PL184707B1 - Wektor do wprowadzania pożądanego genu do komórki roślinnej oraz sposób wytwarzania genetycznie modyfikowanej rośliny wolnej od wpływu genu markerowego i sposób wprowadzania co najmniej dwóch pożądanych genów do rośliny - Google Patents

Abstract

1. Wektor do wprowadzania pozadanego genu do komórki roslinnej, który zawiera pozadany gen, co najmniej jeden gen wywolujacy nieprawidlowosc morfologiczna jako selekcyjny gen markerowy i usuwalny element DNA, w którym gen wywolujacy nieprawidlowosc morfologiczna jest tak umieszczony, ze jest usuwany wraz z elementem DNA mozliwym do usuniecia, a pozadany gen jest umieszczony tak, ze nie jest usuwany wraz z elementem DNA moz- liwym do usuniecia 10. Sposób wytwarzania genetycznie modyfikowanej rosliny wolnej od wplywu genu markerowego, znamienny tym, ze obejmuje nastepujace etapy: (A) wprowadzenie do komórki roslinnej wektora, który obejmuje pozadany gen, co najmniej jeden gen wywo- lujacy nieprawidlowosc morfologiczna (MAI) jako selekcyjny gen markerowy i usuwalny element DNA, w którym gen MAI jest umieszczony tak, ze jest usuwany wraz z elementem DNA mozliwym do usuniecia, a pozadany gen jest umieszczony tak, ze nie jest usuwany wraz z elementem DNA mozliwym do usuniecia, (B) hodowanie komórki roslinnej otrzymanej w (A), wykrywanie nieprawidlowej morfologicznie tkanki roslin- nej, która pojawia sie w trakcie hodowli i selekcje takiej morfologicznie nieprawidlowej tkanki, oraz (C) hodowanie takiej morfologicznie nieprawidlowej tkanki wyselekcjonowanej w (B), wykrywanie morfolo- gicznie nieprawidlowej tkanki, która pojawia sie w trakcie hodowli i selekcje takiej morfologicznie prawidlowej tkanki. 19. Sposób wprowadzania co najmniej dwóch pozadanych genów do rosliny, znamienny tym, ze obejmuje przeprowadzenie nastepujacych etapów co najmniej dwa razy: (A) wprowadzenie do komórki roslinnej wektora, który obejmuje pozadany gen, co najmniej jeden gen wywo- lujacy nieprawidlowosc morfologiczna (MAI) jako selekcyjny gen markerowy i usuwalny element DNA, w którym gen MAI jest umieszczony tak, ze jest usuwany wraz z elementem DNA mozliwym do usuniecia, a pozadany gen jest umieszczony tak, ze nie jest usuwany wraz z elementem DNA mozliwym do usuniecia, (B) hodowanie komórki roslinnej otrzymanej w (A), wykrywanie nieprawidlowej morfologicznie tkanki roslin- nej, która pojawia sie w trakcie hodowli i selekcje takiej morfologicznie nieprawidlowej tkanki, oraz (C) hodowanie takiej morfologicznie nieprawidlowej tkanki wyselekcjonowanej w (B), wykrywanie morfolo- gicznie prawidlowej tkanki, która pojawia sie w trakcie hodowli i selekcja takiej morfologicznie prawidlowej tkanki. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest wektor do wprowadzania pożądanego genu do komórki roślinnej oraz sposób wytwarzania genetycznie modyfikowanej rośliny wolnej od wpływu genu markerowego i sposób wprowadzania co najmniej dwóch pożądanych genów do rośliny.

Transformacja mikroorganizmów i hodowanie komórek przy zastosowaniu inżynierii genetycznej są obecnie stosowane do wytwarzania aktywnych fizjologicznie substancji użytecznych jako lekarstwa, a zatem bardzo mają duże znaczenie przemysłowe. W dziedzinie hodowli roślin, zastosowanie inżynierii genetycznej na skalę przemysłową pozostaje w tyle ponieważ cykle życiowe roślin są znacznie dłuższe niż mikroorganizmów. Jednakże, ponieważ technologia ta umożliwia wprowadzenie pożądanego genu bezpośrednio do rośliny przeznaczonej do hodowania, posiada ona następujące zalety w porównaniu z klasyczną hodowlą, która wymaga wielu krzyżowań.

a) Możliwe jest wprowadzenie jedynie tej cechy, która ma być ulepszona.

b) Możliwe jest wprowadzenie cechy z gatunków innych niż rośliny (takie jak mikroorganizm i temu podobne).

c) Możliwe jest znaczne skrócenie czasu hodowli.

184 707

A zatem metody inżynierii genetycznej w hodowli roślin są intensywnie badane.

Wytwarzanie transgenicznych roślin wymaga następujących trzech etapów.

1) Wprowadzenia pożądanego genu do komórki roślinnej (włączając w to wprowadzenie go do chromosomów, jądra i temu podobnych).

2) Selekcji tkanki roślinnej utworzonej jedynie z komórek, do których wprowadzony został pożądany gen.

3) Regeneracji rośliny z wyselekcjonowanej tkanki roślinnej.

W celu wyselekcjonowania transgenicznych tkanek, do których został wprowadzony pożądany gen, potrzebna była wizualna identyfikacja tkanki, w której pożądany gen ulega ekspresji, bez regeneracji nowej rośliny. Aby to osiągnąć, pożądany gen jest zazwyczaj wprowadzany do komórki roślinnej razem z selekcyjnym genem markerowym, którego ekspresja może być łatwo wykrywana na etapie hodowania komórek. To jest, ekspresja selekcyjnego genu markerowego jest stosowana jako wskaźnik wprowadzenia pożądanego genu. Przykłady konwencjonalnych selekcyjnych genów markerowych obejmują geny oporności na antybiotyki, takie jak gen oporności na kanamycynę (tj. NPTII; gen fosfotransferazy neomycyny), gen oporności na higromycynę (tj. HPT; gen fosfotransferazy higromycyny), geny syntetaz aminokwasów, takie jak gen syntetazy nopaliny (NOS), gen syntetazy oktopiny (OSC), oraz gen oporności na sulfonylomocznik (tj. ALS; gen syntetazy acetylooctanowej), który ma swój udział w chemicznej oporności upraw.

Jednakże, ekspresja selekcyjnego genu markerowego może powodować poważne problemy, wtedy, kiedy taka transgeniczna roślina jest stosowana jako pożywienie. To znaczy, jest dość trudno mieć pewność, że produkt genu, wytwarzany poprzez ekspresję selekcyjnego genu markerowego jest bezpieczny dla ludzkiego organizmu. W konsekwencji, jeżeli transgeniczna roślina zawierająca selekcyjny gen markerowy ma być sprzedawana jako pożywienie, muszą być przeprowadzone szczegółowe badania w celu określenia wpływu genu markerowego na ludzki organizm. Przykładowo, gen NPTII jest stosowany jako selekcyjny gen markerowy na poziomie laboratoryjnym od wczesnych lat 80-tych. W roku 1994, produkt tego genu został ostatecznie zaakceptowany jako dodatek do pożywienia przez Food and Drug Administration (FDA). Od tego czasu, transgeniczne rośliny zawierające gen NTPII jako selekcyjny gen markerowy są używane jako pożywienie. Jednakże niektórzy konsumenci produktów zawierających gen NPTII nadal mają pewne obawy o efekty tego genu.

Ponadto, selekcyjnymi genami markerowymi, które znajdują praktyczne zastosowanie są jedynie geny, takie jak gen NPTII, które uczestniczą w detoksyfikacji w komórkach roślinnych substancji hamujących wzrost. A zatem, w celu wyselekcjonowania tkanki roślinnej, do której został wprowadzony pożądany gen, tkankę hoduje się w podłożu hodowlanym zawierającym substancję hamującą wzrost i określa się ekspresję selekcyjnego genu markerowego, a konkretnie oporność tkanki na substancję hamującą, i stosuje się ją jako wskaźnik. Jednakże, nawet wtedy, gdy tkanka ma taką oporność, hodowanie w obecności substancji hamującej może dawać niepożądane efekty uboczne w komórkach roślinnych, takie jak zmniejszenie namnażania się i różnicowania się tkanki transgenicznej.

Ponadto, ekspresja selekcyjnego genu markerowego w komórce roślinnej po selekcji tkanki transgenicznej stanowi poważną przeszkodę w hodowli roślin przy wprowadzaniu kolejnego genu. To znaczy, kiedy inny gen jest wprowadzany do transgenicznej rośliny zawierającej selekcyjny gen markerowy, wprowadzenie genu musi być śledzone poprzez użycie innego, selekcyjnego genu markerowego. Jednakże, skuteczność selekcyjnego genu markerowego jest różna w zależności od gatunku roślin. A zatem konieczny jest wstępny test do ustalenia warunków dla każdego selekcyjnego genu markerowego (przykładowo, doniesiono, że w roślinach ryżu bardziej skuteczny jest gen HPT niż gen NPTII (K. Shimamoto i wsp., Nature (London), vol. 338, p. 274, 1989)). Co więcej, ponieważ wybór selekcyjnych genów markerowych jest ograniczony, nie można powtarzać wielokrotnie wprowadzania genu nieskończoną ilość razy po prostu przez zmianę selekcyjnego genu markerowego. Czyli, liczba wprowadzań genu do pewnych roślin jest ograniczona przez ilość różnych selekcyjnych genów markerowych, które mogą być zastosowane w tej roślinie. Ponadto, rodzaj selekcyjnego genu markerowego, który może być w konkretnym przypadku zastosowany jest ograniczony,

184 707 jak wspomniano powyżej. Zgodnie z powyższym, pożądane jest znalezienie sposobu usunięcia selekcyjnego genu markerowego z chromosomu po selekcji transgenicznej tkanki roślinnej w celu wykluczenia wpływu selekcyjnego genu markerowego na komórkę, tkankę lub roślinę.

Dla wyeliminowania wpływu selekcyjnego genu markerowego przedstawiono dwa sposoby. W jednym ze sposobów, selekcyjny gen markerowy i transpozon roślinny jest wprowadzany do chromosomu roślinnego, a następnie usuwany z niego razem z transpozonem (międzynarodowa publikacja wyłożeniowa nr WO 92/01370). W drugiej metodzie, zamiast transpozonu zastosowany jest system miejscowo-specyficznej rekombinacji faga P1 (międzynarodowa publikacja wyłożeniowa nr WO 93/01283). Przy zastosowaniu tych metod możliwe jest otrzymanie komórki, w której po wprowadzeniu genu, z chromosomu roślinnego usuwany jest z daną częstością selekcyjny gen markerowy. Niestety, prawdopodobieństwo, że selekcyjny gen markerowy będzie usunięty jest bardzo niskie.

Ponadto, komórki roślinne, z chromosomów których usunięte zostały geny markerowe przy zastosowaniu tych metod, są rozrzucone pomiędzy komórkami, w których selekcyjne geny markerowe są nadal obecne i podlegają ekspresji. Tych dwóch rodzajów komórek nie można odróżnić wizualnie.

Komórki roślinne zawierające geny markerowe i gen pożądany mogą być selekcjonowane na podstawie ich odporności chemicznej, wymagań pokarmowych i temu podobnych. Jednakże, w trakcie selekcji, komórki nie zawierające selekcyjnych genów markerowych wykazują poważne zahamowanie wzrostu i w wielu przypadkach są niszczone. A zatem selekcja taka nie może być stosowana do otrzymania komórek pozbawionych selekcyjnych genów markerowych.

W celu otrzymania roślin, które nie zawierają selekcyjnego genu markerowego i które zawierają gen pożądany, przy zastosowaniu wspomnianych powyżej sposobów, tkankę roślinną, w której komórki nie mające selekcyjnego genu markerowego i komórki zawierające selekcyjne geny markerowe są zmieszane, namnaża się, regeneruje, a następnie analizuje w celu selekcji, stosując metody takie, jak hybrydyzacja Southerna lub reakcja łańcuchowa polimerazy. Sposób ten opiera się na założeniu, że zregenerowany osobnik pochodzi z jednej komórki, i wskutek tego wszystkie komórki rośliny powinny mieć taką samą charakterystykę. A zatem osobnik, pochodzący z komórki bez selekcyjnego genu markerowego, składa się jedynie z takich komórek. Niestety, komórki wchodzące w skład takiego zregenerowanego osobnika są niekoniecznie jednorodne. Komórki nie zawierające chromosomu z selekcyjnym genem markerowym i komórki z selekcyjnym genem markerowym występują obok siebie i są rozmieszczone nieregularnie nawet w jednej zregenerowanej roślinie i w jednej jej tkance. A zatem, jest niezwykle trudno otrzymać osobnika utworzonego jedynie z komórek nie zawierających selekcyjnego genu markerowego na etapie, w którym hodowana tkanka podlega różnicowaniu w celu zregenerowania osobnika.

Ponadto, znane analityczne metody selekcji stosują tkankę, taką jak liście, jako próbkę testową (a nie cały organizm lub pojedyncza komórkę). W konsekwencji, analizowana jest jedynie ogólna tendencja w odniesieniu do stanu selekcyjnego genu markerowego obecnego w liściach. Poza tym, w tym przypadku jest częste, że komórki wolne od selekcyjnego genu markerowego i komórki zawierające selekcyjny gen markerowy są jednocześnie obecne w tym samym osobniku albo tkance. Tak więc, nawet jeżeli nastąpi utworzenie osobnika zawierającego jedynie komórki pozbawione selekcyjnego genu markerowego, trudno jest go wyselekcjonować. Nawet jeżeli nie wykrywa się obecności selekcyjnego genu markerowego w tej tkance, tkanki z innych miejsc tego samego osobnika mogą zawierać selekcyjny gen markerowy, lub po prostu oznacza to, że ilość selekcyjnego genu markerowego jest poniżej granicy wykrywalności. A zatem niemożliwe jest określenie, czy próbka testowa jest całkowicie wolna od komórek zawierających gen markerowy.

Stosując wspomniane powyżej metody, otrzymuje się osobnika pozbawionego selekcyjnego genu markerowego jedynie z komórek zarodkowych, takich jak pyłek, komórka jajowa i temu podobne. Kiedy przeprowadza się samozapylenie przy zastosowaniu komórek jajowych pozbawionych selekcyjnego genu markerowego, zapłodnione jajo pozbawione selekcyjnego genu markerowego uzyskuje się z ustaloną częstością zgodnie z klasycznymi prawa6

184 707 mi dziedziczenia, a z tych zapłodnionych jaj wytwarzany jest osobnik powstały jedynie z komórek o takiej samej charakterystyce jak zapłodnione jajo. Dla tego osobnika mogą być przeprowadzone konwencjonalne analityczne metody, takie jak hybrydyzacja Southerna. Tak więc nawet, jeżeli przy zastosowaniu opisanej dotychczas metody wytwarzane są komórki pozbawione selekcyjnego genu markerowego, osobnika utworzonego jedynie z takich komórek otrzymuje się najpierw poprzez różnicowanie rośliny z hodowli tkankowej zawierającej takie komórki, przeprowadzenie krzyżowania zregenerowanej rośliny i otrzymanie potomstwa F1 lub dalszych pokoleń. Tak otrzymany osobnik może być wyselekcjonowany jako osobnik pozbawiony selekcyjnego genu markerowego.

W celu usunięcia selekcyjnego genu markerowego z roślin trangenicznych, Jp-A-6-276872 przedstawia technikę do wprowadzania genu, w której selekcyjny gen markerowy jest wstawiony do oddzielnego wektora plazmidowego, różnego od wektora zawierającego pożądany gen. Plazmid zawierający selekcyjny gen markerowy jest usuwany z komórek po zakończeniu wprowadzania genu (stosowany tu termin „JP-A” oznacza opublikowane japońskie zgłoszenie patentowe). Jednakże technika ta wymaga etapu krzyżowania dla usunięcia selekcyjnego genu markerowego. W tym względzie, technika ta jest taka sama, jak te z dwóch wspomnianych powyżej doniesień.

Powyższe metody są trudne do zastosowania dla roślin drzewiastych, które mają długi okres wzrostu, osobników sterylnych lub osobników hybrydowych, u których cenne jest samo F,. Ponadto, kiedy stosowane są usuwalne elementy DnA, takie jak transpozony i temu podobne, częstość z którą takie elementy są usuwane z chromosomalnego DNA, DNA wektorów wirusowych i temu podobnych, tam gdzie te elementy są obecne i funkcjonują, jest niezwykle niska. A zatem niezbędne jest, aby usunięcie tych elementów (mianowicie, usunięcie selekcyjnego genu markerowego) można było łatwo wykrywać na bieżąco, co najmniej w stadium hodowli tkankowej. Jeżeli nie można tego wykryć przed zróżnicowaniem się hodowanej tkanki i wytworzeniem dalszego pokolenia poprzez krzyżowanie zregenerowanego osobnika, metoda jest niepraktyczna.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie wektora zawierającego gen, który ma być wprowadzony do rośliny i selekcyjny gen markerowy, który to wektor umożliwia uzyskanie zawierając go rośliny nie wywołującej niekorzystnych efektów w stosunku do organizmu ludzkiego po jej spożyciu, nawet jeżeli selekcyjny gen markerowy podlega ekspresji.

Wektor według wynalazku do wprowadzania pożądanego genu do rośliny zawierający też selekcyjny gen markerowy, powinien umożliwiać selekcję transgenicznej tkanki bez użycia substancji hamującej wzrost komórki roślinnej, która zmniejsza aktywność komórki roślinnej i działać tak, aby wyeliminować wpływ selekcyjnego genu markerowego poprzez usunięcie selekcyjnego genu markerowego z DNA, w którym selekcyjny gen markerowy jest obecny i funkcjonuje. Stosując ten wektor, pożądany gen może być wielokrotnie wydajnie wprowadzany.

Dalszym celem niniejszego wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania genetycznie modyfikowanej rośliny przy użyciu takiego wektora, który może wyeliminować wpływ selekcyjnego genu markerowego bez przechodzenia etapu wytwarzania F, lub dalszych pokoleń poprzez krzyżowanie, oraz sposobu wielokrotnego wprowadzania genów do rośliny poprzez zastosowanie opisanego powyżej sposobu.

Wektor według wynalazku zawiera pożądany gen, co najmniej jeden gen wywołujący nieprawidłowość morfologiczną jako selekcyjny gen markerowy i usuwalny element DNA, w którym gen wywołujący nieprawidłowość morfologiczną jest tak umieszczony, że jest usuwany wraz z elementem DNA możliwym do usunięcia, a pożądany gen jest umieszczony, tak, że nie jest usuwany wraz z elementem DNA możliwym do usunięcia. W takim wektorze selekcyjny gen markerowy jest usuwany z DNA po zajściu jego ekspresji. Ekspresja selekcyjnego genu markerowego i zanik jego funkcji są wykrywalne poprzez zmiany morfologiczne w tkance, do której selekcyjny gen markerowy został wprowadzony.

Według wynalazku sposób wytwarzania genetycznie modyfikowanej rośliny wolnej od wpływu selekcyjnego genu markerowego obejmuje następujące etapy:

184 707 (A) wprowadzenie wektora do komórki roślinnej, w którym wektor obejmuje pożądany gen, co najmniej jeden gen MAI jako selekcyjny gen markerowy i usuwalny element DNA, w którym gen MAI jest umieszczony tak, że zachowuje się integralnie z usuwalnym elementem DNA i w którym pożądany gen jest umieszczony tak, że nie zachowuje się integralnie z usuwalnym elementem DNA, (B) hodowanie komórki roślinnej otrzymanej w (A), wykrywanie nieprawidłowej morfologicznie tkanki roślinnej, która pojawia się w trakcie hodowli i selekcję takich morfologicznie nieprawidłowych tkanek, oraz (C) hodowanie takich morfologicznie nieprawidłowych tkanek wyselekcjonowanych w (B), wykrywanie morfologicznie nieprawidłowych tkanek, które pojawiają się w trakcie hodowli i selekcję takiej morfologicznie prawidłowej tkanki.

W zakres wynalazku wchodzi również sposób wprowadzania co najmniej dwóch pożądanych genów do rośliny, który obejmuje przeprowadzenie następujących etapów co najmniej dwa razy:

(A) wprowadzenie wektora do komórki roślinnej, w którym wektor obejmuje pożądany gen, co najmniej jeden gen MAI jako selekcyjny gen markerowy i usuwalny element DNA, w którym gen MAI jest umieszczony tak, że zachowuje się integralnie z usuwalnym elementem DNA i w którym pożądany gen jest umieszczony tak, że nie zachowuje się integralnie z usuwalnym elementem DNA, (B) hodowanie komórki roślinnej otrzymanej w (A), wykrywanie nieprawidłowej morfologicznie tkanki roślinnej, która pojawia się w trakcie hodowli i selekcję takich morfologicznie nieprawidłowych tkanek, oraz (C) hodowanie takich morfologicznie nieprawidłowych tkanek wyselekcjonowanych w (B), wykrywanie morfologicznie prawidłowych tkanek, które pojawiają się w trakcie hodowli i selekcję takiej morfologicznie prawidłowej tkanki.

Przez hodowanie opisanej powyżej morfologicznie prawidłowej tkanki można uzyskać dojrzałą roślinę o pożądanych opisanych powyżej cechach.

Figura 1 przedstawia schemat plazmidu Ti i mapy restrykcyjnej fragmentu PstI w regionie T-DNA szczepu A. tumifaciens P022.

Figura 2 przedstawia schemat konstrukcji pEPT2.

Figura 3 przedstawia schemat konstrukcji pIPT3 z pIPT2.

Figura 4 przedstawia schemat konstrukcji pIPT4 z pIPT3.

Figura 5 przedstawia mapę restrykcyjną regionu T-DN a będącego elementem struktury pIPT4.

Figura 6 przedstawia wyniki analizy PCR fenotypu skrajnie wysokiej liczby pędów dla tytoniu, do którego wprowadzono gen stosując pIPT4.

Figura 7 przedstawia schemat konstrukcji pNPI102.

Figura 8 przedstawia schemat konstrukcji pNPI102 z pIPT4 i pNPI102.

Figura 9 przedstawia schemat konstrukcji pNPI106 z pNPI103.

Figura l0 przedstawia mapę restrykcyjną regionu T-DNA, będącego elementem struktury pNPI106.

Figura 11 przedstawia zdjęcie pędu nr 2 po jednomiesięcznej uprawie w przykładzie 2.

Figura 12 przedstawia zdjęcie pędu nr 8 po jednomiesięcznej uprawie w przykładzie 2.

Figura 13 przedstawia wyniki analizy PCR pędu nr 8 z przykładu 2.

Figura 14 przedstawia wyniki analizy PCR osobników normalnych otrzymanych z pędów nr 13-1 i 14-1 w przykładzie 3.

Figura 15 przedstawia zdjęcie prawidłowych pędów zróżnicowanych z tytoniu o fenotypie skrajnie wysokiej liczby pędów w przykładzie 2.

Figura 16 przedstawia wyniki analizy PCR osobników normalnych otrzymanych z liści utworzonych z pędu nr 7 z przykładu 2.

Figura 17 przedstawia schemat konstrukcji pNPI128.

Figura 18 przedstawia schemat konstrukcji pNPI129 z pNPI128.

Figura 19 przedstawia schemat konstrukcji pNPI132 z pNPI1018 i 4pNPI129.

Figura 20 przedstawia mapę restrykcyjną regionu T-DNa w strukturze pNPI132.

184 707

Figura 21 przedstawia wyniki analizy PCR dla osobników normalnych otrzymanych z pędów nr 15 do 21 z przykładu 5 przy użyciu starterów, które wykrywają obecność genu ipt.

Figura 22 przedstawia wyniki analizy PCR dla osobników normalnych otrzymanych z pędów nr 15 do 21 z przykładu 5, przy użyciu starterów, które wykrywają eliminację regionu otoczonego pairąRs, obejmującego gen int.

Figura 23 przedstawia wyniki analizy PCR dla osobników normalnych otrzymanych z pędów nr 15 do 21 z przykładu 5, przy użyciu starterów, które wykrywają obecność genu GUS.

Figura 24 przedstawia wyniki analizy PCR dla osobników normalnych otrzymanych z linii niezdolnej do wytworzenia fenotypu skrajnie wysokiej liczby pędów z przykładu 5.

Figura 25 przedstawia schemat konstrukcji pNPl702.

Figura 26 przedstawia mapę restrykcyjną regionu T-DNA będącego elementem struktury pNPI702.

Figura 27 przedstawia zdjęcie prawidłowych pędów wyróżnicowanych z hybrydowej osiki o fenotypie skrajnie wysokiej liczby pędów z przykładu 7.

Figura 28 przedstawia mapą restrykcyjną regionu T-DNA będącego elementem struktury pNPI140.

Figura 29 przedstawia wyniki analizy PCR dla prawidłowych pędów wyróżnicowanych z fenotypu skrajnie wysokiej liczby pędów po wielokrotnym wprowadzeniu genów w przykładzie 8.

Poniżej przedstawiono najlepszy sposób stosowania wynalazku.

Stosowany tu gen MAI jest genem, który wywołuje w tkance rośliny morfologicznie nieprawidłowe różnicowanie, takie jak karłowatość, utrata dominacji wierzchołkowej, przebarwienia, tworzenie się guzowatych narośli, tworzenie korzeni włosowatych, zwijanie się liści i temu podobne. Jako korzystny gen MAI, mogą być użyte geny izolowane z bakterii rodzaju Agrobacterium lub temu podobnych, które indukują nowotwory lub nowotwór wielotkankowy (np. tworzenie pędów przybyszowych i korzeni przybyszowych). Przykłady takich różnorodnych genów MAI obejmują geny syntezy cytokinin (np. gen ipt (izopentenylotransferazy) (A. C. Smigocki, L. D. Owens, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 85, str. 5131, 1988)), gen iaaM (monooksygenazy tryptofanu) (H. J. Klee i wsp., Genes and Development, vol. 1 str. 86, 1987), gen 5 (H. Korber i wsp., eMBo Journal, vol.10, str. 3983, 1991), gen 6b (P. J. J. Hooykaas i wsp., Plant Mol. Biol. , vol. 11, str. 791, 1988), i geny rol, takie jak rolA, rolB, rolC, i rolD (F. F. White i wsp., J. Bacteriol., vol. 164, str. 33, 1985). Ponadto przykłady takich genów obejmują gen iaaL (syntazy kwasu indolooctowego-lizyny) z Pseudomonas syringae subsp. savastanoi (A. Spena i wsp., Mol. Gen. Genet., vol. 227, str. 205, 1991), geny homeotyczne i geny fitochromu z różnych roślin. Korzystnie, jeżeli stosuje się geny syntezy cytokininy, takie jak gen ipt lub przynajmniej jeden gen wybrany spośród genów rol (korzystniej, jeżeli geny rol obejmują geny rolA, rolB i rolC). Gen ipt jest obecny w T-DNA Agrobacterium tumefaciens i wywołuje utratę dominacji wierzchołkowej. Geny rol obejmujące rolA, rolB i rolC są obecne w T-DNA Agrobacterium rhizogens i przynajmniej jeden z nich indukuje tworzenie korzeni włosowatych, karłowatość, zwijanie się liści i temu podobne w roślinach zregenerowanych korzeni włosowatych.

Stosując techniki według niniejszego wynalazku, można zaprojektować kombinację tych selekcyjnych genów markerowych, tak aby specyficzne struktury, takie jak pędy przybyszowe, korzenie przybyszowe i temu podobne różnicowały się w specyficznej roślinie, do której wprowadzono te selekcyjne geny markerowe. W niniejszym wynalazku może być użyta taka kombinacja genów MAI zgodnie z warunkami wytwarzania rośliny transgenicznej, stosownie do rodzaju rośliny, do której geny mają być wprowadzane.

Morfologicznie nieprawidłowa tkanka otrzymana poprzez wprowadzanie genu MAI do komórek jest utworzona jedynie z komórek zawierających ten gen. A zatem, stosując ten gen jako selekcyjny gen markerowy, konstruowany jest wektor z genem pożądanym. Kiedy taki wektor jest wprowadzany do komórki roślinnej i wyhodowana zostaje genetycznie modyfikowana roślina, można wselekcjonować tkankę składającą się jedynie z takich komórek, do

184 707 których wprowadzony został selekcyjny gen markerowy i gen żądany poprzez selekcję wizualną nieprawidłowej morfologicznie tkanki utworzonej z tych komórek.

Odpowiednie wektory przydatne zgodnie z niniejszym wynalazkiem posiadają sekwencję DNA, która wprowadza obcy gen do komórki gospodarza i która kieruje ekspresją obcego genu w komórce gospodarza.

Kiedy gen jest wprowadzany przy zastosowaniu wektora według niniejszego wynalazku, tkanka roślinna utworzona jedynie z komórek stransformowanych może być wyselekcjonowana a wizualnie po prostu poprzez hodowanie komórek po zabiegu wprowadzania genu na zwykłej pożywce hodowlanej, takiej jak pożywka hodowlana MS (Murashige-Skoog) w zwykłych warunkach wzrostu. Ponieważ nie ma potrzeby użycia specjalnej substancji do selekcji stransformowanej tkanki, takiej jak substancja hamująca wzrost lub temu podobna, ma miejsce nie tylko uproszczenie procedury, ale również nie następuje zmniejszenie się aktywności komórki roślinnej przez taką substancję. Ponadto roślina ma własny gen MAI lub gen MAI jest spontanicznie wprowadzany do rośliny poprzez infekcję bakteriami lub temu podobnymi. A zatem roślina otrzymana przy zastosowaniu wektora według niniejszego wynalazku nie rożni się od naturalnie występującej rośliny, która nie ma takiej nieprawidłowości morfologicznej.

Stosowany tu usuwalny element jest sekwencją DNA, którą można usunąć z DNA, w którym taki element DNA występuje i funkcjonuje. Wektor według wynalazku korzystnie jako usuwalny element DNA zawiera transpozon. W roślinach, transpozon obecny w chromosomie jest znany jako taki element. Struktura, aktywność i zachowanie się transpozonów są prawie całkowicie poznane. Zasadniczo, dla funkcjonowania transpozonów konieczne są dwa składniki, (1) enzym, który jest wyrażany z genu w nim obecnego i który katalizuje wycięcie i transpozycję samego transpozonu (transpozaza) i (2) sekwencje wiążące DNA, które są obecne w krańcowym regionie transpozonu i dzięki którym działa transpozaza. Za pośrednictwem tych elementów transpozon jest usuwany z chromosomu, w którym się znajduje, a następnie zwykle podlega transpozycji do nowego miejsca w DNA. Jednakże, z pewną częstością transpozon również znika w czasie transpozycji. Niniejszy wynalazek wykorzystuje taki błąd w transpozycji transpozonu.

Transpozon może być jednego z dwóch typów, bądź transpozonem autonomicznym, bądź transpozonem nieautonomicznym. Transpozon autonomiczny zachowuje dwa elementy, transpozazę i sekwencje wiązania w DNA. W transpozonie autonomicznym, trasspozaza jest wyrażana i dla działania wiąże się do sekwencji wiążących w DNA, po czym transpozon jest autonomicznie wycinany z chromosomu. Transpozon nieautonomiczny zachowuje krańcowe sekwencje wiążące w DNA, do których wiąże się transpozaza dla swego działania. W transpozonach nieautonomicznych, gen transpozazy podlega mutacji, tak, że transpozaza nie jest wyrażana; a zatem transpozon nie może być autonomicznie wycięty z chromosomu. Jednakże, jeżeli transpozaza jest dostarczana nieautonomicznego z transpozonu autonomicznego lub z niezależnego genu transpozazy, transpozon nieautonomiczny zachowuje się podobnie do transpozonu autonomicznego.

Przykłady autonomicznych transpozonów obejmują Ac i Spm izolowane z kukurydzy (A. Gierl i H. Saedler, Plant Mol. Biol. vol. 19, str. 39, 1992). Ac może być otrzymany poprzez trawienie locus genu wx-m7 w chromosomie kukurydzy endonukleazą restrykcyjną Sau3A (U. Behrens i wsp., Mol. Gen. Genet., vol. 194, str. 346, 1984). Ten autonomiczny transpozon jest najczęściej analizowanym spośród transpozonów roślinnych. Faktycznie, została już określona jego sekwencja (M. Muller-Neumann i wsp.. Mol. Gen. Genet., vol. 198, str. 19,1984).

Przykłady nieautonomicznych transpozonów obejmują Ds i dSpm, otrzymane w wyniku delecji wewnętrznego regionu odpowiednio, Ac i Spm (H.-P. Doring i P. Starlinger, Ann. Rev. Genet., vol. 20, str. 175, 1986) oraz te izolowane z wielu roślin, innych niż kukurydza, takich jak lwia paszcza, powój i temu podobne (na przykład: Y. Inagaki i wsp., Plant Cell, vol. 6, str. 375, 1994). Kiedy te transpozony są wprowadzane do chromosomów roślin egzogennych, transpozony te są również wycinane z chromosomu i podlegają transpozycji zależnej od pojawienia się aktywności (na przykład, B. Baker i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 83, str. 4844, 1986).

184 707

Wektor według wynalazku może zawierać zarówno transpozony autonomiczne, jak i nieautonomiczne. Transpozony nieautonomiczne mogą być zastosowane po wstawieniu do nich funkcjonalnego genu transpozazy.

Innym usuwalnym elementem, który nie występuje w roślinach, ale który może być zastosowany w wektorze według niniejszego wynalazku, jest element pochodzący z systemu rekombinacji miejscowo-specyficznej. System rekombinacji miejscowo-specyficznej składa się z dwóch elementów, (1) miejsca rekombinacji (odpowiadającego usuwalnemu elementowi DNA według niniejszego wynalazku), mającego charakterystyczną sekwencję DNA i (2) enzymu, który wiąże się specyficznie do sekwencji DNA i katalizuje rekombinację pomiędzy sekwencjami dNa, jeżeli istnieją dwie lub więcej takich sekwencji (rekombinaza). Jeżeli dwie sekwencje DNA są zorientowane w tę samą stronę w określonej odległości od siebie w tej samej cząsteczce DNA, region zawarty pomiędzy tymi sekwencjami jest wycinany z cząsteczki DNA, takiej jak plazmid, chromosom lub temu podobne. Jeżeli dwie sekwencje DNA są zorientowane w przeciwnej orientacji w tej samej cząsteczce DNA, region zawarty między tymi sekwencjami DNA jest odwracany.

W niniejszym wynalazku stosuje się przede wszystkim pierwsze z nich, wycięcie. Zarówno wycięcie, jak i odwrócenie w obrębie miejsca rekombinacji, zachodzi jako rezultat homologicznej rekombinacji poprzez system rekombinacji miejscowo-specyficznej, który różni się od mechanizmu z zastosowaniem transpozonu. Wiadomo, że gen rekombinazy nie musi być koniecznie obecny w tej samej cząsteczce DNA, w której znajduje się miejsce rekombinacji. Gen rekombinazy musi być jedynie obecny w tej samej komórce i podlegać ekspresji dla wycięcia lub odwrócenia regionu zawartego między tymi dwiema sekwencjami DNA (N. L. Craig, Annu. Rev. Genet., vol. 22, str. 77, 1988).

Obecnie, systemy rekombinacji miejscowo-specyficznej są zidentyfikowane w mikroorganizmach, takich jak fagi, bakterie (np. E. coli), drożdże i temu podobne. Ich przykłady obejmują system Cre/lox, system pSRl, system FLP, system cer i system fim (na przykład, N. L. Craig, Annu. Rev. Genet., vol. 22, str. 77, 1988). Kiedy system rekombinacji miejscowo-specyficznej, izolowany z tych mikroorganizmów z zastosowaniem systemu Cre/lox pochodzącego z faga Pl (WO 93/01283), jest włączony do organizmów (włączając w to rośliny), różniących się od organizmu, z którego ten system pochodził, zachowuje się on w ten sam sposób, jak w organizmie wyjściowym. System rekombinacji miejscowospecyficznej drożdży (Zygosaccharomyces rouxii) (system pSR1 (H. Matsuzaki i wsp., J. Bacteriology, vol. 172, str. 610, 1990)) może być również zastosowany zgodnie z niniejszym wynalazkiem. Ten system pSR1 również zachowuje właściwą sobie funkcję w wyższych organizmach (H. Onouchi i wsp., Nucleic Acid Res., vol. 19, str. 6373, 1991).

W wektorze według wynalazku, gen indukujący nieprawidłowości morfologiczne (MAI) może być wstawiony w takim miejscu, że gen ten jest wycinany razem z usuwalnym elementem DNA. Przykładowo, gdy jako usuwalny element DNA stosowany jest transpozon, gen MAI może być wstawiony w miejscu, które nie wpływa na wycinanie transpozonu i które znajduje się przed regionem promotorowym genu transpozazy, ale za regionem krańcowym, do którego wiąże się transpozaza. Kiedy stosowany jest system pSR1, gen MAI może być wstawiony w dowolnej pozycji w obrębie regionu otoczonego przez charakterystyczne sekwencje DNA, które nie hamują ekspresji rekombinazy.

W wektorze według wynalazku korzystnie gen MAI znajduje się w obrębie usuwalnego elementu DNA. Z drugiej strony, pozycja pożądanego genu nie jest szczególnie ograniczona; jednakże korzystne jest, jeżeli pożądany gen znajduje się poza usuwalnym elementem DNA.

W wektorze według wynalazku, gen wywołujący nieprawidłowość morfologiczną jest otrzymany z mikroorganizmu z rodzaju Agrobacterium. Korzystnie gen wywołujący nieprawidłowość morfologicznąjest genem syntezy cytokininy, korzystnie jest genem ipt, izopentenylotransferazy, który jest obecny w T-DNA Agrobacterium tumefaciens.

W wektorze według wynalazku, gen wywołujący nieprawidłowość morfologiczną jest co najmniej jednym genem wybranym spośród genów rol. Korzystnie geny rol zawierają geny rolA, rolB i rolC, które są obecne w T-DNA Agrobacterium rhizogenes.

184 707

U

Przy zastosowaniu wektora o opisanej powyżej strukturze, po wprowadzeniu pożądanego genu, gen MAI może zostać z pewną częstością usunięty z dNa, do którego został wprowadzony i funkcjonuje, razem z usuwalnym elementem DNA. Pożądany gen, który nie zachowuje się integralnie z selekcyjnym genem markerowym pozostaje w tej samej cząsteczce DNA. Wektor może być zastosowany do zwielokrotnienia wprowadzania pożądanego genu do pewnych roślin. Ponadto, ponieważ utrata funkcji tego genu MAI może być wykrywana wizualnie, jako zmiana morfologiczna tkanki transgenicznej w czasie hodowania, tkanka ta, utworzona jedynie z komórek z pożądanym genem, ale bez selekcyjnego genu markerowego, może być łatwo wyselekcjonowana bez potrzeby specyficznej procedury. W konsekwencji, nawet jeżeli taka komórka powstaje z małą częstością, komórka ta może być z wyselekcjonowana z wydajnością wystarczającą, aby uczynić procedurę przydatną w praktyce. Ponadto, przy użyciu tego wektora można nie tylko powtarzać wielokrotne wprowadzanie genu wiele razy, ale może być to powtarzane przed zregenerowaniem dorosłej rośliny. A zatem wielokrotne wprowadzanie może być przeprowadzane wydajnie. W celu otrzymania indywidualnej genetycznie modyfikowanej rośliny utworzonej jedynie z takich komórek, roślina może być zregenerowana z tak wyselekcjonowanej tkanki bez konieczności przeprowadzania procesu krzyżowania. Otrzymane w ten sposób transgeniczne rośliny są całkowicie wolne od niekorzystnych efektów na ludzki organizm, powodowanych przez selekcyjny gen markerowy, jak wspomniano powyżej. Co więcej, zastosowanie tych wektorów nie wymaga substancji hamującej wzrost komórek, która mogłaby zmniejszyć aktywność komórki na etapie selekcjonowania tkanek transgenicznych.

Wektor według niniejszego wynalazku może być użyty w dowolnej roślinie, do której gen może być wprowadzany metodami inżynierii genetycznej. Pożądanym genem według niniejszego wynalazku może być dowolny gen, dzięki któremu można uzyskać bardzo dobre cechy hodowlane i dowolny gen, który umożliwia badania mechanizmów ekspresji genów i temu podobne, gdzie znakomite cechy hodowlane nie są koniecznie przenoszone.

Dla wytwarzania białka takiego jak enzym z genu, ogólnie wymagana jest sekwencja genu struktury kodująca informację o peptydzie i sekwencje regulacyjne genu struktury, takie jak sekwencja promotora (sekwencja rozpoczynająca ekspresję) i sekwencja terminatora (sekwencja kończąca ekspresję) i temu podobne. Przykłady odpowiedniej sekwencji promotorowej, która funkcjonuje w roślinach, obejmują między innymi promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora (J. T. Odell i wsp., Nature (London), vol. 313, str. 810, 1985), promotor syntetazy nopaliny (W. H. R. Langridge i wsp., Plant Cell Restr., vol. 4, str. 355, 1985) i promotor małej podjednostki karboksylazy/oksygenazy difosforanu rybulozy (R. Fluhr i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol. 83, str. 2358, 1986). Przykłady odpowiedniej sekwencji terminatora obejmują sygnał poliadenylacji syntetazy nopaliny (A. Depicker i wsp., J. Mol. Appl. Gen., vol. 1, str. 561, 1982) i sygnał poliadenylacji syntetazy oktopiny (J. Gielen i wsp., EMBO J., vol. 3, str. 835, 1984). A więc, jeżeli trzeba, gen na wektorze według niniejszego wynalazku obejmuje gen struktury i jego sekwencje regulujące ekspresję genu. Gen lub gen i sekwencje regulacyjne, może być otrzymany poprzez syntezę chemiczną lub poprzez klonowanie cDNA lub DNA genomowego.

Wektor według niniejszego wynalazku może być pośrednio włączony do komórki roślinnej za pomocą wirusów lub bakterii, którymi rośliny są infekowane (I. Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. vol. 42, str. 205, 1991). Przykłady odpowiednich wirusów obejmują wirus mozaiki kalafiora, geminiwirus, wirus mozaiki tytoniu i wirus mozaiki bromu. Przykłady odpowiednich bakterii obejmują Agrobacterium tumefaciens (dalej określane jako A. tumefaciens) i Agrobacterium rhizogens (dalej określane jako A. rhizogens). Ogólnie wiadomo, że rośliny dwuliścienne są infekowane przez bakterie z rodzaju Agrobacterium. Ostatnio doniesiono również o wprowadzeniu genów do roślin jednoliściennych poprzez infekcję nimi tych roślin (na przykład, w międzynarodowej publikacji wyłożeniowej nr WO 94/00977).

Wektor według niniejszego wynalazku może być bezpośrednio wprowadzony do komórki roślinnej poprzez fizyczne i chemiczne metody, takie jak mikroiniekcja, elektroporacja, metoda z glikolem polietylenowym, metoda fuzji i penetracja balistyczna przy dużej prędkości (I. Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., vol. 42, str. 205, 1991). Ponieważ

184 707 ogólna pośrednia metoda wprowadzania przy zastosowaniu rodzaju Agrobacterium nie może być zastosowana dla wielu roślin jednoliściennych i roślin dwuliściennych, które są oporne na infekcję Agrobacterium, powyżej wspomniane metody bezpośredniego wprowadzania są skuteczne dla tych roślin.

Wektor do zastosowania w niniejszym wynalazku nie jest w szczególny sposób ograniczony, o ile spełnione są wymagania niniejszego wynalazku. Przykładowo, jeżeli wektor jest wprowadzany do komórki roślinnej pośrednio, wektorem może być wektor Ti lub wektor wirusowy. Przykłady wektora Ti do zastosowania w niniejszym wynalazku obejmują Bin19 (M. Bevan i wsp., Nucleic Acids Res., vol. 12, str. 8711, 1984), pRAL3940 (A. Hoekema i wsp., Plant Mol. Biol., vol. 5, str. 85, 1985), pGA492 i pGA482 (G. An, Plant Physiol., vol. 81, str. 86, 1986), pC22 (C. Simoens i wsp., Nucleic Acids Res., vol. 14, str. 8073, 1986), pAGS111 (P. van den Elzen i wsp., Plant Mol. Biol:, vol. 5, str. 149, 1985), pEND4K (H. J. Klee i wsp., Bio/Technology, vol. 3, str. 637, 1985), pGV831 (R. Delaere i wsp., Nucleic Acids Res., vol.13, str. 4777, 1985) i pMON200 (R. T. Fraley i wsp., Bio/Technology, vol. 3, str. 629, 1985). Przykłady wektora wirusowego do zastosowania w niniejszym wynalazku obejmują wirus mozaiki kalafiora (N. Brissón i wsp., Nature (London. vol. 310, str. 511, 1984), wirus gemini (R. J. Hayes i wsp., Nature London), vol. 34, str. 79, 1988), wirus mozaiki bromu (R. French i wsp., Science vol. 231, str.1294, 1986), wirus mozaiki tytoniu (N. Takamatsu i wsp. EMBO J., vol. 6, str. 307, 1987) i wektor agroinfekcyjny (N. Grimsley i wsp., Nature (London), vol. 325, str. 177, 1987). Jednakże wektory do zastosowania w niniejszym wynalazku nie ograniczają się do nich.

Ponadto pożądany gen do zastosowania w niniejszym wynalazku nie jest w szczególny sposób ograniczony. Sama natura pożądanego genu nie jest krytyczna dla niniejszego wynalazku. Przykłady pożądanych genów do zastosowania w niniejszym wynalazku obejmują geny oporności na choroby (np. gen endotoksyny Bacillus thuringiensis, WO 92/20802), oporności na herbicydy (np. zmutowany gen syntazy octanomleczanowej, WO 92/08794), białek zapasowych z nasion (np. gen gluteliny, WO 93/18643), syntezy kwasów tłuszczowych (np. gen tioesterazy acylo-ACP, WO 92/20236), hydrolizy ściany komórkowej (np. gen poligalakturonazy (D. Grierson i wsp., Nucleic Acids Res., vol. 14, str. 8595, 1986)), syntezy antocyjanu (np. gen syntazy chalkonu (H. J. Reif i wsp., Mol. Gen. Genet., vol. 199, str. 208, 1985)), biosyntezy etylenu (np. gen oksydazy ACC (A. Slater i wsp., Plant Mol. Biol. vol. 5, str. 137, 1985)), system zmiatania aktywnego tlenu (np. gen reduktazy glutationu) (S. Greer i R. N. Perham Biochemistry, vol. 25, str. 2736, 1986)) i biosyntezy ligniny (np. gen liazy amonowej fenyloalaniny, gen dehydrogenazy alkoholu cynamonowego, gen o-metylotransferazy, gen 4-hydroksylazy cynamonianu, gen ligazy 4-kumaryno-CoA, gen reduktazy CoA cynamonianu (A. M. Boudet i wsp., New Phytol., vol. 129 str. 203, 1995)). Jednakże pożądane geny do zastosowania w niniejszym wynalazku nie są do nich ograniczone.

Ponadto roślina do zastosowania w niniejszym wynalazku jako gospodarz nie jest w szczególny sposób ograniczona. Przykłady roślin zielnych stosowanych jako gospodarz obejmują tytoń (Tabacum), pomidor (Lycopersicom), słodki ziemniak (Impoea), ziemniak (Solanum), marchew (Dacus), sałatę (Lactuca), kalafior (Brassica), kapustę (Brassica), rzepak oleisty (Brassica), słonecznik (Helianthus), burak cukrowy (Bela), szparag (Asparagus), banan (Musa), bawełnę (Gossypium), arabidopsis (Arabidopsis), lucernę (Medicago), groch (Pisum), soję (Glycine), ryż (Oryza), kukurydzę (Zea) i żyto (Secale). Przykłady roślin drzewiastych stosowanych jako gospodarz obejmują topolę (Populus), eukaliptus (Eucalyptus), akację (Acacia), gruszę (Pyrus), jabłoń (Malus), winorośl (Vitis), orzech włoski (Juglans), śliwę (Prunus), różę (Rosa) i świerk (Picea). Jednakże rośliny będące gospodarzami do zastosowani a w niniejszym wynalazku nie są do nich ograniczone.

W niniejszym wynalazku gen MAI podlega ekspresji z wytworzeniem nieprawidłowych warunków fizjologicznych wewnątrz komórki. Fizjologiczne nieprawidłowości obejmują wytwarzanie roślinnego hormonu wzrostu w komórce roślinnej z takim skutkiem, że namnażanie i różnicowanie się komórki zawierającej gen MAI są zaburzone, wywołując różne morfologiczne nieprawidłowości. Przykładowo, agregaty nieuporządkowanych pędów z zaburzoną dominacją wierzchołkową (fenotyp niezmiernie dużej liczby pędów; ang. extreme shooty phenotype, ESP),

184 707 korzenie włosowate i temu podobne, można wytworzyć z komórek, do których został wprowadzony taki gen MAI. Fenotyp ten tworzy się poprzez nieprawidłowe namnażanie i różnicowanie wspomnianej powyżej komórki. A zatem taka morfologicznie nieprawidłowa tkanka jest utworzona jedynie z komórek zawierających ten gen. Tak więc, jeżeli konstruuje się wektor z zastosowaniem tego genu jako selekcyjnego genu markerowego oraz genu pożądanego i wprowadza się go do komórki roślinnej, a komórka jest hodowaną można wyselekcjonowo tkankę utworzoną jedynie z komórek, do których zostały wprowadzone selekcyjny gen markerowy i gen pożądany, jedynie poprzez selekcję wizualną morfologicznie nieprawidłowej tkanki utworzonej z takich komórek roślinnych. A zatem możliwa jest wizualna selekcja transgenicznej tkanki bez przeprowadzania żadnych specjalnych procedur, takich jak dodanie substancji hamującej wzrost komórki roślinnej i temu podobnych do pożywki hodowlanej.

Jakkolwiek konwencjonalne selekcyjne geny markerowe, takie jak gen NPTII, nie są wprowadzane do roślin bez inżynierii genetycznej, gen MAI według niniejszego wynalazku jest genem, który rośliny posiadają samoistnie lub, który jest naturalnie wprowadzany do roślin przez infekcję bakteriami i temu podobnymi. Z tego powodu, poziom bezpieczeństwa obecności tego produktu genowego w ludzkim organizmie jest uważany za stosunkowo wysoki.

Ponadto, w niniejszym wynalazku gen MAI jest wstawiany w takim miejscu, że zachowuje się integralnie z usuwalnym elementem DNA. Po wprowadzeniu wektora o takiej strukturze do rośliny, gen MAI stosowany jako selekcyjny gen markerowy jest usuwany z DNA, łącznie z usuwalnym elementem, z określoną częstością, prowadząc do utraty swojej funkcji. Jednocześnie, pożądany gen, który nie zachowuje się integralnie z usuwalnym elementem DNA pozostaje w tym samym DNA i zachowuje swoją funkcję. A więc ekspresja samego selekcyjnego genu markerowego może być stosowana jako wskaźnik wprowadzania pożądanego genu za każdym razem. Zatem wektor ten powoduje wielokrotne wprowadzenie genu do pewnych roślin jedynie poprzez zmianę struktury związanej z pożądanym genem, który ma być wprowadzony, bez konieczności zmiany struktur selekcyjnego genu markerowego i innych. Z tego powodu, wektor może być wielokrotnie używany nieograniczoną liczbę razy.

Ponieważ utrata funkcji selekcyjnego genu markerowego, to jest utrata funkcji genu MAI, może być wykrawana wizualnie, tkanka utworzona z komórek nie zawierających selekcyjnego genu markerowego i zawierających pożądany gen może być otrzymywana w sposób pewny i łatwy. To jest, hodowanie, selekcja wizualna i rozdzielenie może być powtarzane bez potrzeby żadnych specjalnych procedur dla otrzymania takiej tkanki. Ponadto, roślina utworzona jedynie z wspomnianych powyżej komórek, może być otrzymana jedynie poprzez regenerację rośliny z otrzymanej tkanki, bez konieczności przechodzenia etapów krzyżowania. Dodatkowo, jakkolwiek trudno jest całkowicie usunąć transpozon z DNA, ponieważ ten element wykazuje wysoki poziom transpozycji, wynalazek może być skutecznie zastosowany w praktyce z powodu wysoce wydajnej selekcji.

Przykład

Niniejszy wynalazek będzie zilustrowany poprzez odwołanie się do następujących przykładów, ale wynalazek nie powinien być interpretowany jako do nich ograniczony.

W następujących przykładach, doświadczenia wykonywano zgodnie z instrukcjami z Molecular Cloning, 2-gie wydanie (Sambrook i wsp., wyd., Cold Sprinq Harbor Laboratory Press, New York, 1989) lub dostarczanymi przez producenta, o ile nie zaznaczono inaczej.

Przykład 1

I. Konstrukcja wektora

Gen ipt obecny w T-DNA patogennego szczepu A. tumefaciens P022 (H. Wabiko, Chemical Regulation of Plants, vol. 24, str. 35, 1989 (patrz fig. 1)) przecięto endonukleazą restrykcyjną PstI i otrzymano plazmid pIPTl poprzez ligację genu ipt w miejscu restrykcyjnym PstI płasmidu pUC7 (Molecular Cloning, 2-gie wydanie, vol., 4.10). Gen ipt zawierający natywny promotor i natywny sygnał poliadenylacji wycięto z tego plazmidu endonukleazami restrykcyjnymi BamHI i PstI i otrzymano plazmid pIPT2 poprzez ligację genu ipt w miejscach restrykcyjnych BamHI-Pstl plazmidu pUC119 (otrzymany z Takara Shuzo Co., Ltd.). Gen struktury i natywny sygnał poliadenylacji genu ipt został wycięty z tego plazmidu endonukleazą restrykcyjną RsaI i otrzymano plazmid pIPT3 poprzez ligację genu ipt w miejscu

184 707 restrykcyjnym SmaI plazmidu pUC119. Następnie, gen ipt wstawiono do pIPT3 przeciętego endonukleazami restrykcyjnymi BamHI i SacI i otrzymano plazmid pIPT4 przez ligację fragmentu do miejsc restrykcyjnych BamHI-SacI plazmidu wektorowego pBI121 (otrzymanego z Clontech Co.), który jest użyteczny do wprowadzania genu do roślin. Kiedy roślinę infekuje się A. tumefaciens zawierającym plazmid pIPT4, region T-DNA który jest zawarty pomiędzy miejscem LB i miejscem RB, tutaj region około 5 kb zawierający NPTII gen i gen ipt, zostaje włączony do chromosomu rośliny.

Plazmid ten, pIPT4, wprowadzono do szczepu JM 109 E. coli (Escherichia coli) i zdeponowano zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim jako E. coli JM 109 (pIPT4) pod numerem depozytu FERM BP-5063.

Strategia konstruowania plazmidu pIPT4 jest przedstawiona schematycznie na fig. 2 do 4. Mapa restrykcyjna jego regionu T-DNA jest pokazana na fig. 5. Na fig. 2 do 4 i 5, „P” i „T” w kółku oznaczają, odpowiednio, natywny promotor i natywny sygnał poliadenylacji samego genu ipt. 35S-P oznacza promotor 35s wirusa mozaiki kalafiora, a Nos-P oznacza promotor genu syntazy nopaliny. T (fig. 4) lub Nos-T (fig. 5) oznaczają sygnał poliadenylacji genu syntazy nopaliny.

W tym przykładzie, jak pokazano na fig. 5, jako gen MAI będący selekcyjnym genem markerowym, został użyty gen ipt, który ma udział w tworzeniu ESP poprzez wywoływanie utraty dominacji wierzchołkowej, a gen NPTII został zastosowany jako model pożądanego genu. Gen ipt należy do onkogenów posiadanych przez patogenny szczep A. tumefaciens. Komórka roślina, do której wprowadzany jest gen ipt, powoduje różnicowanie, prowadzące do powstania ESP poprzez nadprodukcję cytokininy, która jest hormonem roślinnym.

W tym przykładzie, promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora został użyty jako sekwencja promotora genu ipt, a natywny sygnał poliadenylacji z samego genu ipt zastosowano jako sekwencję terminatora.

II. Wprowadzanie IPT4 do Agrobacterium.

Szczepem A. tumefaciens LBA4404 (otrzymanym z Clontech Co.) zaszczepiono 10 ml płynnej pożywki hodowlanej YEB (zawierającej 5 g/l ekstraktu wołowego, 1 g/l ekstraktu drożdżowego, 1 g/l peptonu, 5 g/l of sacharozy i 2 mM MgSO₄, pH 7,2 w 22°C (pH w 22°C jest stosowane dalej, o ile nie zaznaczono inaczej)) i hodowano w 28°C do chwili osiągnięcia 0D₆3_O w zakresie od 0,4 do 0,6. Następnie hodowlę zwirowywano przy 6900 x g przez 10 minut w 4°C w celu zebrania komórek. Komórki zawieszano w 20 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) i zawiesinę ponownie wirowano przy 6900 x g przez 10 minut w 4°C. Następnie zebrane komórki ponownie zawieszano w 200 pl of płynnej pożywki hodowlanej YEB i ta zawiesina była używana jako zawiesina komórek do wprowadzania plazmidu.

W 15-mililitrowych probówkach (wykonanych przez firmę Falcon) mieszano 200 pl zawiesiny komórek do wprowadzenia plazmidu z 6 pg plazmidu pIPT4, otrzymanego w opisanym powyżej etapie I, i mieszaninę schładzano poprzez zanurzenie jej na 5 minut w etanolu, który był schładzany w ciekłym azocie przez 30 do 40 minut. Tak schłodzony roztwór, łącznie z probówką wstawiano do łaźni wodnej 29°C na 25 minut. Następnie dodawano do niego 750 pl płynnej pożywki hodowlanej YEB i zmieszany roztwór hodowano w 29°C przez 1 godzinę z wytrząsaniem. Tę zawiesinę komórek rozprowadzano na agarowej pożywce hodowlanej YEB (zawierającej 1,2% wag./obj. agaru i te same uzupełnienia, co wspomniana powyżej pożywka hodowlana), do której dodano 50 mg/l kanamycyny, i hodowano w 28°C przez 2 dni. Tak otrzymanymi koloniami komórek zaszczepiano płynną pożywkę hodowlaną YEB i hodowano dalej. Następnie z komórek ekstrahowano plazmid metodą alkaliczną i przecinano endonukleazami restrykcyjnymi PstI, BamHI i EcoRI. Tak otrzymane fragmenty plazmidów analizowano poprzez elektroforezę w żelu agarozowym i potwierdzono, że do szczepu A. tumefaciens LBA4404 został wprowadzony plazmid pIPT4.

III. Przeniesienie IPT4 z Agrobacterium do tytoniu

Dojrzałe liście tytoniu (Nicotiana tabacum cv. xanthi, w dalszej części tytoń będzie oznaczał tę odmianę, o ile nie zaznaczono inaczej) hodowanego w szklarni zanurzano w 1%o obj./obj. wodnym roztworze podchlorynu sodowego w celu sterylizacji i przemywano trzykrotnie sterylną wodą. Następnie, usuwano żyłkę liściową w celu utworzenia dysków liścio184 707 wych o wymiarach około 8 mm kwadratowych. Tak otrzymane dyski liściowe zanurzano na około 1 minutę w zawiesinie szczepu A. fcumefaciens LBA4404, do którego wprowadzono pIPT4 w opisanym powyżej etapie II, i w ten sposób infekowano (zawiesina była rozcieńczana sterylną wodą do 0D_63O=0,25 po nocnej hodowli w płynnej pożywce hodowlanej YEB). Zainfekowany dysk liściowy umieszczano na sterylnej bibule filtracyjnej dla usunięcia resztek zawiesiny komórkowej. Następnie, układano dolną stroną liścia do góry, na agarowej pożywce hodowlanej MS bez hormonów (T. Murashige i F. Skoog, Physiol. Plant., vol. 15, str. 473, 1962 (zakładając, że był do niej dodany 0,8 % wag./obj. agar)), zawierającej 50 mg/l acetylosyringonu i hodowano przez 3 dni w 25°C przy pełnym świetle (hodowanie eksplantu, tkanki roślinnej i rośliny prowadzono w takich warunkach temperatury i oświetlenia, o ile zalecono inaczej). Tak hodowany dysk liściowy był następnie przeszczepiany na agarową pożywkę hodowlaną MS bez hormonów, zawierającą jedynie 500 mg/l karbenicyliny i hodowanie kontynuowano. W rezultacie zróżnicowało się 22 pędów przybyszowych. Takie pędy przybyszowe były oddzielane i dalej hodowane na pożywce hodowlanej o wspomnianym powyżej składzie, w wyniku czego otrzymano 6 linii ESP. Te linie ESP były hodowane, z przeszczepianiem co miesiąc, na tej samej pożywce hodowlanej, a następnie, po 3 miesiącach po infekcji, hodowane na agarowej pożywce hodowlanej MS bez hormonów, nie zawierającej karbenicyliny, z wielokrotnym odświeżaniem hodowli. Gdy nie obserwowano namnażania się Agrobacterium, przeprowadzono test na oporność na kanamycynę i analizę PCR.

IV. Analiza tytoniu do którego wprowadzono gen.

A. Test oporności na kanamycynę linii ESP, otrzymanych w opisanym powyżej etapie III, hodowano bez przeszczepiania. Liście, które rozwinęły się z takich linii ESP odcinano od dysków liściowych i umieszczano na agarowej pożywce hodowlanej MS (z dodatkiem 1 mg/l benzyloadeniny i 0,2 mg/l kwasu a-naftalenooctowego), zawierającej 200 mg/l kanamycyny. Po hodowli na takiej pożywce hodowlanej zawierającej kanamycynę przez 1 miesiąc, tworzenie się linii ESP obserwowano również dla dysków liściowych otrzymanych z tych linii.

B. Analiza PCR.

Chromosomalne DNA ekstrahowano ze wszystkich sześciu linii ESP, otrzymanych w opisanym powyżej etapie III, i geny wprowadzane do nich były analizowane poprzez metodę PCR.

Chromosomalny DNA ekstrahowano przy zastosowaniu następującej zmodyfikowanej metody CTAB.

Na wstępie, około 1 g liści powstałych z ESP rozcierano w ciekłym azocie, stosując schłodzony moździerz i tłuczek, i zawieszano w 5 ml buforu (zawierającego 2% wag./obj. CTAb (bromek heksadecylotrimetyloamonowy), 1,4 M NaCl, 0,2% wag./obj. β-merkaptoetanolu, 20 mM EDTA i 100 mM Tris-HCl (pH 8,0)), który został ogrzany do 60°C. Taką zawiesinę ogrzewano w 60°C przez okres od 30 do 60 minut z łagodnym wytrząsaniem, a następnie schładzano do temperatury pokojowej. Do tej zawiesiny dodawano równą objętość mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego (24:1) i delikatnie mieszano. Następnie mieszaninę wirowano przy 1600 x g przez 5 minut w celu odzyskania supematantu. Następnie do supematantu dodawano 2/3 objętości alkoholu izopropylowego i ponownie delikatnie mieszano. Mieszaninę pozostawiano w lodzie przez 10 minut w celu wytrącenia chromosomalnego DNA. Ten chromosomalny DNA zbierano poprzez wirowanie przy 1600 x g przez 10 minut. Tak zebrany chromosomalny DNA przemywano 70% wag./obj. etanolem, suszono pod próżnią i rozpuszczano w 300 pl TE, zawierającego 10 mM Tris-HCl i 1 mM EDTA.

W międzyczasie, w celu wykrycia genu ipt poprzez metodę PCR, zsyntetyzowano potrzebną parę starterów (oligonu-kleotydów), w syntetyzatorze DNA (wyprodukowanym przez Applied Biosystems Co.). Po związaniu się ich z genem ipt, odległość pomiędzy dwoma starterami będzie wynosiła około 800 bp. W celu powielenia genu ipt, 1 pg wyekstrahowanego chromosomalnego DNA rozcieńczano w 50 pl mieszaniny zawierającej 0,2 pM tych starterów, 10 mM Tris HCl (pH 8,8 w 25°C), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 1% wag./obj. Tritonu Χ-100, 0,1 mM dNTP i 1,25 jednostek polimerazy Taq (otrzymanej z CETUS C0.). Po podgrzaniu mieszaniny w 94°C przez 1,5 minuty, trzyczęściowy cykl ogrzewania, a mianowicie, w 94°C przez 1 minutę, w 55°C przez 2 minuty i w 72°C przez 3 minuty, był powtarzany

184 707 razy dla doprowadzenia reakcji do końca. Otrzymaną mieszaninę reakcyjną analizowano poprzez elektroforezę w żelu agarozowym w celu wykrycia obecności genu ipt w chromosomalnym DNA poprzez powielenie fragmentu genu około 800 bp.

Wyniki są pokazane na fig. 6. Jak jasno wynika z fig. 6, można było zaobserwować powielenie fragmentu genu około 800 bp dla wszystkich 6 ESP. Na fig. 6, wartości pokazane po lewej stronie oznaczają długość w zasadach fragmentów w wykrywanych prążkach DNA (dalej określanych jako prążki) po rozdziale elektroforetycznym markera wielkości DNA.

Porównawczy przykład 1

Analizę prowadzono w odniesieniu do 16 pędów, które nie miały zdolności tworzenia ESP i były otrzymane z korzeni przybyszowych wyróżnicowanych z liści zainfekowanych A. tumefaciens w etapie III z przykładu 1. To jest, w czasie hodowania 22 korzeni przybyszowych i selekcji 6 linii ESP w etapie III z przykładu 1, te linie, które wykazywały morfologicznie normalne pędy (określane dalej jako „nie-ESP”) były również uwalniane od A. tumefaciens i poddawane testowi na oporność na kanamycynę w taki sam sposób, jak w etapach III i IV przykładu 1. Następnie 9 linii nie-ESP poddawano analizie PCR. Jednakże w przypadku linii nie-ESP, dyski liściowe umieszczane na pożywce hodowlanej zawierającej kanamycynę stawały się brązowe i obumierały po 3 miesiącach. Ponadto, w analizie PCR, dla żadnej z analizowanych dziewięciu linii nie wykrywano powielenia fragmentu DNA około 800 bp, który dowodził obecności genu ipt.

Wyniki analizy PCR są pokazane na fig. 6.

Przykład 2

I. Konstrukcja wektora

Plazmid pH5G398 (otrzymany z Takara Shuzo Co., Ltd.) trawiono endonukleazą restrykcyjną BamHI. Lepkie końce wytwarzane poprzez trawienie zamieniano na tępe końce przy użyciu polimerazy i DNA T4 (duża podjednostka) i poprzez ligację tych końców otrzymano plazmid pNPI100. To jest, pNPI100 był pH5G398, który utracił miejsce rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną BamHI. W międzyczasie, plazmid pCKR97 (T.Izawa i wsp., Mol. Gen. Genet., vol. 227, str. 391, 1991) trawiono endonukleazą restrykcyjną PstI. Transposon Ac z kukurydzy wycinano i wstawiano w miejscu restrykcyjnym PstI pNPI100 w celu otrzymania plazmidu pNPI102.

Następnie, z plazmidu pIPT4, skonstruowanego w przykładzie 1, wycięto endonukleazami restrykcyjnymi Hindlll i SacI promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora z dołączonym do niego genem ipt. W celu otrzymania plazmidu pNPI101, lepkie końce tak otrzymanego fragmentu zmieniano na tępe końce za pomocą polimerazy i DNA T4, a fragment wstawiano w miejsce restrykcyjne HincII plazmidu pUC119. Promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora i gen ipt wycięto ponownie z plazmidu pNPI101 endonukleazami restrykcyjnymi PstI i EcoRI i lepkie końce fragmentu zmieniano na tępe końce za pomocą polimerazy i DNA T4. Następnie otrzymano plazmid pNPI103 poprzez ligację fragmentu w miejscu dla endonukleazy BamHI w pNPI102, po zmianie końców na tępe. To znaczy, że w plazmidzie pNPI103, promotor 35S i dołączony do niego gen ipt znajdują się w starym miejscu BamHI w obrębie transpozonu transpozonu Ac.

Pożądany wektor został otrzymany poprzez wycięcie transpozonu Ac, zawierającego promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora i gen ipt, z plazmidu pNPI103 endonukleazą restrykcyjną PstI i wstawienie tego transpozonu w miejscu restrykcyjnym Ssel wektora plazmidowego pBI121. Został on nazwany plazmidem pNPI106.

Plazmid pNPI106 został również wprowadzony do szczepu E. coli JM109 i zdeponowany zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim jako E. coli JM109 (pNPI106) pod nr depozytu FERM BP-5064.

Strategia konstruowania plazmidu pNPI106 jest schematycznie pokazana na fig. 7 do 9. Mapa restrykcyjna zawartego w nim regionu T-DNA jest pokazana na fig. 10. Na fig. 7 do 9 i 10, krańcowe regiony transpozonu Ac są pokazane, odpowiednio, jako przeciwnie zorientowane czarne trójkąty. Na fig. 10, Ac-P jest natywnym promotorem obecnym w obrębie Ac. Inne symbole są takie, same jak pokazane na fig. 2 to 5.

184 707

Jak widać jasno na fig. 10, plazmid ten ma gen ipt jako selekcyjny gen markerowy, a gen NPTII i gen GUS (β-galaktozydazy) jako model genu pożądanego w regionie T-DNA, a mianowicie w regionie, który ma być włączony do chromosomu rośliny. Ponadto, gen ipt jest obecny jako wstawka w obrębie transpozonu Ac. Ponieważ komórki mające gen GUS metabolizują specjalny substrat z wytworzeniem niebieskiego barwnika, ekspresja genu może być identyfikowana poprzez wykrywanie tego barwnika. A zatem gen GUS jest często stosowany do analizy ekspresji genu w roślinie.

II. Wprowadzenie NPI106 do tytoniu i analiza tytoniu do którego wprowadzono gen.

A. Wprowadzenie NPI106 do tytoniu i test na ekspresję wprowadzonego genu.

W taki sam sposób, jak w etapach II i II przykładu 1, do szczepu A. tumefaciens L8A4404 został wprowadzony pNPI106 i tym A. tumefaciens infekowano dyski liściowe tytoniu. Tak infekowany liść tytoniu hodowano na agarowej pożywce hodowlanej MS bez hormonów zawierającej 50 mg/l acetylosyringonu, a następnie na agarowej pożywce hodowlanej, do której dodawano 500 mg/l karbenicyliny. Po dwóch miesiącach takiej hodowli, wydzielono 63 linie ESP.

Te linie ESP przenoszono na pożywkę hodowlaną o tym samym składzie (agarową pożywkę hodowlaną MS bez hormonów nie zawierającą karbenicyliny). Miesiąc później, spośród pędów z EPS, które słabo rosły, wybrano wizualnie 9 pędów (te, które powstały z EPS są dalej nazywane po prostu „pędami”), które rosły około dwa lub więcej razy (?) w porównaniu z innymi pędami, dla których nie obserwowano wzrostu pędów bocznych, i w których wpływ genu ipt wydawał się być zmniejszony. Liście tych pędów poddawano temu samemu testowi na oporność na kanamycynę, jak przeprowadzony w etapie IV-A przykładu 1 i testowi na ekspresję genu GUS (test aktywności GUS) w oparciu o metodę Jefferson i wsp. Pędy otrzymane po odcięciu liści były przeszczepiane na agarową pożywkę hodowlaną MS bez hormonów i hodowane. Miesiąc później, obserwowano kształt celem wykrycia zdolności pędów do tworzenia ESP, a zatem wykazywania ekspresji genu ipt.

Wyniki są pokazane w tabeli 1.

Tabela 1

Wyniki testu na ekspresję genu wprowadzonego do tytoniu przy użyciu wektora pNPI106

	Nr pędu	Oporność na kanamycynę	Aktywność GUS	Morfologia po 1 miesiącu hodowli
Przykład 2	1	+	+	ESP
2	+	+	ESP
3	+	-	ESP
4	+	+	ESP
5	+	-	ESP
6	+	-	ESP
7	+	+	ESP
8	+	+	prawidłowa
9	+	+	ESP
Porównawczy przykład 2	10	-	-	prawidłowa
11	-	-	prawidłowa
12	-	-	prawidłowa

Uwagi: 1. Dla oporności na kanamycynę, + oznacza „oporny”, i - oznacza „nieoporny”.

2. W przypadku aktywności GUS, + oznacza „aktywny”, i- oznacza „nieaktywny”.

3. „prawidłowa” oznacza osobnika, który wykazuje wzrost wierzchołkowy pędu głównego i tworzenie korzeni

184 707

Jak widać z tabeli 1, jakkolwiek liść pędu nr 8 wykazuje oporność na kanamycynę i aktywność GUS, EPS nie powstaje, nawet jeżeli pęd jest hodowany przez 1 miesiąc. Dzieje się tak prawdopodobnie dlatego, że gen ipt, który powoduje wytwarzanie ESP jest obecny jako wstawka w obrębie transpozonu Ac w plazmidzie pNPI106. To znaczy, gen ipt, który jest wprowadzany do chromosomu tytoniu poprzez infekcję tkanki A. tumefaciens, zawierającej ten plazmid i podlega ekspresji w początkowym stadium hodowania tkanki tuż po infekcji, jest usuwany razem z Ac porzez działanie Ac w dalszym ciągu prowadzenia hodowli. Jednocześnie, w tym samym wektorze, gen NPTII i gen GUS są wstawione w takim miejscu, że nie zachowują się integralnie z Ac, a więc geny te pozostają nadal w chromosomie rośliny i podlegają ekspresji.

W tabeli 1, jakkolwiek oporność na kanamycynę i zdolność tworzenia EPS obserwuje się w pędach nr 3, 5 i 6, jedynie aktywność GUS jest negatywna. Oznacza to, że w tych pędach spośród genów wprowadzonych przy zastosowaniu pNPI106, jedynie gen GUS nie podlega ekspresji. Uw^ż a się, że jest to wynikiem błędnej integracji, która zachodzi w czasie włączania genów do chromosomu rośliny. To znaczy, kiedy gen jest wprowadzany za pośrednictwem A. tumefaciens zawierającej plazmid o strukturze pNPI106 lub temu podobnej, region T-IDNA, a mianowicie cały wewnętrzny region pomiędzy miejscami RB i LB, normalnie musi być włączony do chromosomu rośliny. Jednakże czasami region ten nie jest włączany kompletnie, ale jest przerwany i wstawiany jako defektywny kawałek, któremu brak części końca LB. W regionie T-DNA pNPI106. gen GUS jest obecny w pozycji najbliższej miejsca LB. Zgocbiie z powyższym, uważa się, że wskutek błędnego włączania się w czasie wprowadzania genu, gen GUS jest włączany do chromosomu w warunkach, w których gen GUS jest rozrywany na kawałki i traci swoją własną funkcję, bądź też gen GUS nie jest wcale włączany, a zatem w tych pędach gen GUS nie podlega ekspresji i nie obserwuje się jego aktywności.

Fotografie pędów nr 2 i 8 po jednym miesiącu hodowania są pokazane na fig. 11 i 12.

W przypadku liścia hodowanego z pędu nr 8 i poddanego testowi na oporność na kanamycynę, hodowla była dalej kontynuowana po wykonaniu testu. Z tego liścia otrzymano pięć pędów przybyszowych i wszystkie one były nie-ESP.

B. Analiza PCR

Dla pędów nr od 1 do 9 w tab. 1, po zaobserwowaniu zdolności do tworzeni a EPS, przeprowadzono analizę PCR w ten sam sposób, jak w etapie IV-B w przykładzie 1 w celu dalszego zbadania obecności genu ipt w chromosomie, zakładając, że para starterów, która została zaprojektowana tak, aby wiązać się, odpowiednio, do genu NPTII i do genu GUS, będzie zastosowana dodatkowo oprócz starterów stosowanych w etapie IV-B w przykładzie 1. W przypadku użycia tych starterów, kiedy wstawione tam Ac i gen ipt (kompleks genowy Ac-ipt) są wycięte z regionu T-DNA pNPIW6, w reakcji PCR powielany jest fragment DNA około 3 kb. Tak więc wycięcie kompleksu genowego Ac-ipt z DNA może być wykrywane przy zastosowaniu takiego powielania jako wskaźnika.

Wyniki analizy PCR dla pędu nr 8 są pokazane na fig. 13, na której wartości wskazane po lewej stronie są takie same, jak pokazane na fig. 6.

Jak widać na podstawie wyników, w DNA chromosomalnym wyekstrahowanym z pędu nr 8, obserwuje się powielenie fragmentu DNA około 3 kb, co dowodzi wycięcia kompleksu genowego Ac-ipt, podczas gdy nie obserwuje się powielania fragmentu DNA około 800 bp, które dowodzi obecności genu ipt. Oznacza to, że gen ipt jest wycięty z DNA chromosomalnego tego pędu łącznie z Ac i znika. Z drugiej strony, w odniesieniu do pędów nr 1 do 7 i 9, w żadnej z próbek chromosomalnego DNA nie wykrywano powielenia fragmentu DNA około 3 kb, podczas gdy we wszystkich próbkach DNA chromosomalnego wykrywano fragment DNA około 800 bp. Tak więc uważa się, że w tych pędach gen ipt jest nadal obecny w DNA chromosomalnym, łącznie z Ac.

Porównawczy przykład II

W hodowli liścia infekowanego A. tumefaciens z etapu II-A w przykładzie 2 trzy nieESP, zróżnicowane obok ESP, wydzielono i poddano testowi na oporność na kanamycynę, testowi na aktywność GUS, wizualnej obserwacji po miesiącu hodowli i analizie PCR w ten sam sposób, jak w II z przykładu 2 .

184 707

Wyniki są pokazane w tabeli 1. Pędy otrzymane z tych nie-ESP nie mają żadnej oporności na kanamycynę, aktywności GUS i zdolności tworzenia ESP. Poza tym w analizie PCR nie wykrywano powielania fragmentów DNA około 800 bp i około 3 kb.

Przykład 3

W dalszym ciągu kontynuowano hodowanie 63 linii ESP wydzielonych w przykładzie 2 na agarowej pożywce hodowlanej MS bez hormonów. Około 2 miesiące po wydzieleniu, z dwóch linii ESP otrzymano łącznie 7 pędów o nr 13-1 do 13-3 i 14-1 do 14-4, które były normalnymi pędami możliwymi do zidentyfikowania wizualnie, to jest które wykazywały dominację wierzchołkową. Pędy te były oddzielone i przeniesione do pożywki hodowlanej o wspomnianym powyżej składzie, a następnie normalnie się rozrosły i ukorzeniły. Spośród nich, osobniki otrzymane z pędów 13-1 i 14-1 poddano analizie PCR w ten sam sposób, jak w etapie II-B w przykładzie 2. W rezultacie nie zaobserwowano powielania fragmentu DNA około 800 bp ani w pędzie nr 13-1, ani 14-1. Jednocześnie w obu tych pędach obserwowano powielenie fragmentu DNA około 3 kb. Stwierdzono w ten sposób, że gen ipt został wycięty z chromosomalnego DNA tych osobników łącznie z Ac i zanikł. Wyniki są pokazane na fig. 14, na której wartości wskazane po lewej stronie są takie same, jak te pokazane na fig. 6. Ponadto wykryto ekspresję genu GUS we wszystkich osobnikach otrzymanych ze wszystkich siedmiu pędów.

Figura 15 pokazuje normalne pędy wyróżnicowane z ESP.

Przykład 4

Liść otrzymany z pędu, który jest pokazany jako pęd nr 7 w tabeli 1, łącznie z 9 pędami wyselekcjonowanymi w przykładzie 2, hodowano na agarowej pożywce hodowlanej MS bez hormonów przez około 1 miesiąc. Jeden normalny pęd był wizualnie wybrany i oddzielony z 6 pędów przybyszowych, które wyróżnicowały się z hodowanego liścia. Ten normalny pęd przenoszono na pożywkę hodowlaną o wspomnianym powyżej składzie, a następnie otrzymano normalnie rozwiniętego i ukorzenionego osobnika. Następnie osobnik ten został poddany analizie PCR w taki sam sposób, jak w etapie II-B w przykładzie 2 i na podstawie zniknięcia fragmentu DNA około 800 bp i powielenia fragmentu DNA około 3 kb stwierdzono, że gen ipt został wycięty z DNA chromosomalnego łącznie z Ac i zniknął. Wyniki są pokazane na fig. 16, na której wartości wskazane po lewej stronie są takie same, jak te pokazane na fig. 6. Ponadto w tym samym osobniku wykrywano również ekspresję genu GUS.

Przykład 5

I. Izolacja systemu rekombinacji miejscowo specyficznej (system pSR1) z drożdży.

Drożdżami (Zygosaccharomyces rouxii) (otrzymanymi z Institute for Fermentation)) zaszczepiono 5 ml płynnej pożywki hodowlanej YPAd (zawierającej 10 g/l ekstraktu drożdżowego, 20 g/l polipeptonu, 0,4 g/l adeniny i 20 g/l glukozy) i hodowano w 30°C przez 24 godziny. Płyn hodowlany zwirowywano przy 6900 x g przez 3 minuty w 20°C w celu zebrania komórek (komórki były dalej zbierane w tych samych warunkach). Otrzymane komórki zawieszano w 2 ml roztworu zawierającego 0,2 M Tris-HCl (pH 8,0) i 5% obj./obj. merkaptoetanolu. Zawiesinę komórek pozostawiano w 25°C przez 30 minut od czasu do czasu delikatnie mieszając, po czym komórki zbierano. Następnie zebrane komórki zawieszano w 1 ml roztworu (pH 6,8) zawierającego 2,5 mg/ml Zaimolyeis-20T (otrzymanego z SEIKAGAKU CORPORATION), 10% wag./obj. sorbitolu i 5% wag./obj. KPO4. Zawiesinę komórek pozostawiano w 30°C przez 90 minut i ponownie wirowano celem powtórnego zebrania komórek. Zebrane komórki zawieszano w 1 ml roztworu zawierającego 0,2 M NaCl, 0,1 M EDTA, 5% wag./obj. SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 8,5) i dodawano Proteinazę K do 20 mg/ml. Mieszaninę pozostawiano w 60°C na 1 godzinę, a następnie przenoszono z powrotem do temperatury pokojowej i ekstrahowano mieszaniną fenolu z chloroformem, a następnie oczyszczano chloroformem. Do tak otrzymanego supematantu dodano równą objętość izopropanolu celem wytrącenia DNA chromosomalnego i plazmidu pSR1. Mieszaninę wirowano przy 6900 x g przez 10 minut w 4°C celem otrzymania DNA i zebrany DNA przemywano 70% obj./obj. etanolem, suszono pod próżnią i rozpuszczano w 100 pl TE.

Stosując tak wyekstrahowany DNA (mieszanina DNA chromosomalnego i plazmidu pSR1) jako matrycę, w reakcji PCR powielany był jedynie system rekombinacji miejscowo specyficznej, który był obecny plazmidzie pSR1 (określany dalej jako „system pSR1”). System

184 707 pSR1 składa się z genu R, który jest genem rekombinazy i sekwencji rekombinacyjnej Rs, a ich sekwencje DNA zostały już ustalone (H. Araki i wsp., J. Mol. Biol., vol:182, str. 191, 1985). W niniejszym wynalazku, celem powielenia genu R zsyntetyzowano starter, w którym na końcu 5' 22 zasad, a mianowicie zasad 5596-5617 w sekwencji plazmidu pSR1 (5 '-CCTCTAGAATGCAATTGAGCAAGiGATACTG-3') zostało dodane miejsce restrykcyjne XbaI i starter, w którym na końcu 5' 22 zasad, a mianowicie zasad, 4126-4147 w sekwencji plazmidu pSR1 (5'-CCGAGCTCTTAATCTTGTCAGGAGGTGTCA-3') zostało dodane miejsce restrykcyjne SacI. Z drugiej strony, celem powielenia Rs zsyntetyzowano dwie pary starterów, każdy zawierający 30 zasad (łącznie cztery rodzaje). To znaczy, jedna para składała się ze startera, w którym trzy z zasad 287-316 w sekwencji plazmidu pSR1 zastąpiono poprzez wprowadzenie miejsca restrykcyjnego SseI (5'-AGGATTGAGCTACTGGACGGGAATCC TGCA-3') i startera, w którym cztery z zasad 690-719 w sekwencji plazmidu pSR1 zastąpiono poprzez wprowadzenie miejsca restrykcyjnego HindIII oraz miejsca restrykcyjnego Xhol (5' CTCGAGCAATCAAAGCTTCTCGTAGTC-3'). Rs, który miał być powielany przy użyciu tego zestawu starterów nazwano „Rs1”. Druga para składała się ze startera, w którym trzy z zasad 287-316 w sekwencji plazmidu pSR1 zastąpiono poprzez wprowadzenie miejsca restrykcyjnego Xhol oraz miejsca restrykcyjnego EcoRI (5'-AGGATTGAGCTACTCGAGG GGAATTCTGGA-3') i startera, w którym pięć z zasad 688-717 w sekwencji plazmidu pSR1 zastąpiono poprzez wprowadzenie miejsca restrykcyjnego SseI (5'-ACTGGACCAATCCCTG CAGGTCGTAgTCAA-3'). Rs, który miał być powielany przy użyciu tego zestawu starterów nazwano „Rs2”.

W celu powielenia genu R i Rs, 1 pl roztworu wyekstrahowanego DNA dodawano do 50 pl mieszaniny stosowanej w etapie IV-B z przykładu I, zawierającej 0,2 p,M każdego z odpowiedniego zestawu starterów. Trzyczęściowy cykl ogrzewania, a mianowicie, w 95°C przez 30 sekund, w 55°C przez 30 sekund i w 72°C przez 1,5 minuty, był powtarzany 30 razy. Tak otrzymaną mieszaninę reakcyjną analizowano poprzez elektroforezę w żelu agarozowym w celu potwierdzenia powielenia genu R i Rs.

II. Konstrukcja wektora

Rs1 powielony przy zastosowaniu metody PCR strawiono endonukleazami restrykcyjnymi PstI i Xhol i poprzez wstawienie tego Rs1 w miejsca restrykcyjne PstI-XhoI w p5Ll 180 (otrzymanego z Pharmacia Biotech Co.) otrzymano plazmid pNPI126.

Następnie, celem wyeliminowania miejsca restrykcyjnego EcoRI i miejsca restrykcyjnego HindIII z pH5G398, trawienie tymi endonukleazami restrykcyjnymi, powtórzono zamianę strawionych końców na tępe końce przy użyciu polimerazy I T4 (duża podjednostka) i ligację tępych końców, w tej kolejności. W ten sposób otrzymano plazmid pNPI121 z wyeliminowanymi tymi miejscami restrykcyjnymi. Plazmid pNPI127 wytworzono poprzez trawienie Rs2, powielonego przy użyciu metody PCR, endonukleazami restrykcyjnymi Xhol i PstI i wstawienie tego Rs2 w miejscach restrykcyjnych SalI-PstI plazmidu pNPI121.

Plazmid pNPI128 otrzymano poprzez wycięcie Rs1 z pNPI126 endonukleazami restrykcyjnymi SmaI SpeI i wstawienie tego fragmentu w miejscach restrykcyjnych Smal-Xbal pNPI127.

Gen R powielony przy zastosowaniu metody PCR trawiono endonukleazami restrykcyjnymi XbaI i Sacl i wstawiano do miejsca restrykcyjnego Xbal-Sacl w pH5G398. Tak otrzymany plazmid oznaczono pNPI124.

Następnie, pBI221 (otrzymany z Clontech Co.) strawiono endonukleazą restykcyjną PstI. Strawione końce zmieniono na tępe, a następnie poddawano ligacji w sposób opisany powyżej. A zatem otrzymano plazmid pNPI111, z wyeliminowanymi miejscami restrykcyjnymi Ssel i PstI. Następnie, gen R, wycięty z pNPI124 endonukleazami restrykcyjnymi XbaI i Sacl, wstawiano do miejsc restrykcyjnych Xbal-Sacl w pNPI111, podmieniając gen GUS, z wytworzeniem plazmidu pNPI125. Następnie, promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora, gen R dołączony do promotora i sygnał poliadenylacji syntetazy nopaliny wycięto endonukleazami restrykcyjnymi HindIII i EcoRI i wstawiono do miejsc restrykcyjnych Hindlll-EcoRI w pNPI128 w celu utworzenia plazmidu pNPI129.

PNPI101 trawiono endonukleazą restrykcyjną SmaI i w miejscu trawienia dołączano 5'-fosforylowany linker HindIII (otrzymany - z Takara Shuzo Co., Ltd.) w celu otrzymania

184 707 plazmidu pNPI122. To znaczy, ten plazmid pNPI122 jest takim, w którym miejsce restrykcyjne SmaI zastąpiono miejscem restrykcyjnym HindIII. Następnie, pNPI122 trawiono endonukleazą restrykcyjną PstI i końce po trawieniu zmieniano na tępe końce i poddano ligacji w celu utworzenia pNPI123 z wyeliminowanymi miejscami restiykcyjnymi Ssel i PstI. Z tego plazmidu pNPI123, wycinano promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora i gen ipt dołączony do promotora endonukleazą restrykcyjną HindIII i wstawiano do miejsca restrykcyjnego HindIII w pNPI129 w celu wytworzenia plazmidu pNPI130.

Pożądany wektor został otrzymany poprzez wycięcie endonukleazą restrykcyjną PstI fragmentu, zawierającego gen ipt i gen R, z dołączonym do nich, odpowiednio, promotorem 35S wirusa mozaiki kalafiora i Rs obecnymi na obu końcach tych genów i wstawienie tego fragmentu do miejsca restrykcyjnego Ssel w pBI1211. Tak otrzymany plazmid został nazwany pNPI132.

Plazmid pMPI132 został również wprowadzony do szczepu E. coli JM109 i zdeponowany zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim jako E. coli JM109 (pNPI132) pod nr depozytu FERM BP-5065.

Strategia konstruowania plazmidu pNPI132 jest schematycznie pokazana na fig. 17 do 19. Mapa restrykcyjna zawartego w nim regionu T-DNA jest pokazana na fig. 20. Na fig. 17 do 19 i 20, zakreskowane trójkąty oznaczają sekwencje rekombinacyjną Rs, pochodzącą z plazmidu pSR1 z drożdży, i kierunek tych sekwencji. Inne symbole są takie same, jak pokazane na fig. 2 do 5.

Jak widać na fig. 20, plazmid pNPI132, tak samo jak plazmid pNPI106, ma gen ipt jako selekcyjny gen markerowy, a gen NPTII i gen GUS jako modele genu pożądanego w regionie T-DNA. Jednakże, w tym przypadku, region pomiędzy dwiema sekwencjami rekombinacyjnymi Rs w systemie pSR1 zachowuje się jak usuwalne elementy DNA. A zatem gen ips jest wstawiony tak, że zawiera się między dwiema tak samo zorientowanymi sekwencjami rekombinacyjnymi.

II. Wprowadzenie NPI132 do tytoniu i analiza tytoniu, do którego wprowadzono gen. pNPI132 został wprowadzony do szczepu A. tumefaciens L8A4404 w taki sam sposób, jak w etapach II i II przykładu 1, i dyski liściowe tytoniu (Nicotiana tabacum cv. SR1) infekowano tym A. tumefaciens. Następnie, liście tytoniu hodowano na agarowej pożywce hodowlanej MS bez hormonów zawierającej 50 mg/l acetylosyringonu, a następnie na agarowej pożywce hodowlanej, do której dodawano 500 mg/l karbenicyliny.

Miesiąc później, hodowane liście przenoszono na pożywkę hodowlaną o tym samym składzie i hodowla była dalej kontynuowana przez 1 miesiąc. Następnie wydzielano 48 linii ESP.

Te linie ESP przenoszono na pożywkę hodowlaną o tym samym składzie i hodowla była dalej kontynuowana. Około miesiąca później (to znaczy 3 miesiące po infekcji A. tumefaciens), pędy, dla których można było stwierdzić, że mają normalną morfologię, powstały z siedmiu spośród 48 linii ESP. Pędy te zostały oddzielone i przeniesione na pożywkę hodowlaną o tym samym składzie, a następnie można było uzyskać dziesięć normalnych osobników.

Osobniki te poddano analizie PCR w ten sam sposób, jak w etapie II-B przykładu 2, z tym, że oprócz starterów zastosowanych w etapie II-B z przykładu 2, użyto pary starterów do wykrywania genu GUS. Przeprowadzając PCR z zastosowaniem tych starterów, powielano fragment o wielkości około 800 bp wtedy, gdy obecny był gen ipt; fragment DNA o wielkości około 3 kb powielano wtedy, kiedy gen ipt był wycinany z regionu T-DNA plazmidu pNPI132 poprzez wycięcie części otoczonych przez Rs (wyniki te są takie same, jak w analizie w etapie IIB w przykładzie 2), a fragment DNA o wielkości około 1,7 kb powielano wtedy, kiedy obecny był gen GUS. Wyniki są pokazane na fig. 21-23 i w tabeli 2. Na fig. 21-23, wartości pokazane po lewej stronie są takie, same jak pokazane na fig. 6.

184 707

Tabela 2

Wyniki analizy transgenicznego genu w tytoniu, do którego gen został wprowadzony przy użyciu wektora pNPI132

Nr linii ESP	Nr poszczególnych roślin	re ipt	re GUS 1,7 kb
800 bp	3 kb
15	1	-	+	+
	2	-	+	+
16	1	-	+	+
17	1	-	+	+
18	1	-	+	+
19	1	-	+	+
	2	-	+	+
20	1	-	+	+
	2	-	+	+
21	1	-	+	+

Uwagi: + wskazuje, że odpowiedni fragment DNA jest powielony, i - wskazuje, że jest nie powielony.

Jak widać z tabeli 2, nie wykrywano obecności genu ipt, który był selekcyjnym genem markerowym, w żadnym z chromosomów osobników, które zostały wyselekcjonowane po prostu przez wizualną obserwację ich morfologii, natomiast wykrywano powielenie fragmentu DNA, który wskazuje na wycięcie genu ipt. Jednocześnie obecność genu GUS, stosowanego jako gen pożądany, wykrywano we wszystkich osobnikach.

Z drugiej strony, analizowano oporność na kanamycynę poprzez zastosowanie skrajnych pączków osobników, które zostały otrzymane przy użyciu podłoża agarowego MS bez hormonów zawierającego 200 mg/l kananycyny z linii nie-ESP, różnicujących się niemal jednocześnie z 48 liniami ESP i wykazywały normalny wzrost i ukorzenienie. W rezultacie stwierdzono, że 2 spośród 16 osobników ma oporność na kanamycynę.

W dalszym ciągu, te osobniki kanamycyno-oporne badano poprzez poddanie analizie PCR, łącznie z trzema osobnikami wyselekcjonowanymi spośród 14 osobników kanamycynowrażliwych w ten sam sposób, jaki zastosowano dla osobników otrzymanych z ESP. Figura 24 pokazuje wyniki, gdzie wartości pokazane po lewej stronie są takie same, jak pokazane na fig. 6.

Jak jasno pokazuje fig. 24, każdy z dwóch osobników kanamycyno-opornych wykazywał powielenie fragmentu DNA, który wskazuje na wycięcie regionu zawierającego gen ipt i otoczonego przez Rs oraz obecność genu GUS. A zatem udowodniono, że geny pochodzące z pNPI132 zostały włączone do tych chromosomów. W przeciwieństwie do tego, takiego powielenia nie obserwowano dla trzech osobników kanamycyno-wrażliwych. Ponadto, żaden z tych osobników (mianowicie, ani osobniki oporne na kanamycynę, ani osobniki wrażliwe na kanamycynę) nie wykazywał powielenia fragmentu DNA, wskazującego na obecność genu ipt.

Uważa się, że te kanamycyno-opome osobniki, otrzymane ze szczepu pozbawionego zdolności do tworzenia ESP, tak samo jak osobniki kanamycyno-wrażliwe, pochodzą z komórek, do chromosomów których pNPI132 nie został włączony w czasie infekcji A. tumefaciens. Przyjmując to założenie jest niemożliwe, żeby geny pochodzące z tego wektora znajdowały się w chromosomach. Co więcej, jest niemożliwe żeby osobniki, które są pozbawione genu ipt, ale zawierają gen NPT2 (na co wskazuje fakt, że osobniki te były oporne na kanamycynę) i gen GUS, każdy w pełnej postaci w chromosomach, pojawiły się z taką częstością, biorąc pod uwagę, że wszystkie te geny pochodziły z tego samego wektora.

Można mianowicie wnioskować, że u tych kanamycyno-opomych osobników, pNPI132 został raz wprowadzony do chromosomu. To znaczy zakłada się, że region T-DNA pNPI132 został raz wprowadzony do chromosomu wskutek infekcji A. tumefaciens, ale nadmiernie

184 707 wydajne funkcjonowanie systemu pSR1, stosowanego w tym wektorze, spowodowało wycięcie genu ipt przed utworzeniem ESP po infekcji A. tumefaciens. W rezultacie jedynie gen NPT2 i gen GUS pozostały w chromosomie. Fakt, że osobniki kanamycyno-oporne wykazywały w analizie PCR wycięcie regionu zawierającego gen ipt i otoczonego przez Rs również potwierdza tą hipotezę.

Przykład 6

I Konstrukcja wektora

Geny rol (S.Kiyokawa, Plant Physiol., vol. 104, str. 801, 1994), zawierające rolA, rolB i rolC, o całkowitej wielkości 7,6 kb, wprowadzone w miejsce restrykcyjne EcoRI w pBluescriptll SK+ (skonstruowanym przez Toyobo Co., Ltd.), wycięto endonukletazą restrykcyjną EcoRI. Fragment ten wprowadzono w miejsce restrykcyjne EcoRI w pNPI129 i utworzono plazmid pNPI700.

Z plazmidu pNPI700 wycięto endonukleazą restrykcyjną SseI geny rol, promotor 35S z wirusa mozaiki kalafiora, gen R połączony z promotorem oraz Rs obecne na obu końcach genów i wprowadzono w miejsce restrykcyjne SseI w pBI121, otrzymując pożądany plazmid pNPI702.

Plazmid pNPI702 wprowadzono także do szczepu E. coli JM109 i zdeponowano zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim jako E. coli JM 109 (pNPI702) pod numer depozytu FERM BP-5066.

Strategię konstruowania plazmidu pNPI702 przedstawiono schematycznie na fig. 25. Mapę restrykcyjną zawartego w nim regionu T-DNA przedstawiono na fig. 26. Symbole na fig. 25 i 26 są takie same, jak na fig. 2 do 5.

Jak widać na fig. 26, plazmid pNPI702 jest podobny do pNPI132; jedynie selekcyjny gen markerowy ipt zamieniono na geny rol. Geny rol użyte w tym wektorze są obecne w TDNA A. rhizogenes w naturze. Wiadomo, że po wprowadzeniu genów rol do komórek roślinnych, w tkankach roślinnych tworzone są korzenie włosowate oraz, że rośliny regenerujące z korzeni włosowatych wykazują nieprawidłowości morfologiczne, takie jak karłowatość lub temu podobne.

II. Wprowadzenie pNPI702 do tytoniu i analiza tytoniu do którego został wprowadzony gen

Plazmid pNPI702 wprowadzono do szczepu LBA4404 A. tumefaciens w podobny sposób, jak opisano w etapie II i III z przykładu 2 i otrzymanymi A. tumefaciens infekowano dyski liściowe tytoniu.

Tak otrzymane dyski liściowe tytoniu hodowano na agarowej pożywce hodowlanej MS bez hormonów zawierającej 50 mg/l acetylosyringonu, w ciemności, przez 3 dni, a następnie na agarowej pożywce hodowlanej MS bez hormonów, do której dodano 400 mg/litr tikarcyliny. Po około 15 dniach od rozpoczęcia hodowli obserwowano różnicowanie się korzeni włosowatych. Korzenie włosowate oddzielano jeden od drugiego i przekładano na pożywkę indukującą wytwarzanie pędów (agarowa pożywka hodowlana MS zawierająca 0,1 mg/litr kwasu a-naftalenoacetylowego, 2,0 mg/litr benzyloadeniny oraz 400 mg/litr tikarcyliny). Następnie spośród odróżnicowanych pędów wybrano wizualnie 18 o prawidłowej morfologii i poddano analizie metodą PCR w taki sam sposób, jak w etapie II-B z przykładu 2, stosując startery do wykrywania wycinania obszaru zawierającego geny rol otoczonego przez R poprzez powielenie fragmentu DNA o wielkości około 3 kb (jak te same startery użyte w przykładzie 2 do 5 i Porównawczym przykładzie 2) oraz startery do wykrywania obecności genów rol poprzez powielenie fragmentu DNA o wielkości około 1,1 kb. W rezultacie potwierdzono, że obszar zawierający geny rol i otoczony przez Rs jest wycinany z chromosomów 9 pędów.

Przykład 7

Przy użyciu wektora pNPI106 z powyższego przykładu 2, wprowadzono gen do hybrydowej osiki (Populus Sieboldii x Populus grandidentata; roślina drzewiasta).

Łodygę hybrydowej osiki szczepu Y63 (pochodzącej z doświadczalnego lasu Akita Jujo Chemicals Co., Ltd.), rosnącą w sterylnych naczyniach, cięto na 5 mm skrawki bez węzłów. Następnie skrawki cięto wzdłuż na dwa kawałki stanowiące próbki, które infekowano szczepem A. tumefaciens LBA4404, niosącym pNPI106, w taki sam sposób, jak w etapie z przykładu 1. Po infekcji, skrawek łodygi umieszczano na agarowej pożywce hodowlanej MS bez

184 707 hormonów (zawierającej 2% wag./obj. sacharozy i 0,8% agar), do której dodawano 40 mg/litr acetylosyringonu i tak hodowano go przez 3 dni. Następnie skrawek przenoszono na taką samą pożywkę, lecz zawierającą 500 mg karbencyliny zamiast acetylosyringonu i hodowlę kontynuowano. Zastosowaną tu zmodyfikowaną pożywkę hodowlaną MS przygotowano poprzez zmianę zwykle występujących w pożywce hodowlanej MS stężeń amonowych i azotanowych źródeł azotu na, odpowiednio, 10 mM i 30 mM.

Po około dwóch miesiącach, pąki przybyszowe, które wyrosły ze skrawków rozdzielano i dalej hodowano przez 2 miesiące. W ten sposób otrzymano 6 linii ESP. Linie te hodowano dalej i po około 4 miesiącach (tj. około 8 miesięcy po infekcji A. tumefaciens) po raz pierwszy obserwowano prawidłowe morfologicznie pędy wyrastające z ESP. Następnie pędy przenoszono do 2/3 rozcieńczonej pożywki MS z gumą żelującą (zawierającej 2% wag./obj. sacharozy i 0,3 wag./obj. gumy żelującej), do której dodawano 0,05 mg/l IBA (kwasu indolilomasłowego) i tak hodowano. A zatem, w dziesięć miesięcy po infekcji A. tumefaciens otrzymano łącznie siedem normalnych roślin z 2 linii ESP.

Rośliny te poddano następnie analizie metodą PCR, w taki sam sposób, jak w etapie III z przykładu 5. W wyniku tej analizy w żadnej z roślin nie wykryto genu ipt. Z drugiej strony wykryto obecność genu GUS w dwóch roślinach. Tak więc potwierdzono, że wektor według niniejszego wynalazku może pracować skutecznie także w roślinach drzewiastych.

Nawiasem mówiąc, w pozostałych 5 normalnych roślinach wykrywano tylko część genu GUS. Wygląda na to, że u tych osobników, podczas wycinania z chromosomu transpozonu Ac wprowadzonego na wektorze pNPI106, wraz z genem ipt, gen GUS leżący w ich pobliżu brał udział w wycinaniu i ulegał uszkodzeniu.

Figura 27 przedstawia wygląd prawidłowych pędów zróżnicowanych z ESP.

Przykład 8

Normalne osobniki (otrzymane poprzez ESP) posiadające geny wprowadzone do nich przy zastosowaniu pNPI132 z przykładu 5, poddano dalszemu wprowadzaniu genu przy użyciu wektora według niniejszego wynalazku.

Gen GUS z pNPI132 zamieniono na gen HPT (gen warunkujący oporność na higromycynę). Przy użyciu otrzymanego w ten sposób wektora (pNPI140, fig. 28), wspomnianym powyżej normalnym osobnikom, wprowadzano gen w taki sam sposób, jak w etapie II i III z przykładu 1. Po 40 dniach od infekcji A. tumefaciens z wprowadzonym do niego wektorem, otrzymano 10 linii ESP. Linie ESP rozdzielano, przenoszono na pożywkę hodowlaną o tym samym składzie (agarowa pożywka hodowlana MS bez hormonów, zawierająca 500 mg karbenicyliny) i hodowano dalej. W rezultacie, po 20 dniach (około 2 miesiące po infekcji A. tumefaciens) obserwowano w jednej z tych linii zróżnicowane pędy o wizualnie prawidłowej morfologii.

Jeden z tak zróżnicowanych normalnych pędów poddano analizie metodą PCR w taki sam sposób, jak w etapach IV-B z przykładu 1. Wyniki przedstawiono na fig. 29. Należy zauważyć, że parę starterów zaprojektowanych do wiązania się, odpowiednio, z genem NPII i genem HPT celem wykrywania wycinania obszaru zawierającego gen ipt w otoczeniu Rs z chromosomalnego DNA, oraz inną parę starterów do wykrywania obecności genu HPT (wykrywanie poprzez powielanie fragmentów DNA, odpowiednio, około 4 kb i około 1 kb) wykorzystano tutaj dodatkowo oprócz starterów użytych w etapie IV-B z przykładu 1. Na fig. 29 wartości pokazane po lewej stronie są takie same, jak na fig. 6.

Jak jasno przedstawia fig. 29, analiza PCR, przeprowadzona na DNA chromosomalnym wyekstrahowanym z pędów, wykazuje powielenie fragmentu DNA o wielkości około 4 kb, co wskazuje na to, że gen ipt został usunięty poprzez wycięcie obszaru otoczonego przez Rs, a powielenie fragmentu około 1 kb, wskazuje na obecność genu HPT. Z drugiej strony, powielenie fragmentu DNA o wielkości około 800 bp, wskazuje na to, że gen ipt nie był obecny w tym samym DNA. Wyniki te sugerują że gen ipt, wprowadzony raz do DNA chromosomalnego pędów został stąd wycięty poprzez wycięcie obszaru otoczonego przez Rs i dlatego zaniknął, podczas gdy gen HPT nadal pozostał w DNA. Oznacza to, że do osobnika z wprowadzonymi, przy pomocy pNPI132, pożądanymi genami (tj. genem NPTII i genem GUS) wprowadzono następnie nowy pożądany gen (tj. gen HPT), przy użyciu wektora, którego kon184 707 strukcję zmieniono wyłącznie pod względem pożądanego genu (tj. jako selekcyjnego genu markerowego użyto tego samego genu ipt) i powtórzono hodowlę, wizualną selekcję i rozdzielenie. Ponadto, wyniki pokazują, że możliwe jest wprowadzenie trzeciego, czwartego lub więcej pożądanych genów przy użyciu tego samego selekcyjnego genu markerowego.

Jak widać z opisanych powyżej przykładów, otrzymywane linie ESP zawsze mają gen ipt w swoich chromosomach co pokazano na fig. 6. Dodatkowo, ESP o szczególnie nieprawidłowej morfologii, którą można zidentyfikować wizualnie, wykazują bez wyjątku oporność na kanamycynę dzięki ekspresji genu NPII, który jako pożądany gen modelowy jest wprowadzony razem z genem ipt. Dowodzi to, że taki gen MAI nadaje się jako selekcyjny gen markerowy do wprowadzania genu do rośliny, a wektor według niniejszego wynalazku, zawierający ten MAI jako selekcyjny gen markerowy nadaje się na wektor do wprowadzania genu do rośliny.

Po wprowadzeniu genu do rośliny przy użyciu wektora pNPI106, w którym gen ipt włączono do transpozonu Ac, z tkanki, która raz utworzyła ESP w wyjściowym etapie hodowania zaraz po wprowadzeniu genu otrzymywano pęd lub temu podobne, które utraciły zdolność tworzenia ESP w wyniku zniknięcia genu ipt z chromosomu, podczas gdy zachowały cechy dostarczone przez pożądany gen (gen NPII i/lub gen GUS), jak pokazano w tabeli 1 oraz na fig. 13, 14 i 16. Poza tym, morfologię otrzymanej tkanki (tj. pędu lub temu podobnych, które utraciły zdolność tworzenia ESP) można identyfikować wizualnie, jak pokazano na fig. 15 i 27. Dodatkowo, po tej selekcji, rozdzieleniu i hodowli otrzymywano osobniki rosnące do góry i ukorzenione, o prawidłowej morfologii. Ponadto, tkanki odróżnicowane z tkanki otrzymanej z pędu, który utracił zdolność tworzenia ESP, także wykazywały prawidłową morfologię bez zdolności tworzenia ESP. Dowodzi to, że taki pęd lub jemu podobne składają się z jednorodnych komórek.

Takie same wyniki obserwowano również wtedy, kiedy jako usuwalny element DNA, zastosowano system rekombinacji miejscowo-specyficznej oraz kiedy użyto genów rol jako genów MAI. To znaczy, kiedy gen został wprowadzony do rośliny przy użyciu wektora, w którym konstrukcję obejmującą transpozon lub transpozon i gen ipt z wektorów użytych w przykładach 1 do 4 i 7 zastąpiono konstrukcją związaną ze wspomnianym powyżej systemem rekombinacji i/lub genami rol, jak opisano w przykładzie 5 i 6, z tkanki która wykazywała nieprawidłowości morfologiczne bezpośrednio po wprowadzeniu genu otrzymano prawidłową morfologicznie tkankę i roślinę, w których gen MAI zniknął z chromosomów, podczas gdy pożądany gen pozostał (fig. 21-23, tab. 2). Ponadto, możliwe jest także wielokrotne wprowadzanie pożądanych genów do tego samego osobnika poprzez powtarzanie etapów wprowadzania genu, hodowlę i wizualną selekcję przy użyciu wektora, w którym zmieniono wyłącznie konstrukcję odpowiadającą pożądanemu genowi, podczas gdy jako selekcyjny gen markerowy wykorzystany jest gen indukujący nieprawidłowości morfologiczne (przykład 8, fig. 29).

A zatem, kiedy używa się takiego wektora, w którym gen MAI jest stosowany jako selekcyjny gen markerowy i jest wstawiony w takie miejsce, że zachowuje się integralnie z usuwalnym elementem DNA, można otrzymać tkankę utworzoną jedynie z komórek, w których chromosomie lub temu podobnych pozostaje jedynie pożądany gen i utrzymuje swoją funkcję, poprzez przeprowadzenie następujących etapów: (1) hodowanie komórek zaraz po wprowadzeniu genu i wizualna selekcja morfologicznie nieprawidłowej tkanki, pojawiającej się podczas hodowania, (2) dalsza hodowla morfologicznie nieprawidłowej tkanki i wizualna selekcja morfologicznie prawidłowej tkanki, pojawiającej się podczas hodowania. Dodatkowo, roślinę wytworzoną z tylko takich komórek można także otrzymać z prawidłowej morfologicznie tkanki.

Poza tym, kiedy system rekombinacji miejscowo-specyficznej jest zastosowany jako usuwalny element DNA, ponieważ jego wycinanie następuje szybko i z dużą częstością, morfologicznie prawidłowa tkanka pojawiająca się z tkanki morfologicznie nieprawidłowej może być również szybko wykrywana i można z niej otrzymać wiele normalnych osobników z dobrą wydajnością..

Tabela 3 przedstawia wydajność, z jaką otrzymuje się osobniki normalne z morfologicznie nieprawidłowej tkanki wtedy, kiedy jako usuwalny element DNA w wektorze według

184 707 niniejszego wynalazku zastosowany jest transpozon lub system rekombinacji miejscowospecyficznej.

Tabela 3

Różnice w wydajności otrzymywania osobników normalnych zależna od typu usuwalnego elementu DNA:

	Wektor	Usuwalny element DNA	Numer linii ESP	Numer linii, w których regenerują się osobniki normalne
Przykład 3	pNPI106	Ac (transpozon)	63	2 (7 osobników)
Przykład 5	pNPI132	region otoczony przez Rs z systemu pSR1 (system Rekombinacji miejscowo- Specyficznej	48	7(10 osobników)

Uwagi: 1. ESP został wyizolowany po dwóch miesiącach hodowli.

2. Prawidłowy pęd mógł być wykryty po czterech miesiącach hodowli w przykładzie 3 i po trzech miesiącach hodowli w przykładzie 5.

3. Każdy z wyżej wymienionych normalnych osobników zawierał gen GUS jako model pożądanego genu.

W przykładach 1 do 5, w warunkach bez hormonów, tkanka zawierająca komórki transgeniczne namnażała się, różnicowała pędy przybyszowe i regenerowała w roślinę. Jest to przypuszczalnie spowodowane działaniem genu ipt wprowadzonego do chromosomu komórki transgenicznej jako selekcyjny gen markerowy. Poprzez ekspresję tego genu w komórce nadprodukowany jest hormon roślinny. W konsekwencji, hormon roślinny wytwarzany w komórce zawierającej gen ipt wpływa nie tylko na różnicowanie się tej komórki w tkankę taką, jak ESP lub podobną lecz także do pewnego stopnia na tkankę przylegającą do tej komórki, tworząc takie same warunki jak przy sztucznym podawaniu hormonu roślinnego do pożywki hodowlanej.

W wektorze według niniejszego wynalazku jako selekcyjnego genu markerowego użyto genu MAI. Dlatego, kiedy wprowadzenie genu do rośliny jest przeprowadzone przy użyciu tego wektora, tkankę do której wprowadzany jest pożądany gen można selekcjonować przez hodowanie komórki poddanej działaniu wprowadzonego genu na powszechnie stosowanej pożywce hodowlanej, w powszechnie stosowanych warunkach hodowlanych, bez dodawania żadnych związków chemicznych do selekcji, i wizualną identyfikację otrzymywanej, morfologicznie nieprawidłowej, tkanki. Zgodnie z tym, procedura jest uproszczona i aktywność komórki roślinnej nie spada podczas selekcji.

Ponadto, gen MAI jest obecny w roślinie lub jest do niej wprowadzany poprzez infekcję bakteriami lub temu podobnymi w naturze. Z tego powodu, nawet jeśli gen MAI ulega ekspresji w komórce roślinnej, do której gen ten wprowadzono, wykazuje stosunkowo wysoki poziom bezpieczeństwa po spożyciu przez człowieka.

Co więcej, przy użyciu genu ipt jako genu MAI, tkanka zawierająca transgeniczną komórkę namnaża się i różnicuje w pędy przybyszowe dzięki aktywności genu, stwarzając możliwość wyeliminowania potrzeby dodawania hormonów roślinnych do pożywki hodowlanej, uważanej zasadniczo za niezbędną dla namnażania i różnicowania hodowanej komórki roślinnej.

Dodatkowo, w wektorze tym gen MAI użyty jako selekcyjny gen markerowy wprowadzono w takie miejsce, że zachowuje się on integralne z usuwalnym elementem DNA, za pomocą którego selekcyjny gen markerowy jest usuwany z DNA, gdzie gen ten istnieje i funkcjonuje, poprzez wycięcie elementu DNA z daną częstością po wprowadzeniu genu do

184 707 komórki roślinnej, co powoduje utratę jego funkcji. Tak więc, tylko pożądany gen, obecny w takim miejscu wektora, że nie zachowuje się integralnie z usuwalnym elementem DNA, pozostaje w tym samym DNA i zachowuje zdolność wyrażania swojej funkcji. A zatem, dzięki tej strukturze wektor umożliwia wielokrotne wprowadzenie genu do danej rośliny jedynie poprzez zamianę fragmentu z genem pożądanym do wprowadzenia bez jakiejkolwiek zmiany struktury selekcyjnego genu markerowego czy innych. Tak więc, wielokrotne wprowadzanie można prowadzić nieograniczoną ilość razy.

Ponadto, w tym przypadku, utratę funkcji genu MAI jako selekcyjnego genu markerowego można wykrywać wizualnie dzięki zmianom morfologicznym transgenicznej tkanki, podobnie jak wprowadzenie tego genu. Dlatego, tkanka utworzona wyłącznie z komórek, w których w chromosomie lub temu podobnych pozostał jedynie gen pożądany i zachowuje on swoją funkcję, może być selekcjonowana pewnie i z łatwością. Dzięki temu można prowadzić z wysoką wydajnością wielokrotne wprowadzenie genu, a genetycznie modyfikowana roślina jest utworzona jedynie z takich komórek, to znaczy, mogą być otrzymane osobniki wolne od wpływu genu markerowego i nie stwarzające jakiegokolwiek ryzyka zdrowotnego związanego z produktem genu markerowego, bez konieczności przechodzenia etapu krzyżowania.

*** Uwagi ***

Dotyczące wskazań związanych ze zdeponowanymi organizmami, wymienionymi w zgłoszeniu jak następuje:

FERM BP-5063 na stronie 31, wiersz 22

2) FERM HP-5064 na stronie 40, wiersz 4

FERM BP-5065 na stronie 53, wiersz 16-17

FERM BP-5066 na stronie 59, wiersz 25-26

Cztery powyższe mikroorganizmy, identyfikowane poprzez numery dostępu, zostały jednocześnie zdeponowane w następującej instytucji depozytowej.

Nazwa instytucji depozytowej:

National Institute of Bioscience i Human-Technology Agency of Industrial Science i Technology (Osamu Suzuki, Dr., DIRECTOR GENERAL)

Adres instytucji depozytowej.

1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305 JAPAN

Data złożenia depozytu: 5 Kwiecień, 1995

184 707 rH

FIG

O

O c

~1

JO f\r

bi) gen metabolizmu opiny •n>

o

Φ

2sl •H f—<

Ct

OJ

U

-itf

OJ

-P ctf

N o

o ct

184 707

CM

FIG.

Z

Q

I

N

XI .n:

λγ

O

CM

P	CM
w	CM	P
Ol-	O	o*
	CU	«Η
•P
c	3	c
ω	a	ω
ε	φ	h0
tłO	N
co	O
u	N	o
<4-4	TO	a

	©1			M CS»
				U-Λ LC «5	3 ~3
	-	σι	CD	C
-	©				*—< O <0 Ol

184 707

FIG. 3 p I P T 2 P U C 1 1 9

184 707

FIG

ω c

184 707

3 ' ł—<	r
u 1—1	Nos •T
CO h-i	Θ J_ł Cu
-Q >< HH
1 1 e to to _q cq B ·—< ~	35S-P
O ΙΌ <5 ,Ο, Q- =s
hH	ω O fZZ
cn t— c_ zz
£ 1—1
V} cu n -O -id
a- o zz
V	Od ’	r

JD

-V

CO c

C\J ł—

Q_

CL

184 707 <

Cl

•H
o
\D)	o
0
	·>
r—1	2
Φ •H	=
3	o M
Li	•H
Φ .*	VJ
Lr co	<
e co	2L O
Λί •N	rH
	O
•H	c
O	ra
wn	Ή

LD

O

K tu

en

I

N	Ή rH Ό-* 3'°
Φ	□ Φ*
N	Ό o.
Lr o.	<u.o »
>»	HN'O Λί O U
C	>>α £
CO	3 CL. a
3	N >.	o
O	Φ +J >,	CL.
	Ή θ£	>,
□	c c o
Ό	0
O		c
L<	Ή CL» c X?	CJ
O.
>»	CO X1??
3

<jO m

C*1

ω N N in co c\l co co <*> o <n o o o c4 C\) v< i-< GO CO

184 707

FIG

C w

184 707

FIG. 8

N P I 1 O 3 (8. 9 k b)

184 707

FIG

184 707

Ο

H t,

184 707 '91J

184 707

FIG. 12

184 707

-i to

FIG. 13 \

οΧ .8

N

0)

N

O

Ł.

-P §

(“{ o

$ s

rH

Φ •H

U

Φ

o	3-	c-<	o. 0 u	XJ c		co	i-l <y	y-ι C	<4 c	y_j
	;	>,	fe> “	o					E	0
<3			s	υ			P	O	•H
E	s		CO to	—-		O	S-J	U	U	c
a	Ό	'O a	s °	rH		2	c.	r“ s	a	o Ή
N	ς	υ	i—i	C\j		X)	CP4J	Cn	W
•H W	X	Zj Ό	Ła		co	0 0	Ή	in • r-ł	Ά	•P U
		O			Cl	r;	ω	X	w	κ
<	S		Scb	—	c	W	Σ5	CJ	4>	a
Z	\	—	’z		¥	»'
rA	'-χ		o.	Q_	$	149	xr		LO

1'^: φ o •H C

O Gj \W,h ίο

Ol

C«N ’CQ #'θ'

O «Ζ3 WO

LT\ rA ω

-J

Φ Π3 'N Gj *N ąj Φ ii.

•H

O

WO

I t

III 5 //1 I l\\

r-ł	03	e-	00	CO	Ol	co
<0	CO	03	10	C—	o-	o
o?	<O	o	CO	o	00	<0
O*	03	03	r-<	τ-ł

184 707 α> α »

L,

C-I

FIG. 14

Φ

Ή

Li

O

U

O*i O & o \ó>—< μλ ·—< v<o '-Km

l /\ |. \\\

T-(	OJ	o	CO	O-
CD	ol	CM	LTJ	CO	04	co
en	cn	O	CO	o	O-	O
-*r	Ol	04	V“*	V*	CO	co

184 707

FIG. 15

184 707

Ο w

(u §

5-4 ♦Η Ο $ ^Ξ· 5 α r-ł Ν Φ -Η T? w

Ł/ < Φ £2 gj γλ =· ο •8 οο ^ug ο^Η α Ν ο Φ > ν ο

Li .·, ο

r-4 η, s

ο υ

ω ο

en

Η ⁰⁴ sf

F (±3

Ο og sc

t-r-ż	(MCM	CO	in ' ^r	Xf z <M CM	LT\ fc\	/ CM
(0 JsS 0	co α	φφ	ffiO	fflO	Gj	O
‘tJ c Φ .-3	Ss		Jec	ΐ%	$	O
Ή , o-r-|			“U		Φ	r-4
\tn	4S	O v(0			o \(Q

U-4 ο

c

Ο

-Η •Ή υ

ζ α

ί

Μι ΜΙ

ś~>	CM	e-	co	co	CM	co
CO	CM	CM	LO	ο-	o-	o
CO	CO	o	co	ο	co	co
	CM	CM	—	r-^

184 707

FIG. 17

184 707 ω

L.

οο

U

Η

C4

ligation Cmi gen R ligacja 'κ p N P I 1 2 o

C φ

bO

184 707

FIG. 19

184 707 ο

CN

ΙΩ

CO

CA

CO

Di i—i § Ph ω

184 707 w

fN o

flj λ:

ω

-P u

ω ω

m |4S § — ’ ·¹ ł. ,

ft a o o

ŁC

£ ν'» lO ryft

X X ^(ΓΓ’ΙΓΓ¹ [^r~ C -:^- . . * , Tfez fez fez fez^fe 2. (0 qjo ojc hjc <qcxh s ·Ή C «Η— m-Ι— — g c-j ^CJ ej c?*4 w-M t4-< «r-ł^-* =Y3>c

Cc O 2 2 ® ..

o 4 tn o c . u*\ <0 b--J «ϊα *Nfcj ęu <jl, <U_, <Vh φ_,φ, •H *H *4 mH m-4 «Η

O O O o o o «0 sw MO MO UQ Mft

CO

CD o® ω ίΰφί ro pjp f^cW⁹o : ^łVlWo.¹^ - normo i. indi v j.duo i Ho. psobnik normalny nr2 *«8 - normal indivjduai no. opobnik normalny nr1

W? J¹; V^^a^^r 33 - normal jndjvjrltial No, oęobnłk normalny nr2 ścieżką, 12 linia nr 21 lanc } t. , linę No. 21 - normal jndividu<il No. tosobnik normalny nr1

184 707

0' 0' θ' Ο⁴ 0' Ο™ θ’ ο ' 13 J ^{C C} ~ ^C - ^C - ² - ^{C C} - ⁵ -^{1 C C} α c* 5^2^: źa i* 2-* Łm g^ g^ 2

I Ο·Η '•Pri ·Ρ ^·Ρ ~'*-l rf*P ^P »P 2

COr • rP

2J

O' o^N 2. ; ,c ,c o

\w o

Ip

Φ •P

U s

P

Φ

N •P w

<

ffl ° M ^C

O

Φ rP «Ρ O \W ο

Η □ £<,

C

Ο •Ρ ω ω u <ο •Ρ &

•Ρ Ν □ φ Ν

α.

§3

Β 8 £

<σ •Ρ

I £

ο ,3

Ρ

Φ

-Ρ

Ρ

W φ

«Η !

ω ο

-Ρ w

«3

Ρ * 8 -Ρ Ο

SI c

φ b0

Ο b0

Φ &

Ό ε

φ

I : o^r o^o^o^o ^07 oSo°-°^;

O8 cgj|g§ | = a §g g| £CŚ 2«i2 _{= =} ⁰ Sigopogęgogogog goggogo

I—I -tP^ . “ P Cj 1 >

O P e-< cx χ >-.

Cc I I

ŁT\^UVL0

C-CCC = Cc:cc:cc:c = Ci

Φ Ln^Lfy^kO^C^r-COCOOf^Ch^O⁰^⁰^'^ r? Cj v ηγ-η ,-i^— <-'Cm^

-O O^N^O CO &0&Ó&0&0&OCO *c <1 .**1 _j jŁ. 2 2 2 2 λ. x.2 (02 (0^i\ z3^co i0c0rt(onj<oo3*p*H U TJPUH OPO riUHCJTiCJPCl-d CMO C° CO ? O^CCCC Cccccc cccc Ccpc^c Ό p Ρ'^Ήη «p··^ ·Ρ·Ή ·ρ·Ρ «ρ-Η •p’”' »P^ P’ rH·^-1 q Ο,Ωη^γ-Τ' ΗΗΗ^γ-ΗΗ-Ή^/-Ρ X

-tx· CD υή-ΟξφΟ csT- oj=3 0V>

So s<u 3o se s? se

C\icfC\ 0 toEg E

Ρ·υΡ Π5 •t4—Hm Ή

Φ Φ μ—| «Ρ ,8,8 ,

	ζρ		cz>
	•P
»Ρ			C7>
O	•P
	fC		50
c	-P
0	r;
’r|	c	ω	c~-
P	0	-
U		σι	co
Φ	£
4J	S		tro
Φ	•P	>1
Ό	ν'	r\	.
	O
P	P	Ό
O		»P	n
C-4	Φ	O
	r*
ω	-P
P		Tj	__
<y	ip
g	0	Ή
-P
p	c	c
Ch	0
	•p	δ
σ>	ω	ν'
c	-p
•P	U	P>j
ω	:<	Η
o	0	•pj

ω S« ST ST 5Γ ,„ .. .. ..^c S^S^ S°

Π/U φίυ φίΰ φ<3 Φ<3 QjC QjC φίΧ ·, | ( pł »pP ·Ρ—I ·ι·Ρ·ł ·τ+ν ·ΡΠ3 ·Ρίρ

Ο ϋ Ο ϋ ϋ xw νω \w \ω xw

184 707 (0 Z o o At 4FIG. 23 <e §

r-4

Φ «Η

U

Φ

U tn <

Z rs

Aj	—(		o%
φ	φ		c (Ot
•U	c	t\l	O JA
a	63		S
\w		5'	Φ •H
		•N	O
		Φ	\W
		»H	CsJ
		O	—H
		\w

5g'Ł 7= 7© -£ -c 7c 7c3 7

C 3 2 ^2^2^.2^.2^2^2^4 -8RY 7§ ‘4§ cogo r/o To ^o ^o^o” o a -Mg 5 8 .q ° = ° -5 ° .3° .30 O -. O O0 ^o >« cJW ’ ° 8 -° ł25 =23 Ξ'(ά ε «5 = m ξ a ε'πί =.

IO NS^oSogoio^oioioicbcCc

J > QJ—ł—i ^LCp-O-O-O-OCę-O-O'o N^| .S.e.C.C.C.C.C.C.C, >> >? C^lTrAD'· ip OLOpOCOCS^OCCCOCoS⁰ Mg Z CS c² s z s s · 2 S z:

^c ssi. tu to <o «o.. <0 , to,. te .

“·η”“ C C-C-CCC- C C — r—ζ o CO'** C'·’*r-ł”R ♦*·<·-<-f-C-T«ł-t-¹ *1*4-4 •ł-f·'·'f-C

X •H'·^ f-r^-4 «—r-* r-r-4 rd'-’<—Γ~* n-l'pac rH r-ł *-· K ·Η - ·· · · ........

a. > .-i σι o v- *oj·* — n spr LfV) v£Jo Ct-- Ctto ap Tt3 rę_ _§ω JS« J§o Su ^o j§~^;.

-NC-rt -NC -Ne OJC -Ny -I <Uo Ok: <4a Ote Tfc °t ' £·u> r-r-- aj c n-\ σ> οι oq o o o <- ·

- -1 i^—*-<^-«—ięQr\j ę\jr^-

4^<\Γ

U-4

O

CO		•H
»ć-ł		ZJ
s		O
1		Φ zJ	ω
u		Φ	c
		TŹ	Φ
ę»			lT*
		U
o		O	en
TJ		LU	o
£ XO u			o
	m i-t	U-4
Φ		Φ	O
4J		g
Lr		ri	Φ
.2		U	□
CO		o.	c
			Φ
Φ		rn U
•h r*		C	ω
S	co	•r-ł	u
Ϊ	o	tn	χ
O W O	o	o	a
3
+J	C
en	Φ
t3	M

184 707

FIG. 24 (A) Zastosowani starterów do wykrywania obecności genu ipt (A) Using primers for detection of existence of ipt gene

ścieżka 1 marker wielkości EWA lane 1 ; DNA size marker /-ind E — φ liii/SaeE iproduced by T0Y030 CO., (wyprodukowany przez ,TD. ) pN? ! 1 32 (control) (kontrola) ścieżka/5 osobnik niezakażony lane o ; uninfected individual ścieżka .4-6,.osobnik wrażliwy na kanamycynę __ lane 4 O ; kanamycm 3ensitive-incivicual B ścieżką 7,8 osobnik' oporny na kanamycynę lane 7, 8 ; kanamvcir_; resistant-indwićual (B) Zastosowanie starterów dc wykrywania wycięcia regionu zawierającego gen ipt i otoczonego przez Rs (3) Llsinc primers for detection of ercis: conraining ipt gene and held by Rs¹s the region

ścieżka 1 marker wielkości DNA lane 1 ; DNA size marker //Sjnd E — pllTZ/dzeE (produced by T0Y030 CO., LTD.)

-idual ścieżka, 4-6. osobnik wrażliwy na kanamycynę , TJne o . kanamycir. sensitive-inc vvidu„.i ścieżką.7,¾ osobnik oporny na kanamycynę^ lane I o : kanamycir· resistant-inćivicual ,C) Using primers for detection of ezistence of GUS gene (C) Zastosowanie starterów do wykrywania obecności genu GUS i 2

marker wielkości DNA lane 1 ; DNA size marker 2. /ii ind lit - ό X] 74/iićs 0 (produced by T0Y030 CO.

° ścieżka 1

LTD. ) uninfected ind ivid.ua 1 osobnik niez ścieżka,4-6,. osobnik wrażliwy nąkanainycynę , ™une Nj ; kanamycir. se?.sitive-in6rVifi'jai śf7,% osQbnik_yoęorąy_sna_tkanamyęyn_?ćija,

184 707

FIG. 25

184 707 l£>

CM

Ο

Η

_α οζ

CD

ΓΟ

CM

C\l ο

Γ'· ο_

ο.

184 707

FIG. 27

184 707

CD

CM

U

H fM

J3 oz

CO

Γ^·

O xr

CL

A

CL

184 707

CS

O ω

•ker wielkości DNA u

O y

<Q 2 ±e •N o

\u)

-J i

N ω

N

U

Cl >>

§

O

CJ

O ~ α

Οι O X <’ O hO

8>

I

Ό (0

Li ω

c

-P o

<2

N

Φ

N

U

CU o

*0 α »Π T^W riT-i

C θ2υ&c N oJrfoT?

izg c ę-H 3 _c U.^i 3 _{o ω} • 2 — co Ij O >·; “

Q

υ υ tj o ^oSoS “ ^α

O	0 p	2 3 ^2-'8-
JJ	4J	£ gj^S
o o	o u	O θ Ł« T tft

' Ł ws o z 2: u r\ — —

CJ

Ό

O >>c; ΦΓ; <DT — 5 '.z *MO flj_ c0_ ” ^'Oc3? * •<H O-J O— 5· - ę/7^ 07^ ~ rn O^w O^{w 0} ~ o, w to • c^⁷ m

&$!^So * τνκνίιν ' «Φ

C- ‘

C0~ •Ϊ gĘ QjfO d/0

0Π m-P \w Q O *O \W \O \«

zastosowanie starterów do wykrywania obecności genu HPT

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz Cena 6,00 zł.

Claims (27)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Wektor do wprowadzania pożądanego genu do komórki roślinnej, który zawiera pożądany gen, co najmniej jeden gen wywołujący nieprawidłowość morfologiczną jako selekcyjny gen markerowy i usuwalny element DNA, w którym gen wywołujący nieprawidłowość morfologiczną jest tak umieszczony, że jest usuwany wraz z elementem DNA możliwym do usunięcia, a pożądany gen jest umieszczony tak, że nie jest usuwany wraz z elementem DNA możliwym do usunięcia.
2. 2. Wektor według zastrz. 1, w którym gen wywołujący nieprawidłowość morfologiczną jest obecny w obrębie tego usuwalnego elementu DNA.
3. 3. Wektor według zastrz. 1, w którym usuwalny element DNA jest transpozonem.
4. 4. Wektor według zastrz. 1, w którym usuwalny element DNA pochodzi z systemu rekombinacji miejscowo-specyficznej.
5. 5. Wektor według zastrz. 1, w którym gen wywołujący nieprawidłowość morfologiczną jest otrzymany z mikroorganizmu z rodzaju Agrobacterium.
6. 6. Wektor według zastrz. 1, w którym gen wywołujący nieprawidłowość morfologiczną jest genem syntezy cytokininy.
7. 7. Wektor według zastrz. 6, w którym gen syntezy cytokininy jest genem ipt, izopentenylotransferazy, który jest obecny w T-DNa Agrobacterium tumefaciens.
8. 8. Wektor według zastrz. 1, w którym gen wywołujący nieprawidłowość morfologiczną jest co najmniej jednym genem wybranym spośród genów rol.
9. 9. Wektor według zastrz. 8, w którym geny rol są genami roi zawierającymi geny rolA, rolB i rolC, które są obecne w T-DNA Agrobacterium rhizogenes.
10. 10. Sposób wytwarzania genetycznie modyfikowanej rośliny wolnej od wpływu genu markerowego, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

    (A) wprowadzenie do komórki roślinnej wektora, który obejmuje pożądany gen, co najmniej jeden gen wywołujący nieprawidłowość morfologiczną (MAI) jako selekcyjny gen markerowy i usuwalny element DNA, w którym gen MAI jest umieszczony tak, że jest usuwany wraz z elementem DNA możliwym do usunięcia, a pożądany gen jest umieszczony tak, że nie jest usuwany wraz z elementem DNA możliwym do usunięcia, (B) hodowanie komórki roślinnej otrzymanej w (A), wykrywanie nieprawidłowej morfologicznie tkanki roślinnej, która pojawia się w trakcie hodowli i selekcję takiej morfologicznie nieprawidłowej tkanki, oraz (C) hodowanie takiej morfologicznie nieprawidłowej tkanki wyselekcjonowanej w (B), wykrywanie morfologicznie nieprawidłowej tkanki, która pojawia się w trakcie hodowli i selekcję takiej morfologicznie prawidłowej tkanki.
11. 11. Sposób według zastrz. 10, w którym gen wywołujący nieprawidłowość morfologicznąjest obecny w obrębie tego usuwalnego elementu DNA.
12. 12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że usuwalny element DNA jest transpozonem.
13. 13. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że usuwalny element DNA pochodzi z systemu rekombinacji miejscowo-specyficznej.
14. 14. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że gen wywołujący nieprawidłowość morfologicznąjest otrzymany z mikroorganizmu z rodzaju Agrobacterium.
15. 15. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że gen wywołujący nieprawidłowość morfologicznąjest genem syntezy cytokininy.

    184 707
16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że gen syntezy cytokininy jest genem ipt, izopentenylotransferazy, który jest obecny w T-DNA Agrobacterium tumefaciens.
17. 17. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że gen wywołujący nieprawidłowość morfologicznąjest co najmniej jednym genem wybranym spośród genów rol.
18. 18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że geny rol sągenami roi zawierającymi geny rolA, rolB i rolC, które są obecne w T-DNa Agrobacterium rhizogenes.
19. 19. Sposób wprowadzania co najmniej dwóch pożądanych genów do rośliny, znamienny tym, że obejmuje przeprowadzenie następujących etapów co najmniej dwa razy:

    (A) wprowadzenie do komórki roślinnej wektora, który obejmuje pożądany gen, co najmniej jeden gen wywołujący nieprawidłowość morfologiczną (MAI) jako selekcyjny gen markerowy i usuwalny element DNA, w którym gen MAI jest umieszczony tak, że jest usuwany wraz z elementem DNA możliwym do usunięcia, a pożądany gen jest umieszczony tak, że nie jest usuwany wraz z elementem DNA możliwym do usunięcia, (B) hodowanie komórki roślinnej otrzymanej w (A), wykrywanie nieprawidłowej morfologicznie tkanki roślinnej, która pojawia się w trakcie hodowli i selekcję takiej morfologicznie nieprawidłowej tkanki, oraz (C) hodowanie takiej morfologicznie nieprawidłowej tkanki wyselekcjonowanej w (B), wykrywanie morfologicznie prawidłowej tkanki, która pojawia się w trakcie hodowli i selekcja takiej morfologicznie prawidłowej tkanki.
20. 20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że gen wywołujący nieprawidłowość morfologicznąjest obecny w obrębie usuwalnego elementu DNA.
21. 21. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że usuwalny element DNA jest transpozonem.
22. 22. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że usuwalny element DNA pochodzi z systemu rekombinacji miejscowo-specyficznej.
23. 23. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że gen wywołujący nieprawidłowość morfologiczną jest otrzymany z mikroorganizmu z rodzaju Agrobacterium.
24. 24. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że gen wywołujący nieprawidłowość morfologiczną jest genem syntezy cytokininy.
25. 25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że gen syntezy cytokininy jest genem ipt, izopentenylotransferazy, który jest obecny w T-DNa Agrobacterium tumefaciens.
26. 26. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że gen wywołujący nieprawidłowość morfologiczną jest co najmniej jednym genem wybranym spośród genów rol.
27. 27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że geny rol 5 są genami rol zawierającymi geny rolA, rolB i rolC, które są obecne w T-DNA Agrobacterium rhizogenes.