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WO1998049318A1 - Composition vaccinale anti-helicobacter a base d'adn - Google Patents

Composition vaccinale anti-helicobacter a base d'adn Download PDF

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Publication number
WO1998049318A1
WO1998049318A1 PCT/FR1998/000876 FR9800876W WO9849318A1 WO 1998049318 A1 WO1998049318 A1 WO 1998049318A1 FR 9800876 W FR9800876 W FR 9800876W WO 9849318 A1 WO9849318 A1 WO 9849318A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
helicobacter
pylori
urease
polypeptide
dna molecule
Prior art date
Application number
PCT/FR1998/000876
Other languages
English (en)
Inventor
Jean Haensler
Bruno Guy
Yves Girerd-Chambaz
Original Assignee
Pasteur Merieux Serums & Vaccins
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pasteur Merieux Serums & Vaccins filed Critical Pasteur Merieux Serums & Vaccins
Priority to AU75375/98A priority Critical patent/AU7537598A/en
Publication of WO1998049318A1 publication Critical patent/WO1998049318A1/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/205—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Campylobacter (G)

Definitions

  • the present invention relates to the particular use of a vaccine preparation intended to induce in a mammal, a protective immune response against a pathogenic organism infecting mucous membranes, in particular against the Helicobacter bacteria.
  • Helicobacter is a bacterial genus characterized by gram negative spiral bacteria. Several species colonize the gastrointestinal tract of mammals. We cite in particular H. pylori, H. heilmanii, H. felis and H. mustelae. Although H. pylori is the species most commonly associated with human infections, in some rare cases, H. heilmanii and H. felis have been isolated from humans. A Helicobacter type bacterium, Gastrospirillum hominis has also been described in humans.
  • Helicobacter infects more than 50% of the adult population in developed countries and almost 100% of that of developing countries; making it one of the predominant infectious agents worldwide.
  • H. pylori is found exclusively to date on the surface of the stomach lining in humans and more particularly around crater lesions of gastric and duodenal ulcers. This bacterium is currently recognized as the etiological agent of antral gastritis and appears as one of the cofactors required for the development of ulcers. Furthermore, it seems that the development of gastric carcinomas may be associated with the presence of H. pylori.
  • a variant of these methods consists in carrying out a primary immunization by the systemic route before administering the antigen by the nasal route.
  • the antigen most often a bacterial lysate or a purified protein, is combined with an appropriate adjuvant such as cholera toxin (CT) or heat-labile toxin (LT) of E. coli.
  • CT cholera toxin
  • LT heat-labile toxin
  • the humoral response which is observed is predominantly of the IgA type. This indicates that there was a local immune response.
  • IgA indicates the implementation of a response from T-helper type 2 lymphocytes (Th2 response).
  • T-helper lymphocytes by a particular antigen makes it possible to obtain different sub-populations of T-helper cells, characterized by different synthesis profiles of cyto ines.
  • Thl cells in particular selectively produce interleukin-2 (IL-2) and interferon- ⁇ (INF- ⁇ ), while Th2 cells preferably secrete IL-4, -5, and -10 .
  • IL-2 interleukin-2
  • IFN- ⁇ interferon- ⁇
  • Th2 cells preferably secrete IL-4, -5, and -10 .
  • cytokines these two types of T-helper cells have distinct roles: Th l cells promote cell-mediated immunity ia an inflammatory response, while Th2 cells stimulate humoral response from type IgA, IgE and certain subclasses of IgG.
  • cytokines produced by mouse Thl cells can stimulate the antibody response and in particular that IFN- ⁇ induces an IgG2a response.
  • a DNA-based vaccination promotes the induction of a Th1 response at a significant level. It has now been demonstrated that by carrying out a DNA-based vaccination against Helicobacter, it is possible to obtain a level of protection similar or higher than that observed when using an antigen eg, by the mucosa.
  • composition comprising a DNA molecule comprising a sequence coding for a peptide or polypeptide derived from Helicobacter placed under the control of the elements necessary for its expression in a mammalian cell;
  • Helicobacter and (iii) a method for preventing or treating a Helicobacter infection in a mammal, according to which said mammal is administered a DNA molecule comprising a sequence coding for a peptide or polypeptide derived from Helicobacter placed under the control of the elements necessary for its expression in a mammalian cell, a method by which said mammal is protected against Helicobacter infection or by which the infectious load of Helicobacter is reduced in said mammal.
  • the mammal for which the pharmaceutical composition or method is intended is advantageously a primate, preferably a human.
  • the administration of the DNA molecule is repeated one or more times, preferably at least twice, in order to induce the desired immune response.
  • a preferred therapeutic method is one by which the infectious load of Helicobacter is removed.
  • the systemic route is advantageously used, and preferably exclusively.
  • the DNA molecule can advantageously be a plasmid which is unable both to replicate and to integrate substantially in the genome of a mammal.
  • the coding sequence cited above is placed under the control of a promoter allowing expression in a mammalian cell.
  • This promoter can be ubiquitous or specific for a tissue.
  • ubiquitous promoters mention is made of the early promoter of Cytomegalovirus (described in US Patent No. 4, 168,062) and the promoter of Rous sarcoma virus (described in Norton & Coffin, Molec. Cell. Biol. (1985) 5 : 281).
  • the desmin promoter (Li et al, Gene (1989) 78: 244443; Li & Paulin, J. Biol. Chem.
  • the polypeptide derived from Helicobacter which can be expressed by a DNA molecule according to the invention can be any polypeptide from Helicobacter eg, of H. pylori. It can in particular be a polypeptide present in the cytoplasm, a polypeptide of the internal or external membrane or a polypeptide secreted in the external medium.
  • Many Helicobacter polypeptides have already been described in the literature, either by reference to their amino acid sequence deduced from the sequence of the corresponding cloned or identified gene, or by reference to a purification process which makes it possible to obtain them in the form isolated from the rest of their natural environment.
  • polypeptides are also described in WO 96/40893, WO 96/33274, WO 96/25430 and WO 96/33220.
  • a polypeptide useful for the purposes of the present invention may be identical or similar to one of those cited in the reference insofar as it is capable of promoting an immune response against Helicobacter. Provided this latter condition is met, the immunogenic agent can also be a peptide derived from a polypeptide cited in reference.
  • a DNA molecule useful for the purposes of the present invention comprises a sequence coding for a polypeptide selected from the UreA and UreB subunits of the urease of Helicobacter, in particular of H. pylori (see WO 90/4030).
  • the DNA molecule comprises a first sequence coding for the A subunit of the Helicobacter urease, in particular of H. pylori, and a second sequence coding for the subunit B of the urease of Helicobacter, in particular of H. pylori; each sequence being placed under the control of the elements necessary for its expression in a mammalian cell.
  • Any chain of amino acids whose size is less than about 50 amino acids is called a "peptide".
  • polypeptide is used which is also interchangeable with the term "protein”.
  • a peptide or polypeptide useful for the purposes of the present invention can be identical or similar to that existing under natural conditions. It is similar in that it is capable of inducing an immune response of the same nature but it may include certain structural variations such as for example a mutation, the addition of a residue of lipid nature or else be in the form of a peptide. or fusion polypeptide.
  • a DNA molecule may also have an additional sequence encoding a cytokine, for example a lymphokine such as interleukin-2 or -12, under the control of elements suitable for expression in a mammalian cell.
  • a cytokine for example a lymphokine such as interleukin-2 or -12
  • An alternative to this option also consists in adding to a pharmaceutical composition useful for the purposes of the present invention comprising a DNA molecule or a vector, another molecule or viral vector coding for a cytokine.
  • the nucleotide molecule e.g. the DNA molecule can be formulated or not.
  • the choice of formulation is very varied.
  • the DNA can simply be diluted in a physiologically acceptable solution with or without a carrier. When the latter is present, it can be isotonic or weakly hypertonic and have low ionic strength. For example, these conditions can be fulfilled with a sucrose solution e.g. 20%.
  • the polynucleotide can be combined with agents which promote entry into the cell. It can be (ii) a chemical agent which modifies cell permeability, such as bupivacaine (see for example WO 94/16737) or (ii) an agent which associates with the polynucleotide and acts as a vehicle facilitating the transport of the polynucleotide .
  • the latter may in particular be cationic polymers e.g. polylysine or a polyamine e.g. derivatives of spermine (see WO 93/18759). They can also be fusogenic peptides e.g. GALA or Gramicidine S (see WO 93/19768) or even peptides derived from viral fusion proteins.
  • Anionic or neutral lipids have been known for a long time as being able to serve as transport agents, for example in the form of liposomes, to a large number of compounds including polynucleotides. A detailed description of these liposomes, their constituents and their manufacturing processes is for example provided by Liposomes: A Practical Approach, RPC New Ed, IRL press (1990).
  • Cationic lipids are also known and commonly used as transport agents for polynucleotides.
  • Lipofectin TM also known under the name of DOTMA (N- [l- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N- trimethylammoniu chloride), DOTAP (1,2-bis (oleyloxy ) -3- (trimethylamrnonio) propane), DDAB (dimethyldioctadecylammonium bromide), DOGS (dioctadecylamidoglycyl spermine) and cholesterol derivatives such as DC-chol (3 beta - (N- (N ', N'-dimethyl aminoethane) -carbamoyl) cholesterol).
  • lipids A description of these lipids is provided by EP 187,702, WO 90/1 1092, US Patent No. 5,283,185, WO 91/15501, WO 95/26356 and US Patent No. 5,527,928.
  • the cationic lipids are preferably used with a neutral lipid such as DOPE (dioleyl phosphatidylethanolamine) as is for example described in WO 90/1 1092.
  • DOPE dioleyl phosphatidylethanolamine
  • Gold or tungsten microparticles can also be used as transport agents, as described in WO 91/359, WO 93/17706 and Tang et al, Nature (1992) 3_56: 152.
  • the polynucleotide is precipitated on the microparticles in the presence of calcium chloride and spermidine then the whole is administered by high-speed jet in the dermis or in the epidermis, using a device without a needle such as those described in US Pat. Nos. 4,945,050 and No. 5,015,580 and WO 94/24243.
  • the amount of DNA that can be used to vaccinate an individual depends on a number of factors such as for example the strength of the promoter used to express the antigen, the immunogenicity of the product expressed, the condition of the mammal to which is intended for administration (eg, weight, age, and general health), method of administration and type of formulation.
  • administration by the intramuscular route requires a larger amount of DNA than administration by the intradermal route using a needle-free device.
  • a dose suitable for prophylactic or therapeutic use in an adult of the human species is from approximately 1 ⁇ g to approximately 5 mg, preferably from approximately 10 ⁇ g to approximately 1 mg, and very particularly preferably from about 25 ⁇ g to about 500 ⁇ g.
  • a pharmaceutical composition according to the present invention can contain a single DNA molecule according to the invention or more, each comprising a sequence coding for a different polypeptide.
  • An alternative to the latter possibility is to use a single DNA molecule but comprising several sequences, each coding for a particular polypeptide.
  • a pharmaceutical composition according to the present invention can also contain compounds other than the immunogenic agent itself, the nature of these compounds depending to a certain extent on the route of administration. So as already seen above, the pharmaceutical composition can include different formulating agents. For information, it is indicated that, in general, a DNA molecule may not require the addition of an adjuvant.
  • the therapeutic or prophylactic efficacy of a composition, method or use according to the invention can be evaluated according to standard methods eg, by measuring the induction of an immune response or the induction of therapeutic immunity or protective using eg, the mouse / H. felis model and the procedures described in Lee et al, Eur. J. Gastroenterology & ⁇ epatology (1995) 7: 303 or Lee et al, J. Infect. Say. (1995) 172: 161.
  • H. felis can be replaced in the mouse model by another species of Helicobacter.
  • pylori is preferably evaluated in a mouse model using a strain of H pylori adapted to the mouse. Efficacy can be determined by comparing the degree of infection in the gastric tissue (by measuring urease activity, bacterial load, or gastritis status) to that of a control group. There is a therapeutic or protective effect when the infection is reduced compared to the control group.
  • a pharmaceutical composition according to the present invention can be manufactured in a conventional manner.
  • it can be formulated with a pharmaceutically acceptable diluent or carrier, e.g., water or saline.
  • a pharmaceutically acceptable diluent or carrier e.g., water or saline.
  • the diluent or carrier can be selected depending on the mode and route of administration and according to standard pharmaceutical practices. Appropriate carriers or diluents as well as what is essential for the development of a pharmaceutical composition are described in Remington's Pharmaceutical Sciences, a standard reference book in this field.
  • a composition, method or use according to the invention can be used to treat or prevent i.a. Helicobacter infections, in particular H. pylori infections and therefore, gastroduodenal diseases associated with these infections, including acute, chronic or atrophic gastritis, peptic ulcers e.g., gastric or duodenal ulcers.
  • a composition according to the invention can be administered by any conventional route of administration used in the field of vaccines.
  • the systemic route ia is used, the parenteral route which even can be chosen from the intravenous, intramuscular, intradermal, intraepidermal and subcutaneous routes; the latter four, however, being preferred to the intravenous route.
  • the operation which consists in administering a pharmaceutical composition according to the present invention can be repeated one or more times, leaving a certain time interval between each administration; interval which is of the order of the week or the month. Its precise determination is within the reach of those skilled in the art and may vary depending on various factors such as the nature of the immunogenic agent, the age of the individual, etc.
  • the same route of administration is used for the primoimmunization and the boosters, we speak of administration by strict route e.g., by strict systemic route.
  • a method in which the administration of the immunogenic agent is carried out by a strict systemic route is defined as a method which does not involve a route of administration other than the systemic route.
  • a method in which the immunogenic agent is administered by the systemic route and by the mucous route does not meet the definition given above.
  • a method in which the administration of the immunogenic agent is carried out by a strict systemic route must be understood as a method in which the immunogenic agent is administered by a systemic route excluding any other route, in particular the mucosal route.
  • a vaccination scheme is evoked which consists in administering a DNA molecule comprising a sequence coding for the A subunit and a sequence coding eg, for the B subunit of the apoenzyme of l urease three times intramuscularly, in the dorso-lumbar region with an interval of three to four weeks between each administration.
  • a method comprising several concomitant or consecutive administration steps (in the latter case, one speaks of primary immunization followed by one or more reminders); and in particular (a) a first step which consists in administering to a mammal, a DNA molecule useful for the purposes of the present invention and (b) a second step which consists in administering to said mammal a peptide or polypeptide in purified form derived from 'Helicobacter which preferably corresponds to the coding sequence derived from Helicobacter of the DNA molecule.
  • Said first step can be used as a booster or as a primary immunization; the latter mode being preferred.
  • a vaccination protocol according to which a first DNA immunization coding for UreA and UreB is administered systemically, followed by one or more reminders consisting in particular in administering apoenzyme mucosal urease eg, oral.
  • kits composition comprising, for concomitant or consecutive administration, (a) a first product containing a DNA molecule useful for the purposes of the present invention, preferably formulated for systemic administration and (b) a second product containing a purified peptide or polypeptide derived from Helicobacter; preferably provided that the DNA molecule contains a sequence coding for the peptide or the polypeptide present in the second product.
  • a method according to which a concomitant or consecutive administration is carried out (a) a DNA molecule useful for the purposes of the present invention, preferably by the systemic route and (b) a peptide or polypeptide in purified form derived from Helicobacter; preferably provided that the DNA molecule comprises a sequence coding for the peptide or the polypeptide administered concomitantly or consecutively.
  • the peptide or polypeptide in purified form can be administered by all the conventional routes and in particular by all systemic routes e.g., intramuscular, subcutaneous, intraepidermal and intravenous; and mucous membranes e.g. via the ocular, oral nasal route e.g. buccal or gastric, pulmonary, intestinal, rectal, vaginal or urinary.
  • systemic routes e.g., intramuscular, subcutaneous, intraepidermal and intravenous
  • mucous membranes e.g. via the ocular, oral nasal route e.g. buccal or gastric, pulmonary, intestinal, rectal, vaginal or urinary.
  • Figure 1 refers to the experiments described in the example below and shows the levels of urease activity measured 4 to 6 weeks after the test.
  • the mice received beforehand the plasmids VR-ureA and VR-ureB, in the dorso- muscles. lumbar (a), or in the quadriceps (b) or the plasmid VR-ureB alone, in the quadriceps (c).
  • the standard reference group mice received recombinant urease associated with cholera toxin, intragastrically (d). Groups (e) and (f) correspond respectively to the positive (infection, without immunization) and negative (no infection) controls.
  • Figure 2 shows a schematic map of plasmid VR1012 described in Hartikka et al, supra.
  • mice 6/8 week old Swiss female mice were supplied by Janvier (France). For the duration of the experiment, sterilized equipment was used; the cages were protected by "isocaps"; the mice were fed filtered water and irradiated food.
  • Plasmids were obtained by insertion into the polylinker of plasmid VR1012 ( Figure 2) located between the CMV promoter and the polyadenylation sequence, of a DNA fragment obtained by PCR (polymerase chain reaction) from the H genome . pylori and coding for UreA and UreB respectively.
  • a strain of £. coli was transformed with each of these plasmids and then the two transformants were cultured in a conventional manner.
  • the plasmids thus amplified were harvested in the usual way by alkaline lysis followed by an isopicnic gradient in cesium chloride. The DNA was taken up either in distilled water or in physiological water (0.9% NaCl).
  • the apoenzyme of H urease. pylori was expressed in E. coli and purified as described in Example 5 of WO96 / 31235. In the following text to designate this apoenzyme, the simple term urease is used.
  • the cholera toxin comes from Pasteur Mérieux serums & vaccines. Administration protocol
  • mice are made up of groups of 8 to 10 mice and receive 3 doses of the same product; each dose in a volume of 50 ⁇ l and 28 days apart (days 0, 28 and 56).
  • the different protocols are as follows:
  • mice Two weeks after the second booster, the mice were subjected to gastric gavage with 300 ⁇ l of a suspension of an H. strain. pylori adapted to the mouse, the ORV2002 strain (1.6 x 10 6 live bacteria in 200 ⁇ l of PBS; OD 550 of approximately 0.5). A group having received no dose of antigen and serving as a control is likewise tested.
  • mice Six weeks after the test, the mice were sacrificed by rupture of the cervical vertebrae. The stomachs were removed to assess urease activity. Urease activity was evaluated after 4 and 24 hours (OD at 550 nm) with the Jatrox test, Procter & Gamble) and after 24 hours the number of mice still negative was noted.
  • Figure 1 shows that whatever the plasmid composition used, a significant reduction in the infectious load is observed compared to the positive control group. The best results are obtained when the two plasmids comprising ureA and ureB are administered.
  • mice which are still negative for urease activity 24 hrs after being sacrificed are reported in FIG. 2 and it is indicated that the number of mice which are still negative for urease activity 24 hrs after being sacrificed is (a) 2/9, (b) 2/9, (c) l / 9, (d) 1/8, (e) 0/10 and ( f) 5/5.

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Abstract

L'invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant une molécule d'ADN comportant une séquence codant pour un peptide ou polypeptide dérivé d'Helicobacter, notamment d'H. pylori, placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule de mammifère. Le polypeptide peut notamment être la sous-unité A ou B de l'uréase d'Helicobacter, notamment d'H. pylori. Une telle composition est destinée à traiter ou à prévenir une infection à Helicobacter, notamment à H. pylori.

Description

Composition vaccinale anti-Helicobacter à base d'ADN
La présente invention a pour objet l'usage particulier d'une préparation vaccinale destinée à induire chez un mammifère, une réponse immunitaire protectrice à l'encontre d'un organisme pathogène infectant des muqueuses, notamment à l'encontre des bactéries Helicobacter.
Helicobacter est un genre bactérien caractérisé par des bactéries spiralées à gram négatif. Plusieurs espèces colonisent le tractus gastrointestinal des mammifères. On cite en particulier H. pylori, H. heilmanii, H. felis et H. mustelae. Bien qu'H. pylori soit l'espèce la plus communément associée aux infections humaines, dans certains cas rares, H. heilmanii et H. felis ont pu être isolés chez l'homme. Une bactérie de type Helicobacter, Gastrospirillum hominis a également été décrite chez l'homme.
Helicobacter infecte plus de 50 % de la population adulte dans les pays développés et près de 100 % de celle des pays en voie de développement ; ce qui en fait un des agents infectieux prédominants au plan mondial.
H. pylori est retrouvée exclusivement à ce jour à la surface de la muqueuse de l'estomac chez l'homme et plus particulièrement autour des lésions de cratère des ulcères gastriques et duodénaux. Cette bactérie est à l'heure actuelle reconnue comme l'agent étiologique des gastrites antrales et apparaît comme un des cofacteurs requis pour le développement des ulcères. Par ailleurs, il semble que le développement des carcinomes gastriques puisse être associé à la présence d'H. pylori.
Il apparaît donc hautement souhaitable de mettre au point un vaccin en vue de prévenir ou de traiter les infections à Helicobacter.
A ce jour, plusieurs protéines d 'Helicobacter ont déjà été proposées comme antigène vaccinal et la méthode de vaccination qui est couramment préconisée consiste à délivrer l'antigène au niveau de la muqueuse gastrique, c'est-à-dire à l'endroit même où la réponse immune est souhaitée. Pour ce faire, l'administration par voie orale a donc été retenue.
Toujours dans le même but (induction d'une réponse immunitaire au niveau de l'estomac), il a été proposé plus récemment, de délivrer l'antigène en un site muqueux autre que la muqueuse gastrique ; tel que par exemple la muqueuse nasale ou rectale (WO 96/31235). Des lymphocytes stimulés par l'antigène en un territoire muqueux dit inducteur peuvent migrer et circuler de manière sélective pour aller induire une réponse immunitaire en d'autres territoires muqueux, dits effecteurs.
Une variante de ces méthodes consiste à effectuer une primo-immunisation par voie systémique avant d'administrer l'antigène par voie nasale.
Pour administration par voie muqueuse, l'antigène, le plus souvent un lysat bactérien ou une protéine purifiée, est associé à un adjuvant approprié comme la toxine cholérique (CT) ou la heat-labile toxine (LT) d'E. coli.
Lorsque l'administration par voie muqueuse est mise en oeuvre, la réponse humorale que l'on observe, est de manière prédominante de type IgA. Ceci indique bien qu'il y a eu une réponse immunitaire locale.
Certains auteurs ont pensé très tôt qu'il existait une bonne corrélation entre une forte réponse de type IgA et un effet protecteur (Czinn et al, Vaccine (1993) JJ_ : 637). D'autres ont émis un avis plus réservé (Bogstedt et al, Clin. Εxp. Immunol. (1996) 105 : 202). Bien qu'il n'existe pas à ce jour de véritable certitude concernant ce sujet, l'induction d'anticorps qui soient notamment de type IgA, apparaît quoi qu'il en soit souhaitable pour la plupart des auteurs.
De manière générale, l'apparition des IgA témoigne de la mise en oeuvre d'une réponse de la part des lymphocytes T-helper de type 2 (réponse Th2).
En effet, la stimulation des lymphocytes T-helper par un antigène particulier permet d'obtenir différentes sous-populations de cellules T-helper, caractérisées par des profils de synthèse de cyto ines différents.
Les cellules Thl produisent notamment de manière sélective l'interleukine-2 (IL-2) et l'interféron-γ (INF-γ), tandis que les cellules Th2 sécrètent de préférence l'IL-4, -5, et -10. En raison de leur production différentiée de cytokines, ces deux types de cellules T-helper ont des rôles distincts : les cellules Th l favorisent l'immunité à médiation cellulaire i.a. une réponse de type inflammatoire, tandis que les cellules Th2 stimulent la réponse humorale de type IgA, IgE et de certaines sous- classes d'IgG. On sait aussi que les cytokines produites par des cellules Thl de souris peuvent stimuler la réponse anticorps et en particulier que l'IFN-γ induit une réponse IgG2a.
Ainsi, des différentes études de l'art antérieur, émerge l'opinion selon laquelle l'induction d'une réponse Th2 caractérisée par l'apparition d'IgA est indispensable, sinon suffisante, afin d'obtenir un effet protecteur.
De manière surprenante, on a maintenant découvert que, même si une réponse Th2 ne nuit pas, il est aussi nécessaire d'induire une forte réponse Thl. En effet, des résultats expérimentaux démontrent maintenant qu'un effet protecteur peut-être corrélé plus aisément avec une réponse Thl qu'avec une réponse Th2.
Contrairement à ce qui était initialement recherché (D'Elios et al, J. Immunol. (1997) 158 : 962), la présente demande révèle donc l'importance d'induire une réponse Thl de type inflammatoire au moment de l'immunisation, sans laquelle on ne peut observer d'effet protecteur.
On peut parvenir à induire une réponse Thl à l'encontre d'Helicobacter en jouant sur un certain nombre de facteurs, comme par exemple la nature de l'agent immunogène. Ainsi, on sait que dans la majorité des cas, une vaccination à base d'ADN favorise l'induction d'une réponse Thl à un niveau significatif. On a maintenant mis en évidence qu'en effectuant une vaccination à base d'ADN à l'encontre d'Helicobacter, on peut obtenir un taux de protection similaire ou supérieur à celui observé lorsque l'on utilise un antigène e.g., par la voie muqueuse.
C'est pourquoi l'invention a notamment pour objet
(i) une composition pharmaceutique comprenant une molécule d'ADN comportant une séquence codant pour un peptide ou polypeptide dérivé d'Helicobacter placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule de mammifère ;
(ii) l'usage d'une molécule d'ADN comportant une séquence codant pour un peptide ou polypeptide dérivé d'Helicobacter placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule de mammifère, dans la fabrication d'un médicament destiné à traiter ou prévenir une infection à
Helicobacter ; et (iii) une méthode pour prévenir ou traiter une infection à Helicobacter chez un mammifère, selon laquelle on administre audit mammifère, une molécule d'ADN comportant une séquence codant pour un peptide ou polypeptide dérivé d 'Helicobacter placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule de mammifère, méthode par laquelle ledit mammifère est protégé contre une infection à Helicobacter ou par laquelle la charge infectieuse d'Helicobacter est réduite chez ledit mammifère.
Le mammifère auquel est destinée la composition pharmaceutique ou la méthode est avantageusement un primate, de préférence un humain.
En ce qui concerne la méthode, on indique que, de manière avantageuse, l'administration de la molécule d'ADN est répétée une ou plusieurs fois, de préférence au moins deux fois, pour que soit induite la réponse immune recherchée. Une méthode thérapeutique préférée est une méthode par laquelle la charge infectieuse d'Helicobacter est éliminée. Dans le cadre de la méthode selon l'invention, on utilise avantageusement la voie systémique, et de préférence de manière exclusive.
La molécule d'ADN peut avantageusement être un plasmide qui est incapable à la fois de se répliquer et de s'intégrer de manière substantielle dans le génome d'un mammifère. La séquence codante citée ci-dessus est placée sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression dans une cellule de mammifère. Ce promoteur peut être ubiquitaire ou spécifique d'un tissu. Parmi les promoteurs ubiquitaires, on cite le promoteur précoce du Cytomegalovirus (décrit dans le brevet US n° 4, 168,062) et le promoteur du virus du sarcome de Rous (décrit dans Norton & Coffin, Molec. Cell. Biol. (1985) 5 : 281). Le promoteur desmine (Li et al, Gène (1989) 78 : 244443 ; Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1993) 268 : 10403) est un promoteur sélectif permet l'expression dans les cellules musculaires et aussi dans les cellules de la peau. Un promoteur spécifique des cellules musculaires est par example le promoteur du gène de la myosine ou de la dystrophine. Des vecteurs plasmidiques que l'on peut utiliser aux fins de la présente invention sont décrits i.a., dans WO 94/21797 et Hartikka et al, Human Gène Therapy ( 1996) 7 : 1205.
Le polypeptide dérivé d'Helicobacter qui peut être exprimé par une molécule d'ADN selon l'invention peut être n'importe quel polypeptide d'Helicobacter e.g., d'H. pylori. Il peut notamment s'agir d'un polypeptide présent dans le cytoplasme, d'un polypeptide de la membrane interne ou externe ou d'un polypeptide sécrété dans le milieu extérieur. De nombreux polypeptides d'Helicobacter ont déjà été décrits dans la littérature, soit par référence à leur séquence d'acides aminés déduites de la séquence du gène correspondant clone ou identifié, soit par référence à un procédé de purification qui permet de les obtenir sous forme isolée du reste de leur environnement naturel. A titre indicatif, on cite en particulier les document suivants : WO 94/26901 and WO 96/34624 (ΗspA), WO 94/09023 (CagA), WO 96/38475 (ΗpaA), WO 93/181 150 (cytotoxine), WO 95/27506 et Ηazell et al, J. Gen. Microbiol. (1991) 137 : 57 (catalase), FR 2 724 936 (récepteur membranaire de la lactoferrine humaine), WO 96/41880 (AlpA), EP 752 473 (FibA) and O'Toole et al, J. Bact. ( 1991 ) 173 : 505 (TsaA). D'autres polypeptides sont aussi décrits dans WO 96/40893, WO 96/33274, WO 96/25430 et WO 96/33220. Un polypeptide utile aux fins de la présente invention peut être identique ou similaire à l'un de ceux cités en référence dans la mesure où il est capable de promouvoir une réponse immune à l'encontre d'Helicobacter. A condition de remplir cette dernière condition, l'agent immunogène peut aussi être un peptide dérivé d'un polypeptide cité en référence.
De manière avantageuse, une molécule d'ADN utile aux fins de la présente invention comporte une séquence codant pour un polypeptide sélectionné parmi les sous-unités UreA et UreB de l'uréase d'Helicobacter, notamment d'H. pylori (voir WO 90/4030). De préférence, la molécule d'ADN comporte une première séquence codant pour la sous-unité A de l'uréase d'Helicobacter, notamment d'H. pylori, et une deuxième séquence codant pour la sous-unité B de l'uréase d'Helicobacter, notamment d'H. pylori ; chaque séquence étant placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule de mammifère.
On appelle "peptide" toute chaîne d'acides aminés dont la taille est inférieure à environ 50 acides aminés. Lorsque la taille est supérieure, on utilise le terme de "polypeptide" qui est aussi interchangable avec le terme "protéine". Un peptide ou polypeptide utile aux fins de la présente invention peut être identique ou similaire à celui existant dans les conditions naturelles. Il est similaire en ce qu'il est capable d'induire une réponse immune de la même nature mais il peut comporter certaines variations structurelles comme par exemple une mutation, l'adjonction d'un résidu de nature lipidique ou bien être sous forme de peptide ou de polypeptide de fusion. Une molécule d'ADN peut aussi comporter une séquence additionnelle codant pour une cytokine, par exemple une lymphokine telle que l'interleukine-2 ou -12, sous le contrôle d'éléments appropriés pour expression dans une cellule de mammifère. Une alternative à cette option consiste aussi à ajouter dans une composition pharmaceutique utile aux fins de la présente invention comprenant une molécule d'ADN ou un vecteur, une autre molécule ou vecteur viral codant pour une cytokine.
Dans une composition pharmaceutique selon la présente invention, la molécule nucléotidique e.g. la molécule d'ADN peut être formulée ou non. Le choix de la formulation est très varié. L'ADN peut être simplement dilué dans une solution acceptable d'un point de vue physiologique avec ou sans porteur. Lorsque ce dernier est présent, il peut être isotonique ou faiblement hypertonique et avoir basse force ionique. Par exemple, ces conditions peuvent être remplies par une solution de sucrose e.g. à 20 %.
De manière alternative, le polynucléotide peut être associé avec des agents qui favorise l'entrée dans la cellule. Ce peut être (ii) un agent chimique qui modifie la perméabilité cellulaire, telle que la bupivacaine (voir par exemple WO 94/16737) ou (ii) un agent s'associant au polynucléotide et agissant en tant que véhicule facilitant le transport du polynucléotide. Ce dernier peut être notamment des polymères cationiques e.g. de la polylysine ou une polyamine e.g. des dérivés de la spermine (voir WO 93/18759). Ce peut être également des peptides fusogéniques e.g. du GALA ou de la Gramicidine S (voir WO 93/19768) ou bien encore des peptides dérivés des protéines de fusion virales.
Il peut aussi s'agir de lipides anioniques ou cationiques. Les lipides anioniques ou neutres sont connus depuis longtemps comme pouvant servir d'agents de transport, par exemple sous forme de liposomes, à un grand nombre de composés y compris les polynucléotides. Une description détaillée de ces liposomes, de leurs constituants et de leurs procédés de fabrication est par exemple fournit par Liposomes : A Practical Approach, RPC New Ed, IRL press (1990).
Les lipides cationiques sont aussi connus et communément utilisés comme agents de transport pour les polynucléotides. On cite par exemple la Lipofectin™ aussi connue sous le nom de DOTMA (N-[l-(2,3-dioleyloxy) propyl]-N,N,N- trimethylammoniu chloride), le DOTAP (l,2-bis(oleyloxy)-3-(trimethylamrnonio) propane), le DDAB (dimethyldioctadecylammonium bromide), le DOGS (dioctadecylamidoglycyl spermine) et les dérivés du cholestérol tel que le DC-chol (3 bêta -(N-(N',N'-dimethyl aminoethane)-carbamoyl) cholestérol). Une description de ces lipides est fournie par EP 187,702, WO 90/1 1092, le brevet US N° 5,283,185, WO 91/15501, WO 95/26356 et le brevet US N° 5,527,928. Les lipides cationiques sont utilisés de préférence avec un lipide neutre tel que la DOPE (dioleyl phosphatidylethanolamine) comme cela est par exemple décrit dans WO 90/1 1092.
Des microparticules d'or ou de tungstène peuvent aussi être utilisées comme agents de transport, tel que c'est décrit dans WO 91/359, WO 93/17706 et Tang et al, Nature (1992) 3_56 : 152. Dans ce cas là, le polynucléotide est précipité sur les microparticules en présence de chlorure de calcium et de spermidine puis l'ensemble est administré par jet à haute vitesse dans le derme ou dans l'épiderme, à l'aide d'un appareil sans aiguille tel que ceux décrits dans les brevets US N° 4,945,050 et N° 5,015,580 et WO 94/24243.
La quantité d'ADN qui peut être utilisée pour vacciner un individu dépend d'un certains nombre de facteurs tels que par exemple la force du promoteur utilisé afin d'exprimer l'antigène, l'immunogénicité du produit exprimé, la condition du mammifère auquel est destinée l'administration (e.g., le poids, l'âge, et l'état de santé général), le mode d'administration et le type de formulation. On indique en particulier, que l'administration par voie intramusculaire requiert une quantité d'ADN plus importante que l'administration par voie intradermique à l'aide d'un appareil sans aiguille. En général une dose appropriée à un usage prophylactique ou thérapeutique chez un adulte de l'espèce humaine est d'environ 1 μg à environ 5 mg, de préférence d'environ 10 μg à environ 1 mg, et de manière tout particulièrement préférée d'environ 25 μg à environ 500 μg.
Une composition pharmaceutique selon la présente invention peut contenir une unique molécule d'ADN selon l'invention ou plusieurs, chacune comportant une séquence codant pour un polypeptide différent. Une alternative à cette dernière possibilité consiste à utiliser une molécule d'ADN unique mais comportant plusieurs séquences, chacune codant pour un polypeptide particulier.
Une composition pharmaceutique selon la présente invention peut en outre contenir des composés autres que l'agent immunogène lui-même, la nature de ces composés dépendant dans une certaine mesure La., de la voie d'administration. Ainsi comme on l'a déjà vu précédemment, la composition pharmaceutique peut inclure différents agents de formulation. A titre d'information, on indique que d'une manière générale, une molécule d'ADN peut ne pas réquérir l'adjonction d'un adjuvant.
L'efficacité thérapeutique ou prophylactique d'une composition, méthode ou d'un usage selon l'invention peut être évaluée selon des méthodes standard e.g., en mesurant l'induction d'une réponse immune ou l'induction d'une immunité thérapeutique ou protectrice en utilisant e.g., le modèle souris / H. felis et les procédures décrits dans Lee et al, Eur. J. Gastroenterology & Ηepatology (1995) 7 : 303 ou Lee et al, J. Infect. Dis. (1995) 172 : 161. L'homme de l'art s'avisera que H. felis peut être remplacé dans le modèle souris par une autre espèce d'Helicobacter. Par exemple, l'efficacité d'un agent immunogène dérivé d'H. pylori est de préférence évalué dans un modèle souris mettant en oeuvre une souche d'H pylori adaptée à la souris. L'efficacité peut être déterminée en comparant le degré d'infection dans le tissu gastrique (en mesurant l'activité uréase, la charge bactérienne ou l'état de la gastrite) à celui d'un groupe contrôle. Il y a effet thérapeutique ou effet protecteur lorsque l'infection est réduite par comparaison au groupe contrôle.
Une composition pharmaceutique selon la présente invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, elle peut être formulée avec un diluent ou un porteur acceptable d'un point de vue pharmaceutique e.g., de l'eau ou une solution saline. En général, le diluent ou le porteur peut être sélectionné en fonction du mode et de la voie d'administration et selon les pratiques pharmaceutiques standard. Des porteurs ou des diluents appropriés ainsi que ce qui est indispensable à l'élaboration d'une composition pharmaceutique sont décrits dans Remington's Pharmaceutical Sciences, un livre de référence standard dans ce domaine.
Une composition, méthode ou un usage selon l'invention peut être mis en oeuvre pour traiter ou prévenir i.a. les infections à Helicobacter, notamment à H. pylori et par conséquent, les maladies gastroduodénales associées à ces infections, y compris les gastrites aiguës, chroniques ou atrophiques, les ulcères peptiques e.g., les ulcères gastriques ou duodénaux.
Une composition selon l'invention peut être administrée par toute voie d'aministration conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins. Avantageusement, on utilise la voie systémique i.a., la voie parentérale qui elle- même peut être choisie parmi les voies intraveineuse, intramusculaire, intradermique, intraépidermique et sous-cutanée ; ces quatre dernières étant toutefois préférées à la voie intraveineuse.
Afin d'obtenir un effet protecteur ou thérapeutique, l'opération qui consiste à administrer une composition pharmaceutique selon la présente invention peut être répétée une ou plusieurs fois, en laissant un certain intervalle de temps entre chaque administration ; intervalle qui est de l'ordre de la semaine ou du mois. Sa détermination précise est à la portée de l'homme du métier et peut varier en fonction de divers facteurs tels que la nature de l'agent immunogène, l'âge de l'individu, etc. Lorsque la même voie d'administration est utilisée pour la primo-immunisation et les rappels, on parle d'administration par voie stricte e.g., par voie systemique stricte.
"Une méthode dans laquelle l'administration de l'agent immunogène est mise en oeuvre par voie systemique stricte" est définie comme une méthode ne mettant pas en jeu de voie d'administration autre que la voie systemique. Par exemple, une méthode dans laquelle l'agent immunogène est administré par voie systemique et par voie muqueuse, ne répond pas à la définition énoncée ci-avant. En d'autres termes, "une méthode dans laquelle l'administration de l'agent immunogène est mise en oeuvre par voie systemique stricte" doit être comprise comme une méthode dans laquelle l'agent immunogène est administré par voie systemique à l'exclusion de toute autre voie, notamment la voie muqueuse.
A titre illustratif non-limitatif, on évoque un schéma de vaccination qui consiste à administrer une molécule d'ADN comportant une séquence codant pour la sous-unité A et une séquence codant e.g., pour la sous-unité B de l'apoenzyme de l'uréase trois fois par voie intramusculaire, dans la région dorso-lombaire avec un intervalle de trois à quatre semaines entre chaque administration.
Selon un mode alternatif, on peut aussi mettre en oeuvre une méthode comprenant plusieurs étapes d'administration concomitantes ou consécutives (dans ce dernier cas, on parle de primo-immunisation suivie d'un ou plusieurs rappels) ; et notamment (a) une première étape qui consiste à administrer à un mammifère, une molécule d'ADN utile aux fins de la présente invention et (b) une deuxième étape qui consiste à administrer audit mammifère un peptide ou polypeptide sous forme purifiée dérivé d'Helicobacter qui correspond de préférence, à la séquence codante dérivée d'Helicobacter de la molécule d'ADN. Ladite première étape peut être utilisée en rappel ou en primo-immunisation ; ce dernier mode étant préféré. Pour une telle méthode on peut prévoir d'opérer en mode d'administration systemique stricte ou bien encore selon un tout autre mode. A titre illustratif non-limitatif, on évoque un protocole de vaccination selon lequel on administre en primo- immunisation, une molécule d'ADN codant pour UreA et UreB par voie systemique, suivie d'un ou plusieurs rappels consistant notamment à administrer l'apoenzyme de l'uréase par voie muqueuse e.g., orale.
Ainsi l'invention a aussi pour objet :
(iv) une composition kit comprenant pour administration concomitante ou consécutive, (a) un premier produit contenant une molécule d'ADN utile aux fins de la présente invention, de préférence formulée pour administration par voie systemique et (b) un deuxième produit contenant un peptide ou polypeptide sous forme purifiée dérivé d'Helicobacter ; de préférence à condition que la molécule d'ADN comporte une séquence codant pour le peptide ou le polypeptide présent dans le deuxième produit.
(v) une méthode selon laquelle on administre de manière concomitante ou consécutive, (a) une molécule d'ADN utile aux fins de la présente invention, de préférence par voie systemique et (b) un peptide ou polypeptide sous forme purifiée dérivé d'Helicobacter ; de préférence à condition que la molécule d'ADN comporte une séquence codant pour le peptide ou le polypeptide administré de manière concomitante ou consécutive.
Pour usage dans une telle méthode, le peptide ou polypeptide sous forme purifiée peut être administré par toutes les voies conventionnelles et notamment par toutes voies systémiques e.g., intramusculaire, sous-cutanée, intraépidermique et intraveineuse ; et muqueuses e.g. par voie oculaire, nasale orale e.g. buccale ou gastrique, pulmonaire, intestinale, rectale, vaginale ou urinaire.
On précise que tous les documents publiés et cités dans la présente demande sont incorporés par référence.
La Figure 1 se réfère aux expériences décrites dans l'exemple ci-après et présente les niveaux d'activité uréase mesurée 4 à 6 semaines après épreuve. Les souris ont reçues au préalable les plasmides VR-ureA et VR-ureB, dans les muscles dorso- lombaires (a), ou dans les quadriceps (b) ou bien le plasmide VR-ureB seul, dans les quadriceps (c). Les souris du groupe de référence standard ont reçues de l'uréase recombinante associée à de la toxine cholérique, par voie intragastrique (d). Les groupes (e) et (f) correspondent respectivement aux contrôles positifs (infection, sans immunisation) et négatifs (pas d'infection).
La Figure 2 présente une carte schématique du plasmide VR1012 décrit dans Hartikka et al, supra.
Exemple : Mise en évidence d'un effet protecteur à l'encontre d'une infection à H. pylori induit par un plasmide comportant ureA ou ureB
A - Matériel et méthodes
Souris
Des souris femelles Swiss de 6/8 semaines ont été fournies par Janvier (France). Pendant toute la durée de l'expérience on a utilisé du matériel stérilisé ; les cages étaient protégées par des "isocaps" ; les souris ont été nourries avec de l'eau filtrée et des aliments irradiés.
Plasmides VR-ureA et VR-ureB
Ces plasmides ont été obtenues par insertion dans le polylinker du plasmide VR1012 (Figure 2) situé entre le promoteur CMV et la séquence de polyadénylation, d'un fragment d'ADN obtenu par PCR (polymerase chain reaction) à partir du génome d'H. pylori et codant respectivement pour UreA et UreB. Une souche d'£. coli a été transformée par chacun de ces plasmides puis les deux transformants ont été mis en culture de manière conventionnelle. Les plasmides ainsi amplifiés ont été récoltés de manière usuelle par lyse alcaline suivie d'un gradient isopicnique en chlorure de césium. L'ADN a été repris soit en eau distillée soit en eau physiologique (NaCl 0,9 %).
Autre antigène et adjuvant
L'apoenzyme de l'uréase d'H. pylori a été exprimée dans E. coli et purifiée comme cela a été décrit dans l'exemple 5 de WO96/31235. Dans la suite du texte pour désigner cette apoenzyme, on emploie le simple terme d'uréase.
La toxine cholérique provient de chez Pasteur Mérieux sérums & vaccins. Protocole d'administration
Lors de chaque expérience, les souris sont constituées en groupe de 8 à 10 souris et rçoivent 3 doses du même produit ; chaque dose sous un volume de 50 μl et à 28 jours d'intervalle (les jours 0, 28 et 56). Les différents protocoles sont comme suit:
Figure imgf000014_0001
On précise que les injections intramusculaires ont été effectuées dans les muscles dorso-lombaires en une injection unique.
Epreuve
Deux semaines après le deuxième rappel, les souris ont été soumises à un gavage gastrique avec 300 μl d'une suspension d'une souche d'H. pylori adaptée à la souris, la souche ORV2002 (1.6 x 106 bactéries vivantes dans 200 μl de PBS ; DO550 de 0.5 environ). Un groupe n'ayant reçu aucune dose d'antigène et servant de contrôle est éprouvé de même.
Analyse de l'épreuve
Six semaines après l'épreuve, les souris ont été sacrifiées par rupture des vertèbres cervicales. Les estomacs ont été prélevés pour évaluer l'activité uréase. L'activité uréase a été évaluée après 4 et 24 heures (OD à 550 nm) avec le Jatrox test, Procter & Gamble) et après 24 heures le nombre de souris encore négatives a été relevé.
B - Résultats
Les résultats sont présentés dans la Figure 1 décrite ci-avant et commentée comme suit : Avant tout commentaire au sujet de cette figure, on note qu'elle présente les résultats obtenus avec l'antigène utilisé sous forme adjuvantée par de la toxine cholérique et administré par voie intragastrique. Cette expérience est dite expérience de référence standard dans la mesure où l'association de l'art antérieur CT / IG est celle qui donne les meilleurs résultats à ce jour.
La Figure 1 montre que quelque soit la composition plasmidique utilisée, on observe une diminution significative de la charge infectieuse par rapport au groupe contrôle positif. Les meilleurs résultats étant obtenus lorsque les deux plasmides comportant ureA et ureB sont administrés.
De plus, on fait référence aux expériences (a) à (f) dont les résultats en termes d'activité uréase 4 hrs après que les souris aient été sacrifiées sont reportés dans la Figure 2 et on indique que le nombre de souris qui sont toujours négatives pour l'activité uréase 24 hrs après avoir été sacrifiées est respectivement (a) 2/9, (b) 2/9, (c) l/9, (d) 1/8, (e) 0/10 et (f) 5/5.

Claims

Revendications
1. Une composition pharmaceutique comprenant une molécule d'ADN comportant une séquence codant pour un peptide ou polypeptide dérivé d'Helicobacter, notamment d'H. pylori, placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule de mammifère.
2. Une composition selon la revendication 1, dans laquelle le polypeptide est la sous-unité A ou B de l'uréase d'Helicobacter, notamment d'H. pylori.
3. Une composition selon la revendication 1, dans laquelle la molécule d'ADN comporte une première séquence codant pour la sous-unité A de l'uréase d'Helicobacter, notamment d'H. pylori, et une deuxième séquence codant pour la sous-unité B de l'uréase d'Helicobacter, notamment d'H. pylori ; chaque séquence étant placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule de mammifère.
4. L'usage d'une molécule d'ADN comportant une séquence codant pour un peptide ou polypeptide dérivé à! Helicobacter. notamment d'H. pylori, placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule de mammifère, dans la fabrication d'un médicament destiné à traiter ou à prévenir une infection à Helicobacter, notamment à H. pylori.
5. L'usage selon la revendication 4, dans lequel le polypeptide est la sous-unité A ou B de l'uréase -d'Helicobacter, notamment d'H. pylori.
6. L'usage selon la revendication 4, dans lequel la molécule d'ADN comporte une première séquence codant pour la sous-unité A de l'uréase d'Helicobacter, notamment d'H pylori, et une deuxième séquence codant pour la sous-unité B de l'uréase d'Helicobacter, notamment d'H. pylori ; chaque séquence étant placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule de mammifère.
7. L'usage selon l'une des revendications 4 à 6, selon lequel le médicament est destiné à être administré par voie parentérale. L'usage selon la revendication 7, selon lequel le médicament est destiné à être administré par voie intramusculaire, intraepidermique ou intradermique.
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