PL195917B1

PL195917B1 - Nowe peptydy - analogi ludzkiego hormonu uwalniającego hormon wzrostu

Info

Publication number: PL195917B1
Application number: PL350463A
Authority: PL
Inventors: Jan Izdebski; Danuta Kunce; Alicja Orłowska; Ewa Witkowska; Wiesław Szelejewski; Andrzej Kutner; Krzysztof Bańkowski; Elżbieta Frąckiewicz
Original assignee: Inst Farmaceutyczny; Zaklady Farm Polpharma Sa
Priority date: 2001-10-31
Filing date: 2001-10-31
Publication date: 2007-11-30
Also published as: US7928063B2; JP4401170B2; WO2003037928A2; EP1442059B1; EP1442059A2; CA2465667C; JP2005517633A; SI1442059T1; WO2003037928A3; EA007841B1; HUP0401589A2; EA200400603A1; US20060172927A1; HUP0401589A3; AU2002351536A1; ES2282494T3; PL350463A1; HU229220B1; CA2465667A1; ATE353917T1

Abstract

1. Peptydy - analogi ludzkiego hormonu uwalniajacego hormon wzrostu posiadajace sekwencje aminokwasów przedstawiona wzorem I: Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr 10 -R 11 -R 12 -Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-R 20 -R 21 -Leu-Leu- -Gln-Asp-lle-Nle-Asp-R 29 -NH 2 , w którym: R 11 stanowi hArg, Gab albo Gap; R 12 stanowi hArg, Orn, Gab albo Gap; R 20 stanowi hArg, Gab albo Gap; R 21 stanowi hArg, Orn, Gab albo Gap; R 29 stanowi D-Arg, hArg, Gab albo Gap; oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne sole. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są nowe peptydy - analogi ludzkiego hormonu uwalniającego hormon wzrostu, sposób otrzymywania nowych peptydów i ich zastosowanie w lecznictwie.

Uwalnianie i produkcja ludzkiego hormonu wzrostu (GH) znajdują się pod stałą kontrolą dwu antagonistycznych hormonów podwzgórza - hormonu hamującego (somatostatyny) oraz pobudzającego wydzielanie GH. Terapia oparta na podawaniu ludzkiego hormonu uwalniającego hormon wzrostu (hGH-RH) może być stosowana u większości pacjentów z niedoborem GH. Stwierdzono, że najkrótszym fragmentem zachowującym pełną biologiczną aktywność endogennego hGH-RH, zawierającego w swym łańcuchu 44 reszty aminokwasowe, jest jego N-końcowy analog hGH-RH(1-29)-NH2, który może być otrzymywany na drodze syntetycznej. Syntetyczny GH-RH(1-29)NH2 pod nazwą sermorelin acetate jest zatwierdzony do stosowania w niedoborze wzrostu u dzieci, a ponadto znajduje się w badaniach w zaburzeniach neurosekrecji, jako środek wspomagający gonadotropinę w wywoływaniu owulacji u kobiet z bezpłodnością i katabolizmie towarzyszącym AIDS.

Stwierdzono jednak, że hGH-RH(1-29)-NH2 jest stosunkowo mało odporny na działanie enzymów. Główne obserwowane metabolity są charakterystyczne dla rozpadu wiązań pomiędzy Arg¹¹-Lys¹²i Lys¹²-Val¹³ wywołanego przez enzymy podobne do trypsyny (L.A. Frohman, T.R. Downs, E.P. Heimer, A.M. Felix, J. Glin. Invest. 1989, 83, 1533-1540). Ostatnio wykazano, że w czasie trawienia trypsyną analogu hGH-RH(1-29)-NH2 hydroliza wiązań peptydowych następuje od strony grupy karboksylowej wszystkich zasadowych reszt aminokwasowych, z C-końcowym wiązaniem amidowym włącznie, podczas gdy dla analogu różniącego się tym, że zamiast reszt Lys zawiera Orn, hydrolizie ulegają wiązania tylko w sąsiedztwie reszt Arg (E. Witkowska, A. Orłowska, B. Sagan. M. Smoluch, J. Izdebski, J. Peptide Sci., 2000, 6 (Suppl.), 189; E. Witkowska, A. Orłowska, B. Sagan. M. Smoluch, J. Izdebski, J. Peptide Sci., 2001, 7, 166-172). To odkrycie pozostaje w zgodzie z wyjątkowo wysoką biologiczną aktywnością in vivo analogów zawierających Orn w pozycji 12 i 21 (J. Izdebski, J. Piński, J.E. Horwath, G. Halmos, K. Groot, A.V. Schally, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1995, 92, 4872-4876).

Problem nietrwałości analogu hGH-RH(1-29)-NH2 próbowano przezwyciężyć m.in. zastępując w sekwencji aminokwasu Arg w pozycji 29 przez Agm (4-guanidyno-butyloaminę) (Bajusz i in., w Peptides 1982, pod red. Blaha i Melon, W. De Gruyter, Berlin-Nowy Jork, 1983, str. 643-647), Tyr w pozycji 1 przez Dat (dezaminotyrozynę), Lys w pozycji 12 przez D-Lys, Arg lub Orn (międzynarodowe zgłoszenia patentowe WO 94/11396 i 94/11397).

Rezultaty tych prób pozostają jednak niezadowalające i wciąż istnieje potrzeba uzyskania analogów o podwyższonej zdolności uwalniania hormonu wzrostu i wyższej odporności na degradację enzymatyczną, które pozwoliłyby na zmniejszenie dawek leku i ograniczenie częstości ich podawania pacjentom.

Obecnie Twórcy wynalazku stwierdzili, że wprowadzenie do analogu ludzkiego hormonu uwalniającego hormon wzrostu aminokwasów zawierających ugrupowanie guanidynowe w łańcuchu bocznym w pozycje zajmowane w naturalnym peptydzie przez Lys i Arg, a także D-Arg w pozycję 29, nie tylko prowadzi do uzyskania analogów o wyższej aktywności biologicznej uwalniania hormonu wzrostu, ale także korzystnie wpływa na zwiększenie enzymatycznej trwałości peptydu.

Nowe peptydy - analogi ludzkiego hormonu uwalniającego hormon wzrostu posiadają sekwencję aminokwasów przedstawioną wzorem I:

Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-R¹¹-R¹²-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-R²⁰-R²¹-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-R²⁹-NH2 gdzie:

R¹¹ stanowi hArg, Gab albo Gap;

R¹² stanowi hArg, Orn, Gab albo Gap;

R²⁰ stanowi hArg, Gab albo Gap;

R²¹ stanowi hArg, Orn, Gab albo Gap;

R²⁹ stanowi D-Arg, hArg, Gab albo Gap.

Nowe peptydy wykazują silne i selektywne działanie stymulujące uwalnianie hormonu wzrostu oraz wysoką odporność na działanie enzymów.

Korzystne peptydy według wynalazku wybrane są z grupy obejmującej:

(1) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-hArg-hArg-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg²⁰-hArg-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-hArg²⁹-NH2

PL 195 917 B1 (2) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-hArg-Orn-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg²⁰-Orn-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-hArg²⁹-NH2 (3) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Gab-Gab-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Gab-Gab-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-Gab-NH2 (4) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-hArg-Gab-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Gab-Gab-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-Gab-NH2 (5) Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Gab-hArg-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-hArg-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-D-Arg-NH2 (6) Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-hArg-Gab-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-hArg-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle Asp-D-Arg-NH2 (7) Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Gap-Gap-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Gap-Gap-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-Gap-NH2 (8) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Gap-Gap-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-Gap-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-Gap-NH2.

Peptydy szczególnie korzystne pod względem aktywności biologicznej oraz odporności na działanie enzymów trawiennych stanowią:

Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-hArg-hArg-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg²⁰-hArg-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-hArg²⁹-NH2 i

Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-hArg-Orn-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg²⁰-Orn-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-hArg²⁹-NH2.

Nowe peptydy są przydatne w profilaktyce i leczeniu zaburzeń związanych z działaniem ludzkiego hormonu uwalniającego hormon wzrostu, a zatem można je stosować w niedoborach wzrostu u dzieci, w zaburzeniach związanych ze starzeniem się, do zwiększenia nietłuszczowej masy ciała i gęstości mineralnej kości, w leczeniu ran, oparzeń, złamań kości, jak również jako niesteroidowy czynnik anaboliczny w przewlekłych chorobach powodujących osłabienie, a także w diagnostyce.

W leczeniu zaburzeń związanych z działaniem ludzkiego hormonu uwalniającego hormon wzrostu sposobem według wynalazku pacjentowi potrzebującemu takiego leczenia podaje się terapeutycznie skuteczną ilość peptydu - analogu hGH-RH posiadającego sekwencję aminokwasów przedstawioną wzorem I.

Dobór dawki peptydu i schematu dawkowania zależy od rodzaju choroby, wieku, wagi i stanu zdrowia chorego i może być określony przez specjalistę w oparciu o znane schematy leczenia i profilaktyki chorób związanych z niedoborem ludzkiego hormonu uwalniającego hormon wzrostu. W leczeniu tego typu chorób odpowiednia dawka dzienna analogu hGH-RH wynosi zazwyczaj od 0,01 do 2 m g na kilogram masy ciała.

Odpowiednia dawka dzienna może być podawana choremu w postaci jednej lub kilku jednostek dawkowania, z wyjątkiem postaci o przedłużonym działaniu, którą podaje się raz na 15 albo 30 dni albo raz na trzy miesiące.

Peptydy według wynalazku zazwyczaj podaje się pacjentowi w postaci środka farmaceutycznego, dowolną dogodną drogą, taką jak droga dożylna, podskórna, domięśniowa, doustna, donosowa lub wziewna.

Nowe peptydy można ewentualnie podawać w połączeniu z innymi środkami terapeutycznymi używanymi w leczeniu zaburzeń związanych z działaniem ludzkiego hormonu uwalniającego hormon wzrostu. Związki takie można podawać jednocześnie w postaci jednego preparatu lub osobnych preparatów, albo kolejno po sobie w ustalonej przez specjalistę kolejności i odstępach czasu.

Środek farmaceutyczny według wynalazku zawiera co najmniej jedną substancję aktywną, którą stanowi peptyd - analog hGH-RH posiadający sekwencję aminokwasów przedstawioną wzorem I lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól oraz co najmniej jeden nośnik i/lub substancję pomocniczą.

Środkowi farmaceutycznemu według wynalazku można nadać różnorodne postaci farmaceutyczne, dobrze znane specjalistom, np. z wydawnictwa Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 18, Mack Publ. Co.

Postaci środków farmaceutycznych do iniekcji i wlewów obejmują jałowe roztwory wodne, wodno-organiczne i niewodne, zawiesiny, substancje suche oraz tabletki do sporządzania roztworów lub implantacji. Do sporządzania zawiesiny używa się substancji pomocniczych zapewniających równomierne rozproszenie substancji leczniczej w fazie ciekłej, takich jak polisorbaty, lecytyna, kopolimery polioksyetylenu z polioksypropylenem, peptyzatorów, takich jak fosforany, polifosforany i cytryniany, rozpuszczalnych w wodzie polimerów takich jak karboksymetyloceluloza, metyloceluloza, poliwinylopi4

PL 195 917 B1 rolidon, gumy lub żelatyna. Środki do iniekcji mogą zawierać farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze, takie jak środki nadające odpowiedni odczyn pH i buforujące, zmieniające toniczność i konserwujące. Substancje suche przeznaczone są do przygotowania roztworu lub zawiesiny ex tempore, przez rozcieńczenie za pomocą odpowiedniego rozpuszczalnika.

Dla wygody pacjenta i uzyskania odpowiedniej charakterystyki uwalniania substancji, pochodne peptydów dogodnie jest podawać w postaci preparatów iniekcyjnych o przedłużonym działaniu, w postaci krystalicznych polimerycznych mikrosfer, w których zamknięta jest substancja biologicznie czynna. Przykład innego preparatu o przedłużonym działaniu stanowi implantant na bazie polimerowej, w którym biodegradowalny polimer i substancję biologicznie czynną rozpuszcza się w rozpuszczalniku mieszającym się z wodą do uzyskania ciekłej kompozycji. Po jej wstrzyknięciu do organizmu polimer tworzy stały depot, z którego uwalnia się substancja czynna.

Postaci farmaceutyczne leków do podawania drogą doustną obejmują tabletki, pigułki, proszki, granulki, peletki lub kapsułki, zawierające stałe dopuszczalne farmaceutycznie nośniki, takie jak skrobia kukurydziana, laktoza, sacharoza, sorbitol, talk, kwas stearynowy, stearynian magnezu, fosforan dwuwapniowy lub gumy. Tabletki lub granulki można powlekać lub przetwarzać w inny sposób dla uzyskania jednostki dawkowania zapewniającej korzystne wydłużone działanie. Do wytwarzania takich warstw zabezpieczających lub powlekających można stosować szereg różnych substancji, obejmujących różnorodne kwasy polimeryczne i mieszaniny kwasów polimerycznych z takimi substancjami jak szelak, alkohol cetylowy lub octan celulozy.

Środek farmaceutyczny zawierający peptyd jako substancję czynną może mieć także postać odpowiednią do podawania w postaci aerozolu lub proszku do inhalacji. Typowy preparat aerozolowy, oprócz substancji czynnej w roztworze wodnym, może zawierać substancje buforujące i izotoniczne, oraz środki konserwujące i ewentualnie inne substancje pomocnicze ułatwiające podawanie substancji czynnej za pomocą kroplomierza lub rozpylacza z dozownikiem.

Nowe peptydy według wynalazku można wytwarzać jedną ze znanych metod syntezy chemicznej, takich jak klasyczna synteza w roztworze lub synteza w fazie stałej.

W syntezie w roztworze końcowe, odpowiednio zabezpieczone N- a-aminowe (z zabezpieczonymi łańcuchami bocznymi, jeśli są obecne reaktywne łańcuchy boczne) pochodne aminokwasów lub fragmenty peptydów sprzęga się z odpowiednio zabezpieczonymi karboksylowymi pochodnymi aminokwasów lub fragmentów peptydów. Funkcję a-aminową zasadniczo zabezpiecza się w postaci ochrony uretanowej, takiej jak nietrwała w warunkach kwaśnych grupa t-butyloksykarbonylowa (Boc), grupa benzyloksykarbonylowa (Z) i ich podstawionych analogów lub w postaci nietrwałej w warunkach zasadowych ochrony 9-fluorofenylo-metyloksykarbonylowej (Fmoc). Funkcje karboksylowe można chronić przez utworzenie estru, na przykład nietrwałego w warunkach zasadowych estru metylowego, nietrwałego w warunkach kwaśnych estru t-butylowego lub nietrwałego w warunkach wodorolizy estru benzylowego. Grupy karboksylowe w chronionej strukturze poddaje się aktywacji metodą azydkową, metodą mieszanych bezwodników, metodą aktywowanych estrów, metodą soli fosfoniowych lub uroniowych lub metodą z użyciem karbodiimidów, z użyciem związków katalizujących reakcję i hamujących racemizację, takich jak N-hydroksysukcynimid, 1-hydroksybenzotriazol, 1-hydroksy-7-azabenzotriazol lub 3-hydroksy-4-okso-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazyna. Przegląd sposobów kondensacji oraz grup ochronnych stosowanych powszechnie w chemii peptydów, podano na przykład w publikacji Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, t. 3, wyd. E.Gross, J.Meienhofer (Academic Press, Nowy Jork, 1981) i Protective Groups in Organic Synthesis, wyd. II (Wiley, Nowy Jork, 1991).

W metodzie syntezy w fazie stałej, zaproponowanej przez Merrifielda (J. Amer. Chem. Soc. 85 (1963), 2149), stosuje się nierozpuszczalny w stosowanych w reakcji rozpuszczalnikach nośnik polimeryczny, zawierający grupę funkcyjną, do której można trwale przyłączyć pierwszy aminokwas. Peptyd buduje się na polimerycznym podłożu przez przyłączanie kolejnych aminokwasów, przy czym łańcuch peptydowy jest związany wiązaniem kowalencyjnym przy C-końcu z cząstkami polimeru. Odpowiednie jako nośniki polimery stanowią np. celuloza, polialkohol winylowy, polimetakrylany, chlorometylowany kopolimer styren/diwinylobenzen, 4-metylobenzhydryloamino-żywica (żywica MBHA), benzhydryloamino-żywica (BHA) i inne. Syntezę peptydów na nośniku polimerycznym prowadzi się w organicznych rozpuszczalnikach obojętnych w warunkach reakcji, w których są rozpuszczalne stosowane pochodne aminokwasów. Korzystne są rozpuszczalniki, które dodatkowo wykazują własności spęczniania żywicy, takie jak dimetyloformamid, dichlorometan, N-metylo-2-pirolidon, acetonitryl, sulfotlenek dimetylu i ich mieszaniny. Grupy ochronne każdej reszty alfaaminowej usuwa się po każdorazowym przyłączeniu kolejnego aminokwasu. Po przyłączeniu odpowiednich aminokwasów w żądanej

PL 195 917 B1 sekwencji, peptyd ostrożnie uwalnia od wszystkich pozostałych grup chroniących łańcuchy boczne metodami znanymi z literatury, odszczepia od polimerycznego nośnika i poddaje się oczyszczaniu, na przykład metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej.

Nowe peptydy - analogi GH-RH według wynalazku, zawierające w łańcuchach bocznych aminokwasów grupę guanidynową, korzystnie otrzymuje się metodą syntezy w fazie stałej, wbudowując w łańcuch peptydowy połączony z polimerycznym nośnikiem odpowiednie pochodne lizyny, kwasu 2,4-diaminomasłowego lub kwasu 2,3-diaminopropionowego i po usunięciu ochrony grup aminowych w łańcuchu bocznym wymieniając je na grupy guanidynowe przez działanie czynnikiem guanidynującym, a następnie po usunięciu wszystkich pozostałych t-butyloksykarbonylowych grup ochronnych otrzymany peptyd odszczepia się od nośnika, oczyszcza i ewentualnie przeprowadza się w farmaceutycznie dopuszczalną sól.

W reakcji guanidynowania stosuje się nadmiar molowy odpowiedniego czynnika guanidynującego, takiego jak na przykład N,N'-bis(tert-butyloksykarbonylo)-S-metyloizotiomocznik, w obecności promotora reakcji, na przykład 4-(dimetyloamino)pirydyny.

Otrzymany peptyd dla uzyskania wysokiej czystości odpowiedniej do zastosowań farmaceutycznych poddaje się oczyszczaniu, korzystnie metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej.

Nowe peptydy można wyodrębnić z mieszaniny reakcyjnej w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych soli z różnymi nieorganicznymi i organicznymi kwasami i zasadami. Nowe peptydy mogą tworzyć farmaceutycznie dopuszczalne sole z kwasami nieorganicznymi, takimi jak kwas solny, bromowodorowy, siarkowy, azotowy lub fosforowy albo kwasami organicznymi, takimi jak kwas octowy, propionowy, maleinowy, fumarowy, malonowy, bursztynowy, winowy, cytrynowy, askorbinowy, jabłkowy, szczawiowy, cynamonowy, migdałowy, benzoesowy, metanosulfonowy, etanosulfonowy, p-tolueno-sulfonowy i inne.

Można też otrzymywać sole w wyniku reakcji ugrupowania karboksylowego peptydu z metalami alkalicznymi, wodorotlenkami i alkoholanami metali alkalicznych, jak również z zasadami organicznymi, takimi jak trimetyloamina, dietyloamina, etanoloamina, piperydyna, cholina i inne.

Sole można otrzymywać znanymi sposobami, w reakcji produktu w postaci wolnego kwasu lub zasady z jednym lub większą liczbą równoważników odpowiedniej zasady lub kwasu w rozpuszczalniku lub w środowisku, w którym sól jest nierozpuszczalna.

W korzystnym wariancie obecnego wynalazku nowe peptydy - analogi hGH-RH są w postaci octanu.

Badanie aktywności biologicznej

Dla dokonania oceny skuteczności peptydów według wynalazku badano ich wpływ na poziom hormonu wzrostu i pozostałych hormonów przysadki w plazmie szczurów oraz porównywano je z wpływem fragmentu hGH-RH(1-29)NH2 jako substancją odniesienia.

W badaniach stosowano hGH-RH(1-29)NH2 pochodzący z Sigma Chemical Co. oraz peptydy analogi hGH-RH syntetyzowane sposobem według wynalazku.

Szczury samce rasy Wistar o wadze 240 - 260 mg utrzymywano w kontrolowanych warunkach (14 godzin światło, 10 godzin ciemność), zaopatrując w karmę w peletkach i wodę ad libitum. Zwierzęta przydzielono losowo do grup eksperymentalnych, otrzymujących sól fizjologiczną (0,9%; 0,3 ml), hGH-RH(1-29)NH2 w dawkach 50 lub 150 mg/kg masy ciała orazpeptydy według wynalazku w dawkach 1lub 3 mg/kg masy ciała. Pojedyncze dawki peptydu wzorcowego i nowych analogów podawano zwierzętom podskórnie (sc.),rozpuszczone w 0,3 ml soli fizjologicznej.

W dniu eksperymentu szczury znieczulano, wstrzykując dootrzewnowo (ip.) ketaminę (120 mg/kg) i do żyły szyjnej zakładano kaniulę do ciągłego pobierania krwi. Po 30 minutach wstrzykiwano podskórnie substancję testowaną. Grupa kontrolna zwierząt otrzymywała wyłącznie roztwór soli fizjologicznej. Krew (ok. 0,6 ml) pobierano z żyły szyjnej na 1minutę (próbka „0”) przed oraz 15 i 30 minut po wstrzyknięciu substancji badanej. Pobraną krew uzupełniano heparynizowanym roztworem soli (10 UI/ml). Na zakończenie eksperymentu zwierzęta uśmiercano ketaminą. Próbki krwi odwirowywano, oddzielone próbki plazmy (ok. 0,3 ml) przechowywano w temp. -20°C do czasu poddania analizie.

Stężenia hormonu wzrostu, prolaktyny, lutropiny, folitropiny i tyreotropiny (GH, PRL, LH, FSH i TSH) w plazmie oznaczano metodą radioimmunologiczną z użyciem zestawów z Biotrak (Amersham Life Science, Wlk. Brytania); próbki po 0,05 ml; czułość oznaczenia poszczególnych hormonów odpowiednio 0,16, 0,08, 0,08, 0,09 i 0,05 ng/probówkę.

Analizę statystyczną wyników przeprowadzono za pomocą oprogramowania Statsoft Statistica PL dla Windows. Wszystkie grupy danych wstępnie oceniano pod kątem normalności testem Kolmogarova-Smirnova i Shapir-Wilka. Różnice statystyczne pomiędzy grupami określano w jednokierunkowym teście ANOVA. Porównania wyników post hoc dokonywano w wielozakresowym teście Dun6

PL 195 917 B1 can'a. Dane poddawano obróbce za pomocą jednokierunkowego testu ANOVA, a następnie wielozakresowego testu Duncan'a, a w przypadku odchyleń niejednorodnych metodą analizy nieparametrycznej Kruskal-Wallis.

Stężenie hormonów netto wyrażano jako różnicę pomiędzy stężeniem po 15 minutach od wstrzyknięcia związku i stężeniem hormonu przed iniekcją (Δ15-0) oraz pomiędzy stężeniem po 15 i 30 minutach od wstrzyknięcia związku (Δ15-30).

Oceny wpływu poszczególnych związków na uwalnianie GH dokonywano przez porównanie średniego stężenia GH netto (Δ15-0) po podaniu peptydu wzorcowego hGH-RH-(1-29)-NH₂ w dawkach 50,0 i 150,0 mg/kg masy ciała oraz nowych związków podanych w dawkach 1,0 i 3,0 ng/kg masy ciała. Wyniki dla wybranego związku (1) przedstawiono w tabelach 1i 2. Znaczenie statystyczne wyników pomiędzy grupami zwierząt określano za pomocą testu Kruskal-Wallis z modyfikacją Lillietor.

Tabela 1

Wpływ podskórnego podawania analogów hGH-RH na uwalnianie GH u szczurów samców

Związek	Dawka [mg/kg]	Liczebność grupy	Stężenia GH w plazmiepo podaniu s.c. [ng/ml]
			0 min	15 min	30 min
Sól	50	11	21,4±2,9	19,8±3,9	17,8±2,7
HGH-RH (1-29)-NH2	50	11	24,5±2,7	79,1±7,9*	39,0±5,9*
150	11	27,1±3,2	163±18**	103±15**
Związek 1	1	9	23,1±2,0	99,1±16**	42,5±9,2*
3	9	28,3±4,1	130±16**	58,4±8,9**

Rezultaty wyrażono jako średnią ±SEM. *P <,01 względem grupy kontrolnej ** P <0,001 względem grupy kontrolnej

Tabela 2

Zmiany średniego stężenia GH netto po podaniu podskórnym analogów hGH-RH

Związek	Dawka [mg/kg]	Liczebność grupy	Stężenie GH netto w zależności od czasu [ng/ml]
			Δ(15-0)#	Δ(15-30)#
Sól		11	-1,59±1,5	1, 97±1,5
HGH-RH (1-29) -NH2	50	11	54,6±7,9**	40,1±6,7**
150	11	135+16,9**	59, 9±16,6**
Związek 1	1	9	75,9±16,0**	56,5±14,7**
3	9	102±12,6**	72,0±12,6**

Rezultaty wyrażono jako średnią ± SEM.

Zmiany GH w osoczu (AGH) wyrażono w postaci GH netto obliczanej dla każdego szczura.

# Δ(15-0) obliczano jako różnicę stężeń GH po 15 minutach od podania i przed wstrzyknięciem związku badanego („minuta 0”).

# Δ(15-30) obliczano jako różnicę stężeń GH po 15 minutach od podania i po 30 minutach od wstrzyknięcia związku badanego. *P<0,01 względem grupy kontrolnej.

** P <0,001 względem grupy kontrolnej.

PL 195 917 B1

Uzyskane rezultaty wskazują, że badane analogi hGH-RH w porównaniu z kontrolnym roztworem soli fizjologicznej wykazują działanie stymulujące uwalnianie hormonu wzrostu u szczura. Najsilniejsze działanie stymulujące wykazuje związek oznaczony jako (1). Maksymalny efekt stymulujący obserwowano po 15 minutach od podania. Efekt ten utrzymywał się przez 30 minut. Wpływ związku (1) na stężenie GH netto po 15 minutach był porównywalny ze stężeniem GH netto analogu hGH-RH-(1-29)NH2, zastosowanego w dawce 50 razy wyższej. Moc względną związku (1) oceniano na podstawie dawki 1,0 i 3,0 mg/kg masy ciała, zaś hormonu hGH-RH-(1-29)NH2 na podstawie dawki 50,0 i 150,0 mg/kg masy ciała. Aktywność względna związku (1) po 15 minutach od podania była, zależnie od dawki, 70 i 38 razy wyższa niż w przypadku hGH-RH-(1-29)NH2.

W badaniach wykazano ponadto, że nowe związki według wynalazku działają selektywnie i nie wykazują wpływu na poziom pozostałych hormonów przysadkowych -prolaktyny, lutropiny, folitropiny i tyreotropiny w krwi obwodowej szczura.

Otrzymane związki poddano również testowi na odporność enzymatyczną w teście trawienia peptydów trypsyną.

Próbkę peptydu (1,2 mg) rozpuszczano w buforze o pH 8,5 (2,9 ml; 0,05 M roztwór octanu amonu) i inkubowano w temperaturze 37°C przez 20 min. Następnie dodawano roztwór trypsyny (100 ml; 0,02 mg/ml; Serva, 36 U/mg). Uzyskany roztwór inkubowano w temperaturze 37°C przez 60 min. Próbkę roztworu (500 ml) rozcieńczano 0,5 M roztworem kwasu octowego (1ml) i liofilizowano. Analizę otrzymanego materiału przeprowadzano metodą HPLC stosując system Knauera z kolumną Eurospher 100 C18 (4 x 250 mm, 5 mm). Stosowano system rozpuszczalników: A, 0,1% roztwór TFA wwodzie, B, 80% roztwór MeCN w A; liniowy gradient 25 - 70% B; szybkość przepływu 1ml/min; detekcję prowadzono przy 220nm. Wyniki trawienia peptydów 1-8 przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 3

Wyniki trawienia analogów GH-RH trypsyną

Nr związku	Czas trawienia [min]	% analogu niezmienionego
1	2	3
	30	>99
1	60	>99
	30	>99
2	60	>99
	30	86
3	60	72
	30	82
4	60	67
	30	80
5	60	51
	30	85
6	60	73

PL 195 917 B1 ciąg dalszy tabeli 3

1	2	3
	30	75
7	60	68
	30	>99
8	60	>99
	30	0
'Wzorzec*	60	0

*Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Ser-Arg-NH2(hGH-RH(1-29)-NH2).

Przedstawione w tabeli 3 wyniki wskazują, że wszystkie nowe analogi hGH-RH mają znacznie większą odporność na trawienie trypsyną niż peptyd wzorcowy (hGH-RH(1-29)-NH2). W warunkach, w których peptyd wzorcowy ulega całkowitemu strawieniu, peptydy albo pozostają niezmienione (peptyd (1), (2) i (8)) albo po 30 minutach trawienia ulegają tylko częściowej hydrolizie.

Nowe peptydy według wynalazku charakteryzują się wysoką aktywnością uwalniania hormonu wzrostu, a jednocześnie działają selektywnie i nie wykazują wpływu na poziom innych hormonów przysadkowych - prolaktyny, lutropiny, folitropiny i tyreotropiny. Szczególnie korzystny peptyd o sekwencji aminokwasów Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-hArg-hArg-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-hArg-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-hArg-NH2 wykazuje wielokrotnie silniejszy wpływ na uwalnianie hormonu wzrostu niż wzorcowy peptyd GH-RH(1-29)-NH2, pozwalając na uzyskanie maksymalnego efektu stymulującego po 15 minutach. Związki według wynalazku wykazują jednocześnie znacznie większą odporność na działanie enzymów trawiennych od znanych syntetycznych analogów hGH-RH, co czyni je szczególnie przydatnymi w zastosowaniu do wytwarzania środków farmaceutycznych do leczenia i zapobiegania zaburzeń związanych z niedoborem hormonu wzrostu.

Wynalazek ilustrują następujące, nie stanowiące jego ograniczenia przykłady.

Dla oznaczenia aminokwasów przyjęto skróty powszechnie stosowane w nomenklaturze zalecanej przez IUPAC (np. Polskie Słownictwo Biochemiczne, red. A. Morawiecki, wyd. PWN 1974). Stosowane w obecnym opisie skróty mają następujące znaczenia:

Ala = alanina,

Arg = arginina, hArg = homoarginina,

ASP = kwas asparaginowy,

Asn = asparagina,

Dat = dezaminotyrozyna, kwas 3-(4-hydroksyfenylo)propionowy,

Gln = glutamina,

Gab = kwas 4-guanidyno-2-aminomasłowy,

Gap = kwas 3-guanidyno-2-aminopropionowy,

Ile = izoleucyna,

Leu = leucyna,

Nle = norleucyna,

Orn = ornityna,

Phe = fenyloalanina,

Ser = seryna,

Thr = treonina,

Tyr = tyrozyna,

Val = walina.

Wszystkie wymienione w opisie i przykładach sekwencje peptydowe zapisano zgodnie z ogólnie przyjętą konwencją, w której N-końcowy aminokwas jest po lewej, a C-końcowy aminokwas po prawej stronie. Jeśli nie powiedziano inaczej, aminokwasy występują w konfiguracji L.

PL 195 917 B1

Ogólna metodyka otrzymywania peptydów

A. Tworzenie łańcucha peptydowego.

Jako ochronę funkcji a-aminowej stosowano grupę t-butyloksykarbonylową (Boc), łańcuchy boczne aminokwasów zabezpieczano następującymi grupami: Asp - cykloheksyIową; Orn - benzyloksykarbonylową; Ser i Thr - benzylową; Tyr - 2-bromobenzyloksykarbonylową.

Aby uzyskać analogi zawierające resztę hArg w odpowiednie pozycje łańcucha peptydowego wprowadzono reszty lizyny stosując w syntezie pochodną Boc-Lys(Fmoc).

Aby uzyskać analogi zawierające reszty Gab i Gap w odpowiednie pozycje łańcucha peptydowego wprowadzono reszty kwasu 2,4-diaminomasłowego i kwasu 2,3-diaminopropionowego stosując w syntezie pochodne Boc-Dab(Fmoc) i Boc-Dap(Fmoc).

Aby uzyskać analogi zawierające resztę Orn w odpowiednie miejsca łańcucha peptydowego w syntezie wprowadzano pochodną Boc-Orn (Z).

Żywicę MBHA (4-metoksy-benzhydryloamino-żywica, Bachem California lub Novabiochem, ok. 0,5 meq/g), po spęcznieniu w dichlorometanie (DCM) przez 30 min traktowano 5% roztworem diizopropyloetyloaminy (DIEA) w DCM (1x 1 min, 1x 20 min) i przemyto DCM (6x 1 min).

Syntezę chronionego peptydopolimeru prowadzono wykorzystując standardowe procedury, w każdym etapie syntezy postępując według następującego protokołu:

(a) Usuwanie grupy Boc 55% roztworem kwasu trifluorooctowego (TFA) w DCM (1x1 min, 1 x 20 min);

(b) przemywanie DCM (3x 1 min);

(c) przemywanie 30% roztworem dioksanu w DCM (2x 1 min);

(d) przemywanie DCM (3x 1 min);

(e) zobojętnianie 5% roztworem DIEA w DCM (1x 1min, 1x 5 min);

(f) przemywanie DCM (6x 1 min);

(g) przyłączanie Boc-aminokwasu (1,2 mmola) metodą karbodiimidową z wykorzystaniem N,N'-diizopropylokarbodiimidu (DIC), 1,2 mmole, w DCM, czas trwania reakcji 2 godziny. W przypadku Boc-Gln i Boc-Asn do mieszaniny reakcyjnej dodawano N-hydroksybenzotriazol (HOBt), 1,2 mmola;

(h) przemycie DCM (6x 1 min).

B. Wprowadzanie grupy guanidynowej.

W celu usunięcia grupy Fmoc z reszty Lys, chroniony peptydopolimer poddawano działaniu 50% roztworu piperydyny w DMF (1 x 10 min, 1x 2 godziny), następnie żywicę przemywano dimetyloformamidem (DMF) (3 x 1 min), 50% roztworem DMF w DCM (2 x 1 min), 50% roztworem metanolu w DCM oraz DCM (3 x 2 min). Peptydopolimer poddawano reakcji z N,N'-bis(tertbutyloksykarbonylo)-S-metyloizotiomocznikiem (pięciokrotny nadmiar molowy) w obecności 4-(dimetyloamino)pirydyny (70 mg) w DMF przez 4 dni. Uzyskany peptydopolimer przemywano DMF (3 x 1 min), DCM (3x 1 min), usuwano grupy Boc działając 55% roztworem TFA w DCM (1 x 1 min, 1 x 20 min, 1 x 40 min) i przemywano DCM (3x 1 min), 50% roztworem DMF w DCM (2 x 1 min) i DCM (2x 1 min).

C. Odszczepienie peptydu od żywicy.

Peptydopolimer poddawano działaniu ciekłego kwasu fluorowodorowego (HF) w obecności anizolu. Reakcję prowadzono przez 1 godzinę w temp. 0°C. Po usunięciu HF pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość przemywano zimnym eterem dietylowym i ekstrahowano 50% roztworem kwasu octowego, po czym liofilizowano.

D. Oczyszczanie peptydu.

Surowe peptydy oczyszczano metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, stosując system Knauera z kolumną Vertex, Nucleosil-300 C18 (8 x 200 mm, 5 mm). Stosowano układ rozpuszczalników: A, 0,1% roztwór TFA w wodzie, B, 80% roztwór MeCN w A. Wymywanie prowadzono w systemie gradientowym: 20 - 55% B przez 30 minut, a następnie 55% B przez 30 minut, przy szybkości przepływu 2 ml/min. Frakcje analizowano z użyciem kolumny Vertex, Nucleosil-100 C18 (4 x 250 mm, μm) w układzie gradientowym 25 - 70% przez 30 minut; szybkość przepływu 1 ml/min. Detekcję prowadzono przy 220 nm. Jednorodne frakcje (chromatogramy zawierały jeden pik) łączono, rozcieńczano wodą i liofilizowano, otrzymując jednorodny chromatograficznie produkt. Strukturę peptydów potwierdzano za pomocą widma masowego ESI-MS (spektrometr Finnigan MAT 95S, Bremen, Niemcy).

PL 195 917 B1

P r z y k ł a d 1

Otrzymywanie Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-hArg-hArg-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-hArg-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-hArg-NH2 (związek (1))

Stosując powyższą ogólną metodykę syntezy (punkt A), wychodząc z 3,1 g MBH-żywicy (4-metoksy-benzhydryloamino-żywicy, Novabiochem, 0,49 meq/g) i przyłączając odpowiednio zabezpieczone pochodne aminokwasów otrzymano całkowicie blokowaną peptydylo-żywicę:

Dat-Ala-Asp(OcHex)-Ala-Ile-Phe-Thr(OBzl)-Asn-Ser(OBzl)-Tyr(2-Br-Z)-Lys(Fmoc)-Lys(Fmoc)-ValLeu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Lys(Fmoc)-Lys(Fmoc)-Leu-Leu-Gln-Asp(OcHex)-Ile-Nle-Asp(OcHex)-Lys(Fmoc)-żywica.

Postępując zgodnie z ogólną metodykę syntezy (punkt B) usunięto wszystkie grupy ochronne Fmoc, przeprowadzono wyczerpujące guanidynowanie i odbezpieczenie wszystkich grup Boc, otrzymując 9,53 g peptydylo-żywicy: Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-hArg-hArg-Val-Leu-Ala-GlnLeu-Ser-Ala-hArg-hArg-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-hArg-żywica.

Powyższą żywicę poddano działaniu ciekłego fluorowodoru (200 ml HF) w obecności anizolu (15 ml) wg ogólnej metodyki syntezy (punkt C), otrzymując 4,5 g surowego peptydu o czystości 50% według oznaczenia analitycznego HPLC.

Surowy peptyd (próbka 20 mg) oczyszczano metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC zgodnie z ogólną metodykę syntezy (punkt D). Otrzymano 4,3 mg tytułowego peptydu o czystości 92,3% (wg. HPLC).

Widmo masowe, dla C157H258O43N47, M = 3492,0; zarejestrowano:

[M+2H]²⁺: obliczono 1747,0, znaleziono 1747,6;

[M+3H]³⁺: obliczono 1165,0, znaleziono 1165,4;

[M+4H]⁴⁺: obliczono 874,0, znaleziono 874,0;

[M+5H]⁵⁺: obliczono 699,4, znaleziono 699,4.

P r z y k ł a d 2

W analogiczny sposób, wychodząc z odpowiednio zabezpieczonych aminokwasów otrzymano peptydy następujące:

2. Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-hArg-Orn-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg²⁰-Orn-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-nArg²⁹-NH2 ^C153^H251^O43^N43^{, M=3380,9.}

[M+3H]³⁺: obliczono 1128,0, znaleziono 1127,9;

[M+4H]⁴⁺: obliczono 846,2, znaleziono 846,2;

[M+5H]⁵⁺: obliczono 677,2, znaleziono 676,9.

3. Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Gab-Gab-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Gab-Gab-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-Gab-N2

C₁₄₇H₂₃₈O₄₃N₄₇, M=3351,8.

[M+3H]³⁺: obliczono 1118,3, znaleziono 1118,6;

[M+4H]⁴⁺: obliczono 839,0, znaleziono 839,2;

[M+5H]⁵⁺: obliczono 671,4, znaleziono 671,6.

4. Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-hArg-Gab-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Gab-Gab-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-Gab-NH2

C₁₄₉H₂₄₂O₄₃N₄₇, M=3379,8.

[M+4H]⁴⁺: obliczono 846,0, znaleziono 846,3;

[M+5H]⁵⁺: obliczono 677,0, znaleziono 677,2.

5. Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Gab-hArg-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-hArg-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-D-Arg-NH2 ^C154^H253^O43^N47^{, M=3451,0.}

[M+3H]³⁺: obliczono 1151,3, znaleziono 1152,0;

[M+4H]⁴⁺: obliczono 863,8, znaleziono 863,8.

[M+5H]⁵⁺: obliczono 691,2, znaleziono 691,6.

6. Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-hArg-Gab-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-hArg-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-D-Arg-NH2 ^C154^H253^O43^N47^{, M=3451,0.}

[M+3H]³⁺: obliczono 1151,3, znaleziono 1151,4;

[M+4H]⁴⁺: obliczono 863,8, znaleziono 863,6;

[M+5H]⁵⁺: obliczono 691,2, znaleziono 691,3.

PL 195 917 B1

7. Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Gap-Gap-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Gap-Gap-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-Gap-NH2

C₁₄₂H₂₂₉O₄₃N₄₇, M=3282,7.

[M+3H]³⁺: obliczono 1095,2, znaleziono 1095,3;

[M+4H]⁴⁺: obliczono 821,7, znaleziono 821,7;

[M+5H]⁵⁺: obliczono 657,5, znaleziono 657,8.

8. Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Gap-Gap-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-Gap-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-Gap-NH2 ^C145^H235^O43^N47^{, M=3324,8.}

[M+3H]³⁺: obliczono 1109,3, znaleziono 1109,6;

[M+4H]⁴⁺: obliczono 832,2, znaleziono 832,2;

[M+5H]⁵⁺: obliczono 666,0, znaleziono 666,0.

Claims

1. Peptydy - analogi ludzkiego hormonu uwalniającego hormon wzrostu posiadające sekwencję aminokwasów przedstawioną wzorem I:

Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-R¹¹-R¹²-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-R²⁰-R²¹-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-R²⁹-NH2, w którym

R¹¹ stanowi hArg, Gab albo Gap;

R¹² stanowi hArg, Orn, Gab albo Gap;

R²⁰ stanowi hArg, Gab albo Gap;

R²¹ stanowi hArg, Orn, Gab albo Gap;

R²⁹ stanowi D-Arg, hArg, Gab albo Gap;

oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

2. Peptyd według zastrz. 1, wybrany z grupy obejmującej:

(1) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-hArg-hArg-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg²⁰-hArg-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-nArg²⁹-NH2 (2) Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-hArg-Orn-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg²⁰-Orn-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-hArg²⁹-NH2 (3) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Gab-Gab-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Gab-Gab-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-Gab-NH2 (4) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-hArg-Gab-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Gab-Gab-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-Gab-NH2 (5) Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Gab-hArg-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-hArg-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-D-Arg-NH2 (6) Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-hArg-Gab-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-hArg-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-D-Arg-NH2 (7) Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Gap-Gap-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Gap-Gap-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-Gap-NH2 (8) Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-Gap-Gap-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg-Gap-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-Asp-Gap-NH2

3. Peptyd według zastrz. 2, który stanowi:

Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-hArg-hArg-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-hArg²⁰-hArg-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-hArg²⁹-NH2

4. Peptyd według zastrz. 2, który stanowi:

Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-hArg-Orn-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-nArg²⁰-Orn-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-hArg²⁹-NH2.

5. Sposób wytwarzania peptydów - analogów ludzkiego hormonu uwalniającego hormon wzrostu posiadających sekwencję aminokwasów przedstawioną wzorem I:

R¹¹ stanowi hArg, Gab albo Gap;

R¹² stanowi hArg, Orn, Gab albo Gap;

R²⁰ stanowi hArg, Gab albo Gap;

PL 195 917 B1

R²¹ stanowi hArg, Orn, Gab albo Gap;

R²⁹ stanowi D-Arg, hArg, Gab albo Gap;

oraz ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli metodą syntezy w fazie stałej, znamienny tym, że w łańcuch peptydowy połączony z polimerycznym nośnikiem wbudowuje się w odpowiednich miejscach pochodne lizyny, kwasu 2,4-diaminomasłowego lub kwasu 2,3-diamonopropionowego i po usunięciu ochrony grup aminowych w łańcuchu bocznym wymienia się je na grupy guanidynowe przez działanie czynnikiem guanidynującym, a następnie po usunięciu wszystkich pozostałych t-butyloksykarbonylowych grup ochronnych otrzymany peptyd odszczepia się od nośnika, oczyszcza i ewentualnie przeprowadza w farmaceutycznie dopuszczalną sól.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako polimeryczny nośnik stosuje się MBHA-żywicę.

7. Sposób według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że jako czynnik guanidynujący stosuje się N,N'-bis(tertbutyloksykarbonylo)-S-metyloizotiomocznik w obecności 4-(dimetyloamino)pirydyny.

8. Sposób według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że otrzymany peptyd usuwa się z nośnika działaniem fluorowodoru.

9. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że otrzymany peptyd oczyszcza się metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej.

10. Środek farmaceutyczny zawierający substancję aktywną, nośniki i/lub substancje pomocnicze, znamienny tym, że substancję aktywną stanowi analog hormonu uwalniającego hormon wzrostu przedstawiony wzorem I: Dat-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-R¹¹-R¹²-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-R²⁰-R²¹-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-R²⁹-NH₂, w którym:

R¹¹ stanowi hArg, Gab albo Gap;

R¹² stanowi hArg, Orn, Gab albo Gap;

R²⁰ stanowi hArg, Gab albo Gap;

R²¹ stanowi hArg, Orn, Gab albo Gap;

R²⁹ stanowi D-Arg, hArg, Gab albo Gap;

lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól.

11. Zastosowanie peptydu - analogu hGH-RH posiadającego sekwencję aminokwasów przedstawioną wzorem I: Dat-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr¹⁰-R¹¹-R¹²-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-R²⁰-R²¹-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-R²⁹-NH₂, w którym:

R¹¹ stanowi hArg, Gab albo Gap;

R¹² stanowi hArg, Orn, Gab albo Gap;

R²⁰ stanowi hArg, Gab albo Gap;

R²¹ stanowi hArg, Orn, Gab albo Gap;

R²⁹ stanowi D-Arg, hArg, Gab albo Gap;

lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli do wytwarzania leku do leczenia zaburzeń związanych z działaniem ludzkiego hormonu uwalniającego hormon wzrostu.