PL174448B1

PL174448B1 - Szczepionka do wywoływania u ssaka odpowiedzi immunologicznej na infekcję Helicobacter

Info

Publication number: PL174448B1
Application number: PL93304419A
Authority: PL
Inventors: Pierre Michetti; André Blum; Catherine Davin; Rainer Haas; IrŐne Corthesy-Theulaz; Jean-Pierre Kraehenbuhl; Emilia Saraga
Original assignee: Oravax Inc
Priority date: 1992-11-03
Filing date: 1993-11-02
Publication date: 1998-07-31
Also published as: AU2003270987A1; PL304419A1; DK0625053T3; DE69331901D1; DE69331901T2; HU9402261D0; SK280619B6; NZ299149A; EP0625053B1; EP1170016A2; PT625053E; RO114870B1; EP0625053A1; OA10087A; FI943171A0; HUT69938A; KR100287424B1; WO1994009823A1; ZA938203B; CN1094640A

Abstract

Szczepionka do wywolywania u ssaka odpowiedzi immunologicznej na infekcje Heli- cobacter na bazie ureazy, znamienna tym, ze zawiera od 10 µg do 100 miligramów ureazy Helicobacter pylori Iub Helicobacter felis, Iub polipeptyd zawierajacy jej podjednostke i od 5 do 50 µg adiuwantu sluzówkowego na dawke jednostkowa w dopuszczalnym farmaceuty- cznie nosniku Iub rozcienczalniku. P L 174448 B 1 PL PL PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy szczepionki do wywoływania u ssaka odpowiedzi immunologicznej na infekcję Helicobacter. W szczególności, wynalazek dotyczy szczepionki odpowiedniej do stosowania w zapobieganiu i leczeniu infekcji Helicobacter u ssaków, w tym ludzi oraz do leczenia ludzi cierpiących na infekcje żołądka, ich konsekwencje takie jak chroniczny nieżyt żołądka oraz w zapobieganiu rakowi żołądka.

Infekcje Helicobacter w ludzkim nabłonku żołądka powodują nieżyt żołądka, są głównym czynnikiem rozwoju wrzodów żołądka i chłoniaka żołądka i mogą być czynnikiem ryzyka raka żołądka [1-3]. Najczęstszym czynnikiem infekcyjnym jest Helicobacter pylori, po którym następuje ze znacznie niższą częstością Helicobacter heilmanii. H. pylori jest mikroorganizmem Gram-ujemnym w kształcie smukłej litery S, który jest rutynowo wyodrębniany z biopsji żołądka dorosłych i dzieci z histologicznie udowodnionym nieżytem żołądka Iub wrzodem trawiennym. Dowody na istnienie związku przyczynowego między H. pylori a chorobą wrzodową żołądka i dwunastnicy pochodzą z badań na ochotnikach ludzkich, pacjentach z wrzodami i rakiem żołądka, sterylnych świniach oraz królikach wolnych od drobnoustrojów. Co się tyczy etiologii, postulaty Kocha zostały spełnione przez wytworzenie potwierdzonego histologicznie nieżytu żołądka u osobników poprzednio niezainfekowanych w następstwie konsumpcji zjadliwych mikroorganizmów [4-11] oraz przez leczenie wyniszczające H. pylori zakończone wyleczeniem nieżytu żołądka oraz zmniejszenie ilości nawrotów u chorych na chorobę wrzodową [12].

Mimo podatności in vitro na wiele środków przeciwbakteryjnych wytępienie ustalonej infekcji H. pylori in vivo za pomocą środków przeciwbakteryjnych jest trudne [13]. Mikroorganizm występuje w otoczce śluzowej leżącej pod nabłonkiem żołądka i w dołkach w śluzówce żołądka. Są to miejsca, w których uzyskanie odpowiednich poziomów środków przeciwbakteryjnych wydaje się niemożliwe nawet przy doustnym podaniu wysokiej dawki antybiotyku. Obecnie większość autorytetów zaleca trwającą 2-4 tygodnie potrójną terapię, mianowicie sole bizmutu w połączeniu z lekami takimi jak tetracyklina i metronidazol. Jednakże skuteczność tego Iub innych schematów chemoterapeutycznych pozostaje poniżej optymalnej. Ponadto leczenie takie może powodować poważne działania uboczne.

Obecnie niewiele wiadomo jest o roli systemu immunologicznego śluzówki żołądka. Rozmieszczenie komórek wytwarzających immunoglobuliny (Ig) w normalnej jamie odźwiernikowej wskazuje, że komórki IgA osocza stanowią do 80% łącznej populacji komórek osocza. Ponadto ilość komórek osocza IgA obecnych w jamie odźwiernikowej jest porównywalna z innymi błonami śluzowymi [14, 15]. Wiele badań na ludziach [16] i na modelach zwierzęcych [8, 10] wykazało specyficzne odpowiedzi IgG i IgA w surowicy i w wydzielinie żołądkowej w następstwie infekcji Helicobacter. Jednakże obserwacja, że infekcja H. pylori utrzymuje się przez lata mimo indukowania miejscowej i układowej odpowiedzi immunologicznej nie zachęca do opracowywania strategii szczepienia.

174 448

Lee i współpr. opisali możliwość zainfekowania wolnych od mikroorganizmów królików za pomocą Helicobacter felis, bakterii blisko spokrewnionej z H. pylori, w których następnie rozwija się udokumentowany histologicznie, powtarzalny nieżyt żołądka [9,10]. Od tego czasu ta para bakteria-gospodarz jest akceptowana jako dobry model do badania nieżytu żołądka wywoływanego przez Helicobacter i czynników go inicjujących [17]. Czinn i współpr. wykazali, że powtarzane szczepienie drogą doustną myszy i fretek surowym lizatem H. pylori plus toksyną cholery jako adiuwantem indukuje silną odpowiedź żołądkowo-jelitową IgA anty-H. pylori [13]. Ponadto Chen i współpr. oraz Czinn donieśli ostatnio, że doustne szczepienie surowym lizatem

H. felis indukuje odporność przeciwko infekcjom H. felis u myszy [21, 22]. Dokładna natura antygenu(ów) odpowiedzialnych za indukcję tej odporności nie została jednakże ustalona i nie jest znana żadna informacja, która sugerowałaby, że antygen(y) H. felis indukujące zabezpieczenie przeciwko temu patogenowi indukowałyby odporność krzyżową, rozciągającą się na inny gatunek Helicobacter.

Wykazano, że sonikaty H. pylori i H. felis, i że niektóre z tych przeciwciał, skierowane przeciwko H. pylori będą reagować krzyżowo z H. felis i odwrotnie [24, 25]. Podstawa tej reaktywności krzyżowej jest nieznana.

W oparciu o homologię istniejącą między różnymi znanymi sekwencjami aminokwasów ureazy zaproponowano, że ureaza może być stosowana jako szczepionka przeciwko H. pylori [26]. Mimo to reaktywność krzyżowa nie jest regułą. Guo i Liu kilka lat temu wykazali, że ureazy z Proteus mirabilis, Proteus vulgaris i Providencia rettgeri wykazują reaktywność krzyżową na siebie wzajemnie, natomiast ureazy fasoli Jaś i Morganella morgani różnią się pod względem immunologicznym od trzech poprzednich ureaz [23]. Nawet jeśli reaktywność krzyżowa ureazy H. pylori z innymi ureazami Helicobacter była rozsądnym postulatem, to nie istniały żadne dane wykazujące, że tak rzeczywiście było do czasu, gdy wykazaliśmy, że niektóre przeciwciała raonoklonalne H. felis reagują krzyżowo z ureazą H. pylori [25]. J. Pappo wykazał następnie, że myszy zainfekowane H. felis wytwarzają przeciwciała, które reagują krzyżowo z ureazą H. pylori, ale nie reagują krzyżowo z ureazą z fasoli Jaś (J. Pappo, dane nieopublikowane, 1993).

Zastosowanie ureazy H. pylori lub ureaz pokrewnych jako szczepionki przeciwko infekcji H. pylori zostało zaproponowane przez A. Labigne w zgłoszeniu patentowym EPO 367644 [28]. Jednakże zgłoszenie to nie zawiera żadnych dowodów na zaszczepienie jakiegokolwiek ssaka przeciwko jakiejkolwiek infekcji Helicobacter za pomocą ureazy.

Ponadto, mimo że homologia sekwencji z innymi ureazami bakteryjnymi mogłaby stanowić poparcie dla zastosowania ureazy jako kandydata na szczepionkę przeciwko infekcjom H. pylori, to obecna wiedza o infekcjach H. pylori u ludzi z całą pewnością nie pozwoliłaby na to. Po pierwsze, mimo faktu, że zainfekowane osobniki często wytwarzają silną reakcję przeciwciał na ureazę, to wynikiem anty-ureazowej odpowiedzi immunologicznej nie jest ani klirens ani zwalczenie infekcji. Po drugie, H. pylori jest zdolny do transportowania ureazy poza komórkę i do pozbywania się jej z powierzchni komórki [19, 20]. Zatem ureaza nie może stanowić odpowiedniego celu dla powstawania ochronnej śluzówkowej odpowiedzi immunologicznej. Rzeczywiście uważa się, że odporność immunologiczna powstaje głównie za pośrednictwem wydzielniczych IgA, których czynność aglutynująca mogłaby zostać zaburzona, gdyby rozpoznany antygen mógł być wydalany przez patogen celowy i przez to służyć jako przynęta dla przeciwciała uodporniającego. Po trzecie wydaje się, że ureaza jest toksyczna dla komórek nabłonka w hodowli i podejrzewa się, że odgrywa ona rolę w degradacji śluzówki oraz wrzodzeniu żołądka in vivo. Zatem stosowanie ureazy jako antygenu może być toksyczne.

Mimo to przeprowadziliśmy rozumowanie, że antygen ten może być potencjalnie skuteczną szczepionką jeśli:

- po pierwsze, będzie dostarczana doustnie w dawce wystarczająco wysokiej dla wywołania silniejszej odpowiedzi immunologicznej niż naturalnie występująca odpowiedź immunologiczna,

- po drugie, ilość wytwarzanych przeciwciał będzie wystarczająco wysoka dla związania całej ureazy, czy to wydalonej czy nie wydalonej,

- po trzecie, zastosuje się podjednostki ureazy lub rodzaje cząsteczek, które nie są toksyczne.

174 448

Podsumowując, istnieje potrzeba skutecznego leczenia i zapobiegania infekcji żołądka indukowanych H. pylon u ludzi. Ostatnie dane sugerują, że istnieje możliwość stworzenia szczepionki przeciwko tej infekcji, ale nie zidentyfikowano w sposób jasny antygenu(ów), wspólnych dla wszystkich szczepów H. pylori, które mogłyby być wprowadzone do bezpiecznej i skutecznej szczepionki.

W wynalazku tym zidentyfikowano antygen ureazy H. pylori jako kandydata na szczepionkę i wykazano jego skuteczność w modelu zwierzęcym. Wyniki te były nieoczekiwane w świetle naturalnej historii infekcji Helicobacter.

Odkryto, że odporność u ssaków podatnych na żołądkowo-jelitową infekcję Helicobacter można indukować przez wykorzystanie determinant antygenowych ureazy istniejących na powierzchni lub w pobliżu powierzchni organizmów Helicobacter i wykorzystanie ich jako celu szczepionki. Odporność można indukować przez szczepienie naturalnymi ureazami, a także rekombinacyjną podjednostką ureazy, wytwarzaną w nieczynnej enzymatycznie, a zatem nietoksycznej formie. Wynalazek dostarcza sposobu indukowania odporności na infekcję Helicobacter przez podawanie do powierzchni śluzówki ssaka preparatu poliaminokwasowego, to jest mieszaniny peptydów i/lub białek, razem z odpowiednim adiuwantem. Ten preparat poliaminokwasowy posiada wiele determinant antygenowych charakterystycznych dla ureazy i wykazywanych przez enzym ureazę, endogenny dla infekującego organizmu Helicobacter. Preparat poliaminokwasowy może być podawany drogą doustną.

Składnik czynny preparatu może zawierać naturalne Iub biosyntetyczne determinanty antygenowe i może przybierać różne formy. Niewyczerpująca lista możliwych preparatów obejmuje oczyszczone, występujące naturalnie Iub wytwarzane rekombinacyjnie preparaty ureazy pochodzenia bakteryjnego Iub innego, produkty trawienia ureazy, białka fuzyjne zawierające determinanty antygenowe ureazy, obcięte formy enzymu ureazy Iub peptydy o sekwencji aminokwasów homologicznej do sekwencji aminokwasów ureazy. Ponieważ powstanie odporności zależy od indukcji humoralnych i/lub komórkowych odpowiedzi immunologicznych, które wiążą się z infekującym organizmem Helicobacter, korzystne są takie preparaty, które najbliżej odtwarzają determinanty antygenowe endogenne dla organizmu infekującego. Na przykład preparaty posiadające determinanty antygenowe ureazy H. pylori są korzystne do podawania ludziom podatnym na H. pylori. Jednakże zgodnie z ważnym aspektem wynalazku odkryto, że może być zastosowana ureaza z innych gatunków. Na przykład wykazano, że infekcji H. felis u myszy można zapobiegać przez podawanie ureazy z H. pylori.

Według wynalazku szczepionka do wywoływania u ssaka odpowiedzi immunologicznej na infekcję Helicobacter na bazie ureazy, charakteryzuje się tym, że zawiera od 10 gg do 100 miligramów ureazy Helicobacter pylori Iub Helicobacter felis Iub polipeptyd zawierający jej podjednostkę i od 5 do 50 gg adiuwantu śluzówkowego na dawkę jednostkową w dopuszczalnym farmaceutycznie nośniku Iub rozcieńczalniku.

Szczepionkę według wynalazku stosuje się do wywoływaniau gospodarza ssaka ochronnej odpowiedzi immunologicznej na infekcję Helicobacter. Stosowanie to polega na tym, że na powierzchnię śluzówki gospodarza ssaka w tym człowieka podaje się efektywną immunologicznie ilość antygenu ureazy, zdolnego do wywoływania takiej ochronnej odpowiedzi immunologicznej, korzystnie ureazy H. pylori Iub podjednostki B ureazy H. pylori i adiuwanta śluzówkowego.

Nadawanie gospodarzowi ssakowi biernej odporności na infekcję Helicobacter za pomocą szczepionki według wynalazku, polega na podawaniu na powierzchnię śluzówki gospodarza efektywnej immunologicznie ilości przeciwciała specyficznego dla ureazy, wytwarzanego w gospodarzu immunizowanym ureazą, korzystnie ureazą H. pylori Iub podjednostką B ureazy H. pylori, zdolną do wywoływania ochronnej odpowiedzi immunologicznej na infekcję Helicobacter.

Wynalazek w odniesieniu do załączonych rysunków, na których figury 1 do 6 są ilustracjami graficznymi wyników przedstawionych w tabelach 1 do 6.

Oodkryto, że podawanie myszom drogą doustną preparatów poliaminokwasowych posiadających determinanty antygenowe ureazy H. pylori wywołuje ochronną odpowiedź immunologiczną przeciwko H. felis u myszy, w modelu zwierzęcym o ogólnie akceptowanej wartości dla badań odpowiedzi immunologicznej na infekcję Helicobacter [9], Skutkiem ochronnej odpowie174 448 dzi immunologicznej jest to, że u szczepionych myszy po prowokacji patogenem częstość występowania infekcji jest znacznie mniejsza w porównaniu ze zwierzętami nieszczepionymi. Ponadto odkryto, że doustne szczepienie myszy za pomocą podjednostki B ureazy H. pylori, wytwarzanej w postaci rekombinacyjnego, nieaktywnego enzymatycznie białka wywołuje u myszy ochronną odpowiedź immunologiczną przeciwko H. felis. Wpływ ochronnej odpowiedzi immunologicznej jest taki, że u zwierząt szczepiennych częstość występowania infekcji po prowokacji antygenowej jest znacznie zmniejszona w porównaniu z zainfekowanymi zwierzętami nieszczepionymi.

Wywoływanie u gospodarza ssaka ochronnej odpowiedzi immunologicznej na infekcję Helicobacter może polegać także na podawaniu do powierzchni śluzówki ssaka, w tym człowieka, efektywnej immunologicznie ilości rekombinacyjnego, nieaktywnego enzymatycznie antygenu podjednostki B ureazy, korzystnie rekombinacyjnej podjednostki B ureazy H. pylori, zdolnej do wywoływania takiej ochronnej odpowiedzi immunologicznej.

Składniki szczepionki według wynalazku pozwalają na leczenie Iub zapobieganie infekcji Helicobacter u ssaków, w tym ludzi, polegające na tym, że do powierzchni śluzówki pacjenta podaje się efektywną immunologicznie ilość ureazy Iub jej podjednostek, zdolnej do wywoływania ochronnej odpowiedzi immunologicznej na infekcję Helicobacter wraz z adiuwantem śluzówkowym. Korzystnie jako ureazę stosuje się ureazę H. pylori Iub podjednostkę B ureazy H. pylori, a ureaza może być podawana sama albo w połączeniu z hydroksylowanym fosforanem wapnia, na przykład hydroksyapatytem, jako cząstką nośnika. Ponadto ureazę H. pylori podaje się w połączeniu z adiuwantem śluzówkowym: podjednostką B toksyny cholery, dipeptydem muramylowym Iub innymi takimi adiuwantami.

Bez wiązania się teorią, wynalazcy uważają, że podawanie antygenu ureazy Iub jego podjednostki B do powierzchni śluzówki stymuluje wspólny śluzówkowy system immunologiczny i być może lokalne miejsca w śluzówce żołądka, indukując odpowiedź immunologiczną, w tym pojawienie się specyficznych przeciwciał IgA przeciwko H. pylori w wydzielinie żołądkowej, które zapobiegają infekcji Helicobacter. Ponieważ badania przedkliniczne kandydatów na szczepionki dla ludzi rutynowo prowadzi się na modelach zwierzęcych, to metodologia wynalazku powinna być skuteczna u ludzi, zwłaszcza w zapobieganiu i leczeniu wrzodom trawiennym, nieżytowi żołądka, złośliwym nowotworom żołądka i innym stanom chorobowym, będącym rezultatem obecności H. pylori i/lub H. heilmanii.

Szczep H. pylori stosowany w badaniach pochodził od pacjenta chorego na wrzód dwunastnicy i był hodowany na płytkach agarozowych BHI do jednorodności. H. pylori hodowano na odpowiedniej pożywce, zwykle pożywce BHI (Brain-Heart Infusion), zawierającej 0,25% wyciągu z drożdży i 10% cielęcej surowicy płodowej i suplementowanej 0,4% dopełniacza selektywnego dla Campylobacter (suplement Skirrowa, Oxoid 69). Bakterie inkubowano przez noc w warunkach mikroaerofilowych w 37°C w butelkach, które następnie szczelnie zamknięto i wytrząsano w 37°C przez 2 do 3 dni, otrzymując hodowlę płynną. Hodowlę można również otrzymać na płytkach agarozowych składających się z BHI z 0,25% wyciągu z drożdży i 5% krwi owczej w warunkach mikroaerofilowych w 37°C przez 3 dni. Ilość bakterii oznaczano mierząc gęstość optyczną roztworu BHI przy 660 nm, przy czym jednajednostka gęstości odpowiadała Kfbakterii. Hodowle na płytkach agarozowych najpierw zawieszano w 154 mm NaCl.

Korzystnym źródłem poliaminokwasu posiadającego determinanty antygenowe ureazy jest ureaza oczyszczana, na przykład ureaza H. pylori otrzymywana według ogólnej metody Dunna i współpr., J. Biol. Chem. 265, 9464-9469, zmodyfikowanej w sposób opisany poniżej. Po namnożeniu H. pylori zbiera się w wodzie, odwirowuje i odwirowuje ponownie otrzymując supernatant. Następnie roztwór zawierający aktywność ureazy H. pylori (ocenia się za pomocą opisanego poniżej szybkiego testu na ureazę) chromatografuje się na kolumnie CL-6B, a frakcje zawierające silną aktywność ureazy zbiera się i dializuje przez noc i chromatografuje ponownie na żelu anionowymiennym. Frakcje eluuje się w rosnącym gradiencie buforu NaCl, a zebrane frakcje posiadające silną aktywność ureazy poddaje się pojedynczo elektroforezie w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS, a następnie wybarwianiu błękitem Coomassie. Jako ureazę identyfikuje się dwa różne prążki, odpowiadające ciężarowi cząsteczkowemu około 63 i

174 448 około 29 kDa. Frakcje zawierające ureazę łączy się, otrzymując oczyszczoną ureazę H. pylori o czystości w zakresie 95% do 99%.

Jakkolwiek korzystnie jako materiał antygenowy stosuje się oczyszczaną ureazę H. pylori, należy rozumieć, że możliwe jest również stosowanie jako materiału antygenowego dowolnej ureazy lub podjednostki ureazy, zarówno występującej naturalnie jak i otrzymuje techniką rekombinacji DNA, jak również jej fragmentów otrzymanych przez trawienie, białek fuzyjnych zawierających fragmenty ureazy Iub całą ureazę, obciętych konstruktów ureazy Iub innych preparatów peptydowych, Iub białkowych, posiadających determinanty antygenowe, które są zdolne do wywoływania ochronnej odpowiedzi immunologicznej na infekcję Helicobacter (patrz poniżej). Zatem możliwe jest zastosowanie ureazy mającej znaczną homologię w odniesieniu do ureazy H. pylori i efektywnej w podwyższaniu, krzyżowej odpowiedzi immunologicznej na Helicobacter. Przykładem takiej, ureazy jest ureaza z fasoli Jaś, która posiada około 70% homologii z ureazą H. pylori. Wynalazek nie jest zatem ograniczony do stosowania ureazy nie poddawanej obróbce i obejmuje zastosowanie dowolnego preparatu poliaminokwasowego, który posiada determinanty antygenowe ureazy i jest efektywny w generowaniu w gospodarzu ochronnej odpowiedzi immunologicznej na infekcję Helicobacter. Typowo jako antygen ureazowy w szczepionce według wynalazku stosuje się ureazę mającą 70-95% homologii, na przykład 80-90% homologii z ureazą H. pylori.

Nieograniczająca lista źródeł potencjalnych preparatów ureazy obejmuje endogenne enzymy ureazy z różnych rodzajów Helicobacter, ureazy z innych bakterii, takich jak Klebsiella pneumoniae lub Proteus mirabilis i przez analogię wszelkie inne ureazy pod warunkiem, że ureazy te posiadają te same determinanty antygenowe reagujące krzyżowo co ureaza H. pylori. Geny ureazy wszystkich wymienionych wyżej organizmów stanowią potencjalne narzędzie ekspresji rekombinacyjnych produktów ureazowych w postaci całego białka lubjakojego części.

Nieograniczająca lista potencjalnie użytecznych preparatów ureazy obejmuje peptydy uzyskiwane z ureazy oczyszczanej (źródła takie jak wymienione powyżej) przy użyciu fizycznych i/lub chemicznych procedur rozszczepiania (na przykład CnBr) i/lub rozszczepiania proteolitycznego (za pomocą proteaz, na przykład proteazy V3, trypsyny lub innych) lub peptydy zsyntetyzowane na drodze chemicznej i posiadające wspólne determinanty antygenowe z ureazą.

Do innych źródeł potencjalnie użytecznych determinant antygenowych należą determinanty antygenowe zidentyfikowane na podstawie ich reaktywności krzyżowej z ureazą w wyniku skriningu przeciwciałami anty-ureazowymi. Peptydy te mogą być peptydami występującymi naturalnie lub peptydami otrzymanymi w wyniku syntezy chemicznej. Ponadto peptydy takie mogą być otrzymane na drodze ekspresji rekombinacyjnego przypadkowego oligonukleotydu.

lnne źródło potencjalnie użytecznych determinant antygenowych obejmuje determinanty antygenowe podobne do ureazy, otrzymywane w wyniku generacji anty-idiotypowych przeciwciał anty-ureazowych. Takie przeciwciała antyidiotypowe, generowane w dowolnym immunokompetentnym gospodarzu, otrzymuje się przez immunizację tego gospodarza przeciwciałami anty-ureazowymi w celu generacji przeciwciał skierowanych przeciwko przeciwciałom antyureazowym, które posiadają homologię strukturalną z ureazą.

Przedstawione tu omówienie wynalazku skupia się na zastosowaniu ureaz wytwarzanych w naturze przez H. pylori (rozdział B). Jednakże należy wziąć pod uwagę, że ureaza lub jej podjednostki albo konstrukty wspomniane powyżej, zdolne do wywoływania ochronnej odpowiedzi immunologicznej, mogą być wytwarzane za pomocą technik rekombinacji DNA dobrze znanych ze stanu technik. Skuteczność konkretnych preparatów może być ustalona w sposób rutynowy przy użyciu modeli zwierzęcych, przez podawanie doustne kandydata na szczepionkę i prowokację patogenem z zastosowaniem protokołu zasadniczo podobnego lub identycznego do procedury opisanej powyżej.

Poniżej w tabelach 1 i 2 oraz na figurach 1-5 opisano rezultaty uzyskane w wyniku szczepienia myszy drogą doustną za pomocą oczyszczanej ureazy H. pylori. W tym eksperymencie antygen H. pylori podawano przez doustne podawanie ureazy H. pylori oczyszczanej w sposób opisany powyżej i sprzężonej z kryształami hydroksyapatytu, stosowanymi jako nośnik w. celu wzmocnienia wiązania i wychwytu do komórek Ml. Jako adiuwant śluzówkowy podawano toksynę cholery (Sigma). W tym eksperymencie myszy samice SPF BALB/c w wieku 6 tygodni

174 448 szczepiono przez podanie drogą doustną w dniach 0, 7, 14 i 21, 30 gg oczyszczanej ureazy H. pylori, sprzężonej z 1mg hydroksyapatytu oraz 10 gg adiuwanta toksyny cholery. Następnie myszy poddawano dwukrotnie prowokacji antygenowej 10⁸ H. felis w dniu 28 i 30. Dla celów porównawczych podobne myszy samice SPF BALB/c w wieku 6 tygodni szczepiono przez podanie drogą doustną w dniach 0, 7, 14 i 21 pełnego lizatu (sonikatu) H. pylori oraz 10 gg adiuwanta toksyny cholery. Myszy poddawano dwukrotnie prowokacji antygenowej H. felis w dniu 28 i 30. Sonikat H. pylori przygotowano przez zebranie H. pylori z hodowli komórkowych, peletkowanie przez wirowanie i ponowne zawieszenie peletki w 0,9% chlorku sodu, a następnie sonikację.

Jako kontrola służyły myszy samice SPF BALB/c w wieku 6 tygodni szczepione przez podanie drogą doustną w dniach 0,7,14 i 21 1mg hydroksyapatytu oraz 10 gg toksyny cholery. Wszystkie myszy były przetrzymywane, szczepione i poddawane prowokacji równolegle. Myszy poddawane badaniom zabijano dnia 35.

Geny kodujące podjednostki strukturalne A i B ureazy H. pylori otrzymano na drodze klonowania za pomocą polimerazowej reakcji łańcuchowej zgodnie z typowymi procedurami, w oparciu o uprzednio opublikowane sekwencje [29]. Geny te włączano do wektora o nazwie pEV40, zaprojektowanego tak, aby uzyskiwać wysoki poziom ekspresji i łatwość oczyszczania obcych genów w E. coli. W skrócie procedura polega na tym, że dokonuje się insercji obcego genu poniżej (downstream) promotora termoregulacyjnego, w ramach sekwencji kodującej sześć powtarzających się histydyn. Wektor ten posiada gen ampR dla celów selekcji transformantów. W odpowiednich warunkach temperaturowych otrzymywane białko rekombinacyjne jest uzupełnione przez sześć histydyn na N-końcu, co pozwala na przeprowadzenie jednoetapowego oczyszczania na kolumnie niklowej. Ekspresję podjednostek A i B rekombinacyjnej ureazy H. pylori przeprowadza się oddzielnie w E. coli, po czym oczyszcza na kolumnie niklowej do czystości 95%.

Jakkolwiek jako materiał antygenowy korzystnie stosuje się rekombinacyjną ureazę H. pylori opisaną powyżej, to zrozumiałe jest, że możliwe jest również zastosowanie jako materiału antygenowego dowolnej ureazy Iub podjednostki ureazy otrzymanej technikami rekombinacyjnymi (na przykład białka fuzyjnego), w których wyniku następuje ekspresja miejsc antygenowych ureazy, zdolnych do wywoływania ochronnej odpowiedzi immunologicznej na infekcję Helicobacter. Zatem możliwe jest zastosowanie konstruktu genu ureazy o znacznej homologii z ureazą H. pylori, zdolnego do zwiększania krzyżowej ochronnej odpowiedzi immunologicznej na Helicobacter. Przykładami takich ureaz są ureaza fasoli Jaś, która posiada około 70% homologii z ureazą H. pylori Iub ureaza H. felis, która posiada około 88% homologii z ureazą H. pylori. Wynalazek nie jest zatem ograniczony do stosowania genów ureazy H. pylori i jej produktów genowych i obejmuje stosowanie dowolnych ureaz rekombinacyjnych i ich podjednostek, posiadających zdolność efektywnego generowania w gospodarzu ochronnej odpowiedzi immunologicznej na infekcję Helicobacter. Szczepionka według wynalazkujako rekombinacyjny antygen ureazy typowo zawiera ureazę rekombinacyjną, mającą 80-90% homologii z ureazą H. pylori.

Niniejsze omówienie skupia się na stosowaniu podjednostek A i B rekombinacyjnej ureazy H. pylori wytwarzanych przez E. coli. Jednakże należy wziąć pod uwagę, że wymienione powyżej rekombinacyjna ureaza lub jej podjednostki albo konstrukty, zdolne do wywoływania pożądanej ochronnej odpowiedzi immunologicznej mogą być wytwarzane przy użyciu innych technik rekombinacji dNa i innych eukariotycznych lub prokariotycznych wektorów ekspresji, dobrze znanych ze stanu techniki.

W tabelach 3, 4 i 5 poniżej oraz na figurze 6 opisano wyniki uzyskane po szczepieniu myszy drogą doustną za pomocą podjednostek rekombinacyjnej ureazy H. pylori wytwarzanych w E. coli. W eksperymencie tym antygen H. pylori podawano myszom przez doustne podawanie myszom podjednostek A lub B rekombinacyjnej ureazy H. pylori wytwarzanych w E. coli i oczyszczanych w sposób opisany powyżej, sprzężonych z kryształami hydroksyapatytu, stosowanymi jako nośnik w celu wzmocnienia wiązania i wychwytu do komórek M. Jako adiuwant śluzówkowy podawano toksynę cholery (Sigma). W tym eksperymencie myszy samice SPF BALB/c w wieku 6 tygodni szczepiono przez podanie drogą doustną w dniach 0, 8, 14 i 21 30 pg podjednostki A i B rekombinacyjnej ureazy H. pylori, sprzężonej z 1 mg hydroksyapatytu oraz 10 pg adiuwanta toksyny cholery. Następnie myszy poddawano dwukrotnie prowokacji antygenowej 10⁸ H. felis w dniach 32,34 i 36. Dla celów porównawczych podobne myszy samice SPF BALB/c w wieku 6 tygodni szczepiono przez podanie drogą doustną w dniach 0, 8, 14 i 21 30 pg podjednostki B rekombinacyjnej ureazy H. pylori sprzężonej z hydroksyapatytem oraz 10 pg adiuwanta toksyny cholery. Myszy poddawano trzykrotnie prowokacji antygenowej H. felis w dniu 32, 34 i 36. Jako kontrola służyły myszy samice SPF BALB/c w wieku 6 tygodni szczepione przez podanie drogą doustną w dniach 0,8,14 i 21 mg hydroksyapatytu oraz 10 pg toksyny cholery. Następnie myszy poddawano prowokacji H. felis w dniach 32, 34 i 36. Wszystkie badane myszy były szczepione i poddawane prowokacji jednocześnie. Myszy zabijano dnia 48 (12 dni po prowokacji) lub w 10 tygodni po prowokacji.

Biopsje pobierano z żołądka, a krew z serca. Jelita usuwano i przemywano 1 mM PMSF (Boehringer) w buforze PBS, otrzymując wydzielinę jelitową do analizy metodą ELISA.

W celu oceny zabezpieczenia przed kolonizacją H. felis biopsje żołądka z każdego zwierzęcia poddawano skriningowi na obecność H. felis, stosując szybki test na aktywność ureazy Jatrox HP (Rohm Pharma) zgodnie ze wskazówkami dostawcy. W skrócie test polega na zanurzeniu biopsji żołądka w 0,5 ml dostarczanej mieszanki mocznika i czerwieni fenolowej jako wskaźnika pH. Aktywność ureazy generuje amoniak i wodorowęglan z mocznika, czego następstwemjest zmiana koloru roztworu w stronę wyższej absorbancji przy 550 nm. Aktywność ureazy oznaczano ilościowo za pomocą analizy spektrofotometrycznej.

Biopsje żołądka każdego ze zwierząt poddawanych szczepieniu doustnemu oczyszczoną ureazą H. Pylori hodowano również na płytkach agarozowych BHI, suplementowanych w sposób opisany powyżej, w celu wykrycia H. felis. Po inkubacji przez 3 do 10 dni w warunkach mikroaerofilowych obecność H. felis potwierdzano przez wybarwianie metodą Grama i oznaczanie aktywności ureazy. Ponieważ przy detekcji hodowli H. felis w pierwszym zestawie eksperymentów (patrz tabela 3) uzyskano korelację na bardzo wysokim poziomie istotności, w celu detekcji H. felis w eksperymencie opisanym w rozdziale C na biopsjach żołądka przeprowadzono tylko testy na ureazę. Detekcję H. felis potwierdzano przez badanie mikroskopowe, wykonywane niezależnie przez dwóch badaczy, stosując dwa różne wybarwienia (oranż akrydynowy i fiolet krezylowy).

Próbki krwi pozostawiono do zakrzepnięcia na 3 godziny w temperaturze pokojowej i do czasu analizy zamrażano w -20°C. Wydzieliny jelitowe wirowano przez 5 minut w 4°C w celu usunięcia resztek komórkowych i trzymano w stanie zamrożonym w -20°C. Próbki krwi i wydzieliny jelitowej od każdego zwierzęcia analizowano metodą ELISA zgodnie ze standartowymi procedurami w celu oceny aktywności anty-Helicobacter. W skrócie procedura polegała na tym, że 96-dołkowe płytki powlekano sonikatem H. pylori, a następnie nasycano 5% mlekiem odtłuszczonym. Próbki rozcieńczano kolejno do stężeń od 1:1 do 1:1000 i inkubowano przez noc w 4°C na płytkach ELISA. Do oznaczenia poziomów przeciwciał wykorzystano biotynylowane przeciwciała anty-mysie IgG (surowica) i anty-mysie IgA, a następnie kompleks streptawidyna-peroksydaza z chrzanu.

Wyniki prowokacji H. felis po szczepieniach oczyszczaną ureazą H. pylori przedstawiono w tabelach 1-3 i na figurach 1-4, zaś wyniki prowokacji H. felis po szczepieniach podjednostkami A i B rekombinacyjnej ureazy H. pylori przedstawiono w tabelach 4-6 i na figurach 5 i 6.

W tabeli 1, która odnosi się do eksperymentu opisanego w rozdziale dotyczącym szczepienia doustnego oczyszczoną ureazą z H. pylori h oznacza godzinę, Ig oznacza immunoglobulinę, NO oznacza nie oznaczano, ureaza + HF oznacza, że myszy szczepiono ureazą (sprzężoną z hydroksyapatytem, z toksyną cholery), po czym poddawano prowokacji H. felis, ureaza oznacza, że myszy szczepiono ureazą (sprzężoną z hydroksyapatytem, z toksyną cholery) i nie poddawano prowokacji, CT + HF oznacza, że myszy szczepiono toksyną cholery i poddawano prowokacji H. felis, sonikat HP + HF oznacza, że myszy szczepiono sonikatem H. pylori z toksyną cholery, po czym poddawano prowokacji H. felis, a sonikat HP oznacza, że myszy szczepiono sonikatem H. pylori z toksyną cholery i nie poddawano prowokacji H. felis. Liczby podane w tabeli 1 jako wyniki pomiarów przeciwciał oznaczają miarę absorbancji przy 595 nm pomnożoną przez 1000. Ttło mierzone w nieobecności przeciwciał zostało odjęte.

174 448

Tabela 1

Numer myszy	Szczepienie	Test ureazy 12 h	Gram hodowli	Immunoglobuliny
osocze	wydzielina jelitowa
Ig	IgG	Ig	IgG
1	Ureaza + HF	+	H.felis	27	0	25	258
2	Ureaza + HF	0	0	264	273	221	246
3	Ureaza + HF	0	0	54	44	318	354
4	Ureaza + HF	+	H.felis	81	42	12	5
5	Ureaza + HF	0	0	98	137	126	234
6	Ureaza + HF	+	0	968	2093	31	22
7	Ureaza + HF	0	0	98	0	96	34
8	Ureaza + HF	0	0	247	1010	214	128
9	Ureaza + HF	0	0	NO	NO	48	23
10	Ureaza + HF	0	0	50	0	124	99
11	Ureaza	0	0	319	205	44	53
12	Ureaza	0	0	14	0	86	87
13	Ureaza	0	0	0	0	0	0
14	Ureaza	0	0	0	0	43	61
14	Ureaza	0	0	58	0	110	127
16	Ureaza	0	0	140	63	21	37
17	Ureaza	0	0	84	240	114	280
18	Ureaza	0	0	NO	NO	93	148
19	Ureaza	0	0	45	0	135	216
20	Ureaza	0	0	261	197	161	261
21	CT +HF	0	0	0	0	0	2
22	CT +HF	+	H.felis	63	0	310	303
23	CT+HF	+	H.felis	90	0	NO	NO
24	CT+HF	+	H.felis	31	0	150	192
25	CT+HF	+	H.felis	197	250	250	440
26	CT+HF	+	H.felis	105	135	214	138
27	CT+HF	+	H.felis	140	47	109	55
28	CT+HF	+	0	0	0	16	15
29	CT +HF	+	H.felis	0	0	0	0
30	CT + HF	+	H.felis	NO	NO	NO	NO
31	Sonikat HP + HF	+	H.felis	0	0	76	103
32	Sonikat HP + HF	+	H.felis	77	0	11	33
33	Sonikat HP + HF	+	H.felis	549	748	57	36
34	Sonikat HP + HF	0	0	660	153	180	286
35	Sonikat HP + HF	+	H.felis	730	192	0	5
36	Sonikat HP + HF	+	H.felis	32	0	5	64
37	Sonikat HP + HF	0	0	400	400	312	1149
38	Sonikat HP + HF	+	H.felis	1007	1360	149	26
39	Sonikat HP + HF	0	0	220	186	133	122
40	Sonikat HP	0	0	873	1016	352	514
41	Sonikat HP	0	0	727	899	126	191
42	Sonikat HP	0	0	109	68	44	83
43	Sonikat HP	0	0	147	949	167	97
44	Sonikat HP	0	0	845	1094	246	64
45	Sonikat HP	0	0	1217	1198	210	157
46	Sonikat HP	0	0	81	0	256	218
47	Sonikat HP	0	0	329	210	241	276
48	Sonikat HP	0	0	1049	737	197	211

Wyniki eksperymentu opisanego w części dotyczącej szczepienia doustnego oczyszczoną ureazą z H. pylori otrzymane na bazie testów biopsji żołądka i wybarwiania hodowli H. felis metodą Grama przedstawiono w tabeli 2. Infekcja została zdefiniowana jako mysz z jednym lub

174 448 więcej znaczników kolonizacji H. felis, łącznie z testem na ureazę lub wybarwianiem hodowli metodą Grama.

Tabela 2

Szczepienie	Prowokacja	% zainfekowanych	% chronionych
Ureaza	H. felis	3/10 (30%)	7/10(70%)*
Sonikat	H. felis	6/9 (66%)	3/9 (33%)**
CT	H. felis	9/10 (90%)	1/10 (10%)

* p = 0,0198 (dwustronny test Fischera) w porównaniu z kontrolą CT ** p = 0,3030 (dwustronny test Fischera) w porównaniu z kontrolą CT

Z wyników przedstawionych w tabelach 1 i 2 widoczne jest, że uodpornienie na prowokację H. felis istotne statystycznie w porównaniu z uodpornieniem uzyskiwanym przez szczepienie za pomocą sonikatu H. pylori lub toksyny cholery uzyskuje się przez szczepienie drogą doustną za pomocą ureazy H. pylori. Z tabeli 2 widoczne jest, że z łącznej liczby 10 zaszczepionych zwierząt tylko 3 zostały zainfekowane, w porównaniu z 6 zwierzętami szczepionymi sonikatem H. pylori i 9 zwierzętami szczepionymi toksyną cholery. Tabela 2 pokazuje, że 70% zwierząt zostało uodpornionych przez prowokację H. felis w porównaniu z 33% zwierząt szczepionych sonikatem H. pylori i 10% zwierząt szczepionych toksyną cholery, a następnie poddanych prowokacji H. felis. Inaczej mówiąc, 90% myszy kontrolnych poddanych ekspozycji na H. felis ulegało zainfekowaniu przez ten patogen, podczas gdy wśród myszy szczepionych ureazą H. pylori 28 dni przed ekspozycją na H. felis współczynnik zainfekowania wyniósł tylko 30%. Oznacza to znaczne zmniejszenie liczby infekcji (p = 0,0198 w dwustronnym teście Fischera, w porównaniu z myszami kontrolnymi). Gdy myszy szczepiono drogą doustną sonikatem H. pylori, współczynnik zainfekowania wynosił 67% (nieznaczący w stosunku do kontroli). Ochrona uzyskiwana przy użyciu ureazy H. pylori jest nieoczekiwana i nie mogła być przewidziana na bazie wyników zaobserwowanych przy użyciu sonikatu H. pylori.

Odnośnie figur 1-4, figura 1 przedstawia graficznie wyniki testów na przeciwciała w osoczu (IgG) i wydzielinie jelitowej (IgA) u myszy nie zabezpieczonych po szczepieniu ureazą. Są to myszy o numerach 1, 4 i 6 w tabeli 1, i stanowią one grupę A. Figura 2 przedstawia odpowiedź przeciwciał u myszy uodpornionych przez szczepienie ureazą (grupa B), to jest myszy 2, 3, 5 i 7-10.

Figury 3 i 4 dotyczą wyników uzyskanych z myszami o numerach 31 do 39. Figura 3 (grupa C) obrazuje odpowiedź przeciwciał u myszy nieuodpornionych po szczepieniu sonikatem H. pylori (myszy o numerach 3132,33,35,36 i 38), a figura 4 (grupa D) obrazuje odpowiedzi przeciwciał myszy uodpornionych po szczepieniu sonikatem H. pylori (myszy o numerach 34, 37 i 39). Interesujące na figurach 3 i 4 jest to, że odpowiedzi przeciwciał IgA (ale nie IgG) są wyższe u myszy uodpornionych niż nieuodpornionych, co sugeruje istnienie korelacji między uodpornieniem a odpowiedzią IgA. Odpowiedzi IgG w osoczu nie wykazują korelacji. Wiadomo jest, że śluzówkowe przeciwciała IgA, ale nie IgG osocza, odgrywają rolę w zabezpieczeniu przeciwko infekcjom bakteryjnym jelita [3].

Wyniki korelacji między wykryciem H. felis w biopsjach żołądka za pomocą testu na ureazę oraz za pomocą testu hodowlanego przedstawiono w tabeli 3.

Tabela 3

	Test ureazy +	Test ureazy -	Łącznie
Hodowla H. felis +	16	0	16
Hodowla H. felis -	2	30	32
Łącznie	18	30	48

Dwustronny test Fischera: p<0,0001

174 448

Tabela 3 pokazuje, że istnieje bardzo istotna korelacja między wynikami testów na ureazę przeprowadzonych na biopsjach żołądka a zidentyfikowaniem infekcji H. felis, w związku z czym testy na ureazę preferowano jako narzędzie diagnozy infekcji H. felis u myszy w następnych eksperymentach ze względu na większą czułość. Takie podejście pozwoliło na powtórzenie testów na ureazę z większymi fragmentami żołądka każdej z myszy i dalszy wzrost czułości testu ureazowego. Ponadto zastosowanie metody o wyższej czułości zapobiega przecenieniu uodpornienia uzyskiwanego za pomocą preparatu szczepionki według wynalazku. Gdy jako wzorzec infekcji stosuje się hodowlę pozytywną, uodpornienie indukowane po szczepieniu ureazą podczas eksperymentu szczepienia doustnego oczyszczoną ureazą z H. pylori jest tak znaczne jak przy połączonym użyciu testu na ureazę i hodowli (p=0,021 w porównaniu z p=0,019).

Wyniki eksperymentów dotyczących szczepienia drogą doustną za pomocą podjednostki rekombinacyjnej ureazy H. pylori uzyskane na bazie testów ureazowych biopsji żołądka są przedstawione w tabelach 4, 5 i 6 i zobrazowane na figurze 6.

Tabela 4

Szczepienie	Nr myszy	Test ureazy	Infekcja
CT	20	0,49	+
	21	0,31	+
	22	0,62	+
	23	0,67	+
	24	0,55	+
	50	0,50	+
	51	0,37	+
	52	0,29	+
	53	0,79	+
	54	0,32	+
ureA + HAP + CT	40	0,67	+
	41	0,48	+
	42	0,42	+
	43	0,65	+
	44	0,56	+
	45	0,52	+
	46	0,33	+
	47	0,63	+
	48	0,22	+
	49	0,37	+
ureB + HAP + CT	25	0,15	—
	26	0,07	-
	27	0,03	-
	28	0,64	+
	29	0,13	-
	30	0,02	-
	31	0,66	+
	32	0,00	—
ureA + HAP + CT	68	0,00
	69	0,07	-
	70	0,42	-
	71	0,00	-
	72	0,00	—
ureB + HAP + CT	73	0,37	+
	74	0,00	—
	75	0,37	+
	76	0,00	—
	77	0,00	—
	78	0,00	—
	79	0,39	+
	80	0,00	-
	81	0,37	+
	82	0,00	—

174 448

W tabeli 4 CT oznacza toksynę cholery, ureA oznacza podjednostkę A rekombinacyjnej ureazy H. pylori, ureB oznacza podjednostkę B rekombinacyjnej ureazy H. pylori, a HAP oznacza kryształy hydroksyapatytu. Myszy 20 do 54 zabito 12 dni po prowokacji a myszy 68 do 82 w 10 tygodni (106 dni) po prowokacji. Wyniki testów ureazowych prowadzonych na biopsjach żołądka każdego ze zwierząt wyrażono jako wartości OD przy 550 nm. Znaki plusa i minusa obrazują końcowy stan infekcji każdego zwierzęcia, zależnie od dodatniego lub ujemnego wyniku testu ureazowego na obecność H. felis. Wynik pozytywny: wartości OD550>0,2.

Tabela 5

Uodpornienie mierzone 12 dni po prowokacji

Szczepienie	Prowokacja	% zainfekowanych	% chronionych
Podjednostką A ureazy	H. felis	10/10 (100%)	0/10 (0%)*
Podjednostką B ureazy	H. felis	3/10 (30%)	7/10 (70%)**
CT	H. felis	10/10 (100%)	0/10 (0%)

* p = 0,0031 (dwustronny test Fischera) w porównaniu z kontrolą CT

Tabela 6

Uodpornienie mierzone 10 tygodni po prowokacji

Szczepienie	Prowokacja	% zainfekowanych	% chronionych
Podjednostką A ureazy	H. felis	1/5 (20%)	4/5 (80%)
Podjednostką B ureazy	H. felis	4/10 (40%)	6/10(60%)*

* p = 0,0031 (dwustronny test Fischera) w porównaniu z kontrolą CT ** p = 0,01 (dwustronny test Fischera) w porównaniu z kontrolą CT

Z wyników przedstawionych w tabelach 4, 5 i 6 widoczne jest, że po szczepieniu drogą doustną za pomocą podjednostki B rekombinacyjnej ureazy H. pylori uzyskuje się istotne statystycznie uodpornienie w porównaniu z uodpornieniem uzyskiwanym przy użyciu podjednostki A rekombinacyjnej ureazy ureazy H. pylori lub toksyny cholery. W odniesieniu do tabeli 4 widoczne jest, że 12 dni po prowokacji z łącznej liczby 10 szczepionych myszy tylko 3 jest zainfekowanych w grupie podjednostki B ureazy w porównaniu ze wszystkimi 10 zwierzętami szczepionymi podjednostką A ureazy H. pylori i 10 z grupy 10 zwierząt szczepionych toksyną cholery. Tabela 4 pokazuje, że 70% zwierząt zostało uodpornionych na prowokację H. felis w porównaniu z 0% zwierząt szczepionych podjednostką A ureazy H. pylori i 0% zwierząt szczepionych toksyną cholery i poddanych następnie prowokacji H. felis. Innymi słowy, 100% myszy kontrolnych poddanych prowokacji H. felis zostało zainfekowanych, podczas gdy wśród myszy szczepionych podjednostką B rekombinacyjnej ureazy H. pylori współczynnik zainfekowania wyniósł tylko 30%. Oznacza to istotny spadek współczynnika zainfekowania (p=0,0031, test dwustronny Fishera) w porównaniu z myszami kontrolnymi.

Fakt, że uodpornienie obserwowane dla ureazy H. pylori jest uzyskiwane wyłącznie przez szczepienie podjednostką B ureazy H. pylori i że podjednostką A nie ma takiego działania był nieoczekiwany na podstawie naszych eksperymentów z ureazą oczyszczaną. Takie określenie ról 2 podjednostek strukturalnych ureazy w rozwoju ochronnej odpowiedzi immunologicznej jest zatem nowe. Uodpornienie uzyskiwane przy użyciu podjednostki B ureazy rekombinacyjnej, która jest nieaktywna enzymatycznie poucza również, że nietoksyczne formy ureazy mogą być stosowane jako szczepionka doustna przeciwko infekcji Helicobacter. Ponadto rezultaty te mocno sugerują, że rozpoznawanie miejsca aktywnego nie jest wymagane dla uodpornienia, ponieważ jest wysoce nieprawdopodobne, aby nieaktywna podjednostką B ureazy indukowała przeciwciała, które rozpoznają i hamują miejsce katalityczne ureazy natywnej.

W odniesieniu do tabeli 6 widoczne jest, że gdy myszy zostały zabite 10 tygodni po zainfekowaniu, 60% (6 myszy z 10) zwierząt szczepionych podjednostką B ureazy i 80% (4 myszy z 5) zwierząt szczepionych podjednostką B ureazy H. pylori było uodpornionych przeciwko infekcji H. felis. Fakt, że uodpornienie uzyskane przez szczepienie podjednostką B

174 448 ureazy trwa w czasie i że szczepienie ureazą A indukuje zabezpieczenie nietrwałe w porównaniu z uodpornieniem indukowanym przez podjednostkę B ureazy nie mógł być oczekiwany na podstawie naszych eksperymentów z ureazą oczyszczaną lub innych eksperymentów przeprowadzanych wcześniej. Fakt, że szczepienie podjednostką B ureazy nadaje uodpornienie definitywnie udowadnia, że rozpoznawanie miejsca aktywnego nie jest wymagane dla uodpornienia. Na figurze 6 zestawiono wyniki uzyskane po szczepieniu drogą doustną podjednostkami A i B ureazy rekombinacyjnej (opisane w tabelach 5 i 6).

Wynalazek niniejszy dostarcza kompozycje szczepionki, nadające się do zapobiegania infekcji Helicobacter. Kompozycje zawierają efektywną ilość antygenu ureazy, korzystnie ureazy H. pylori lub podjednostek rekombinacyjnej ureazy H. pylori, zdolnej do wywoływania w gospodarzu ochronnej odpowiedzi immunologicznej na infekcję H. pylori, w połączeniu z adiuwantem śluzówkowym i dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem lub rozcieńczalnikiem.

Szczepionki według wynalazku są podawane w ilościach łatwych do ustalenia przez przeciętnego specjalistę w tej dziedzinie. Zatem dla dorosłych odpowiednia dawka jest zawarta w zakresie od 10 gg do 100 miligramów, na przykład 50 gg do 50 mg. Podobne zakresy dawek mają zastosowanie dla dzieci. Systemy nośnika dla ludzi obejmują kapsułki dojelitowe, zabezpieczaj ące antygen przed kwasowym środowiskiem żołądka i zawieraj ą antygen ureazy w postaci nierozpuszczalnej jako białka fuzyjne. Szczepionka może być podawana jako podstawowy środek profilaktyczny dla dorosłych i dzieci, jako wtórny środek zapobiegawczy po wytępieniu H. pylori w zainfekowanym gospodarzu lub jako środek leczniczy indukujący odpowiedź immunologiczną w gospodarzu w celu przyczynienie się do wytępienia H. pylori.

Jak wskazano powyżej, odpowiednim adiuwantem śluzówkowym jest toksyna cholery. Do innych adiuwantów, które mogą być zastosowane należą dipeptyd muramylowy lub jego pochodne, nietoksyczne pochodne toksyny cholery, w tym jej podjednostką B i/lub koniugaty albo otrzymane metodami inżynierii genetycznej produkty fuzji antygenu ureazy z toksyną cholery lub jej podjednostką B. Do innych odpowiednich metod dostarczania należą biodegradowalne mikrokapsułki lub kompleksy stymulujące odpowiedź immunologiczną (ISCOM) albo lipozomy, otrzymane metodami inżynierii genetycznej atenuowane żywe wektory, takie jak wirusy lub bakterie oraz rekombinacyjne (chimeryczne) cząstki wiruso-podobne, na przykład typu bluetongue. Zastosowana ilość adiuwanta śluzówkowego zależy od rodzaju adiuwanta śluzówkowego. Na przykład, gdy adiuwantem śluzówkowym jest toksyna cholery, jest ona zastosowana w ilości 5 gg do 50 gg, na przykład 10 gg do 35 gg. Gdy szczepionka ma postać mikrokapsułki, użyta ilość będzie zależeć od ilości zastosowanej w matrycy mikrokapsułek w celu uzyskania pożądanej dawki. Ustalenie tej ilości leży w zakresie umiejętności przeciętnego specjalisty w tej dziedzinie. Odpowiednim nośnikiem dla szczepionki według wynalazku są kapsułki powlekane powłoczką dojelitową i mikrokulki z polilaktydo-glikolidu. Odpowiednimi rozcieńczalnikami są 0,2N NaHCO₃ i/lub solanka.

Szczególnie odpowiednim nośnikiem dla ureazy H. pylori nanoszonej na powierzchnie błon śluzowych jest hydroksylowany fosforan wapnia (HCP) w postaci cząstek. Uważa się, że koniugat ureazy H. pylori z hydroksylowanym fosforanem wapnia jest transportowany przez nabłonek, gdzie wzbudza odpowiedź immunologiczną typu poli-Ig. Korzystnie hydroksylowany fosforan wapnia ma postać mikrocząstek, odpowiednich do transportu przez nabłonek, zwłaszcza przez wyspecjalizowane w tym komórki (komórki M). Korzystną postacią hydroksylowanego fosforanu wapniajest hydroksyapatyt, dostępny w handlu krystaliczny hydroksylowany fosforan wapnia Ca1o(PO4)6(OH)₂.

Dostępny w handlu hydroksyapatyt generalnie ma postać kryształów płytkowych, które są pod względem chemicznym i fizycznym analogiczne do nieorganicznego hydroksyapatytu występującego w normalnej tkance kostnej. Doustne przyjmowanie hydroksyapatytu powinno być zatem bezpieczne, czego dowodem jest istnienie wapniowo-fosforowych suplementów pokarmowych otrzymywanych ze zmielonych kości, które są zaprojektowane do przyjmowania doustnego. Dostępny w handlu wysoko przetworzony hydroksyapatyt (z firmy CalBioChecm) zawiera kryształy o szerokim rozrzucie wielkości. Kryształy o długości powyżej 1 gm nie zostaną prawdopodobnie wchłonięte przez komórki M. Zatem do celów wynalazku dostępny w handlu

174 448 hydroksyapatyt rozbija się na małe, stosunkowo jednorodne fragmenty krystaliczne, na przykład przez sonikację. Korzystnie znaczna część hydroksyapatytu jest obecna w postaci fragmentów o wielkości około 0,01-0,0 pm. Stopień fragmentacji można mierzyć za pomocą mikroskopii elektronowej lub rozproszenia światła, stosując typowe techniki.

Antygen ureazy H. pylori korzystnie podaje się doustnie, donosowo, doodbytniczo lub doocznie. Podawanie doustne może zapewnić dostarczenie do innych błon śluzowych układu żołądkowo-jelitowego, w tym błony śluzowej jelit.

Szczepionka według wynalazku może być podawana do powierzchni błony śluzowej w postaci aerozolu, zawiesiny, kapsułki i/lub czopka. Sposób podawania będzie oczywisty dla specjalisty w tej dziedzinie.

Bierne uodparnianie ssaków, w tym ludzi, przeciwko infekcji Helicobacter osiąga się przez podawanie do powierzchni błony śluzowej pacjenta efektywnej ilości przeciwciała specyficznego dla ureazy, korzystnie efektywnej ilości przeciwciała monoklonalnego lgA specyficznego dla ureazy H. pylori.

Ponieważ wykazano, że ureaza H. pylori przedstawia antygen zaangażowany w indukowanie odporności zabezpieczającej, zastosowano ureazę H. pylori jako reagent diagnostyczny do mierzenia odpowiedzi immunologicznej osób otrzymujących szczepionkę na bazie ureazy lub do ustalania, czy osoba jest uodporniona czy też podatna (a zatem potrzebuje szczepionki). Zastosowano ureazę i przeciwciała specyficzne dla ureazy do konstrukcji testów i zestawów do diagnozy odporności na Helicobacter, oceniano podatności na Helicobacter i określono odpowiedzi immunologiczne na szczepionki.

Poniżej opisano szczep bakteryjny, hodowlę bakteryjną, przygotowanie sonikatów oraz sprzęganie immunogenu z hydroksyapatytem

a) Szczep bakteryjny

H. felis dostarczyła firma J. Fo (oddział Cooperative Medicine, Mass. lnstitute of Technology, Boston, USA). H. pylori wyizolowano od pacjentów chorych na chorobę wrzodową (CHUV, Lozanna, Szwajcaria).

b) Hodowle bakteryjne

Hodowla płynna. - Bakterie namnażano w płynnej pożywce BHl (Brain Heart lnfusion, BioMerieux), zawierającej 0,25% wyciągu z drożdży i 10% cielęcej surowicy płodowej (lnotech), suplementowanej 0,4% dopełniacza selektywnego dla Campylobacter (Oxoid). Bakterie inkubowano przez noc w warunkach mikrofilowych w 37°C, po czym wytrząsano w 37°C przez 2 do 3 dni.

Hodowle na płytkach agarozowych. - Bakterie namnażano na płytce agarowej, składającej się z BHl, 0,25% wyciągu z drożdży i 5% krwi owczej w warunkach mikrofilowych w 37°C przez 3 dni.

Oznaczanie ilościowe. - llość bakterii oznaczano mierząc gęstość optyczną (OD) roztworu BHl przy 660 nm (1 jednostka gęstości optycznej odpowiada 10⁸ bakterii).

c) Przygotowywanie sonikatów

H. pylori zbierano z 30 płytek agarowych z krwią w 0,15 M NaCl i wirowano 5 minut przy 1400 g w 4°C. Paletkę zawieszano ponownie w 3 ml NaCl i sonikowano przez 4 minuty. llość białek oznaczano za pomocą testu Bradforda (zestaw BioRad), zgodnie ze wskazówkami producenta.

d) Sprzęganie immunogenu z hydroksyapatytem lmmunogen (ureazę lub jej podjednostkę) inkubowano z hydroksyapatytem przez 1 godzinę w 4°C. Na jedną mysz stosowano 1,0 mg hydroksyapatytu i 30 pg immunogenu. Pod koniec inkubacji dodawano 10 pg toksyny cholery do objętości końcowej 200 pl PBS.

Próby przeprowadzone na myszach

Próba 1.

Myszy stosowane w badaniach szczepionki przed szczepieniem dożołądkowym poddawano lekkiemu znieczuleniu eterem. Następnie do żołądka myszy dostarczano za pomocą rurki polietylenowej połączonej ze strzykawką preparat sonikatu lub oczyszczanej ureazy, hydroksyapatyt i toksynę cholery, zawieszone w PBS w ilości 200 pl. Procedura ta będzie określana jako szczepienie drogą doustną.

174 448

Badano trzy protokoły szczepienia. Są one opisane poniżej.

Protokół B1 - Szczepienie oczyszczaną ureazą

Myszy samice BALB/c w wieku 6 tygodni (20) szczepiono przez podanie drogą doustną w dniach 0, 7, 14 i 21 30 pg oczyszczanej ureazy H. pylori, 1 mg hydroksyapatytu oraz 10 pg toksyny cholery. Następnie myszy poddawano prowokacji antygenowej 5 x 10⁷ i 10⁸H. felis z hodowli płynnej w dniu 28 i 30.

Protokół B2 - Szczepienie sonikatami Helicobacter

Myszy samice BALB/c w wieku 6 tygodni (20) szczepiono przez podanie drogą doustną w dniach 0,7,14 i 212 mg roztworu sonikatu H. pylori. Następnie myszy poddawano prowokacji antygenowej 5 x K^i 10* H. felis w dniu 28 i 30.

Protokół B3 - Kontrola

Myszy samice BALB/c w wieku 6 tygodni (20) szczepiono przez podanie drogą doustną w dniach 0, 7, 14 i 21 1 g hydroksyapatytu i 10 pg toksyny cholery. Myszy poddawano prowokacji antygenowej 5 x 107i 10⁸ H. felis w dniu 28 i 30.

Dnia 35 myszy zabito i pobrano biopsje z żołądka oraz wydzielinę jelitową i krew.

Uodpornienie i ocena

W celu oceny uodpornienia biopsje żołądka z każdego zwierzęcia poddawano skriningowi na aktywność ureazy za pomocą testu Jatrox HP (Rohm Pharma) zgodnie ze wskazówkami dostawcy. Aktywność ureazy oznaczano ilościowo za pomocą pomiaru spektrofotometrycznego przy 550 nm. Biopsje hodowano również w obecności H. felis i oznaczano przez wybarwianie metodą Grama. Biopsje przedsionka żołądka homogenizowano i rozcieńczano (1:10 i 1:1000) w 0,15 M NaCl i wysiewano na płytkach agarowych z krwią i inkubowano w warunkach mikroaerofilowych w 37°C przez 4 do 10 dni.

Wydzieliny jelitowe i krew analizowano za pomocą testu ELISA w celu oznaczenia miana przeciwciał. Test ELISA prowadzono w sposób następujący. Płytki polistyrenowe (96 dołków) powlekano przez 2 godziny oczyszczaną ureazą w ilości 1 pg/dołek w temperaturze 37°C. Niespecyficzne miejsca wiążące blokowano 5% roztworem mleka w proszku w PBS zawierającym 0,1% Tween w 37°C przez 30 minut. Płytki przemywano raz 0,1 % Tween w PBS. Próbki krwi testowano przy rozcieńczeniu 1:100, a wydzieliny jelitowe 1:1. Do płytek powleczonych antygenem dodawano 100 pl każdej płytki. Po 2 godzinach inkubacji płytki przemyto 3 razy 0,1% Tween w PBS. Dodano pełne biotynylowane kozie przeciwciało anty-mysie i biotynylowane anty-mysie IgA, IgG i IgM (Amersham) (100 pl) w rozcieńczeniu 1:500 a dla IgA 1:250 i inkubowano w 37°C przez 1 godzinę. Płytki przemywano 3 razy 0,1% Tween w PBS, dodawano 100 pl kompleksu streptawidynaperoksydaza z chrzanu w rozcieńczeniu 1:1000 w 0,1 % Tween w PBS i inkubowano w 37°C przez 30 minut. Płytki przemywano 3 razy i dodawano 50 pl o-fenylenodiaminy w rozcieńczeniu 1:50 w buforze cytrynianowym o pH 5,0, zawierającym 1 pl/ml 30% H2 O2 oraz inkubowano w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Dla każdego dołka mierzono absorbancję przy 495 nm.

Próba 2. (patrz również rozdział dotyczący szczepienia drogą doustną za pomocą podjednostki rekombinacyjnej H. pylori).

Myszy stosowane w badaniach szczepionki przed szczepieniem dożołądkowym poddawano lekkiemu znieczuleniu eterem. Następnie 30 pg podjednostki A i B rekombinacyjnej ureazy H. pylori wytwarzanej w E. coli związanej na hydroksyapatycie i suplementowanej toksyną cholery zawieszono w PBS i 200 pl zawiesiny dostarczano do żołądka myszy za pomocą rurki polietylenowej połączonej ze strzykawką. Procedura ta będzie określana jako szczepienie drogą doustną.

Badano trzy protokoły szczepienia. Są one opisane poniżej.

Protokół Cl - Szczepienie podjednostką A ureazy rekombinacyjnej

Myszy samice BALB/c w wieku 6 tygodni (10) szczepiono przez podanie drogą doustną w dniach 0,8,14 i 21 30 pg podjednostki A oczyszczanej ureazy H. pylori, 1 mg hydroksyapatytu oraz 10 pg toksyny cholery. Następnie myszy poddawano prowokacji antygenowej 10⁸ H. felis z hodowli płynnej w dniu 32, 34 i 36.

174 448

Protokół C2 - Szczepienie podjednostką B ureazy rekombinacyjnej

Myszy samice BALSA) w wedu 6 tygodni 110) szczepiono przez podanie drogią doustoą w dniach 0, 8, 14 i 21 30 gg podjednostki B rekombinacyjnej ureazy H. pylori, 1 mg hydroksyapatytu oraz 10 gg toksyny cholery. Następnie myszy poddawano prowokacji antygenowej 10⁸ H. felis z hodowli płynnej w dniu 32, 34 i 36.

Protokół C3 - Kontrola

Myszy samice- BALBAi w weeku 6 y^g^<dc^ni 110) szczepiono precz podanee drogą doustną w ddńaah 0, 8, 14 i 21 1 g hhddoksyapaaytu i 10 gg toksyny chhreey. Myszy podddwann prowokacji antygenowej 10“ H. felis w dniu 32, 34 i 36.

Dnia 42 lub 106 myszy zabito i pobrano wielokrotne biopsje z żołądka.

Uodpornienie i ocena

W celu oheyd uodpornienia biopsje ściany i przedsionka żołądka z każdego zwierzęcia poddawano skoiyiygkwi na aktywność ureazy za pomocą testu JatroK HP (Rohm Pharma) zgodnie ze wskazówkami dostawcy. Aktywność ureazy ozyaczayo ilościowo za pomocą pomiaru taektrofotometrncznego przy 550 nm. Wartości OD otrzymane dla ścianek i przedsionka dodano, otrzymując końcową wartość OD dla każdej, myszy.

Przykład. Przykładową kompozycję szczepionki według wynalazku wytwarza się następująco:

Ekstrakcja

H. pylon z 30 płytek agarowych zbierano w 0,15 M NaCl na lodzie. Roztwór wirowano przez 5 minut w 4°C przy 1400 g. Peletkę zawieszano ponownie w 20 ml H2O i wirowano przez 45 sekund (prędkość maksymalna). Ekstrakt wirowano następnie przez 20 minut w 4°C przy 6700 g. Zbierano supematant i ozypcyano ilość białka (patrz Oyyahyayie ilościowe powyżej) oraz wytrącano 70% siaohzayem amonu.

Oczyszczanie ureazy

Roztwór choomptografowano na kolumnie Sepharose CL-6B (Pharmacia) z PBS (solanka buforowana fosforanem) jako fazą ruchomą. 22 Zebrane frakcje, posiadające silną aktywność ureazy połącyoyo i dializowano przez noc w 4°C wobec 3 litrów PEB (20 nM bufor fosforanowy, pH 7), po czym choomatogoafowayo na wyzokkprzepłnwowej kolumnie Sepharose Q (Pharmacia), stosując PEB jako fazę ruchomą. Frakcje eluowayk gradientem NaCl od 0 do 500 nM NaCl. Dziesięć zebranych frakcji o najwyższej aktywności ureazy poddano indywidualnie elektroforezie na żelu SDS, p następnie wybawianiu błękitem Coomazsie. 6 Frakcji dających 2 różne prążki, odpowiadające MW-63 i 28 KDa zebrano, uznając je za ohzdszcyaną ureazę. 50 mg ureazy HelicobacIeo pylon miesza się z 35 gg adiuwayIu takiego jak toksyna cholery w rozcieńczalniku takim jak roztwór soli w wodzie.

Pozycje literaturowe

I. Blaser, M.J. Castric Campdlobacter-like orga^ms, gaztoitίt and peptic ulcer disease Gaztroenterology 1987, 93, 371-383.

2. Graham, D.Y. CnmpylkbPhter pylori and peptic ulcer dizepze GnzIrkeyterklkgd 1989, 196,615-625.

3. Parsonnet, J. et al Helicobacter pylori iyfehtion in iytesIinal and diffuse-type gastric adenocaohinomat J. Natl. Cancer Inst. 1991, 93, 640-643.

4. Marshall, B.J. et al Attempt to fulfill KochN postulate for pyloric Campylobacter Med. J. Aust. 1985,142, 436-439.

5. Morris, A. et al Ingestion of Campdlobacter pyloridis ca^es gaztritis and raised fasting gaztric pH Am. J. Gastroenteoolkgd, 1987, 82,192-199.

6. Engstrand, L. et al Inohulation of banier-born pigz with Helicobacter pylori: a useful animal model for gaztoitis type B Infect. Immun, 1990, 53, 1763-1768.

7. Fox, J. G. et al Gastric holkniyatioy by hampdlobacter pylori subsp. mustelae in ferret.s'’ Infect. Immun. 1988, 56, 2994-2996.

8. Fox, J. G. et al Helicobacter musIelae-azsociaIed gasIoitiz in ferret.s: an animal model of Helicobacter pylori gaztoitis in humans Ga^^roenterology 1990, 99, 352-361.

174 448

9. Lee, A. et al A small animal model of human Helicobacter pylori active chronic gastritis Gastroeneteroloy 1990, 99, 1315-1323.

10. Fox, J.G. et al Helicobacter felis gastritis in gnotobiotic rats: an animal model of Helicobacter pylori gastritis Infect. Immun. 1991, 59, 785-791.

11. Eaton, K.A. et al Campylobacter pylori virulence factors in gnotobiotic piglets Infect. Immun. 1989, 57, 1119-1125.

12. Peterson, W.L. Helicobacter pylori and peptic ulcer disease N. Engl. J. Med. 1991, 324, 1043-1048.

13. Czinn, S.J. i Nedmd, J.G. Oral immunization against Helicobacter pylori Infect. Immun. 1991, 2359-2363.

14. Brandtzaeg, P. Role of H chain and secretory component in receptor-mediated glandular and hepatic transport of immunoglobulins in man Scand. J. Immunol. 1985, 22, 111-146.

15. Brandtzaeg, P. Production and secreion of immunoglobulins in the gastrointestinal tract Ann. Allergy 1987, 59, 21-39.

16. Wyatt, J.I. Local immune response to gastritic campylobacter in non-ulcer dyspepsia J. Clin. Path. 1986,39, 863-870.

17. Lee, A. et al Pathogenicity of Helicobacter pylori :A. perspective Infect. Immun. 1993,61,1601-1610.

18. Pallen, M.J. i Clayton, C.L. Vaccination against Helicobacter pylori urease, letter Lancet, 1990, 336, 186.

19. Evans, D.J. et al Urease-associated heat shock protein of Helicobacter pylori Infect. Immun. 1992, 60, 2125-2127.

20. Ferrero, R.L. i Lee, A. The importance of urease in acid protection for the gastric-colonizing bacteria Helicobacter pylori and Helicobacter felis sp. nov. Microb. Ecol. Health Dis. 1991,4, 121-134.

21. Chen, et al Immunization against gastric Helicobacter infection in a mouse/Helicobacter felis model, letter Lancet, 1992, 339, 1120-1121.

22. Czinn, S. et al Oral immunization protects germ-free mice against infection from Helicobacterlfelis. Proceedings of the DDW, American Gastroenterological Association, May

10-13, 1992, 1321, A-331.

23. Guo, M. i Liu, P. V. Serological specificities of ureases of Proteus species J. Gen. Microbiol. 1965, 136, 1995-2000.

24. Michetti, P. et al Specificity of mucosal IgAa response in Balb/c mice following H. felis or H. pylori challenges Proceedings of the DDW, American Gastroenterology Association. May 10-13, 1992,1001, A-251.

25. Davin, C. et al. H. pylori urease elicits protection against H. felis infection in mice Proceedings of the DDW, American Gastroenterology Association, May 16-19, 1993, 1213, A-304.

26. Pallen, M.J. i Clayton, C.L. Vaccination against Helicobacter pylori urease. Lancet 1990, 336, 186-7.

27. Pimentel, J.L. i Cook, M.E. Improved growth in the progeny of hens immunized with jackbean urease Poultry Sci. 1988, 64, 434-439.

28. Labigne, A. Sequences of nucleotides coding for a protein having an urease activity. EPO patent application # EPO 0 367 644 Al, 1989. Inti publication # W090/04030, 1990.

29. Clayton, C.L. et al. Nucłeotide sequence of two genes from Helicobacter pylori encoding for urease subunits. Nucleic Acid Res. 1990,18, 362.

30. McGhee, J.R. i Kyono, H. New perspectives in vaccine development: mucosal immunity to infections. Infect Agents Dis. 1993, 2, 55-73.

174 448

FIGURA 3

GRUPA C: MYSZY NIEUODPORNIONE PO SZCZEPIENIU SONIKATEM H.P

FIGURA 4

GRUPA D: MYSZY UODPORNIONE PO SZCZEPIENIU SONIKATEM H.P.

X g

B

22*

FIGURA 5

Szczepienie ·	sonikat H. pylori	ureaza H. pylori	kontrola

Uodpornione 1	3/9	7/10	1/10

*

Dwustronny test Fishera kontrola

174 448

FIGURA 6 ureA i °,8 F

0,4

0,2

- □ ' α	⁰ B _D
. ^α	EL
□ •Β B	E> ^%
	° EJ
□	□
.α _n □	□

□ e—ee0)

6* myszy 10

Czas po zainfekowaniu dni tygodni

myszy 10

Czas po zainfekowaniu dni tygodni

Test Fishera p= 0,003 p= 0,01

174 448

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Szczepionka do wywoływania u ssaka odpowiedzi immunologicznej na infekcję Helicobacter na bazie ureazy, znamienna tym, że zawiera od 10 pg do 100 miligramów ureazy Helicobacter pylori lub Helicobacter felis, lub polipeptyd zawierający jej podjednostkę i od 5 do 50 pg adiuwantu śluzówkowego na dawkę jednostkową w dopuszczalnym farmaceutycznie nośniku Iub rozcieńczalniku.