IL-6 ani IL-8. W porównaniu z MPL RC529 indukował więcej IL-6, IL-10 i MIP-1e. Związek disacharydowy, RC552, charakteryzował się ogólnie pośrednimi właściwościami stymulującymi w odniesieniu do masy (patrz fig. 9). Dane te wskazują, że RC529 jest silnym induktorem IL-6, IL-10 i MIP-1e dla mrożonych ludzkich PBMC.

PL 206 832 B1

Claims (29)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie jednego lub większej liczby związków opartych na mono- i disacharydach o wzorze:

   i ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, gdzie

   X oznacza -O- lub -NH-;

   R¹ i R² niezależnie oznaczają (C2-C24)acyl;

   R³ oznacza -H lub -PO3R¹¹R¹², gdzie R¹¹ i R¹² niezależnie oznaczają -H lub (C1-C₄)alkil;

   R⁴ oznacza -H, -CH3 lub -PO3R¹³R¹⁴ gdzie R¹³ i R¹⁴ niezależnie oznaczają -H lub (C1-C4)alkil; a Y oznacza gdzie dolne indeksy n, m, p i q niezależnie oznaczają liczby całkowite 0 - 6;

   R⁵ oznacza (C2-C24)acyl;

   R⁶ i R⁷ niezależnie oznaczają H lub CH3;

   C4)alkoksyl, -PO3H2, -OPO3H2,

   R⁸ i R⁹ są niezależnie wybrane z grupy obejmującej H, OH, (C1 -SO3H, -OSO3H, -NR¹⁵R¹⁶, -SR¹⁵, -CN, -NO2, -CHO, -CO2R¹⁵, -CONR¹⁵R¹⁶

   -PO₃R¹⁵R¹⁶,

   -OPO₃R¹⁵R¹⁶,

   -SO₃R¹⁵ i -OSO3R¹⁵, gdzie R¹⁵ i R¹⁶ niezależnie oznaczają H lub (C1-C₄)alkil;

   Z oznacza -O- lub -S-;

   3 11 12 4 13 14 przy czym gdy R³ oznacza -PO3R¹¹R¹² to R⁴ ma znaczenie inne niż -PO3R¹³R¹⁴, do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania chorobie zakaźnej, chorobie autoimmunologicznej lub stanowi alergicznemu u osobnika, w terapii bez stosowania egzogennego antygenu.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym chorobą lub stanem jest zakażenie bakteryjne lub wirusowe.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym chorobą lub stanem jest zapalenie płuc.

   PL 206 832 B1
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 3, w którym pacjent jest pacjentem HIV-pozytywnym.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 2, w którym chorobą lub stanem jest zakażenie przewlekłe.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 2, w którym chorobą lub stanem jest obniżona odporność.
7. 7. Zastosowanie według zastrz. 6, w którym chorobą jest przewlekła czopująca choroba płuc.
8. 8. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym choroba auto-immunologiczna jest wybrana z grupy obejmującej zapalną chorobę jelit, reumatoidalne zapalenie stawów, przewlekłe zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane i łuszczycę.
9. 9. Zastosowanie według zastrz. 8, w którym chorobą jest zapalna choroba jelit.
10. 10. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym stan alergiczny jest wybrany grupy obejmującej astmę, atopowe zapalenie skóry, sezonowe zaburzenie alergiczne i przewlekłe zapalenie zatok nosa.
11. 11. Zastosowanie według zastrz. 1, do modulacji wytwarzania cytokin.
12. 12. Zastosowanie według zastrz. 11, do zwiększania wytwarzania cytokin.
13. 13. Zastosowanie według zastrz. 11, do hamowania wytwarzania cytokin.
14. 14. Zastosowanie według zastrz. 1, do modulacji aktywności receptora typu Toll,
15. 15. Zastosowanie według zastrz. 14, w którym aktywność jest regulowana w górę.
16. 16. Zastosowanie według zastrz. 14, w którym aktywność jest regulowana w dół.
17. 17. Zastosowanie według zastrz. 1 - 16, związku, w którym co najmniej dwa spośród R¹, R² i R⁵ są wybrane spośród (C2-C6)acyli.
18. 18. Zastosowanie według zastrz. 17, związku, w którym dwa spośród R¹, R² i R⁵ są wybrane spośród (C2-C6)acyli, a całkowita liczba atomów węgla w R¹, R² i R⁵ wynosi 6-22.
19. 19. Zastosowanie według zastrz. 17, związku, w którym dwa spośród R¹, R² i R⁵ są wybrane spośród (C2-C6)acyli, a całkowita liczba atomów węgla w R¹, R² i R⁵ wynosi 12 - 18.
20. 20. Zastosowanie według zastrz. 1 - 16, związku, w którym R¹, R² i R⁵ są niezależnie wybrane spośród (C12-C24)acyli, przy czym całkowita liczba atomów węgla w R¹, R² i R⁵ wynosi 44 - 60.
21. 21. Zastosowanie według zastrz. 20, związku, w którym ta całkowita liczba atomów węgla wynosi 46 - 52.
22. 22. Zastosowanie według zastrz. 1 - 16, związku, w którym obydwa X i Z oznaczają -O-.
23. 23. Zastosowanie według zastrz. 1 - 16, w którym ten lek podaje się drogą pozajelitową, doustną, dożylną, drogą wlewu, drogą donosową, drogą inhalacji, przezskórnie i przez śluzówkę.
24. 24. Zastosowanie według zastrz. 1 - 16, w którym ten lek podaje się drogą donosową.
25. 25. Zastosowanie według zastrz. 1 - 16, w którym ten związek lub związki stosuje się w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych soli.
26. 26. Zastosowanie według zastrz. 1 - 16, w którym ten lek stosuje się w postaci kompozycji zawierającej ponadto jeden lub większą liczbę farmaceutycznie dopuszczalnych nośników.
27. 27. Zastosowanie według zastrz. 1 - 16, w którym ten lek stosuje się w postaci wodnej kompozycji zawierającej wodę i jeden lub większą liczbę środków powierzchniowo czynnych.
28. 28. Zastosowanie według zastrz. 27, w którym ten jeden lub większa liczba środków powierzchniowo czynnych wybrana jest z grupy obejmującej dimirystoilofosfatydyloglicerynę (DPMG), dipalmitoilofosfatydyloglicerynę (DPPG), distearoilofosfatydyloglicerynę (DSPG), dimirystoilofosfatydylocholinę (DPMC), dipalmitoilofosfatydylocholinę (DPPC), distearoilofosfatydylocholinę (DSPC); kwas dimirystoilofosfatydowy (DPMA), kwas dipalmitoilofosfatydowy (DPPA), kwas distearoilofosfatydowy (DSPA); dimirystoilofosfatydyloetanoloaminę (DPME), dipalmitoilofosfatydyloetanoloaminę (DPPE) i distearoilofosfatydyloetanoloaminę (DSPE).
29. 29. Zastosowanie według zastrz. 27, w którym stosunek molowy związku lub związków do środka powierzchniowo czynnego wynosi 10:1 do 1:10.

    PL 206 832 B1

    Niespecyficzne działanie ochronne na myszy przeciw śmiertelnej ekspozycji na grypę