PL152438B1 - Method of obtaining of the human tissular plasminogen activator - Google Patents

Description

RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 152 438 POLSKA

Patent dodatkowy do patentu nr ——

Zgłoszono: 83 05 05 (P. 241805)

Int. Cl.⁵ C12N 15/00

Pierwszeństwo: 82 05 05 Stany Zjednoczone Ameryki

URZĄD

PATENTOWY

RP

Zgłoszenie ogłoszono: 84 07 30

Opis patentowy opublikowano: 1991 08 30

Twórcy wynalazku: David V. Goeddel, William J. Kohr, Dianę Pennica, Gordon A. Vehar

Uprawniony z patentu: Genentech, Inc., South

San Francisco (Stany Zjednoczone Ameryki)

Sposób wytwarzania ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu

Przedmiot wynalazku jest sposób wytwarzania ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, odpowiadającego aktywatorowi znajdowanemu w ludzkiej surowicy i/lub tkankach.

Wynalazek bazuje częściowo na odkryciu sekwencji DNA i wydedukownej sekwencji aminokwasowej ludzkiego aktywatora plazminogenu. Odkrycie to ułatwia wytwarzanie ludzkiego aktywatora plazminogenu przy zastosowaniu technologii rekombinantowego DNA, co z kolei ułatwia wytwarzanie materiału o wystarczającej jakości i ilości do rozpoczęcia i przeprowadzenia badań na zwierzętach oraz badań klinicznych, stanowiących warunek wstępny do wprowadzenia do sprzedaży, niezależnie od ograniczeń nieodłącznie związanych z dotychczasowymi sposobami wyodrębniania związanymi z wytwarzaniem i ekstrakcją z istniejących hodowli komórkowych.

Publikacje i inne matriały przytaczane w niniejszym opisie w celu objaśnienia tła wynalazku, a w poszczególnych przypadkach w celu dostarczenia dodatkowych danych odnoszących się do jego praktycznego zastosowania, zostały ponumerowane i zgrupowane w załączonym spisie literatury.

Układ fibrynolityczny znajduje się w równowadze dynamicznej z układem krzepnięcia utrzymywanym w nie naruszonym drożnym łożysku naczyniowym. W ramach układu krzepnięcia odkłada się fibryna jako materiał służący do przywrócenia warunków hemostazy. Po osiągnięciu stanu hemostazy układ fibrynolityczny usuwa sieć fibryny. Proces fibrynolizy prowadzony jest przez enzym proteolityczny plazminę tworzoną z osoczowego białka prekursorowego, plazminogenu. Plazminogen zostaje przekształcony w plazminę przez aktywację aktywatorem.

Obecnie hadnlowo dostępne są dwa aktywatory, streptokinaza i urokinaza. Obydwa są wskazane w leczeniu ostrych chorób naczyniowych, takich jak zawał mięśnia sercowego, udar, zator płucny, zakrzepica żył głębokich, zamknięcie tętnic obwodowych i inne zakrzepice żylne. Ogólnie, choroby te uważane są za duże niebezpieczeństwo i ryzyko dla zdrowia.

Podstawową przyczyną eiologiczną tych chorób jest albo częściowe, albo, w niektórych

152 438 przypadkach, całkowite zamknięcie naczynia krwionośnego przez skrzep krwi - zakrzep lub zator zakrzepowy. Tradycyjne leczenie przeciwkrzepliwe, takie jak leczenie heparyną lub kumaryną nie powoduje bezpośredniego zwiąkszenia rozpuszczania zakrzepów lub zatorów zakrzepowych. Znajdują tu z powodzeniem zastosowanie wcześniej wspomniane czynniki trombolityczne, a mianowicie streptokinaza i urokinaza. Tym nie mniej, istnieją co do nich duże ograniczenia. Żadna z nich nie ma dużego powinowactwa do fibryny, a w konsekwencji obydwie one aktywują względnie jednakowo zarówno plazminogen w krążeniu jak i plazminogen związany z fibryną. Plazmina tworząca się we krwi krążącej jest neutralizowana raczej szybko i traci swą przydatność w odniesieniu do trombolizy. Resztkowa plazmina degraduje szereg białek będących czynnikami krzepnięcia, np. fibrynogen, czynnik V i czynnik VIII, powodując możliwość krwotoku. Oprócz tego, streptokinaza jest silnie antygenowa i u pacjentów z wysokim mianem przeciwciał odpowiedź na leczenie jest nieskuteczna, leczenia nie można prowadzić w sposób ciągły. Leczenie urokinazą jest kosztowne, co jest związane z wyodrębnianiem jej z ludzkiego moczu lub hodowli komórkowej i z tego powodu nie jest ogólnie akceptowane w praktyce klinicznej. Urokinaza była obiektem szeregu badań, patrz np. odnośniki literaturowe 1-6.

Tak zwane aktywatory plazminogenu wyodrębniono z różnych tkanek ludzkich, takich jak macica, krew, surowica - patrz odnośniki 7-11 oraz z hodowli komórkowej (odnośnik 94). Opisano czynniki zawierające te aktywatory - patrz odnośniki 12 i 13 oraz 14 - 18. Aktywatory plazminogenu otrzymane z tych źródeł sklasyfikowano w oparciu o ich waściwości immunologiczne w dwie główne grupy: aktywatory plazminogenu typu urokinazy (u-PA) i aktywatory plazminogenu typu tkankowego (t-PA). Skróty t-PA i u-PA zostały zaproponowane na XXVIII Zjeździe International Committee on Thrombosis and Hemostasis w Bergamo, Włochy, 27 lipca 1982 r.

Ostatnio zidentyfikowano ludzką linię komórek czerniaka, które wydzielają t-PA. Charakteryzacja tego aktywatora plazminogenu z komórek czerniaka wykazała, że jest on nieodróżnialny, zarówno immunologicznie, jak i pod względem składu aminokwasowego od aktywatora plazminogenu wyodrębnionego z normalnej tkanki ludzkiej (odnośniki 19, 88).

Produkt wyodrębniono ze względnie czystej postaci scharakteryzowano i stwierdzono, że jest on w wysokim stopniu aktywnym czynnikiem fibrynolitycznym (20).

W szeregu badań (np. odnośniki 95 - 98) stwierdzono, że t-PA wyodrębniony z linii komórek czerniaka wykazuje powinowactwo do fibryny wyższe niż aktywatory plazminogenu typu urokinazy. Intensywniejszym badaniom ludzkiego t-PA jako potencjalnego czynnika trombolitycznego przeszkodziło jego bardzo niskie stężenie we krwi, ekstraktach z tkanek, płynach z perfuzji naczyń i w hodolach komórkowych.

Uświadomiono sobie, że zastosowanie technologii rekombinantowego DNA może być najskuteczniejszą drogą do zapewnienia żądanych większych ilości wysokiej jakości ludzkiego aktywatora plazminogenu typu tkankowego (nazywanego wcześniej ludzkim aktywatorem plazminogenu) zasadniczo wolnego od innych białek ludzkich. Materiały te wykazywałyby prawdopodobnie bioaktywność pozwalającą na ich użycie kliniczne do leczenia różnych stanów chorobowych i chorób sercowo-naczyniowych.

Technologia rekombinantowego DNA osiągnęła stadium pewnego nagromadzenia doświadczeń. Fachowcy w dziedzinie biologii molekularnej są w stanie dokonać dość łatwo rekombinacji różnych sekwencji DNA, otrzymując nowe jednostki DNA zdolne do tworzenia w transformowanych drobnoustrojach lub hodowlach komórkowych egzogennego produktu białkowego w znacznej ilości. Istnieją ogólne środki i metody łączenia in vitro różnych wolnych lub „lepkich¹* końców fragmentów DNA, z utworzeniem sprawnych wektorów ekspresyjnych, użytecznych przy transformowaniu poszczególnych organizmów i kierujących przez to efektywną syntezą żądanego produktu egzogennego. Tym nie mniej, z punktu widzenia uzyskania indywidualnego produktu, droga ta pozostaje czasem skomplikowana, a i wiedza nie jest zaawansowana do tego stopnia, który pozwoliłby na regularne przewidywanie powodzenia, zaś ten kto zapowiada uzyskanie dobrych wyników bez oparcia się o podstawę eksperymentalną, czyni to ze znacznym ryzykiem niewykonalności.

Rekombinację DNA zasadniczych elementów, to znaczy początku replikacji, jednej lub więcej selekcyjnej cechy charakterystycznej, promotora ekspresji, insertu heterologicznego genu i pozostałej części wektora, przeprowadza się zazwyczaj poza komórką. Powstający w wyniku

152 438 replikujący się wektor ekspresji, lub plazmid, wprowadza się do komórek przez transformację, otrzymując przez rozmnażanie się komórek duże ilości rekombinantowego wektora. Jeśli gen jest włączony prawidłowo w odniesieniu do części, które kierują transkrypcją i translacją zakodowanej w DNA informacji, otrzymany wektor ekspresyjny jest użyteczny w faktycznym wytwarzaniu sekwencji polipeptydowej, którą włączony gen koduje, a opisany proces określa się jako ekspresję. Powstający produkt można otrzymać powodując, jeśli jest to niezbędne, lizę komórki gospodarza w układach drobnoustrojowych oraz odzyskując produkt przez odpowiednie oczyszczenie go od innych białek.

W praktyce, za pomocą technologii rekombinantowego DNA można przeprowadzać ekspresję całkowicie heterologicznych polipeptydów w tak zwanej bezpośredniej ekspresji albo, alternatywnie, można przeprowadzać ekspresję heterologicznego polipeptydu połączonego z częścią sekwencji aminokwasów homologicznego polipeptydu. W tych ostatnich przypadkach żądany produkt bioaktywny uzyskuje się czasem początkowo jako bionieaktywny w ramach połączonego, homologiczno/heterologicznego polipeptydu, aż do rozszczepienia w środowisku zewnątrzkomórkowym. Patrz odnośniki (21) i (22).

Podobnie, technika hodowli komórek lub tkanek do badań genetycznych i fizjologii komórek jest dobrze znana. Dostępne sę środki i metody utrzymywania stałych linii komórkowych przez kolejne seryjne pasaże wychodzące od wyodrębnionych normalnych komórek. Wspomniane linie komórkowe utrzymuje się do użycia do badań na stałej powierzchni podtrzymującej w ciekłym podłożu, względnie prowadzi się ich wzrost w zawiesinie zawierającej podtrzymujące substancje odżywcze. Powiększenie preparatyki do dużej skali wydaje się nastęczać tylko problemy mechaniczne. Dalsze naświetlenie tła wynalazku można znaleźć w literaturowyh odnośnikach (23) i (24). Podobnie, biochemia białek jest użytecznym, jeśli nie niezbędnym uzupełnieniem biotechnologii. Komórki wytwarzające żądane białko wytwarzają także setki innych białek, endogennych produktów metabolizmu komórkowego. Jeżeli te zanieczyszczające białka, jak również inne związki, nie zostaną oddzielone od żądanego białka, mogą one pokazać się toksyczne po podaniu zwierzęciu lub człowiekowi w toku leczenia żądanym białkiem. Tak więc, techniki biochemii białek mają tu zastosownaie, umożliwiając zaplanowanie sposobów rozdzielania odpowiednich dla określonego, rozważanego układu i zapewniając homogenny produkt bezpieczny w zamierzonym użyciu. Biochemia białek umożliwia także identyfikację żądanego produktu, jego charakteryzację i upewnienie się, że komórki wytwarzają go wiernie, bez zmian i mutacji. Ta gałąź wiedzy jest również niezbędna do zaplanowania badań biologicznych, badań stabilności i innych niezbędnych metod, zanim nastąpią badania kliniczne uwieńczone sukcesem i wprowadzenie do sprzedaży.

Wynalazek bazuje na odkryciu, że technologię rekombinantowego DNA można z powodzeniem zastosować do wytwarzania ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu t-PA, korzystnie w postaci bezpośredniej i w ilości wystarczającej do rozpoczęcia i przeprowadzenia badań na zwierzętach i badań klinicznych, stanowiących warunki wstępne do zatwierdzenia do sprzedaży. Produkt, ludzki t-PA, można stosować we wszystkich jego postaciach profilaktycznie lub leczniczo u ludzi o różnym stanie naczyń i przy różnych chorobach sercowo-naczyniowych.

Według wynalazku sposób wytwarzania ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu w rekombinantowej komórce gospodarza polega na tym, że wywołuje się ekspresję DNA kodującego ludzki tkankowy aktywator plazminogenu.

Bardziej szczegółowo, według wynalazku sposób wytwarzania ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu polega na tym, że przygotowuje się replikujący się wektor ekspresyjny zdolny do ekspresji sekwencji DNA kodującej ludzki tkankowy aktywator plazminogenu w odpowiedniej komórce gospodarza, transformuje się komórkę gospodarza w hodowli otrzymując rekombinantową komórkę gospodarza, prowadzi się hodowlę rekombinantowych komórek gospodarza w warunkach pozwalających na ekspresję sekwencji DNA kodującej wytwarzanie ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu i wyodrębnia się otrzymany ludzki tkankowy aktywator plazminogenu.

Tak więc wynalazek dotyczy wytwarzania zasadniczo czystego ludzkiego, tkankowego aktywatora plazminogenu. Produkt wytwarzany za pomocą genetycznie zaprogramowanych drobnoustrojów lub układów hodowli komórkowych zapewnia dogodną sposobność wytwarzania

152 438 ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu w znacznie skuteczniejszy sposób, niż stosowano dotychczas. Stwarza to obecnie możliwość dotychczas nieosiągalnego wykorzystania handlowego. Oprócz tego, w zależności od komórki gospodarza, ludzki tkankowy aktywator plazminogenu może zawierać towarzyszącą glikozylację w stopniu większym lub mniejszym w porównaniu z materiałem natywnym. W każdym przypadku t-PA będzie wolny od zanieczyszczeń normalnie towarzyszących mu w nierekombinowanym otoczeniu komórkowym.

Wynalazek został przedstawiony z uwzględnieniem replikujących się wektorów ekspresyjnych DNA, zawierających sekwencje genowe kodujące ludzki tkankowy aktywator plazminogenu w postaci ekspresyjnej, szczepów drobnoustrojów lub transformowanych nimi hodowli komórkowych i komórek drobnoustrojów lub w hodowli ze wspomnianych transformownych szczepów lub hodowli, zdolnych do wytwarzania ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu.

Przedstawiono różne sposoby przygotowywania wspomnianych sekwencji genowych, ekspresyjnych wektorów DNA, szczepów drobnoustrojów i hodowli komórkowych oraz specyficzne ich zastosowanie, przygotowywanie hodowli, z prowadzeniem fermentacji, wspomnianych drobnoustrojów i hodowli komórkowych, a ponadto ilustrujące go rysunki, na których: fig. 1 przedstawia wyniki SDS PAGE (elektroforeza w 10% żelu poliakryloamidowym z siarczanem sodowododecylowym) białek znaczonych [35s]metioniną wytrąconych przy użyciu czynnika anty-t-PA, IgG, wydzielonego z komórek czerniaka, w obecności inhibitora proteaz i bez niego, fig. 2 wyniki elektroforezy immunoprecypitatów-produktów translacji frakcji mRNA otrzymanych z komórek czerniaka, fig. 3 rozkład hybrydyzacji 96 bakteryjnych kolonii transformowanych cDNA z użyciem spulowanej 14-członowej próbki sondującej znaczonej 32P, przygotowanej w oparciu o 5aminokwasową sekwencję ludzkiego t-PA, fig. 4 mapę miejsc restrykcyjnych cDNA ludzkiego t-PA o pełnej długości, fig. 5a, 5b i 5c przedstawiają sekwencję nukleotydów i wydedukowaną sekwencję aminokwasów odpowiadającą cDNA ludzkiego t-PA o pełnej długości, fig. 6 przedstawia schemat konstrukcji ekspresyjnego plazmidu pARIPA , fig. 7 wyniki badania aktywności fibrynolitycznej komórek E.coli transformowanych pARIPA na płytce z fibryną, fig. 8 wyniki HPLC (cieczowa chromatografia wysokociśnieniowa) peptydów otrzymanych w wyniku trawienia ludzkiego t-PA trypsyną, fig. 9 konstrukcję plazmidu kodującego z bezpośrednią ekspresją dojrzałego ludzkiego t-PA w E.coli, fig. 10 wyniki badania na płytce z fibryną aktywności fibrynolitycznej ludzkiego t-PA wytwarzanego przez E.coli po transformacji pt-PATrpl2, fig. 11 konstrukcję plazmidu kodującego DHFR (mutant lub typ dziki) /t-PA nadającego się do transformowania do hodowli komórek tkanki ssaków, fig. 12 schematyczny diagram ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu przygotowanego jak w przykładzie I niniejszego opisu.

Używany w niniejszym opisie termin „ludzki tkanowy aktywator plazminogenu, lub „ludzki t-PA albo „t-PA“ oznacza ludzki zewnętrzny aktywator plazminogenu typu tkankowego wytworzony przez układy hodowli drobnoustroju lub hodowli komórkowej, w postaciach bioaktywnych zawierający część proteazową i odpowiadający tym tkankowym aktywatorom plazminogenu, które są natywne w stosunku do ludzkiej tkanki. Białko ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu wytworzone sposobem według wynalazku zdefiniowano środkami odnoszącymi się do określonego genu DNA i wydedukowanej sekwencji aminokwasów. Należy rozumieć, że istnieją wariacje alleliczne między poszczególnymi osobnikami. Wariacje te można wykazać jako różnicę (różnice) w aminokwasach w całkowitej sekwencji, albo jako dolecje, podstawienia, insercje, inwersje lub dodania aminokwasu (aminokwasów) we wspomnianej sekwencji. Oprócz tego, lokalizacja i stopień glikozylacji zależeć będzie od charakteru otoczenia w komórce gospodarza.

Istnieje możliwość, przy użyciu technologii rekombinantowego DNA, przygotowania różnych pochodnych ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, w różny sposób zmodyfikowanych w wyniku jednego lub wielu podstawień aminokwasów, delecji, dodań lub przemieszczeń, np. przez punktowo kierowaną mutagenezę podstawowego DNA. W tym zakresie mieści się przygotowanie pochodnych zawierających zasadniczy region tzw. podwójnej pętli (kringle region) i region proteazy serynowej chrakterystyczne dla ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu opisanego szczegółowo w niniejszym opisie, lecz, z drugiej strony, zmodyfikowanego jak powyżej opisano. Wszystkie te alleliczne wariacje i modyfikacje, dające w wyniku pochodne ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu, wchodzą w zakres wynalazku, jak również inne pokrewne

152 438 ludzkie, zewnętrzne, aktywatory plazminogenu typu tkankowego, podobne fizycznie i biologicznie w tym zakresie, w którym zasadnicza, charakterystyczna aktywność ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu pozostaje nie naruszona w swoim rodzaju.

Ludzki tkanowy aktywator plazminogenu przygotowuje się jako 1/zawierający metioninę jako pierwszy aminokwas (obecny dzięki insercji kodonu startowego ATG przed genem strukturalnym), lub 2/posiadający swój zwykle pierwszy aminokwas, jeśli metionina zostanie wewnątrzlub zewnątrzkomórkowo rozszczepiona, lub 3/łącznie ze swoim polipetydem sygnałowym albo przyłączonym białkiem innym niż zwykły polipeptyd sygnałowy, przy czym polipeptyd sygnałowy lub przyłączone białko mogą być specyficznie rozszczepione w wewnątrz-lub zewnątrzkomórkowym otoczeniu (patrz odnośnik 21), lub 4/w postaci dojrzałej w wyniku bezpośredniej ekspresji lub konieczności odszczepiania jakiegokolwiek ubocznego, zbędnego polipeptydu. To ostatnie jest szczególnie ważne, gdy dany gospodarz nie usuwa, lub czyni to w stopniu niewystarczającym, peptydu sygnałowego w przypadku, gdy wektor ekspresyjny jest przeznaczony do ekspresji tkankowego aktywatora palzminogenu łącznie z jego peptydem sygnałowym. W każdym przypdku tak wytworzony ludzki t-PA w jego różnych postaciach odzyskuje się i oczyszcza do poziomu pozwalającego na użycie go do leczenia różnych stanów chorobowych i chorób naczyniowych.

Poza tym t-PA występuje w postaciach, w których zawarte jest zarówno białko 1-łańcuchowe, jak i 2-łańcuchowe. To ostatnie jest otrzymywane ze związku 1-łańcuchowego w wyniku proteolizy. Przypuszcza się, że białko 2-łańcuchowe łączy się z wytworzoną fibryną i że ta konwersja proteolityczna białka 1-łańcuchowego do 2-łańcuchowego zachodzi w miejscu konwersji plazminogenu do plazminy. Wynalazek obejmuje podawanie białka 1-łańcuchowego do konwersji in vivo, jak powyżej opisano, albo podawanie białka 2-łańcuchowego, które także okazało się aktywne. Białko

2-łańcuchowe można przygotowywać na drodze konwersji proteolitycznej in vitro po wytworzeniu białka 1-łańcuchowego. Tak zwany region podwójnej pętli jest usytuowany „w górę“ od regionu proteazy serynowej i uważa się, że gra ważną rolę w łączeniu się tkankowego aktywatora plazminogenu według wynalazku z fibryną, stąd wynika obserwowane specyficzne działanie tkankowego aktywatora plazminogenu na istniejące, przetrwałe zakrzepy.

Tkankowy aktywator plazminogenu według wynalazku wytwarza się jako zawierający enzymatycznie aktywną część odpowiadającą materiałowi natywnemu i termin „ludzki tkankowy aktywator plazminogenu oznacza produkt zawierający tę część, samą lub łącznie z dodatkowymi sekwencjami aminokwasowymi aż do pełnej długości cząsteczki. Podsumowując, w opisie wynalazku podano definicję funkcjonalną ludzkiego t-PA; jest on zdony do katalizowania konwersji plazmionogenu do plazminy, łączy się z fibryną i w oparciu o właściwości immunologiczne sklasyfikowany jest jako t-PA, jak wyżej opisano.

Termin postać zasadniczo czysta, gdy zostaje użyty do opisu stanu ludzkiego t-PA wytworzonego sposobem według wynalazku, oznacza t-PA wolny od białek lub innych materiałów zazwyczaj mu towarzyszących, gdy jest on wytwarzany przez komórki nierekombinantowe, to jest w jego „natywnym otoczeniu.

Termin „białko DHFR oznacza białko zdolne do wykazywania aktywności dehydrogenazy dwuhydrofolianowej (DHFR) i które z tego powodu musi być wytwarzane przez komórki zdolne do przeżycia na podłożu deficytowym w hipoksantyną, glicyną i tymidynę (podłoże -HGT). Ogólnie, komórki, w których brak jest białka DHFR są niezdolne do wzrostu na tym podłożu, natomiast zdolne są do tego komórki zawierające białko DHFR.

Termin komórki wrażliwe na ΜΤΧ odnosi się do komórek niezdolnych do wzrostu na podłożach zawierających kwas 4-amino-10-metylofoliowy (ΜΤΧ) - inhibitor DHFR. Tak więc, komórki wrażliwe na ΜΤΧ są to komórki, które bez zmian genetycznych albo innych uzupełnień nie rosną w warunkach otoczenia i podłożach odpowiednich dla tego typu komórek, gdy stężenie ΜΤΧ wynosi 0,2/zg/ml lub jest wyższe. Niektóre komórki, takie jak bakterie, nie wykazują wrażliwości na ΜΤΧ ze względu na to, że nie dopuszczają go do wnętrza komórki, nawet pomimo tego, że zawierają one DHFR, które w innych warunkach byłyby wrażliwe na ΜΤΧ. Ogólnie, komórki, które zawierają jako swoje białko DHFR, DHFR typu dzikiego, będą wrażliwe na ΜΤΧ wtedy, gdy są one przepuszczalne dla ΜΤΧ lub zdolne do jego pobierania.

Termin „DHFR typu dzikiego oznacza dehydrogenazę dwuhydrofolianową znajdowaną zwykle w poszczególnych omawianych drobnoustrojach. DHFR typu dzikiego jest, ogólnie biorąc, wrażliwa in vitro na nieskie stężenia kwasu 4-amino-10-metylofoliowego.

152 438 „Białko DHFR o niskim powinowactwie do MTX“ ma definicję funkcjonalną. Jest to białko DHFR, które jeśli zostanie wytworzone w komórce, pozwoli rozwijać się komórce wrażliwej na ΜΤΧ w podłożu zawierającym 2pg ml^-1, lub więcej, ΜΤΧ. Wiadomo, że ta funkcjonalna definicja zależy od łatwości, z jaką organizm wytwarza białko DHRF o niskim powinowactwie do ΜΤΧ, jak również i od samego białka. Tym niemniej, przy użyciu tego terminu w kontekście niniejszego wynalazku, zależność od tych dwóch mechanizmów nie powinna być brana pod uwagę. Wynalazek bazuje na nadawaniu zdolności przeżycia przy tych poziomach ΜΤΧ i nie jest istotne, czy zdolność do przeżycia jest związana ze wzmożoną ekspresją w uzupłnianiu do pierwotnego chatakteru wytworzonej DHFR. Odpowiednie białko DHFR spełniające warunki tej definicji ujawniono w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych nr kolejny 459 151, złożonym 19 stycznia 1983 r., włączonym do niniejszego opisu jako odnośnik.

Termin „wektor ekspresyjny¹* obejmuje wektory zdolne do ekspresji zawartych w nich sekwencji DNA, w których sekwencje te są operatywnie połączone z innymi sekwencjami zdolnymi do wywoływania ich ekspresji. Implikuje się, aczkolwiek nie zawsze precyzuje wyraźnie, że wektory te muszą być zdolne do replikacji w organizmie gospodarza albo jako epizomy, albo jako integralna część chromosomalnego DNA. Jest oczywiste, że brak zdolności replikowania się powodowałby to, że byłyby one operatywnie nieskuteczne. Podsumowując, termin „wektor ekspresyjny** ma definicję funkcjonalną i każda sekwencja DNA zdolna do wywoływania ekspresji specyficznego kodu DNA w niej zawartego jest nim objęta w zakresie odnoszącym się do specyficznej sekwencji. Ogólnie, wektory ekspresyjne użyteczne w technologii rekombinantowego DNA mają często postać „plazmidu** i odnosi się to do kolistych pętli dwuniciowego DNA, które w postaci wektora nie są przyłączane do chromosomu. W niniejszym opisie terminy „plazmid** i „wektor** są używane wymiennie, ponieważ plazmid jest najczęściej używaną postacią wektora. Tym niemniej jednak, wynalazek jest tak pomyślany, że obejmuje i inne postacie wektorów ekspresyjnych pełniąc równoważne funkcje, i które są znane w tej dziedzinie wiedzy.

Termin „rekombinantowe komórki gospodarza** odnosi się do komórek, które zostały transformowane wektorami skonstruowanymi metodami technologii rekombinantowego DNA. Jak to zdefiniowano w niniejszym opisie, t-PA wytwarzany jest w ilościach uzyskiwanych sposobem według wynalazku dzięki tej transformacji, podczas gdy gospodarz nietransformowany może wytworzyć znacznie mniejsze jego ilości, często nawet mniejsze od ilości wykrywalnej. T-PA wytwarzany przez wspomniane komórki można określać terminem „rekombinantowy t-PA“.

Wektory i sposoby ujawnione w niniejszym opisie nadają się do zastosownia w komórkach gospodarza, w organizmach prokariotycznych i eukariotycznych w szerokim zakresie.

Ogólnie, organizmy prokariotyczne są, rzecz jasna, korzystne do klonowania sekwencji DNA w skonstruowanych wektorach, użytecznych w sposobie według wynalazku. Np. E.Coli K12 szczep 294 (ATCC 31446) jest szczególnie użyteczny. Do innych szczepów drobnoustrojów, których można użyć należą szczepy E.Coli takie jak E.coli B i E.coli Χ177 (ATCC 31537). Przykłady te podane są, oczywiście, dla objaśnienia, a nie ograniczenia zakresu wynalazku.

Organizmy prokariotyczne można także stosować w celu ekspresji. Można użyć szczepów wyżej wspomnianych, jak również szczepów takich jak E.Coli W3110 (F^_, λ~, prostotrofowy, ATCC 27325), laseczek takich jak Bacillus subtilis, oraz innych Enterobacteriaceae takich jak Salmonella typhimurium lub Sorratia marcesoens, a także różnych gatunków Psoudomonas.

Na ogół, wektory plazmidowe zawierające replikon i sekwencje otrzymywane z gatunków zgodnych z komórką gospodarza, stosuje się w połączeniu z tym gospodarzem. Wektor zawiera miejsce replikacji, jak również sekwencje markorowe zapewniające możliwość fenotypowej selekcji komórek transformowanych. Np. E.coli transformuje się zwykle stosując pBR322, plazmid otrzymany z E.coli [Bolivar i wsp., Gene, 2,95 (1977)]. pBR322 zawiera geny oporności na ampicylinę i tetracyklinę, co zapewnia łatwość identyfikacji transformowanych komórek. Plazmid pBR322 lub inne plazmidy bakteryjne muszą zawierać (lub należy je zmodyfikować tak, aby zawierały) promotory, których może użyć organizm drobnoustroju w celu ekspresji swoich własnych białek. Do promotorów najczęściej używanych w konstrukcji rekombinantowego DNA należą układy promotorowe /Maktamazy (penicylinazy) i laktozowy [Chang i wsp., Naturę, 275, 615 (1978)], Itakura i wsp., Science, 198,1056 (1977), Goeddel i wsp., Naturę, 281, 544 (1979)] oraz układ tryptofanowy (trp) [Goeddel i wsp., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980), zgłoszenie patentowe nr 0036776

152 438 dokonane w Europejskim Urzędzie Patentowym]. Podczas gdy wspomniane układy są najczęściej używane, odkryto i zastosowano inne promotory drobnoustrojowe, a szczegóły dotyczące ich sekwencji nukleotydów zostały opublikowane, co umożliwiło fachowcom dokonanie funkcjonalnego ich połączenia z wektorami plazmidowymi [Siebenlist i wsp., Celi, 20, 269 (1980)].

Oprócz drobnoustrojów prokariotycznych można także użyć drobnoustrojów eukariotycznych, takich jak hodowle drożdży. Wśród drobnoustrojów eukariotycznych najczęściej używa się Saocharomyces cerevisiae, czyli zwykłych drożdży piekarskich, aczkolwiek dostępna jest pewna ilość innych szczepów. Do ekspresji w Saccharomyces używa się zazwyczaj np. plazmidu YRp7 [Stinchcomb i wsp., Naturę, 282,39 (1979), Kingsman i wsp., Gene, 7,141 (1979), Tschemper i wsp., Gene 10, 157 (1980)]. Plazmid ten już zawiera gen trpl zapewniający marker selekcyjny dla mutanowego szczepu drożdży, który utracił zdolność do wzrostu w obecności tryptofanu, np. ATCC 44076 lub PEP 4-1 [ Jones, Genetics, 85, 12 (1977)]. Obecność uszkodzenia trpl jako charakterystyczna cecha genomu drożdżowej komórki gospodarza zapewnia odpowiednie otoczenie do wykrycia transformacji przez wzrost w nieobecności tryptofanu.

Do odpowiednich sekwencji prmotorowych w wektorach drożdżowych należą promotory kinazy 3-fosfoglicerynianowej [Hitzeman i wsp., J. Biol. Chem., 255, 2073 (1980)] lub innych enzymów glikolitycznych [Hess i wsp., J. Adv. Enzyme Reg., 7, 149 (1968), Holland i wsp., Biochemistry, 17, 4900 (1978)], takie jak enolaza, dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa, heksokinaza, dekarboksylaza pirogronianowa, fosfofruktokinaza, izomeraza glukozo-6-fosforanowa, mutaza 3-fosfoglicerynianowa, kinaza pirogronianowa, izomeraza triozofosforanowa, izomeraza fosfoglukozowa i glukokinaza. Przy konstrukcji odpowiednich plazmidów ekspresyjnych sekwencje zakończenia związane z tymi genami łączy się także z wektorem ekspresyjnym 3' sekwencji żądanej w celu ekspresji, dla zakończenia i poliadencylacji mRNA. Innymi promotorami, mającymi dodatkową zaletę w postaci możliwości kontroli transkrypcji przez warunki wzrostu są regiony promotorowe dehydrogenazy alkoholowej II, izocytochromu c, fosfatazy kwaśnej, enzymów degradacyjnych związanych z metabolizmem azotu, wyżej wspomnianej dyhydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej oraz enzymów odpowiedzialnych za zużytkowanie maltozy i galaktozy (Holland, tamże). Odpowiedni jest każdy wektor plazmidowy zawierający zgodny z drożdżami promotor, początek replikacji i zakończenia sekwencji.

Oprócz drobnoustrojów jako gospodarzy można użyć hodowle komórek z organizmów wielokomórkowych. W zasadzie jakakolwiek z tych hodowli komórkowych nadaje się do pracy, zarówno spośród kręgowców, jak i z bezkręgowców. Największe zainteresowanie wiąże się z komórkami kręgowców i namnażanie komórek kręgowców w hodowli (hodowli tkanek) stało się w ostatnich latach metodą rutynową [Tissue Culture, Academic Pross, wyd. Kruse i Patterson (1973)]. Przykładowo linie komórek gospodarza tego rodzaju to komórki VERO i Hela, linia komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) oraz linie komórkowe WI 38, BHK, COS-7 i MDCK. Wektory ekspresyjne dla tych komórek zwykle zawierają, jeżeli jest to niezbędne, początek replikacji, promotor ulokowany przed genem, który ma ulegać ekspresji, łącznie ze wszystkimi potrzebnymi miejscami przyłączania rybosomów, miejscami przyłączania RNA, miejscami poliadenylacji i sekwencjami zakończenia transkrypcji.

Do użycia w komórkach ssaków stosuje się wektory ekspresyjne, których funkcje kontrolne są często zapewnione przez materiał wirusowy. Np. zwykle używane promotory otrzymuje się z wirusa polyoma, adenowirusa 2, a najczęściej z małpiego wirusa 40 (SV40). Promotory wczesne i późny z wirusa SV40 są szczególnie użyteczne, ponieważ obydwa można łatwo uzyskać z wirusa jako fragment, który zawiera także początek replikacji wirusa SV40 [Fiers i wsp., Naturę, 273,113 (1978), włączony do niniejszego opisu jako odnośnik]. Można także użyć mniejszych lub większych fragmentów SV40, pod warunkiem, że zawierają sekwencję o około 250 bp rozciągającą się od miejsca Hindlll ku miejscu Bgll, ulokowanemu w wirusowym początku replikacji. Ponadto możliwe jest też, a często pożądane, stosowanie sekwencji promotorowych lub kontrolnych normalnie współpracujących z żądaną sekwencją genową, o ile te sekwencje kontrolne są zgodne z układami komórki gospodarza.

Początek replikacji można zapewnić albo przez taką konstrukcję wektora, aby włączony był początek egzogenny, taki, jaki można otrzymać z SV40 lub innych wirusów (np. polyoma, adeno, VSV, BPV itp.), lub można go zapewnić przez mechanizm replikacji chromosomów komórki

152 438 gospodarza. Jeśli wektor integruje z chromosomem komórki gospodarza, jest to często wystarczające.

W selekcji komórek gospodarza korzystnych dla transfekcji prezz wektory wytworzone sposobem według wynalazku zawierające sekwencje DNA kodujące zarówno t-PA, jak i białko DHFR należy wybrać gospodarza zgodnie z typem zstosowanego białka DHFR. Jeżeli stosuje się DHFR typu dzikiego, korzystne jest wyselekcjonowanie komórek gospodarza z deficytem DHFR, co pozwoli na użycie sekwencji kodującej DHFR jako markera do przeprowadzenia z powodzeniem transfekcji w podłożu selekcyjnym, w którym brak hipoksantyny, glicyny i tymidyny. Odpowiednie komórki gospodarza stanowi wtedy linia komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) z deficytem aktywności DHFR, przygotowana i namnażana sposobem opisanym przez Urlauba i Chasina [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)].

Z drugiej strony, jeśli jako sekwencji kontrolnej użyje się sekwencji odpowiadającej białku DHFR o niskim powinowactwie do ΜΤΧ, nie jest konieczne użycie komórek wadliwych na DHFR. Ponieważ mutant DHFR jest oporny na kwas 4-amino-10-metylofoliowy, można użyć podłoży zawierających ΜΤΧ jako środków selekcyjnych, pod warunkiem, że komórki gospodarza są same z siebie wrażliwe na kwas 4-amino-10-metylofoliowy. Większość komórek eukariotycznych, które są zdolne do absorbowania ΜΤΧ okazuje się wrażliwa na kwas 4-amino-10metylofoliowy. Jedną z tych użytecznych linii komórkowych jest linia CHO, CHO-K1 ATCC Cl.

W przykładach, które zamieszczono poniżej, opisano użycie E.coli z układem promotora lac i trp i komórek CHO jako gospodarza oraz wektorów ekspresyjnych z początkiem replikacji SV40 jako promotorem. Tym niemniej byłoby dobrze, gdyby fachowcy użyli analogicznych metod do skonstruowania wektorów ekspresyjnych w celu ekspresji żądanych sekwencji białkowych w alternatywnych hodowlach komórek prokariotycznych i eukariotycznych.

Zadowalające ilości ludzkiego t-PA wytworzono w hodowlach komórkowych, tym niemniej późniejsze udoskonalenia z użyciem drugorzędowej sekwencji kodującej posłużyły do dalszego podniesienia produkcji. Drugorzędowa sekwencja dokująca odpowiada dehydrogenazie dihydrofolianowej (DHFR), na którą wywiera się wpływ za pomocą parametru podlegającego regulacji zewnętrznej, takiego jak kwas 4-amino-10-metylofoliowy (ΜΤΧ). Pozwala to kontrolować ekspresję poprzez kontrolę stężenia ΜΤΧ.

Jeśli jako komórek gospodarza użyje się komórek o błonach komórkowych nie stanowiących barier, transfekcję prowadzi się metodą z wytrącaniem fosforanem wapnia, jak opisali Graham i Van der Eb, Virology, 52, 546 (1978). Tym niemniej, można użyć innych metod wprowadzania DNA do komórek, takich jak wstrzyknięcie jądra lub fuzja protoplazmy.

Jeżeli używa się komórek prokariotycznych lub komórek, które zawierają ściany komórkowe o mocnej konstrukcji, korzystną metodę transfekcji stanowi potraktowanie wapniem w postaci chlorku wapnia, jak opisali F.N.Cohen i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972).

W kostrukcjach odpowiednich wektorów zawierających żądaną sekwencję kodującą i kontrolną stosuje się standardowe metody łączenia. Wyodrębnione plazmidy lub fragmenty DNA rozszczepia się, dopasowuje i łączy ponownie w żądanej postaci z utworzeniem żądanych plazmidów.

Rozszczepienia dokonuje się za pomocą potraktowania enzymem restrykcyjnym (lub enzymami restrykcyjnymi) w odpowiednim buforze. Na ogół używa się i pg plazmidu lub fragmentu DNA z około 1 jednostką enzymu w około 20 pg roztworu buforowego. Odpowiednie bufory i ilości substratu dla określonych enzymów podaje wytwórca. Czasem roboczym jest około 1godzinna inkubacja w temperaturze 37°C. Po inkubacji białko wyodrębnia się za pomocą ekstrakcji fenolem i chloroformem i odzyskuje kwas nukleinowy z frakcji wodnej za pomocą wytrącenia etanolem. Jeśli żądane jest łączenie wolnych końców, preparat traktuje się w ciągu 15 minut w temperaturze 15°C 10 jednostkami polimerazy I (fragment Klenowa), ekstrahuje fenolem i chloroformem, po czym wytrąca etanolem.

Podział rozszczepionych fragmentów pod względem wielkości przeprowadza się z użyciem 6% żelu poliakryloamidowego opisanego przez D. Goeddela i wsp., Nucleic Acids Res., 8,4057 (1980), który to opis włączono do niniejszego opisu jako odnośnik.

Przy łączeniu, w przybliżeniu równomolowe ilości żądanych komponentów, z odpowiednio dopasowanymi końcami tak, aby zapewnić prawidłowe kojarzenie, traktuje się około 10 jednost152 438 kami ligazy DNA T4 na 0,5//g DNA. W przypadku stosowania rozszczepionych wektorów jako komponentów, może okazać się użyteczne zapobieżenie powtórnemu łączeniu się rozszczepionego wektora za pomocą wstępnego potraktowania bakteryjną fosfatazą alkaliczną.

Do analizy potwierdzającej obecność prawidłowych sekwencji w skonstruowanych plazmidach używa się mieszanin łączenia do transformowania E. coli K12 szczep 294 (ATCC 31446) i odpowiednie transformanty selekcjonuje pod względem oporności na ampicylinę lub tetracyklinę, jeśli jest to właściwe. Z transformantów wyodrębnia się plazmidy, analizuje za pomocą restrykacji i/lub poddaje analizie sekwencji metodą Messinga i wsp., Nucleic Acids Res., 9, 309 (1981), lub metodą Maxama i wsp., Methods in Enzymology, 65, 499 (1980).

Amplifikację sekwencji kodujących białko DHFR przeprowadza się za pomocą kontroli wzrostu komórek gospodarzy w obecności stężenia około 20 — 500000 nM kwasu 4-amino-10metylofoliowego, kompetycyjnego inhibitora aktywności DHFR. Skuteczny zakres stężeń jest oczywiście w wysokim stopniu zależny od charakteru genu DHFR, białka i charakterystyki gospodarza. Jest oczywiste, że ogólnie zdefiniowanej wyższej i niższej granicy nie można określić. Można także użyć odpowiednich stężeń innych analogów kwasu foliowego i innych związków hamujących aktywność DHFR. Tym niemniej ΜΤΧ jest dogodny, łatwo dostępny i skuteczny.

Ludzki tkankowy aktywator plazminogenu otrzymano w następujący sposób:

/ Ludzkie komórki czerniaka aktywnie wytwarzające ludzki tkankowy aktywator plazminogenu hodowano aż do powstania zlewającej się warstwy.

2/ Osad komórek z tych hodowli komórkowych ekstrahowano w obecności inhibitorów rybonukleazy w celu wyodrębnienia całego RNA cytoplazmy.

3/ Wyodrębniono cały informacyjny RNA (mRNA) na kolumnie oligo-dT w postaci poliadenylowanej. Frakcjonowano ten mRNA pod względem wielkości za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym.

4/ Frakcje żelu zawierające RNA specyficzny dla tkankowego aktywatora plazminogenu zidentyfikowano w następujący sposób: RNA z każdej frakcji żelu poddano translacji w lizacie retikulocytów królika w układzie in vitro uzupełnionym mikrosomami trzustki psa. Otrzymane produkty translacyjne poddano immunoprecypitacji przeciwciałem - immunoglobuliną klasy IgC specyficzną wobec ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu.

5/ Odpowiedni RNA (21 do 24S) przekształcono w odpowiedni jednoniciowy komplementarny DNA (cDNA), na podstawie którego utworzono dwuniciowy cDNA. Po dobudowaniu końców poli-cD wprowadzono go do wektora, takiego jak plazmid z jednym lub większą ilością markerów fonotypowych.

6/ Tak przygotowanych wektorów użyto do transformowania komórek bakterii, zapewniając zbiór klonowanych cDNA. Przygotowano pulę promieniotwórczo znakowanych, syntetycznych dezoksynukleotydów komplementarnych wobec kodonów dla znanych sekwencji aminokwasów w t-PA, takich jak pula 8 sekwencji 14-członowych, np. 5'-dTC/^AG/CA/^AG/TA/-^c-r/TCCCA3'/komplementarna wobec sekwencji kodujących znaną, patrz poniżej, sekwencję aminokwasów: tryptofan - kwas glutaminowy - tyrozyna - cystoina - kwas asparaginowy (W — E — Y — C — D/ i użyto jako próbki sondujące zbiór kolonii.

7/ Z pozytywnych klonów cDNA wyizolowano plazmidowy DNA i poddano anąlizie sekwencji.

8/ Po poddaniu DNA kodującego t-PA analizie sekwencji, przygotowano go in vitro do insercji do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, którego użyto do transformowania odpowiedniej komórki gospodarza, której z kolei pozwolono na wzrost w hodowli i na wytworzenie żądanego ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu.

9/ Tak wytworzony ludzki tkankowy aktywator plazminogenu zawierał około 251 aminokwasów w jego części proteazy serynowej i „w górę“ od niej sekwencję zawierającą region podwójnej pętli, którą to sekwencję uważa się za odpowiedzialną za łączenie się z fibryną. Dojrzałe białko z jego sygnałową presekwencją ma łącznie 562 aminokwasy.

Sposób ten pozwala na wyprodukowanie z powodzeniem czystego t-PA. Sposób według wynalazku z zastosowaniem dodatkowej sekwencji kodującej wrażliwej na kwas 4-amino-10metylofoliowy pozwala na wytworzenie w hodowlach komórek gospodarza antygenowo czynnego białka t-PAwilościachwiększychniżO,l pg(komórkę)dzień.Przyodpowiednimzastosowaniuwarun10

152 438 ków amplifikacji można otrzymać ilości większe niż 20 pg na komórkę na dobę. W innym ujęciu znaczy to, że osiąga się poziom ekspresji genowej dającej w wyniku wytworzenie ponad 9 X 10⁶ jednostek Plough na komórkę na dobę, albo przy odpowiedniej amplifikacji ponad 18 X 10⁴ jednostek Plough na komórkę na dobę aktywności t-PA.

W tym aspekcie wynalzku osiąga się korzyść z zastosowania kwasu 4-amino-10-metylofoliowego jako leku, który aczkolwiek zwykle jest zgubny dla komórek zdolnych do jego pobrania, pozwala na wzrost komórek w obecności ΜΤΧ o regulowanym poziomie, za pomocą amplifikacji genu kodującego sekwencję DHFR [Robert T. Schimke i wsp., Science, 202, 1051 (1978), J.L. Biedler i wsp., Cancer Res., 32, 153 (1972), S.E. Chang i wsp., Celi. 7, 391 (1976)].

W tym aspekcie wynalazku ważne jest wykazanie, że amplifikacja genu dla DHFR powoduje aplifikację towarzyszących sekwencji kodujących inne białka. Ta sama przyczyna działa, gdy towarzyszącym białkiem jest antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby B (HBsAG) [J.Christman i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci., 72 1815 (1982)], białko XGPRT E. coli [Gordon Ringold i wsp., J.Molec. and Appl. Gen., 1,165 (1981)], oraz endogenna sekwencja z kombinacji plazmidowej DHFR SV40 [R. F. Kaufman i wsp., J.Molec. Biol., 159, 601 (1982)].

Innym mechanizmem nadawania oporności na kwas 4-amino-10-metylofoliowy jest zmniejszenie powinowactwa wiązania białka DHFR tak, że jest ono mniej podatne na kwas 4-amino-10metylofoliowy [W.F. Flintoff i wsp., Somat. Coli Genet., 2, 245 (1976)], ale w tym przypadku amplifikacja także zachodzi.

Okazuje się, że geny, zarówno DHFR typu dzikiego, jak i dla DHFR, która jest oporna na ΜΤΧ z powodu zmniejszonego powinowactwa do wiązania się, amplifikują się dzięki obecności ΜΤΧ. Tak więc w zasadzie, ten aspekt niniejszego wynalzku dotyczy wykorzystania wpływu amplifikacji sekwencji DHFR na towarzyszące sekwencje kodujące białko w celu zapewnienia mechanizmu kontrolnego pozwalającego na wyższy poziom ekspresji sekwencji t-PA w obecności ΜΤΧ, albo przez wstępne potraktowanie transformowanych komórek ΜΤΧ.

Następujące dalej przykłady zostały wprowadzone w celu zilustrowania wynalazku. W przykładach tych jako hodowlę komórek gospodarza zastosowano hodowlę E. coli i linie komórek CHO odpowiednich do wprowdzenia typu sekwencji kodującej białko DHFR. Tym niemniej, inne eukariotyczne i prokariotyczne komórki są także odpowiednie do stosowania w sposobie według wynalazku.

Przykład I. Ekspresja ludzkiego genu t-PA w E.coli.

A. Opis figur.

Figura 1 przedstawia autoradiogram SDS PAGE ukazujący wyniki immunoprecypitacji białka (białek) znakowanego [35s]-metioniną, wydzielonego z ludzkich komórek czerniaka podczas 3-godzinnego znakowania in vivo, w obecności (ścieżka b) i w nieobecności (ścieżka a) aprotyniny inhibitora proteaz. Po immunoprecypitacji IgG specyficzną wobec tkankowego aktywatora plazminogenu obserwuje się 3 pasma (ścieżka a) o masie cząsteczkowej około 65000,63000 i 35000. W obecności inhibitora proteaz nie obserwuje się pasma o masie cząsteczkowej 35000. W przypadku użycia preimmunosurowicy (ścieżka c) produkty nie ulegają immunoprecypitacji. Migrację i masy cząsteczkowe standatdowych białek znakowanych ¹⁴C przedstawia ścieżka po lewej stronie ścieżki a.

Figura 2 przedstawia wyniki elektroforezy żalowej po immunoprecypitacji produktów translacji frakcji RNA wyodrębnionych z kwaśnego żelu agarozowego z mocznikiem. Główne pasmo obserwuje się we frakcjach 7 i 8 po translacji w obecności mikrosomów trzustki psa, a następującą po niej immunoprecypitacją za pomocą IgG specyficznej wobec tkankowego aktywtora plazminogenu. Pasmo to wykazuje masę cząsteczkową około 63000 daltonów. Rozmiar migrującego mRNA we frakcjach 7 i 8 wynosi około 21 do 24S. Pozycje markerów rybosomalnego RNA, oznaczono po elektroforezie RNA w żelu z mocznikiem i uwidocznione za pomocą barwienia bromkiem etidium, widać ponad odpowiednimi ścieżkami żelu.

Figura 3 przedstwaia rozkład hybrydyzacji 96 kolonii z próbką sondującą ³²P-dTC/^ag/CA/^Ag/TA/ ^Gt/TCCCA/W — E — Y — C — D/. Prowadzi się hodowlę 96 indywidualnych transformantów na płytce do mikromiareczkowania, tworzy się repliki i pozwala im rosnąć na błonie nitrocelulozowej. Następnie dokonuje się lizy kolonii, utrwala bakteryjny DNA i prowadzi

152 438 hybrydyzację na sączkach z próbkami sondującymi ³²p-14-członowymi (W—E—Y—C—D). Sączki przemywa się w celu usunięcia próbek sondujących, które nie uległy hybrydyzacji i eksponuje na błonie rentgenowskiej. Ten autoradiogram jest reprezentatywny dla rozkładów otrzymanych na 48 indywidualnych sączkach (4600 niezależnych kolonii). Przykładem klonu pozytywnego pod względem cDNA tkankowego aktywatora plazminogenu na sączku nr 25 jest klon oznaczony jako E10 (strzałka).

Figura 4 jest mapą miejsc restykcyjnych cDNA ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu o pełnej długości. Ilość i wielkość fragmentów po rozszczepieniu endonukleazą restrykcyjną oznaczono na podstwie elektroforezy w 6% żelu poliakryloamidowym. Pozycje miejsc potwierdzono analizą sekwencji kwasu nekleinowego (przedstwionego na figurze 5). Region kodujący największej otwartej fazy odczytywania przedstawiony jest w postaci prostokąta, region zakreskowany przedstawia domniemaną sekwencję peptydu sygnałowego, podczas gdy region zacieniony przedstwia domniemaną sekwencję dojrzałego tkankowego aktywatora plazminogenu (527 aminokwasów). Koniec 5'mRNA jest po lewej stronie, podczas gdy koniec 3' po prawej.

Figury 5a, 5b i 5c przedstawiają sekwencję nukleotydów i wydedukowaną sekwencję aminokwasów cDNA ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu o pełnej długości. 35 aminokwasów (-35 do -1) poprzedzających dojrzałą sekwencję przedstawiono jako nieprzerwaną sekwencję. Uważa się, że 35-aminokwasowa sekwencja obejmuje hydrofitową „pro“ sekwencję, poprzedzającą serynę (+1) dojrzałego białka, składającą się z 12 do 15 aminokwasów, z kolei poprzedzoną „zwykłym sygnałem hydrofobowym (rozciągającym się w kierunku 5' do -35'). Ten typ pro-pro struktury wydzielonych białek opisano uprzednio, np. w przypdku preproalbuminy. Biorąc pod uwagę tę teorię, wszystkie częsteczki wydzielonego tkankowego aktywatora plazminogenu będą zaczynać się od seryny (+ 1) jako końca aminowego. Druga teoria głosi, że hydrofitowa sekwencja może być związana z funkcją tkankowego aktywatora plazminogenu w sposób analogiczny do obserwowanego w przypdku plazminogenu, gdzie peptyd o masie cząsteczkowej 10000 daltonów może być odszczepiony od aminokwasowej części natywnego plazminogenu (Gluplazminogen, nazwany tak z powodu reszty aminokwasowej), co w wyniku daje mniejszą cząsteczkę z nowym końcem aminowym, nazwaną Lys-plazminogenem. Lys-plazminogen można łatwiej aktywować do plazminy, ma także większe powinowactwo do fibryny aniżeli Glu-plazminogen. Wykazano, że plazmina katalizuje konwersję Glu- do Lys-plazminogenu. Ten typ mechanizmu regulującego stanowi „dodatnie sprzężenie zwrotne. Pierwsza ilość utworzonej plazminy, obok degradowania fibryny, powoduje także tworzenie cząsteczek plazminogenu, które są łatwiej aktywowane, a także mocniej wiążą się ze swoim substratem, aniżeli plazminogen natywny. Wynikiem jest szybsza degradacja fibryny. Hydrofitowy peptyd tkankowego aktywatora plazminogenu może być związany z podobnym mechanizmem, a jego odszczepienie prowadzi do zmiany wiązania enzymu z fibryną. W każdym przypadku 35-aminokwasową sekwencję uważa się za presekwencję dojrzałego białka.

Figura 6 przedstawia schematyczny diagram konstrukcji ekspresyjnego plazmidu pARIPA* dla tkankowego aktywatora plazminogenu. Wyjściowy plazmid pPA25E10 trawi się uprzednio z pomocą Pstl w celu wyodrębnienia fragmentu o 376 bp, a następnie trawi się w sposób podany na figurze.

Figura 7 przedstawia wyniki badania aktywności fibrynolitycznej na płytce z fibryną produktu ekspresji otrzymanego poprzez pARIPA* w komórkach transformowanych.

Figura 8 przedstawia wyniki badań chromatografii wysokociśnieniowej (HPLC) peptydów otrzymanych z trawienia tkankowego aktywatora plazminogenu wytworzonego sposobem według wynalazku z użyciem trypsyny (absorbancja przy 210 nm). Strzałka identyfikuje szczyt pasma odpowiadający peptydowi przeznaczonemu do skonstruowania próbki sondującej dla zbioru kolonii. Peptyd reprezentowany przez ten szczyt ma, jak stwierdzono, następującą całkowitą sekwencje: L—T—W—E—Y—C—D—V—P—S—C—S—T—C—G—L. Inne główne szczyty podobnie poddaje się analizie sekwencji. Potwierdzono w ten sposób prawidłowość sekwencji aminokwasów ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu. Peptydowy jednoliterowy kod dla oznaczenia aminokwasów jest następujący:

Asp	D	Kwas asparaginowy	Ile	I	Izoleucyna
Thr	T	Treonina	Leu	L	Leucyna
Ser	S	Seryna	Tyr	Y	Tyrozyna

152 438

Clu	E	Kwas glutaminowy	Phe	F	Fenyloalanina
Pro	P	Prolina	His	H	Histydyna
Gly	G	Glicyna	Lys	K	Lizyna
Ala	A	Alanina	Arg	R	Arginina
Cys	C	Cysteina	Trp	W	Tryptofan
Val	V	Walina	Gin	G	Glutamina
Met	M	Metionina	Asn	N	Asparagina

Figura 9 przedstawia konstrukcję plazmidu kodującego z bezpośrednią ekspresją dojrzałego ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu w E. coli. 50pg plazmidu pPA17 trawi się Sau3AI, HincII i Hhal i poddaje elektroforezie w 6% żelu poliakryloamidowym. Odzyskuje się około 0,5pg fragmentu Sau3ΑΙ-Hhal o 55 bp. Podobnie, około 3pg fragmentu Hhal-Narl o 263 bp oczyszcza się z 80 pg klonup pPA25E10 najpierw za pomocą wyodrębnienia fragmentu Pstl-Narl o 300 bp, a następnie trawienia go Hhal. Wszystkie procesy trawienia prowadzi się w temperaturze 37°C w ciągu 1 godziny, po czym produkty reakcji rozdziela się i poddaje elektroelucji z 6% żelu poliakrylowego. Dwa wskazane dezoksyoligonukleotydy: 5'dAATTCATGTCTTATCAAGT /1/ i 5'G ATCACTTGATAAGACATG /11/ systetyzuje się za pomocą metody fosfotirestrowej w fazie stałej (51).

100 pmoli oligonukleotydu II fosforyluje się w 30pi mieszaniny reakcyjnej zawierającej 60 mM Tris o pH 8, 10 mM MgCk, 15 mM /3-merkaptoetanolu i 50pCi [χ³²Ρ]ΑΤΡ (Amersham 5000 Ci mmol ^_1), dodaje się 12 jednostek kinazy polinukleotydowej T4 i pozwala reakcji przebiegać w ciągu 15 minut w temperaturze 37°C. Dodaje się następnie lpl 10 mM ATP i 12 jednostek kinazy T4 i pozwala reakcji przebiegać jeszcze przez 30 minut. Po ekstrakcji fenolem i CHCI3 fosforylowany oligomer II i 5'hydroksylooligomer I łączy się z 0,5 pg wyeluowanego fragmentu Sau3AI-HhaI o 55 bp i 2pg fragmentu Hhal-Narl o 263 bp i wytrąca etanolem. Fragmenty te łączy się w ciągu 4 godzin w temperaturze pokojowej w 60pl mieszaniny zawierającej 20 mM Tris-HCl o pH 7,5, 10 mM MgCU, 10 mM dwutiotreitolu, 0,5 mM ATP i 1000jednostek ligazy DNA T4. Mieszaninę trawi się w ciągu 1 godziny 48 jednostkami Narl, 20 jednostkami EcoRI i 40 jednostkami BgUI (w celu wyeliminowania polimeryzacji polegającej na łączeniu lepkich końców Sau3AI) i poddaje elektroforezie w 6% żelu. Odzyskuje się około 0,1 pg produktu o 338 bp za pomocą elektroelucji.

Pozostałe sekwencje kodujące t-PA (aminokwasy 111 - 528) wyodrębnia się we fragmencie o 1645 bp przez trawienie plazmidu pPA25E10 za pomocą Narl i RgHI.

Plazmid pLelFAtrop 103 jest pochodną plazmidu pLeIFA25 (52), z którego zostało usunięte miejsce EcoRI dalsze od genu LelF A (53). 3pgpLeIFAtrpl03 trawi się 20 jednostkami EcoRI i 20 jednostkami BgUI w ciągu 90 minut w temperaturze 37°C, poddaje się elektroforezie w 6% żelu poliakryloamidowym i odzyskuje duży (~ 4200 bp) fragment wektora za pomocą elektroelucji. Dla uzyskania końcowej konstrukcji łączy się 80 ng EcoRI-Bglll pLeIFAtrpl03 ze 100 ng fragmentu Narl-BgUI o 1645 bp i 20 ng fragmentu EcoRI-Narl o 338 bp w ciągu 10 godzin w temperaturze pokojowej. Tej połączonej mieszaniny używa się do transformowania E. coli K-12 szczep 294. Z 38 tych transformantów przygotowuje się plazmidowy DNA i trawi EcoRI. Dziesięć spośród strawionych plazmidów zawierało żądane fragmenty EcoRI o 600 bp i 472 bp. Analiza sekwencji DNA potwierdziła, że jeden z tych plazmidów (pt-PAtrpl2) ma żądaną sekwencję nukleotydów w miejscach połączeń między promotorem trp, syntetycznym DNA i cDNA.

Figura 10 przedstawia wyniki badania aktywności fibrynolitycznej, na płytce z fibryną, tkankowego aktywatora plazminogenu jako produktu ekspresji według wynalazku. Całonocną hodowlę E. coli W3110/pt-PAtrpl2 w bulionie Lurii zawierającym 5pg ml^-1 tetracykliny rozcieńcza się w stosunku 1:100 w podłożu M9 zawierającym 0,2% glukozy, 0,5% casamino acids i 5pg ml^-1 tetracykliny. Prowadzi się hodowlę komórek w temperaturze 37°C do A550 0,2, po czym dodaje się kwas indoliloakrylowy do uzyskania końcowego stężenia 20 pg ml^-1. Po doprowadzeniu do A550 0,5 - 0,6 (~ 2 X 10⁸ komórek ml^-1) osadza się próbki za pomocą odwirowania i natychmiast zamraża. Osad komórek zawiesza się w 6 M chlorowodorku guanidyny przy 5 X 10⁸ komórek ml¹, poddaje nadźwiękawianiu w ciągu 10 sekund, inkubuje w ciągu 30 minut w temperaturze 24°C, a następnie dializuje w ciągu 4 godzin wobec 25 mM Tris-HCl o pH 8,0, 250 mM NaCl, 0,25 mM EDTA i 0,01% Tween 80. Po dializie próbki odwirowuje się przy 13000 g w ciągu 2 minut i lOpl porcje supernatantu analizuje pod względem aktywności tkankowego aktywa152 438 tora plazminogenu. Z zastosowaniem metody Granelli-Piperno i Reicha (87) płytkę inkubuje się w ciągu 3 1/2 godziny w temperaturze 37°C i mierzy strefy lizy. Wyniki ilościowe uzyskuje się przez porównanie z rozcieńczeniami roztworu oczyszczonego tkankowego aktywatora plazminogenu z czerniaka.

B. Źródło mRNA tkankowego aktywatora plazminogenu.

Używa się ludzkich komórek czerniaka (Bowes). Prowadzi się hodowlę komórek czerniaka do stadium zlewającej się pojedyńczej warstwy w 100 ml minimalnego podłoża odżywczego Earles'a, uzupełnionego wodorowęglanem sodowym do końcowego stężenia 0,12%, 2 mM glutaminą i 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą cielęcą. W celu potwierdzenia, że komórki czerniaka aktywnie wytwarzają ludzki tkankowy aktywator plazminogenu, ludzkie komórki czerniaka hoduje się do stadium zlewającej się warstwy w płytce do mikromiareczkowania o 24 dołkach. Zarówno w obecności, jak i w nieobecności 0,33 μΜ aprotyniny, inhibitora proteaz, komórki przemywa się raz roztworem soli buforowanym fosforanami i dodaje 0,3 ml podłoża bez surowicy i bez metioniny.. Dodaje się 75μ(Ζί [³⁵S]-metioniny i znakuje komórki w ciągu 3 godzin w temperaturze 37°C. Po zakończeniu 3-godzinnego okresu znakowania oddziela się podłoża od komórek i zadaje albo IgG specyficzną wobec tkankowego aktywatora plazminogenu, albo preimmunosurowicą, w celu immunoprecypitacji (54). Wytrącone produkty poddaje się elektroforezie w 10% żelu poliakryloamidowym z SDS. Warstwę żelu utrwala się, suszy i poddaje fluorografii.

C. Wyodrębnianie informacyjnego RNA i frakcjonowanie pod względem wielkości.

Całkowity RNA z hodowli komórek czerniaka ekstrahuje się zasadniczo jak donieśli Ward i wsp. (55). Komórki osadza się za pomocą odwirowania i ponownie zawiesza w 10 mM NaCl, 10 ml Tris-HCl o pH 7,5, 1,5 mM MgCl₂. Komórki poddaje się lizie przez dodanie NP-40 do stężenia Komórki poddaje się lizie przez dodanie NP-40 do stężenia końcowego 1% i jądra osadza za pomocą odwirowania. Całkowity RNA zawarty w supernatancie oczyszszca się dalej za pomocą wielokrotnych ekstrakcji fenolem i chloroformem. W fazie wodnej doprowadza się NaCl do stężenia 0,2 M i całkowity RNA wytrąca przez dodanie 2 objętości etanolu. W celu wyodrębnienia mRNA z preparatu całkowitego RNA stosuje się chromatografię na oligo-dT celulozie (54). Typową wydajnością z 10 g hodowanych komórek czerniaka jest 5 do 10 mg całkowitego RNA i 50 200 mikrogramów poliA⁵ mRNA.

Frakcjonowanie 200μg poliA⁺ mRNA (56) prowadzi się za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym z mocznikiem. Warstwa żelu (57,58) składa się z 1,75% agarozy, 0,025 M cytrynianu sodowego o pH 3,8, oraz 6M mocznika. Elektroforezę prowadzi się w ciągu 7 godzin przy natężeniu 25 miliamperów w temperaturze 4°C. Następnie żel dzieli się żyletką. Poszczególne odcinki stapia się w temperaturze 70°C i ekstrahuje dwukrotnie fenolem-1 oraz chloroformem. Następnie frakcje wytrąca się etanolem i bada, prowadząc translację in vitro w układzie lizatu króliczych retikulocytów, Bethesda Research Lab. (59, 60), uzupełnionym mikrosomami trzustki psa w następujący sposób. Translację prowadzi się z użyciem 25 μθ [³⁵S]-metioniny i 500 ng RNA z każdego odcinka żelu w końcowej objętości mieszaniny reakcyjnej 30μ1, zawierającej 25 mM HEPES, 48,3 mM chlorku potasu, 10 mM fosforanu kreatyny, 19 aminokwasów po 50 mM każdego, 1,1 mM chlorek magnezowy, 16,6mM EDTA, 0,16mM dwutiotreitolu, 8,3mM heminy, 16,6μg ml^-1 kinazy kreatynowej, 0,33 mM chlorku wapniowego, 0,66mM EGTA, 23,3 mM chlorku sodowego.

Inkubację prowadzi się w ciągu 90 minut w temperaturze 30°C. Błony mikrosomalne trzustki psa przygotowuje się z szorstkich mikrosomów przy użyciu EDTA w celu uwolnienia rybosomów (61) i traktuje nukleazą jak opisano (62), po czym doprowadza je do końcowego stężenia 7 Α₂βο jednostek ml^-1 w mieszaninie do translacji. Produkty translacji lub produkty translacji poddane immunoprecypitacji analizuje się za pomocą elektroforezy w 10% żelu poliakryloamidowym z siarczanem sodowo-dodecylowym, jak uprzednio opisano (63). Niebarwione warstwy żelu utrwala się, suszy i poddaje fluorografii (64).

Powstałe produkty translacji z każdej frakcji żelu poddaje się immunoprecypitacji króliczą IgG specyficzną wobec ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu. Jedno większe pasmo o masie cząsteczkowej około 63000 daltonów poddanego immunoprecyitacji polipeptydu daje się zaobserwować w wyniku translacji frakcji RNA nr 7 i 8 (migracja 21 do 24S). Pasma tego nie obserwuje się, gdy do immunoprecypitacji używa się IgG z preimmunosurowicy, co sugeruje, że odpowiadające temu pasma polipeptydu wykazują specyficzność tkankowego aktywatora plazminogenu.

152 438

D. Przygotowanie zbioru kolonii zawierających sekwencje tkankowego aktywatora plazminogenu.

pg mRNA frakcjonowanego w żelu (mRNA z 7 odcinka żelu) używa się do przygotowania dwuniciowego cDNA zwykłymi metodami (52, 65, 66). cDNA frakcjonuje się pod względem wielkości w 6% żelu poliakryloamidowym. W wyniku przeprowdzonej elektroelucji uzyskuje się 125ng cDNA dłuższego od 350 bp. 30 ng cDNA wydłuża się resztami dezoksy(C) za pomocą terminalnej trnsferazy dezoksynukleotydylowej (67) i łączy z 300 ng plazmidu pBR322 (68), który ma podobnie dobudowane resztami dezoksy(G) końce w miejscu Fstl (67). Mieszanina po łączeniu transformuje się E. coli K-12 szczep 294 (ATCC 31446). Otrzymuje się około 4600 tsransformantów.

E. Przygotowanie próbki sondującej DNA.

Otrzymuje się oczyszczony ludzki tkankowy aktywator plazminogenu zgodnie z metodami podanymi w załączonych odnośnikach (19,20). Cząsteczkę poddaje się przeglądowi w celu zlokalizowania regionów najbardziej nadającch się do przygotowania syntetycznych próbek sondujących w następujący sposób.

W celu nadania białkom podatności na trawienie trypsyną, poddaje się redukcji i karboksymetylowaniu. 2 mg próbkę tkankowego aktywatora plazminogenu dializuje się najpierw wobec 0,01% Tween 80 przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie zliofilizowane białko rozpuszcza się w 12 ml 0,56 M buforu Tris-HCl o pH 8,6, 8 molowego pod względem mocznika i 5mM EDTA. Wiązania dwusiarczkowe redukuje się dodając 0,1 ml /3-merkaptoetanolu. Reakcję prowadzi się w atmosferze azotu w ciągu 2 godzin w temperaturze 45°C. Zredukowane dwusiarczki alkiluje się z otrzymaniem pochodnej karboksymetylowej dodając 1,0 ml 1,4 M kwasu jodooctowego win NaOH. Po upływie 20 minut w temperaturze pokojowej reakcję zatrzymuje się za pomocą dializy wobec 0,01% Tween 80 w ciągu 18 godzin w temperaturze pokojowej, po czym liofilizuje.

Powstałe zliofilizowane karboksymetylowane białko rozuszcza się ponownie w 3 ml 0,1 M buforu zawierającego fosforan sodowy o pH 7,5. Dodaje się trypsynę (TPCK) w stosunku 1 do 50 i trawi w temperaturze 37°C. 0,1 ml próbki pobiera się po 3, 6 i 12 godzinach. Drugi raz dodaje się trypsynę po 12 godzinach. Reakcję zatrzymuje się po 24 godzinach przez zamrożenie próbki, aż do wstrzyknięcia jej w celu przeprowadzenia cieczowej chromatografii wysokociśnieniowej (HPLC). Postęp trawienia oznacza się poddając próbki elektroforezie w żelu z SDS. Wszystkie wyniki próbek żelu były zerowe z wyjątkiem słabo wysyconego pasma próbki 3-godzinnej. Wskazuje to na fakt, że 24-godzinne trawienie jest całkowite i nie pozostają duże peptydy.

Około 0,5 ml próbki wstrzykuje się do wysokorozdzielczej kolumny chromatograficznej Altex C-8 ultrakuleczkami o średnicy 5μ w 2 przebiegach. Stosuje się stopniowany gradient actonitrylu (1 do 5% w ciągu 5 minut, 5 - 35% w ciągu 100 minut, 35 - 50% w ciągu 30 minut). W jednym z dwóch przebiegów preparaty wnych, eulant kontroluje się przy 2 długościach fali (210 i 280 nm). Stosunek absorpcji przy tych 2 długościach fali wykorzystano do oznaczenia peptydów zawierających typtofan.

Piki peptydu najprawdopodobniej zawierającego tryptofan lub uważane za użyteczne z innych przyczyn, poddaje się analizie sekwencji jako pierwsze. Umożliwia to określenie sekwencji wokół większości reszt tryptofanu. Po poddaniu analizie sekwencji 25 z najbardziej nadających się do tego pików peptydowych gromadzi się wszystkie dane dotyczące sekwencji, które można uszeregować, w celu otrzymania wstępnego modelu struktury pierwszorzędowej tkankowego aktywatora plazminogenu. Na podstawie tych danych i modelu lokalizuje się kilka możliwych próbek sondujących.

F. Indentyfikacja klonów bakteryjnych zawierającyh sekwencje cDNA tkankowego aktywatora plazminogenu.

Koloniami indywidualnie inokuluje się dołki w płytkach do mikromiareczkowania zawierających LB/93/ + 5//g ml¹ tetracykliny i przechowuje w temperaturze -20°C po dodaniu DMSO do stężenia 7%. Prowadzi się wzrost 2 kopii zbioru kolonii na sączkach nitrocelulozowych i DNA z każdej kolonii utrwala na sączku metodą Grunsteina i Hognessa (69).

Przygotowuje się z syntetycznego oligomeru pulę 14-członowych próbek sondujących TC/^ag/CA/^Ag/TA/^ct/TCCCA (W—E—Y—C—D) znakowanych ³²P, jak wyżej opisano. Sączki zawierające 4600 transformantów hybrydyzuje się wstępnie w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej w 50 mm fosforanie sodowym o pH 6,8,5 X SSC (80), 150//g ml^-1 DNA nadźwiękawianej spermy

152 438 łososia, 5 X roztworze Denhardfa (85), 10% formamidzie, a następnie prowadzi się hybrydyzację ze znakowaną próbką o 50 X 10⁶ zliczeń na minutę w tym samym roztworze. Po całonocnej inkubacji sączki przemywa się 3 razy w temperaturze pokojowej 6 X SSC, 0,1% SDS w ciągu 30 minut oraz raz 2 X SSC, po czym eksponuje na błonie rentgenowskiej Kodak XR-5 z ekranami intensyfikującymi Dupont Lightning Plus w ciągu 16 godzin.

Plazmidowy DNA wyodrębnia się szybką metodą (71) ze wszystkich kolonii wykazujących pozytywną reakcję hybrydyzacji. Inserty cDNA z tych klonów poddaje się następnie analizie sekwencji po podklonowaniu fragmentów do wektora M13 mp 7 (73) i chemiczną metodą Maxama i Gilberta (74). Figura 3 przedstawia sączek nr 25 z rokładem hybrydyzacji pozytywnego klonu tkankowego aktywatora plazminogenu. Insert cDNA w klonie 25E10 jest DNA kodującym tkankowy aktywator plazminogenu, jak wykazano za pomocą porównania jego sekwencji aminokwasów z sekwencją peptydu (patrz wyżej) otrzymanego z oczyszczonego tkankowego aktywatora plazminogenu i jego produktem ekspresji E.coli jak to bardziej szczegółowo opisano w poniższej części opisu. Insert cDNA klonu 25E10 (plazmid pP25E10) wykazuje długość 2304 bp z najdłuższą otwartą fazą odczytywania kodującą białko o 508 aminokwasach (masa cząsteczkowa 56-756 ) i zawierającym nie ulegający translacji region 3'o772bp. W tym klonie cDNA brak N-końcowych sekwencji kodujących.

G. Bezpośrednia ekspresja klonu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu w E. coli.

W odniesieniu do figury 6, 50pg pPa25E10 (powyżej) trawi się Pstl i wyodrębnia za pomocą elektroforezy w 6% żelu poliakryloamidowym fragment o 376 bp. Około 3pg tego fragmentu wyodrębnia się z żelu za pomocą elektroelucji, trawi 30 jednostkami Ddel w ciągu 1 godziny w temperaturze37°C, ekstrahuje fenolem i chloroformem i wytrąca etanolem. Powstałe lepkie końce dDel wydłuża się do wolnych końców przez dodanie do mieszaniny reakcyjnej 5 jednostek polimerazy DNA I (fragment Klenowa) i 0,01 mM każdego z dATP, dCTP, dGTP,dTTP i stosuje 8-godzinną inkubację w temperaturze 4°C. Po ekstsrakcji fenolem i chloroformem, DNA trawi się 15 jednostkami Narl w ciągu 2 godzin, a następnie poddaje mieszaninę reakcyjną elektroforezie w 6% żelu poliakryloamidowym. Odzyskuje się około 0,5μ żądanego fragmentu Narl. Fragment ten koduje aminokwasy nr 69 - 110 dojrzałego białka tkankowego aktywatora plazminogenu o pełnej długości.

W celu wyodręgnienia fragmentu Narl-BgUI o 1645 bp, 30 ug pPA25E10 trawi się 30 jednostkami Narl i 35 jednostkami BgUI w ciągu 2 godzin w temperaturze 37°C i poddaje się mieszaninę reakcyjną elektroforezie w 6% żelu poliakryloamidowym. Otrzymuje się około 6μ żądanego fragmentu NaRI-BgUI o 1645 bp.

Plazmid pAR 1SRC jest pochodną plazmidu pSRCex 16 (79), z którego usunięto miejsca EcoRI bliższe promotorowi trp i dalsze od genu SRC za pmocą reperacji polimerazą DNA I (28) i wprowadzono samokomplementarny oligodezoksynukleotyd AATTATGAATTCAT syntetyzowany metodą fosfotriestową (75), do pozostałego miejsca EcoRI bezpośrednio przylegającego do miejsca Xbal. 20/zg pARlSRC trawi się całkowicie EcoRI, ekstsrahuje fenolem i chloroformem i wytrąca etanolem. Plazmid trawi się następnie 100 jednostkami nukleazy Si w ciągu 30 minut w temperaturze 16°C w 25 mM octanie sodowym o pH 4,6, ImM ZnCl2 i 0,3 M NaCl w celu utworzenia wolnego końca sekwencji ATG. Po ekstrakcji fenolem i chloroformem i wytrąceniu etanolem, DNA trawi się BamHI, poddaje elektroforezie w 6% żelu polikryloamidowym i duży fragment (4300 bp) wektora otrzymuje się za pomocą elektroelucji.

Plazmid ekspresyjny montuje się za pmocą połączenia 0,2pg wektora, 0,06pg fragmentu wolny koniec-Narl o 125 bp i 0,6//g fragmentu Narl-BgUI o 1645 bp za pomocą 10 jednostek ligazy DNA T4 w ciągu 7 godzin w temperaturze pokojowej i używa go do transformowania E. coli szczep 294 (ATCC 31446) w celu nadania oporności na ampicylinę. Plazmidowy DNA przygotowuje się z 26 kolonii i trawi Xbal i EcoRI. 12 z tych plazmidów zawiera żądane fragmenty XbaI-EcoRI o 415 bp i EcoRI o 472 bp. Analiza sekwencji DNA potwierdza, że kilka z tych plazmidów ma kodon inicjacji ATG prawidłowo usytuowany przy początkowym aminokwasie nr 69 (seryna). Bada się jeden z tych plazmidów, pARIPA*. Wytwarza on żądany tkankowy aktywator plazminogenu (figura 7).

H. cDNA tkankowego aktywatora plazminogenu o pełnej długości.

a) Przygotowanie zbioru kolonii zawierających sekwencje N-końca tkankowego aktywatora plazminogenu.

152 438

0,4 pg syntetycznego oligonukleotydu 5'TTCTGAGCACAGGGCG 3' używa się do prymowania 7,5 pg mRNA z frakcji żelu nr 8 (jak wyżej) w celu przygotowania dwuniciowego cDNA zwykłymi metodami (65, 66). cDNA frakcjonuje się pod względem wielkości w 6% żelu poliakryloamidowym. Dokonuje się elektroelucji 36 ng cDNA z frakcji większej od 300 bp. 5ng cDNA wydłuża się resztami dezoksy/C/ za pomocą terminalnej transferazy dezoksynukleotydylowej (67) i łączy z 50 ng plazmidu pBR322 (68), który został podobnie wydłużony resztami dezoksy/G/ przy miejscu Pstl (67). Mieszaninę po łączeniu transformuje się następnie E. coli K-12 szczep 294. Otrzymuje się w ten sposób około 1500 transformantów.

b) Hybrydyzacja ludzkiego genomowego DNA metodą Southerna.

Ponieważ reakcja prymowania cDNA została przeprowadzona z użciem syntetycznego fragmentu, który hybrydyzuje z 13 parami zasad N-końca klonu pPA25E10, nie ma w tym regionie o 29 parach zasad dostępngo, dogodnego fragmentu restrykcyjnego (dotyczy to również 16-członowej sekwencji) do screeningu klonów cDNA. Tak więc niezbędne jest wyodrębnianie genomowego klonu ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu w celu zidentyfikowania wszystkich wydłużonych primerem klonów cDNA zawierających N-końcowe sekwencje kodujące tkankowy aktywator plazminogenu.

Pierwsze stadium tego procesu związane jest z ustaleniem faktu, że tylko pojedynczy homologiczny gen tkankowego aktywatora plazminogenu jest obecny w ludzkim genomowym DNA. Do ustalenia tego prowadzi się hybrydyzację metodą Southerna. W metodzie tej (77) 5'//g ludzkiego DNA z limfocytów o dużej masie cząsteczkowej przygotowanego sposobem podanym w (80) trawi się całkowicie różnymi endonuleazami restrykcyjnymi, poddaje elektroforezie w 1,0% żelu agarozowym (81) i nanosi na sączek nitrocelulozowy (77). Próbkę sondującą DNA znakowaną P przygotowuje sią (76) z końca 5'insertu cDNA pPA25E10 (fragment Hpall-Rsal o 230 bp) i hybrydyzuje (82) na sączku nitrocelulozowym. Próbkę sondującą o 35 X 10⁶ zliczeń na minutę hybrydyzuje się w ciągu 40 godzin i przemywa jak opisano (82). Dwa rozkłady trawienia endonukleazą zapewniają tylko pojedynczy hybrydyzujący fragment DNA:BgIII (5,7 kbp) i PvuII (4,2 kbp). Dwa hybrydyzujące fragmenty DNA obserwuje się w przypadku HincII (5,1 kbp i 4,3 kbp). Łącznie, dane te sugerują obecność tylko pojedynczego genu tkankowego aktywatora plazminogenu w genomie ludzkim oraz to, że gen ten zawiera co najmniej jedną sekwencję wtrąconą.

c) Screening zbioru ludzkiego faga λ dla genów tkankowego aktywatora plazminogenu.

Strategia przyjętych do identyfikacji rekombinantów faga λ zawierających geny tkankowego aktywatora plazminogenu polega na wykrywaniu homologii nukleotydów za pomocą promieniotwórczo znakownej próbki sondującej przygotowanej z cDNA pPA25E10 tkankowego aktywatora plazminogenu. 1 milion rekombinantów faga λ wysiewa się na płytki z DP 50 Sup F z gęstością 10000 pfu na płytkę 15 cm i dla każdej płytki przygotowuje się repliki sączków nitrocelulozowych metodą Bentona i Davisa (78). Próbkę sondującą DNA znakowaną P przygotowuje się zwykłymi metodami (83) z fragmentu Hpall-Rsal o 230 bp zawierającego 34 pary zasad z końca 5'plazmidu pPA25E 10. Każdy sączek nitrocelulozowy hybrydyzuje się wstępnie w ciągu 2 godzin w temperaturze 42°C w 50 mM fosforanie sodowym o pH 6,5,5 X SSC (77), 0,05 mg ml^-1 DNA nadźwiękowionej spermy łososia, 5 X roztworu Denhadrt'a (84), 50% formamidzie, a następnie hybrydyzuje się ze znakowaną próbką o 50 X 6¹⁰ zliczeń na minutę w tym samym roztworze, zawirającym 10% siarczan sodowo-dekstranowy (85). Po całonocnej inkubacji w temperaturze 42°C sączki przemywa się 4 razy 0,2 X SSC w temperaturze 50°C, 0,1% SDS w ciągu 30 minut, raz 2 X SSC w temperaturze pokojowej i eksponuje przez noc na błonie rentgenowskiej Kodak XR-5 z ekranami intensyfikującymi Dupont Cronex. Otrzymuje się 19 klonów hybrydyzujących z próbką sondującą. Fagowy DNA przygotowuje się z 6 rekombinantów jak uprzednio opisano (86). Wyselekcjonowano klon λ Ce celu przygotowania fragmentu PvuII do screeningu kolonii. 30yug DNA trawi się PvuII w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C i poddaje elektroforezie w 1% żelu agarozowym. Uprzednio wykazano, że fragment 0,4,2 kiloparach zasad zawiera sekwencje tkankowego aktywatora plazminogenu, Poddano go elektroelucji i oczyszczaniu. Próbkę sondującą znakowaną ³²P przygotowano zwykłymi metodami (83) do hybrydyzacji kolonii opisanej w poniższej części opisu.

d) Screening zbioru kolonii pod względem sekwencji 5'tkankowego aktywatora plazminogenu.

152 438

Kolonie przenosi się z płytek i prowadzi ich hodowlę na sączkach nitrocelulozowych. DNA z każdej kolonii utrwala się na sączku metodą Grunsteina i Hognessa (69). Próbkę sondującą znakowaną ³²P przygotowuje się za pomocą prymowania materiałem z trzustki cielęcej (83) fragmentu PvuII o 4,2 kiloparach zasad z wyodrębnionego fenomowego klonu tkankowego aktywatora plazminogenu. Sączki zawierające 1500 transformantów hybrydyzuje się z genomowym fragmentem PvuII znakowanym ³²P o 112 X 10⁶cpm zliczeniach na minutę. Hybrydyzację prowadzi się w ciągu 16 godzin w warunkach opisanych przez Fritscha i wsp. (82). Sączki przemywa się ekstensywnie i eksponuje na błonie rentgenowskiej Kodak XR-5 z ekranami intensyfikującymi Dupont Lightning-Plus w ciągu 16-48 godzin. 18 kolonii wyraźnie hybrydyzuje z genomową próbką sondującą. Plazmidowy DNA wyodrębnia się z każdej z tych kolonii, wiąże z sączkami nitrocelulozowymi i hybrydyzuje z 16 członowym syntetycznym oligonukletydem znakowanym ³²P używanym do pierwotnej reakcji prymowania. Z18 klonów 7 hybrydyzuje z podanym działaniu kinazy 16-członowym oligonukleotydem. Analiza sekwencji po podklonowaniu fragmentów do mp⁷ wektora ml3 (73) wykazuje, że jeden klon (pPA17) zawiera prawidłowy 5'N-końcowy region tkankowego aktywatora plazminogenu sygnałową sekwencję liderową i nie ulegający translacji region 5' o 84 bp. Dla 2 klonów, pPA25E10 i pPA17, oznaczono całkowitą sekwencję nuklotydów (figura 5) i układ restrykcyjny (figura 4), odpowiadające klonowi tkankowego aktywatora plazminogenu o pełnej długości.

Cząsteczka natywnego tkankowego aktywatora plazminogenu jest potencjalnie stabilizowana przez 17 mostków dwusiarczkowych, o czym można sądzić na podstawie homologii z innymi proteazami serynowymi. Istnieją 4 potencjalne miejsca N-glikozylacji, z których 3 zlokalizowane są w regionach podwójnej pętli przy Asnn7, Asn 184, Asn2ie, a jedno w regionie łańcucha lekkiego, przy Asn448. Wariacje w strukturze ligandów oligosacharydowych mogą być odpowiedzialne za różne postacie cząsteczkowe, takie jak produkty o masie cząsteczkowej 65000 i 63000.

I. Bezpośrednia ekspresja klonu cDNA tkankowego aktywatora plazminogenu o pełnej długości w E. coli.

Rekonstrukcja nie naruszonej sekwencji kodującej możliwa jest przy wykorzystaniu pospolitego miejsca endonukleazy restrykcyjnej Hhal, wchodzącego w skład obydwu niecałkowitych klonów pPA17 i pPA25E10. Z plazmidu pPA17 wyodrębnia się fragment restrykcyjny Sau3AIHhal o 55 bp odpowiadający aminokwasom 5 - 23. Miejsce restrykcyjne Sau3AI jest zlokalizowane w czwartym kodonie przyjmowanej dojrzałej sekwencji kodującej i używa się go do usuwania regionu kodującego peptyd sygnałowy. Z plazmidu pPA25E10 wyodrębnia się także fragment Hhal-Narl o 263 bp kodujący aminokwasy 24-110. Wyznacza się 2 syntetyczne oligodezoksynukleotydy, które przywracają kodony dla aminokwasów 1-4, wprowadzają kodon inicjacji translacji ATG i tworzą lepki koniec EcoRI. Te 3 fragmenty łączy się następnie razem w celu utworzenia fragmentu o 338 bp kodującego aminokwasy 1-110. Fragment ten i fragment Narl-BgUI o 1645 bp z pPA25E10 włącza się następnie między miejsca EcoRI a BgUI plazmidu pLoIFAtrpl03 (53) z otrzymaniem ekspresyjnego plazmidu pt-PAtrpl2. Klonowany gen t-PA ulega transkrypcji pod kontrolą fragmentu operonu trp.

E. coli o 300 bp zawierającego promotor trp, operator i sekwencję Shine-Dalgarno liderowego peptydu trp, ale nie zawierającego kodonu inicjacji ATG liderowego peptydu (52).

Prowadzi się hodowlę E. coli K-12 szczep W3110 (ATCC 27325) zawierającej plazmid ptPAtrpl2 i przygotowuje ekstrakty do badania aktywności fibrynolitycznej. Jedną z metod używanych do pomiaru aktywności tkankowego aktywatora plazminogenu jest badanie na płytce z fibryną (87). Mierzy się w ten sposób ilość utworzonej fibryny przez pomiar nasilenia trawienia fibryny przez plazminę na płytce z agarozą zawierającą plazminogen i fibrynę. Plazmina tworzy przejrzystą strefę lizy na płytce z fibryną i pole tej strefy może być skorelowane z ilością tkankowego aktywatora plazminogenu w próbce. Gdy ekstrakty z klonów pr-PAtrpl2 bada się pod względem aktywności tkankowego aktywatora plazminogenu za pomocą badania na płytce z fibryną, utworzona przejrzysta strefa lizy jest wyraźnie widoczna. Ta aktywność fibrynolityczna jest hamowana przez IgG specyficzną wobec t-PA, ale nie przez IgG z preimmunosurowicy, albo IgG specyficzną wobec urokinazy. Nie obserwuje się aktywności w ekstrakcie z komórek zawierających, jako kontrolny, plazmid interferonu leukocytowego pLeIFAtrpl03. Przy użyciu krzywej standardowej

152 438 dla oczyszczonego t-PA możliwe jest oszacowanie, że w ekstrakcie otrzymuje się około 20 jednostek aktywności na 10⁹ komórek, przy czym dla oczyszczonego t-PA 90000 jednostek Plough = 1 mg (figura 10).

J. Analiza sekwencji.

Analiza sekwencji opiera się na degradacji Edmana (83 b). Próbkę przenosi się do części wprowdzającej aparatu Beckman 890B lub 890C spinning cup seąuencer. W części wprowadzającej (63 c) używa się jako nośnika Polybrene™ (polidwuoctan N, N, N¹N¹-czterometylo-N- trójmetylenosześciometylenodwuamoniowy). Aparat do oznaczania sekwencji modyfikuje się przy użyciu wymrażarki i wprowadza się pewne zmiany programu w celu zmniejszenia pików tła. Stopień czystości stosowanych odczynników: Beckman's seąuence grade (0,1 M bufor Quadrol, fenyloizotiocyjanian i kwas siedmiofluoromasłowy).

Połączony materiał z cyklonów Edmana poddaje się w obróbce ręcznej konwersji do pochodnych 2-anilino-5-tiazolinowych. 1-chlorobutan suszy się w atmosferze azotu. Następnie do 2anilino-5-tiazolinonu dodaje się 1,0 n wodny roztwór HC1 i ogrzewa w ciągu 10 minut do temperatury 70°C w celu konwersji do 3-fenylo-2-tiohydantoiny (pochodna PTH). Resztę PTH-aminokwasową rozpuszcza się następnie w 50% acetonitrylu i wodzie i wstrzykuje do cieczowego chromatografu wysokociśnieniowego z odwróconymi fazami. Każdy PTH-aminokwas zostaje następnie zidentyfikowany przez porównanie z czasem retencji standardowej mieszaniny ΡΊΉaminokwasów wprowadzonej do fiolki do kowersji i potraktowanej w taki sam sposób jak materiał obiegowy z aparatu do analizy sekwencji.

K. Badania prowadzące do wykrycia ekspresji tkankowego aktywatora plazminogenu.

1. Bezpośrednie badanie tworzenia plazminy.

a) Teoria. Czułe badanie tkankowego aktywatora plazminogenu można przeprowadzić śledząc katalizowaną przez tkankowy aktywator plazminogenu konwersję plazminogenu do plazminy. Plazmina jest enzymem, dla którego istnieją metody badawcze na substracie chromogennym. Badania te oparte są na proteolitycznym odszczepieniu trójpeptydu od grupy chromoforowej. Szybkość odszczepienia jest bezpośrednio zależna zarówno od specyficzności, jak i od stężenia badanej proteazy. Zasadą badania jest oznaczenie ilości plazminy utworzonej w czasie inkubacji roztworu zawierającego tkankowy aktywator plazminogenu z roztworem plazminogenu. Im większa jest ilość aktywatora, tym większa też jest ilość utworzonej plazminy. Pomiar ilości plazminy przeprowadza się przez śledzenie rozszczepienia przez nią chromogennego substratu S2251, zakupionego w Kabi Group, Inc., Greenwich, Ct.

b) Przeprowadzenie oznaczenia. Próbkę miesza się z 0,10 ml 0,7 mg ml^-1 plazminogenu w 0,05 m buforze Tris-HCl o pH 7,4, zawierającym 0,012 M NaCl i objętość doprowadza do 0,15 ml. Mieszaninę inkubuje się w ciągu 10 minut w temperaturze 37°C, po czym dodaje się 0,35 ml 1,0 mM roztworu S2251 w powyższym buforze i reakcję prowadzi przez 30 minut w temperaturze 37°C. W celu zakończenia reakcji dodaje się 25pg kwasu octowego lodowatego. Próbki wiruje się i mierzy absorbancję przy 405 nm. Ilościowe wyniki badania aktywności otrzymuje się za pomocą porównania ze standardowym roztworem urokinazy. Warunki badania w celu wykrycia tkankowego aktywatora plazminogenu o pełnej długości modyfikuje się przez dodanie do roztworu 0,2 mg fibrynogenu. Fibrynogen pobudza aktywność tkankowego aktywatora plazminogenu, co obserwuje się jako nieco podniesiony poziom aktywności. Aktywność rejestruje się w jednostkach Plough, przy czym 90000 jednostek Plough równa się aktywności przejawianej przez 1 mg oczyszczonego aktywatora tkankowego plazminogenu.

2. Pośrednie badanie tworzenia plazminy.

a) Teoria. Wykorzystuje się czułe badanie aktywności aktywatora plazminogenu (87). Zasadą badania jest oznaczenie tworzenia plazminy przez określenie rozmiaru strawienia fibryny przez plazminę na płytce agarowej zawierającej fibrynę i plazminogen. Plazmina wywołuje przejrzystą strefę lizy na płytce z fibryną. Pole tej strefy można skorelować z ilością tkankowego aktywatora plazminogenu w próbce.

b) Przeprowadzenie oznaczenia. Płytki, według metody Granelli-Piperno i Reicha (97), inkubuje się w ciągu 3 1/2 godziny w temperaturze 37°C, po czym mierzy się strefy lizy. Wyniki ilościowe otrzymuje się za pomocą porównania ze standardowym roztworem urokinazy.

152 438

L. Oznaczenie aktywności tkankowego aktywatora plazminogenu.

1. Wzrost bakterii i przygotowanie próbki.

Kolonię E. coli zawierającą plazmid pARIPA* wprowadza się do probówki z 50 ml podłoża wzrostowego LB zawierającego 20 μ ml^-1 ampicyliny. Prowadzi się hodowlę komórek przez noc w temperaturze 37°C. Próbkę tej hodowli rozcieńcza się w stosunku 1:100 300 ml podłoża M9 zawierającego 20μg ml^-1 ampicyliny. Komórki hoduje się w kolbach wstrząsanych w ciągu 4 godzin w temperaturze 37°C, z uzyskaniem absorbancji przy 550 nm równej 0,419. Dodaje się tryptofanowy analog kwasu indoliloakrylowego do stężenia 30μ ml^-1. Komórki inkubuje się w ciągu 90 minut z uzyskaniem absorbancji przy 550 nm równej 0,628. Komórki zbiera się przez odwirowanie ! zawiesza ponownie w 0,8 ml 0,01 M Tris o pH 8,0, zawierającym 0,01 M EDTA. Ut worzoną zawiesinę miesza się energicznie w ciągu 18 godzin w temperaturze pokojowej. Próbkę odwirowuje się i bada supernatant pod względem aktywności tkankowego aktywatora plazminogenu.

Co do ekspresji pt-PAtrpl2, patrz szczegółowy opis dotyczący figury 10.

2. Oznaczenie aktywności.

Tabele 1 i 2 przedstawiają wyniki aktywacji plazminogenu przez odpowiednie ekstrakty z E. coli, w trakcie badania. Powstająca aktywność zależy od obecności plazminogenu (tablica 1). Na aktywność tę nie wpływa preimmunosurowica królika, ale jest ona w stopniu znaczącym hamowana przez immunosurowicę specyficzną wobec oczyszczonego aktywatora plazminogenu z komórek czerniaka (88) (tablice 1 i 2). Wykazuje to, że ekstsrakty z E. coli tworzą aktywność plazminogenu, hamowaną przez przeciwciała przeciw tkankowemu aktywatorowi plazminogenu.

Figura 7 przedstawia wyniki badania aktywności fibrynolitycznej na płytce z fibryną. Standardowe ilości urokinazy dodano do środkowego rzędu, w stężeniu, od lewej do prawej, 0,24,0,14, 0,10,0,05, i 0,02 jednostek Plough. Dolny rząd stanowią próbki naturalnego tkankowego aktywatora plazminogenu, z tą samą ilością enzymu w każdym dołku. Dołki zawierają, od lewej do prawej, tkankowy aktywator plazminogenu, tkankowy aktywator plazminogenu z preimmunosurowicą, tkankowy aktywator plazminogenu z przeciwciałami przeciw tkankowemu aktywatorowi plazminogenu. Z dołków w górnym rzędzie każdy zawiera 8μ1 ekstraktów z E. coli z rekombinantowym tkankowym aktywatorem plazminogenu. W pierwszym dołku jest sam ekstrakt, do drugiego dodano preimmunosurowicę, do trzeciego - przeciwciała przeciw tkankowemu aktywatorowi plazminogenu. Jest oczywiste, że preimmunosurowica nie narusza naturalnego lub rekombinantowego tkankowego aktywatora plazminogenu i że przeciwciała przeciw tkankowemu aktywatorowi plazminogenu hamują aktywność naturalnego aktywatora, jak i aktywatora z ekstraktów z E. coli. W oparciu o standardy urokinazy, ekstrakty zawierają nieco mniej niż 2,5 jednostek Plough na ml. Przedstawia się to korzystnie w porównaniu z wartością pokazaną w tebeli 1, wynoszącą 1,3 jednostki Plough na ml.

Tabele 1 i 2 przedstawiają wyniki badań przeprowadzonych jak wyżej opisano w p. K.l.b. Tabela 1

Aktywacja plazminogenu przez ekstrakty z E. coli z hodowli zawierających pARIPA

Próbka	A405	Aktywność1 %	Obliczone jednostki Plough ml-1
Ekstrakt bez plazminogenu	0,043	0
Ekstrakt	0,451	100	1,3
Ekstrakt + preimunosurowica	0,477	106	_
Ekstrakt + przeciwciała przeciw t-PA	0,079	9

W powyższej tabeli 1 użyto następującego oznaczenia: ¹ Aktywność w % obliczona przez odjęcie wartości dla próby ślepej (0,043) od wartości otrzymanej i podzielenie przez wartość otrzymaną dla ekstraktu.

152 438

Tabela 2 Aktywacja plazminogenu przez ekstrakty z E. coli z hodowli zawierających pt—PAtrpl2

Próbka	A405	Aktywność %
Ekstrakt	0,657	(100)
Ekstrakt + preimmunosurowica	0,665	101
Ekstrakt + przeciwciała przeciw t-PA	0,059	9

Figura 10 przedstawia wyniki badania na płytce z fibryną przeprowadzonego z udziałem ekstraktów z hodowli E. coli pochodzącej z fermentacji w skali 10 litrów, zawierającej plazmid wykazujący ekspresję tkankowego aktywatora plazminogenu. Aktywność fibrynolityczna ekstraktów zawierających tkankowy aktywator plazminogenu jest reprezentowana na figurze 10 przez dołek a. Ta aktywność fibrynolityczna jest hamowana przez IgG specyficzną wobec t-PA (dołek c), ale nie przez IgG z preimmunosurowicy (dołek b) i IgG specyficzną wobec urokinazy (dołek d). Nie stwierdza się aktywności w ekstrakcie otrzymanym z komórek zawierających plazmid pLelFAtrpl03 dla interferonu leukocytowego, użyty jako kontrola (dołek h).

Przykład II. Wytwarzanie t-PA z użyciem białka DHFR o niskim powinowactwie wiązania ΜΤΧ.

A. Konstrukcja wektora.

Sekwencję kodującą ludzki tkankowy aktywator plazminogenu (t-PA) wprowadza się do ekspresyjnego plazmidu zawierającego mutant DHFR o niskim powinowactwie wiązania ΜΤΧ opisanego w równoczesnym zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych nr kolejny 459 151, złożonym 19 stycznia 1983r., odpowiadającemu europejskiemu opisowi patentowemu nr 117 060, włączonym do niniejszego opisu jako odnośnik, w następujący sposób (patrz figura 11):

Trzy fragmenty z plazmidów odpowiadających t-PA: pPA25E10 pPA17 i pt-PAtrpl2 (powyżej) przygotowuje się w następujący sposób. Plazmid pPA17 trawi się Ddel, uzupełnia za pomocą polimerazy DNA I (fragment Klenowa) i nacina Pstl. Tak utworzony fragment o około 200 bp zawierający 5'-końcową sekwencję dla t-PA wyodrębnia się. Drugi fragment odpowiadający t-PA otrzymuje się za pomocą trawienia pt-PAtrpl2 Pstl i Narl z wyodrębnieniem fragmentu o około 310 bp. Trzeci fragment odpowiadający t-PA otrzymuje się za pomocą trawienia pPA25E 10 Narl i BgUI i wyodrębnienia fragmentu o około 1645 bp, który zawiera, o prócz większej części regionu kodującego t-PA, pewne nie ulegające translacji sekwencje 3'.

Plazmid pE342, który wywołuje ekspresję powierzchniowego antygenu HBV (przytaczany także jako pHBs348-E) zost ał opisany w europejskim opisie patentowym nr 73 656 (zgłoszenie patentowe w Stanach Zjednoczonych Ameryki) 326980, złożone 3 grudnia 1981, włączone do niniejszego opisu jako odnośnik). Mówiąc zwięźle, początek z wirusa małpiego SV40 wyodrębnia się przez trawienie DNA SV40 za pomocą Hindlll i przeprowadzenie końców Hindlll w końce EcoRI przez dodanie konwertora (AGCTGAATPC). Ten DNA nacina się PvuII i dodaje łączniki RI. Po trawieniu EcoRI fragment o 348 bp obejmujący początek wyodrębnia się za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym i elektroelucji i klonuje do pBR322. Ekspresyjny plazmid pHBs348-E konstruuje się przez klonowanie fragmentu o 1986 bp powstałego w wyniku trawienia HBV EcoRI i BgUI [Animal Virus Genetics, (Rozdz. 5), Acad. Press, N.Y. (1980)], obejmującego gen kodujący HBsAG, do plazmidu pML [Luksy i wsp., Naturę, 293, 79 (1981)] w miejscach EcoRI i BamHI. (pML jest pochodną pBR322 z delecją eliminującą sekwencje hamujące replikację plazmidu w komórkach małpich). Utworzony plazmid pRI-Bgl przeprowadza się w postać liniową za pmocą EcoRI, a fragment o 348 bp reprezentujący region początku z SV40 wprowadza się do miejsca EcoRI w pPI-Bgl. Fragment odpowiadający początkowi może być włączony w jednej z dwu orientacji. Ponieważ fragment ten koduje zarówno wczesny jak i późny promotor SV40 oprócz początku replikacji, geny HBV mogą ulegać ekspresji pod kontrolą jednego z dwóch promotorów, zależnie od orientacji (pHBS348-E reprezentuje HBS ulegający ekspresji pod kontrolą wczesnego promotora). pE342 modyfikuje się za pomocą częściowego trawienia

152 438

EcoRI, uzupełnienia rozszczepionego miejsca przy użyciu polimerazy DNA I (fragment Klenowa) i ponownego złączenia plazmidu, w wyniku czego usuwa się miejsce EcoRI poprzedzające początek SV40 w pE342. Powstały plazmid oznaczony pE342ARl trawi się EcoRI, uzupełnia za pomocą polimerazy DNA I (fragment Klenowa) i nacina BamHI. Po elektroforezie w żelu akryloamidowym dokonuje się elektroelucji fragmentu o około 3500 bp, ekstrahuje fenolem i chloroformem i wytrąca etanolem, jak wyżej opisano.

W zwykły sposób łączy się tak przygotowany wektor p342E o 3500 bp z wyżej opisanymi fragmentami, odpowiadającymi t-PA, o około 2160 bp. Wyodrębnia się plazmid zawierający te trzy fragmenty kodujące t-PA o prawidłowej orientacji i charakteryzuje. Został on oznaczony jako pE342-t-PA. Plazmid ten trawi się SacII i zadaje bakteryjną fosfatazą alkaliczną (BRL). W celu zapewnienia sekwencji dla DHFR (wraz z sekwencjami kontrolnymi dla jej ekspresji) tworzy się za pomocą trawienia pEHER SacII fragment o około 1700 bp. [pEHER jest plazmidem wykazującym ekspresję mutanta DHFR opisanego w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych nr kolejny 459 151 (wyżej)]. Fragment ten łączy się z plazmidem pE342-t-PA z utworzeniem pETPAER400, plazmidu analogicznego do pEHER, z tą różnicą, że region kodujący HBsAG został zastąpiony sekwencjami cDNA dla t-PA.

B. Ekspresja i amplifikacja sekwencji t-PA.

pETPAER400 (pETPER) wprowadza się na drodze transfekcji tak do komórek dhfr” CHODUX BI 1, jak i komórek DHFR⁺ CHO-K1 (ATCC CCL61) metodą Grahama i Van der Eba (jak wyżej). Transformowane komórki dhfr” selekcjonuje się przez wzrost na podłożu deficytowym pod względem glicyny, hipoksantyny i tymidyny. Transformowane komórki DHFR⁺ selekcjonuje się przez wzrost w 100 nM ΜΤΧ. Kolonie, które rozwinęły się na odpowiednim podłożu selekcyjnym wyodrębnia się stosując klonowanie pierścieniowe i namnażając w tym samym podłożu przez szereg generacji.

W celu amplifikacji, komórki pobiera się z kolonii do podłoży zawierających 5 X 10⁴,10⁵,2,5 X 10⁵, 5 X 10⁵ i 10⁶ nM ΜΤΧ i pasażuje kilka razy. Komórki wysiewa się na płytki przy bardzo małej gęstości komórek (10² - 10³ komórek na płytkę) na 10 cm - płytki, po czym wyodrębnia się utworzone kolonie.

C. Metody badań.

Ekspresję t -PA w amplifikownych po transfekcji koloniach można dogodnie badać metodami podobnymi do zamieszczonych w przykładzie I, (powyżej).

Koamplifikowanie sekwencji DHFR i t-PA bada się za pmocą wyodrębnienia DNA z hodowli w postaci zlewającej się pojedynczej warstwy w sposób następujący. Hodowle w postaci zlewającej się pojedynczej warstwy na 150 mm płytkach przemywa się 50 ml jałowego PBS i poddaje lizie przez dodanie 5 ml 0,1% SDS, 0,4 M CaCb, 0,1 M EDTA, pH 8,0. Po upływie 5-10 minut mieszaninę oddziela się, poddaje ekstrakcji fenolem, a następnie chloroformem, po czym wytrąca etanolem. DNA ponownie zawiesza się w 1 ml (na 150 mm płytkę) lOnMTris-CHlopH 8,1 mM EDTA (TE), po czym dodaje się rybonukleazę do stężenia 0,1 mg ml”¹ i roztwór inkubuje w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C. Następnie dodaje się SDS do stężenia 0,1% i pronazę (Sigma) do stężenia 0,5 mg ml”¹. Po 3 -16 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C roztwór ponownie ekstsrahuje się fenolem, ekstrahuje chloroformem i wytrąca etanolem. Osad DNA zawiesza się w 0,5 ml wody i trawi enzymami restrykcyjnymi. Około 5 - 10pg strawionego DNA poddaje się elektroforezie w żelu agarozowym [1% agaroza w buforze Tris-octanowym (40 mM Tris, 1 mM EDTA, doprowadzony dopH 8,2 przy użyciu kwasu octowego)], Crouse i wsp.,J. Biol. Chem., 257,7887 (1982). Po przebyciu przez błękit bromofenolowy 2/3 jego drogi w dół żelu, pobiera się żel i barwi bromkiem etylowym. Po wizualizacji DNA w świetle UV przenosi się go z żelu na sączki nitrocelulozowe metodą Southerna [J.Mol.Biol., 98, 503 (1975)]. Sączki poddaje się hybrydyzacji z próbką otrzymaną z translacji typu nick, uzyskaną z fragmentu SacII pEHER o 1700 bp (przygotowanie i hybrydyzacja jak opisano w powyższej części opisu), albo z fragmentu BgUI pETPER o około 1970 bp.

Przykład III. Wytwarzanie t-PA w połączeniu z białkiem DHFR typu dzikiego.

A. Konstrukcja wektora.

Konstruuje się plazmid pETPER zawierający sekwencję DNA kodującą DHFR typu dzikiego w sposób analogiczny do użytego w konstrukcji pETPER, Konstrukcja ta jest taka, jaką opisano w

152 438 przykładzie II, p.A, z tą różnicą, że zamiast plazmidu pEHER jako źródła sekwencji genu białka DHFR, stosuje się plazmid pE342.HBV.E400.D22. opisany w europejskim opisie patentowym nr 117 058. Plazmid pE342.HBV.E400.D22 jest taki sam jak pEHER, różni się tylko pojedynczą parą zasad w typie dzikim i mutancie DHFR. Tak więc powstający plazmid pETPER jest w każdym przypadku analogiczny do pETPER, z tym wyjątkiem, że sekwencja kodująca DHFR typu dzikiego zastępuje sekwencję dla mutanta.

B. Ekspresja sekwencji dla t-PA.

pETPFR stosuje się do transfekcji komórek CHO deficytowych pod względem DHFR [Urlaub i Chasim (wyżej)] z użyciem metody wytrącania fosforanem wapniowym Grahama i Van de Eba. 21 kolonii rozwiniętych na selektywnym podłożu (-HGT) bada się w celu wykrycia tworzenia się plazminy przez trawienie fibryny na płytce agarowej zaiwerającej fibrynę i plazminogen, jak opisali Granelli-Piperno i wsp., J.Exp.Med., 148, 223 (1978).

Cztery z najmocniejszych klonów poddaje się następnie badaniu ilościowemu pod względem tworzenia plazminy w oparciu o komórki zgodnie z metodą podaną w przykładzie I.K. 1 .b. Po tym ilościowym określeniu stwierdza się, że 4 badane klony wykazują takie same lub porównywalne wydzielanie t-PA do podłoża, określone jako jednostki (komórkę) dzień. Subklony przygotowuje się przez przeniesienie inokulum z dwóch z tych klonów na oddzielne płytki zawierające podłożeHGT. Dwóch z powstałych podklonów 1SB i 1 używa się do dalszych analiz.

C. Amplifikacja i poziom wytwarzania t-PA.

Powyższe podklony wysiewa się na płytki, stosując 2 X 10⁵ komórek na 100 mm płytkę z 50 nM ΜΤΧ w celu pobudzenia amplifikacji. Komórki, które przeżyły, badane wyżej opisanym sposobem, wykazały we wszystkich przypadkach około 10 X większą aktywność tkankowego aktywatora plazminogenu niż w przypadku komórek nie amplifikowanych. Dwa z tych klonów wybrano do dalszych badań i oznaczono 1 - 15 i 18B - 9.

Podklon 1-15 dalej amplifikuje się przez umieszczenie 2 X 10⁵ komórek na 100 mm płytkach zawierających 500 mM ΜΤΧ. Badanie tak amplifikowanych komórek wykazało dalszy wzrost (około trzykrotny) wytwarzania t-PA. Przy badaniu ilościowym sposobem według przykładu II. C okazało się, że poziom był rzędu 7 X 10'⁴ jednostek/komórek/dzień. Część tych amplifikowanych komórek przenosi się do 10000 nM ΜΤΧ i utrzymuje w tym środowisku. Podklony 1-15 i 18B-9 bada się dalej po przetrzymaniu ich w ciągu, w przybliżeniu 1-2 miesięcy w warunkach wyszcze-

gólnionych w poniższej tabeli Γ.
Linia komórkowa	Tabela Γ
Warunki wzrostu	ng- t-PA komórkę/dzień
1	2	3

1-15500	500 nM ΜΤΧ	28,5	X	10'3
1-15500	500 nM ΜΤΧ	26,0	X	103
l-15soo	(podłoże-HGT,bez ΜΤΧ)	8,3	X	ΙΟ’3
1-15500	(podłoże-HGT,bez ΜΤΧ)	18,0	X	10'3
l-15io,ooo	10μΜ ΜΤΧ	29,3	X	10’3
1-15ι ο,οοο	10μΜ ΜΤΧ	49,0	X	10'3
18B-9	50 ηΜ ΜΤΧ	14,3	X	10’3
18B-9	50 ηΜ ΜΤΧ	14,4	X	10’3
18B-9	(podłoże-HGT, bez ΜΤΧ)	14,3	X	10’3
18B-9	(podłoże-HGT, bez ΜΤΧ)	14,4	X	10’3
1	(podłoże-HGT, bez ΜΤΧ)	1,0	X	103
1	(podłoże-HGT, bez ΜΤΧ)	0,7	X	10'3

W tabeli Γ użyto następującego oznaczenia: t-PA w podłożu hodowli bada się ilościowo w badaniu radioimmunologicznym w następujący sposób. Oczyszczony t-PA i oczyszczony t-PA znakowany jodem, otrzymany z komórek czerniaka, rozcieńcza się seryjnie, obejmując stężenia

12,5 do 400 ng ml^-1 buforem zawierającym roztwór soli buforowany fosforami o pH 7,3, 0,5% surowiczą albuminę bydlęcą, 0,01% Tween 80 i 0,02% NaN₃. Odpowiednie rozcieńczenia próbek

152 438 podłoża dodaje się do promieniotwórczo znakowanych białek. Prowadzi się całonocną inkubację antygenów w temperaturze pokojowej, w obecności frakcji IgG (rozcieńczonej 1:10000) z króliczej immunosurowicy specyficznej wobec t-PA. Kompleksy antygen-przeciwciała wytrąca się przez absorbcję na immunozłożu z kozią immunosurowicą specyficzną wobec króliczej IgG (BioRad) w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej. Złoża kieruje się za pomocą dodania, jako rozcieńczalnika, roztworu soli i wirowania w ciągu 10 minut przy 2000 x g w temperaturze 4°C. Supernatanty odrzuca się i rejestruje promieniotwórczość osadu. Stężenie wyznacza się przez porównanie z odnośnym standardem.

Stosuje się następujące linie komórkowe: linia komórkowa „1“ jest nie amplifikowanym klonem z wyjściowego zestawu 4 klonów. l-15soo jest amplifikowanym podklonem linii komórkowej „1“, którą amplifikowano początkowo w 50 nM ΜΤΧ, z otrzymaniem 1-15, a następnie przeniesiono, w celu dalszej amplifikacji, do 500 nM ΜΤΧ. l-15ioooo jest podklonem l-15soo, który był dalej amplifikowany w obecności 10000 nM ΜΤΧ. Linia komórkowa 188-9 jest podklonem jednym z wykrytych czterech wyjściowych, który był amplifikowany na 50 nM ΜΤΧ.

Wszystkie amplifikowane komórki wykazują podwyższony poziom wytwarzania t-PA w stosunku do wykazywanego przez nieamplifikowane hodowle komórkowe. Nawet nieamplifikowane hodowle wytwarzają ilość p-TA większą od 0,5 pg/komórkę/dzień, amplifikowanie daje w wyniku poziom sięgający 50 pg/komórkę/dzień.

Środki farmaceutyczne.

Związki wytwarzane sposobem wedug wynalazku można formułować znanymi metodami w celu przygotowania farmeceutycznie użytecznych środków, w których łączy się ludzki tkankowy aktywator pazminogenu z domieszką farmaceutycznie dozwolonego nośnika. Odpowiednie nośniki i ich formułowanie, odpowiednie także i dla innych białek ludzkich, takich jak surowicza albumina ludzka, opisał np. E.W.Martin w Remington's Pharmaceutical Sciences, co zostało włączone do niniejszego opisu jako odnośnik. Środki te będą zawierać skuteczną ilość białka wytworzonego sposobem według wynalazku razem z odpowiednią ilością nośnika w celu wytworzenia farmaceutycznie dozwolonych środków nadających się do skutecznego podawania pacjentowi.

I tak np., ludzki tkankowy aktywator plazminogenu można podawać pozajelitowo pacjentom ze stanami chorobowymi lub chorobami sercowo-naczyniowymi. Dawkowanie i same dawki mogą być analogiczne do obecnie przyjmowanych w badaniach klinicznych innych leków sercowonaczyniowych, czynników trombolitycznych i wynosi 440 jednostek międzynarodowych/kg wagi ciała jako dożylna dawka prymująca, z następującą po niej ciągłą infuzją dożylną w ilości 440 jednostek międzynarodowych/kg/godz. w ciągu 12 godzin u pacjentów z zatorem płucnym.

Przykładem odpowiedniej postaci do dawkowania zasadniczo homogennego ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu drogą pozajelitową, odpowiedniej do stosowania sposobem według wynalazku, jest fiolka zawierająca 25000 jednostek międzynarodowych aktywności tkankowego aktywatora plazminogenu, 25 mg mannitu i 45 mg NaCl. Dla podania dożylnego można ją zrekonstytuować dodaniem 5 ml jałowej wody do wstrzykiwań i zmieszać z odpowiednią objętością 0,9% chlorku sodowego do wstrzykiwań lub 5% glukozy do wstrzykiwań.

Szczegółowy opis rekombinantowego ludzkiego t-PA.

Strukturę ludzkiego t-PA będącego szczególnym zastosowaniem sposobu według przykładów podanych w powyższej części opisu, badano dokładnie w niektórych aspektach, zarówno przez określenie genowej sekwencji kodującej, jak i metodami właściwymi dla biochemii białek. Strukturę białka, w obecnym stanie jej rozumienia, przedstawia figura 12.

Collen i wsp. (88) uprzednio wykazali, że dwa łańcuchy ludzkiego t-PA tworzą się w wyniku proteolitycznego rozszczepienia cząsteczki stanowiącej pojedynczy łańcuch na dwa polipeptydy połączone wiłzaniami dwusiarczkowymi. Obecna praca umożliwia konkluzję, że łańcuch ciężki o masie cząsteczkowej 30882 pochodzi z końca aminowego, a łańcuch lekki, o masie cząsteczkowej 28126 obejmuje region końca karboksylowego. Sekwencja N-końca cząsteczki dwułańcuchowej sugeruje, że postać dwułańcuchowa powstaje przez rozszczepienie pojedynczego wiązania między argininą a izoleucyną (figura 12, miejsce pokazane strzałką).

Pierwszorzędowa struktura części regionu ciężkiego łańcucha ludzkiego t-PA (figura 12) ujawnia wysoki stopień homologii sekwencji z regionem podwójnej pętli plazminogenu (89) i

152 438 protrombiny (40, 41). Region podwójnej pętli odnosi się do charakterystycznej struktury trzech wiązań dwusiarczkowych początkowo wykrytej we fragmencie „pro“ prortombiny, opisanej szczegółowo po raz pierwszy przez Magnussona i wsp. (91,92). Jak można sądzić na podstwie pierwszorzędowej struktury t-PA, oczywiście są dwa tak zwane regiony podwójnej pętli o 82 aminokwasach każdy, wykazujące wysoki stopień homologii z 5 regionami podwójnej pętli plazminogenu. 91 pozostałych N-końcowych aminokwasów wykazuje niską homologię ze zwykłym regionem podwójnej pętli. Tym niemniej można przypuszczać, że region ten może także przybierać postać zawierającą liczne wiązania dwusiarczkowe, ponieważ znajduje się tam 11 dodatkowych reszt cysteiny.

Katalityczne centrum lekkiego łańcucha ludzkiego t-PA, tak zwany region proteazy serynowej, podobnie jak w innych enzymach serynowych jest prawdopodobnie utworzone przez reszty histydyny322, kwasu asparaginowegoezi i seryny47e. Poza tym sekwencje aminokwasowe otaczające te reszty są w wysokim stopniu homologiczne z odpowiadającymi im częściami innych proteaz serynowych, takich jak trypsyna, protrombina i plazminogen.

Piśmiennictwo

1. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 3355361.

2. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 3926727.

3. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4029767.

4. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4258030.

5. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4271150.

6. Europejskie zgłoszenie patentowe nr 0037687.

7. Rijken, T>.C.,„Plasminogen Activator from Humań Tissue, Krips Repro Mepel, 1980.

8. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 3555000.

9. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 3998947.

10. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4245051.

11. Europejskie zgłoszenie patentowe nr 0023860.

12. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4083961.

13. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4177262.

14. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 3082612.

15. Wallen, P., Proc. Serono Syrop. 9,91 (1977).

16. Thorsen, S., i wsp., Thrombos. Diathes. haemorrh. 28, 65 (1972).

17. Collen, Thrombos. Haemostas. 43, 77 (1980).

18. Wiman i wsp., Naturę 272, 549 (1978).

19. Europejskie zgłoszenie patentowe nr 0041766.

20. Weimar, W., i wsp., The Lancet,Tom II, nr 8254, str. 1018 (1981).

21. Brytyjskie zgłoszenie patentowe nr 2007676A.

22. Wetzel, American Scientist 68, 664 (1980).

23. Microbiology, 2 wyd., Harper and Row Publications, Inc., Hagerstown, Maryland (1973), w szczególności str. 1122 i następne.

24. Scientific American 245, 106 (1981).

25. Brytyjskie zgłoszenie patentowe nr 2055382A.

26. Opis patentowy RFN nr 2644432. '

27. Chang i wsp., Naturę 275 617 (1978).

28. Itakura i wsp., Science 198,1056 (1977).

29. Goeddel i wsp., Nucleic Acids Research 8,4057 (1980).

30. Europejskie zgłoszenie patentowe nr 0036776.

31. Siebenlist i wsp., Celi 20, 269 (1980).

32. Stinchcomb i wsp., Naturę 282, 39 (1979).

33. Kingsman i wsp., Gene 7,141 (1979).

34. Tschumper i wsp., Gene 10, 157 (1980).

35. Mortimer i wsp., Microbiological Reriews 44, 519 (198 ).

36. Miozzari i wsp., Journal of Bacteriology 134,48 (1978).

37. Jones Genetics 85, 23 (1977).

38. Hitzeman, i wsp., J.Biol.Chem. 255,12073 (1980).

39. Hess i wsp., J. Adv. Enzyme Reguł. 7, 149 (1968).

40. Holland i wsp., Biochemistry 17 4900 (1978).

41. Bostian i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 4504 (1980).

152 438 25

42. The Molecular Biology of Yeast (Aug 11-18,1981), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

43. Chambon, Ann. Rev. Biochemistry, 44 613(1975).

44. Tissue Culture, Academic Press, wyd. Kruse and Patterson, (1973).

45. Gluzman, Celi 23, 175 (1981).

46. Bolivar i wsp., Gene 2, 95 (1977).

47. Lusky i wsp., Naturę 293, 79 (1981).

48. Gluzman i wsp., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 44, 293 (1980).

49. Fiers i wsp., Naturę 273, 113 (1978).

50. Reddy i wsp., Science 200, 494 (1978).

51. Crea i wsp., Nucleic Acids Research 8,2331 (1980).

52. Goeddel i wsp., Naturę 287, 411 (1980).

53. Gray i wsp., Naturę 295, 503 (1982).

54. Oppermann i wsp., Vlrology 108, 47 (1981).

55. Ward i wsp., J. Virol 9, 61 (1972).

56. Aviv i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)69,1408 (1972).

57. Lehrach i wsp., Biochemistry 16,4743 (1977).

58. Lynch i wsp., Virology 98, 251 (1979).

59. Lodish, Am. Rev. of Biochem. 45, 40 (1976).

60. Pelham i wsp., Eur. J. Biochem. 43, 247 (1976).

61. Blobel, i wsp., J. Celi Biology 67, 852 (1975).

62. Shields i wsp., J. Biol. Chemistry 253, 3753 (1978).

63. Laemmli, Naturę 227,680 (1970).

64. Bonner i wsp., Eur. J. Biochem. 46, 83 (1974).

65. Goeddel i wsp., Naturę 281, 544 (1979).

66. Wickens i wsp., J. Biol. Chem. 253, 2483 (1978).

67. Chang i wsp., Naturę 275, 617 (1978).

68. Bolivar i wsp., Gene 2, 95 (1977).

69. Grunstein i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3961 (1975).

70. Hanahan i wsp., Gene 10, 63 (1980).

71. Birnboim i wsp., Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979).

72. Smith, Methods Enzymol 65, 499 (1980).

73. Messing i wsp., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981).

74. Maxam i wsp., Methods in Enzymol 65, 499 (1980).

75. Grea i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 75, 5765 (1978).

76. Lawn i wsp., Celi 15, 1157 (1978).

77. Southern, J. Mol. Biol. 98, 503 (1975).

78. Benton i wsp., Science 196, 180 (1977).

79. McGrath and Levinson, Naturę 295, 423 (1982).

80. Blin 1 wsp., Nucleic Acids Res. 3, 2303 (1976).

81. Lawn i wsp., Science 212, 1159 (1981).

82. Frirtsch i wsp., Celi 19, 959 (1980).

83. Taylor i wsp., Biochem. Biophys. Acta 442, 324 (1976).

83b. Edman i wsp., European J. Biochem. 1,80 (1967).

84. Denhardt, Biochem. Biophys. Res. Comm. 23,641 (1966).

85. Wahl i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 76, 3683 (1979).

86. Davis i wsp., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1980).

87. Granelli-Piperno i wsp., J. Exp. Med. 148, 223.

88. Rijken i wsp., J. Biol. Chem. 256, 7035 (1981).

89. Sottrup-Jensen i wsp., Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Tom 3, Raven Press, N.Y. str. 191 (1978).

90. Sothrup-Jensen i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 72,2577 (1975).

91. Magnussen i wsp., Proteolysis and Physiological Regulation, Wyd. Ribbons i wsp., Academis Press, New York, str. 203 (1976).

92. Magnussen i wsp., Proteases and Biological Control, Cold. Spring Harbor Laboratory, N.Y. str. 123 (1975).

93. Miller, Experiments in Molecular Genetics, str. 431-3 Cold Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York (1972).

152 438

94. Reich, E., Proteases and Biological Control, tamże s.333-341.

95. Matsuo, O., i wsp., Throm. Haemostasis 45 225 (1981).

96. Koringer, C., i wsp., Throm. Haemostasis 46 561, 662 (1981).

97. Hoylaerts, M., i wsp., J. Biol. Chem. 257 2912 (1982).

98. Koringer, C., i wsp., Thromb. Haemostasis 46 685 (1981).

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu o sekwencji aminokwasów przedstawionej na rysunku fig. 5, znamienny tym, że a) hoduje się aż do powstania zlewającej się warstwy ludzkie komórki wytwarzające ludzki tkankowy aktywator plazminogenu, b) izoluje się z hodowli całkowity RNA cytoplazmy w obecności inhibitora/ów/ rybonukleazy, c) przekształca się specyficzny dla tkankowego aktywatora plazminogenu RNA w odpowiedni jednoniciowy komplementarny DNA (cDNA), z którego sporządza się dwuniciowy DNA i po dobudowaniu końców poli-CD wprowadza się go do wektora takiego jak plazmid z jednym lub większą ilością markerów fenotypowych, d) sporządzonym tak wektorem transformuje się komórki bakterii po czym izoluje się i poddaje sekwencjonowaniu plazmidowy DNA, e) kodujący t-PA DNA wprowadza się do wektora ekspresji, którym transformuje się komórki gospodarza oraz, f) poddane transformacji komórki organizmu gospodarza hoduje się i z hodowli izoluje się pożądany ludzki tkankowy aktywator plazminogenu.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako aktywne wytwarzające ludzki tkankowy aktywator plazminogenu stosuje się ludzkie komórki czerniaka.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako komórki gospodarza do transformacji stosuje się prokariotyczne komórki takie jak e.coli, enterobacterioceae, eukariotyczne komórki takie jak drożdże, lub komórki vero, hela i cho.

   Fig.2.

   Hybrydyzacja kolonii
4. 7klonón cWA otrzymanych w oparciu o RNA 2 warstwy żelu wobec próbki sondującej ³²p-tc(£)CA(£)ta($)tccca

   Fg.3.

   Μ ι-ι

   -I ......

   I I

   I ^1-1 l-ι H HI łiH -§££

   Utl ..................ttJ , | ) £

   I I I I I I I

   500 1000 1500 2000 pary zasad

   Fig. 4.

   Bo/l

   2500

   GTTCTGAGCACAGGGCTGGAGAGAAAACCTCTGCGAGGAAAGGGAAGGAGCAA6CCGTGA

   ATTTAAGGGACGCTGTGAAGCAATGC -35 met asp ala met ATG GAT GCA ATG -30 lys arg gly GGG 1 eu CTC AAG AGA cys cys val leu leu leu cys -20 q1y ala va1 phe va1 ser pro ser TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC -10 gin q1u 11e his ala arg phe CAG GAA ATC CAT GCC CGA TTC arq arg gly ala arg 1 SER TYR GLN AGA AGA GGA GCC AGA TCT TAC CAA 10 VAL ILE CYS ARG ASP GLU LYS THR GLN MET ILE TYR GLN GLN HIS GTG ATC TGC AGA GAT GAA AAA ACG CAG ATG ATA TAC CAG CAA CAT 20 GLN SER TRP LEU ARG PRO VAL LEU ARG SER ASN 30 ARG VAL GLU TYR CAG TCA TGG CTG CGC CCT GTG CTC AGA AGC AAC CGG GTG GAA TAT 40 CYS TRP CYS ASN SER GLY ARG ALA GLN CYS HIS SER VAL PRO VAL TGC TGG TGC AAC AGT GGC AGG GCA CAG TGC CAC TCA GTG CCT GTC 50 LYS SER CYS SER GLU PRO ARG CYS PHE ASN GLY 60 GLY THR CYS GLN AAA AGT TGC AGC GAG CCA AGG TGT TTC AAC GGG GGC ACC TGC CAG 70 GLN ALA LEU TYR PHE SER ASP PHE VAL CYS GLN CYS PRO GLU GLY CAG GCC CTG TAC TTC TCA GAT TTC GTG TGC CAG TGC CCC GAA GGA 80 PHE ALA GLY LYS CYS CYS GLU ILE ASP THR ARG 90 ALA THR CYS TYR TTT GCT GGG AAG TGC TGT GAA ATA GAT ACC AGG GCC ACG TGC TAC 100 GLU ASP GLN GLY ILE SER TYR ARG GLY THR TRP SER THR ALA GLU GAG GAC CAG GGC ATC AGC TAC AGG GGC ACG TGG AGC A CA GCG GAG 110 SER GLY ALA GLU CYS THR ASN TRP ASN SER SER 120 ALA LEU ALA GLN AGT 6GC GCC GAG TGC ACC AAC TGG AAC AGC AGC GCG TT6 GCC CAG 130 LYS PRO TYR SER GLY ARG ARG PRO ASP ALA ILE ARG LEU GLY LEU AAG CCC TAC AGC GGG CGG AGG CCA GAC GCC ATC AGG CTG GGC CTG 140 GLY ASN HIS ASN TYR CYS ARG ASN PRO ASP ARG 150 ASP SER LYS PRO GGG AAC CAC AAC TAC TGC AGA AAC CCA GAT CGA GAC TCA AAG CCC 160 TRP CYS TYR VAL PHE LYS ALA GLY LYS TYR SER SER GLU PHE CYS TGG TGC TAC GTC TTT AAG GCG GGG AAG TAC AGC TCA GAG TTC TGC 170 SER THR PRO ALA CYS SER GLU GLY ASN SER ASP 180 CYS TYR PHE GLY AGC ACC CCT GCC TGC TCT GAG GGA AAC AGT GAC TGC TAC TTT GGG Fig.5A.

   ASN GLY SER ALA TYR ARG 190 GLY THR HIS SER LEU THR GLU SER GLY AAT GGG TCA GCC TAC CGT GGC ACG CAC AGC CTC ACC GAG TCG GGT ALA 200 SER CYS LEU PRO TRP ASN SER MET ILE LEU 210 ILE GLY LYS YAL GCC TCC TGC CTC CCG TGG AAT TCC ATG ATC CTG ATA GGC AAG GTT TYR THR ALA GLN ASN PRO 220 SER ALA GLN ALA LEU GLY LEU GLY LYS TAC ACA GCA CAG AAC CCC AGT GCC CAG GCA CTG GGC CTG GGC AAA HIS 230 ASN TYR CYS ARG ASN PRO ASP GLY ASP ALA 240 LYS PRO TRP CYS CAT AAT TAC TGC CGG AAT CCT GAT GGG GAT GCC AAG CCC TGG TGC HIS VAL LEU LYS ASN ARG 2 50 ARG LEU THR TRP GLU TYR CYS ASP YAL CAC GTG CTG AAG AAC CGC AGG CTG ACG TGG GAG TAC TGT GAT GTG PRO 260 SER CYS SER THR CYS GLY LEU ARG GLN TYR 270 SER GLN PRO GLN CCC TCC TGC TCC ACC TGC GGC CTG AGA CAG TAC AGC CAG CCT CAG PHE ARG ILE LYS GLY GLY 280 LEU PHE ALA ASP ILE ALA SER HIS PRO TTT CGC ATC AAA GGA GGG CTC TTC GCC GAC ATC GCC TCC CAC CCC TRP 290 GLN ALA ALA ILE PHE ALA LYS HIS ARG ARG 300 SER PRO GLY GLU TGG CAG GCT GCC ATC TTT GCC AAG CAC AGG AGG TCG CCC GGA GAG ARG PHE LEU CYS GLY GLY 310 ILE LEU ILE SER SER CYS TRP ILE LEU CGG TTC CTG TGC GGG GGC ATA CTC ATC AGC TCC TGC TGG ATT CTC SER 320 ALA ALA HIS CYS PHE GLN GLU ARG PHE PRO 330 PRO HIS HIS LEU TCT GCC GCC CAC TGC TTC CAG GAG AGG TTT CCG CCC CAC CAC CTG THR YAL ILE LEU GLY ARG 340 THR TYR ARG YAL VAL PRO GLY GLU GLU ACG GTG ATC TTG GGC AGA ACA TAC CGG GTG GTC CCT GGC GAG GAG GLU 350 GLN LYS PHE GLU YAL GLU LYS TYR ILE YAL 360 HIS LYS GLU PHE GAG CAG AAA TTT GAA GTC GAA AAA TAC ATT GTC CAT AAG GAA TTC ASP ASP ASP THR TYR ASP 370 ASN ASP ILE ALA LEU LEU GLN LEU LYS GAT GAT GAC ACT TAC GAC AAT GAC ATT GCG CTG CT6 CAG CTG AAA SER 380 ASP SER SER ARG CYS ALA GLN GLU SER SER 390 VAL VAL ARG THR TCG GAT TCG TCC CGC TGT GCC CAG GAG AGC AGC GTG GTC CGC ACT YAL CYS LEU PRO PRO ALA 400 ASP LEU GLN LEU PRO ASP TRP THR GLU GTG TGC CTT CCC CCG GCG GAC CTG CAG CTG CCG GAC TGG ACG GAG CYS 410 GLU LEU SER GLY TYR GLY LYS HIS GLU ALA 420 LEU SER PRO PHE TGT GAG CTC TCC GGC TAC GGC AAG CAT GAG GCC TTG TCT CCT TTC

   Fig.5B

   TYR SER GL U ARG LEU LYS 430 GLU ALA HIS YAL ARG LEU TYR PRO SER TAT TCG GAG CGG CTG AAG GAG GCT CAT GTC AGA CTG TAC CCA TCC SER 440 ARG CYS THR SER GLN HIS LEU LEU ASN ARG 450 THR VAL THR ASP AGC CGC TGC ACA TCA CAA CAT TTA CTT AAC AGA ACA GTC ACC GAC ASN MET LEU CYS ALA GLY 460 ASP THR ARG SER GLY GLY PRO GLN ALA AAC ATG CTG TGT GCT GGA GAC ACT CGG AGC GGC GGG CCC CAG GCA ASN 470 LEU HIS ASP ALA CYS GLN GLY ASP SER GLY 480 GLY PRO LEU YAL AAC TTG CAC GAC GCC TGC CAG GGC GAT TCG GGA GGC CCC CTG GTG CYS LEU ASN ASP GLY ARG 490 MET THR LEU YAL GLY ILE ILE SER TRP TGT CTG AAC GAT GGC CGC ATG ACT TTG GTG GGC ATC ATC AGC TGG GLY 500 LEU GLY CYS GLY GLN LYS ASP YAL PRO GLY 510 YAL TYR THR LYS GGC CTG GGC TGT GGA CAG AAG GAT GTC CCG GGT GTG TAC ACA AAG YAL THR ASN TYR LEU ASP 520 TRP ILE ARG ASP ASN MET ARG 527 PRO OP GTT ACC AAC TAC CTA GAC TGG ATT CGT GAC AAC ATG CGA CCG TGA

   CCAGGAACACCCGACTCCTCAAAAGCAAATGAGATCCCGCCTCTTCTTCTTCAGAAGACA

   CTGCAAAGGCGCAGTGCTTCTCTACAGACTTCTCCAGACCCACCACACCGCAGAAGCGGG

   ACGAGACGCTACAGGGAGAGGGAAGAGTGCATTTTCCCAGATACTTCCCATTTTGGAAGT

   TTTCAGGACTTGGTCTGATTTCAGGATACTCTGTCAGATGGGAAGACATGAATGCACACT

   AGCCTCTCCAGGAAT6CCTCCTCCCTGGGCAGAAGTGGCCATGCCACCCTGTTTTCGCTA

   AAGCCCAACCTCCTGACCTGTCACCGTGAGCAGCTTTGGAAACAGGACCACAAAAATGAA

   AGCATGTCTCAATAGTAAAAGAAACAAGAGATCTTTCAGGAAAGACGGATTGCATTAGAA

   ATAGACAGTATATTTATAGTCACAAGGGCCCAGCAGGGCTCAAAGTTGGGGCAGGCTGGC

   TGGCCCGTCATGTTCCTCAAAAGCGCCCTTGACGTCAAGTCTCCTTCCCCTTTCCCCACT

   CCCTGGCTCTCAGAAGGTATTCCTTTTGAGTACAGTGTGTAAAGTGTAAATCCTTTTTCT

   TTATAAACTTTAGAGTAGCATGAGAGAATTGTATCATTTGAACAACTAGGCTTCAGCATA

   TTTATAGCGATCCATCGTTAGTTTTTACTTTCCGTTGCCACAACCCTGTTTTATACCGTA

   CTTAATAAATTCGGATATATTTTTTCACAGTTTTTTCCAAAAAAAAAAAAAA

   Fig. 5C

   Q O^upoZOZStldzOJ °/₉ mmoiZ Ofbuoqjosq\j

   Czas (minuty}

   Fig. 8.

   pt-PAfrp!2 a b c d e f g h

   Fig. 10.

   ₉ΡΑΠ Dde A Kleno* Pol /.PstJ ' Wyodrębnienie fragmentu o~200bp o PA 25EI0 ^°^T W _► ^{P U} Wyodrębnienie fragmentu 0~1bb5bp ot'PAfrol2 EsLLJfSLl_ * ^p Wyodrębnienie fragmentu o~31Qbp ρΕ3ΜΔΡΙ t'⁰ R ‘ M A Barr^jl

   Mitg p£H£P niaittek\p£MMmi!2j^^CJL fM&iienie EcSi \ _f ffiioMfagmento 'μΓ Ί&

   punktowej tpom

   7vw

   Sacll o~fWÓbp

   Wczesny __ fcoPt/Dde I Pstl początek *ŚX Nar Z 5^

   Początek E. coli

   Bglll/BamHl

   Bakteryjna fosfaza alkaliczna

   Sacll

   DHFR

   Początek E.coli

   Sacff ywczesny 'miejsce mutacji punktowej

   Fig .11

   Fig. 12.