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JP2585532B2 - 動物細胞の形質転換体及びそれを得る方法並びにその形質転換体を用いてｔ−ＰＡを生産する方法 - Google Patents

動物細胞の形質転換体及びそれを得る方法並びにその形質転換体を用いてｔ−ＰＡを生産する方法

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JP2585532B2
JP2585532B2 JP61105824A JP10582486A JP2585532B2 JP 2585532 B2 JP2585532 B2 JP 2585532B2 JP 61105824 A JP61105824 A JP 61105824A JP 10582486 A JP10582486 A JP 10582486A JP 2585532 B2 JP2585532 B2 JP 2585532B2
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Mitsui Toatsu Chemicals Inc
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Description

【発明の詳細な説明】 （１） 産業上の利用分野 本発明は野性型DHFR遺伝子を優性選択マーカーとして
動物細胞に導入し、その一次転換体を一旦得た後更にDH
FR阻害剤を含む選択培地によって有用物質の生産性の高
い高次形質転換体を得る技術にかかわり、特には組織プ
ラスミノージェン活性化因子（本願書類の全文に於いて
このものをｔ−PAと略記している）の生産技術に有効に
利用できる。
言い換えれば、特定の遺伝子を含む形質転換体から特
定の手段に依って高次の形質転換体を得ること、これら
形質転換体は外来の野性型DHFR遺伝子を含んでいること
などにも特徴がある。
なお、DHFR遺伝子とはジヒドロ葉酸還元酵素をコード
する遺伝子のことである。
また本発明によると、産業上有用な野性型動物細胞に
薬剤耐性を付与して、これにより同時にヒトｔ−PA遺伝
子などの有用物質の構造遺伝子を含むベクターで形質転
換された細胞の選択を可能として、またさらに高次形質
転換体を得て従来の技術におけるより安定に高い収率で
有用物質を生産することが出来る。
（２） 従来の技術 本発明に関連する技術としては、野性型哺乳動物細胞
に対し変異DHFR遺伝子を優性選択マーカーとして使用し
て薬剤耐性を付与し、これにより同時にヒトｔ−PA遺伝
子を含むベクターで形質転換された細胞の選択を行った
例がある（特開昭59−183696）。
しかし従来技術では、野性型DHFR遺伝子を優性選択マ
ーカーとして用いたからといって形質転換体が安定して
えられる訳ではなく、又たまたま形質転換体が得られた
としてもそのもの形質発現は不安定なものでしかなかっ
た。
従って従来技術では、野性型細胞を宿主として用いる
場合に半DHFR欠損株を宿主としてｔ−PA生産株を得る方
法がとられてきた。
（３） 発明が解決しようとする問題点 従来技術では野性型細胞に対し変異DHFR遺伝子を優性
選択マーカー遺伝子として用いてMTX（メトトレキセー
ト）耐性を賦与して、これにより同時にヒトｔ−PA遺伝
子を含むベクターで形質転換された細胞の選択を行い、
得られた形質転換体をさらに高い濃度のMTX存在下で培
養することで遺伝子増幅を図り、ｔ−PA生産株を得る技
術が開示されていることは上記の通りである。
しかしながらこの従来技術での問題点は、第一に変異
DHFR遺伝子が突然変異によりその遺伝子産物の22番目の
アミノ酸がロイシンからアルギニンに変化していること
である。このような変異DHFR遺伝子が、あるいはその遺
伝子産物が、宿主として用いる野性型細胞に与える癌化
等の影響を問題が未解決であり、安全性の要求が厳しい
医薬品技術としては変異DHFR遺伝子の使用は未解決の問
題を孕んだ侭であるということである。
変異DHFRはMTXに対する結合親和力の点で野性型DHFR
と異り、僅かにその1/270にすぎない弱い性質がある。
故に変異DHFR遺伝子を使用する場合、高められた濃度
のMTX存在下で耐性株を得る一連の遺伝子増幅の操作で
は野性型DHFRの場合に比較してどうしても相当に高いMT
X濃度で形質転換細胞を培養せざるを得ない。
この濃度は、実際に野性型DHFR遺伝子を用いる場合よ
りかなり高い。そしてその様な高濃度のMTXは細胞にと
って有害であるから、その様な高濃度MTX存在下で得ら
れる耐性株はそれ自体がどうしても不安定であるので現
状の技術では充分に再現性の良い実用的な技術になりえ
ていない。
このような背景から変異DHFR遺伝子を用いたｔ−PA高
生産形質転換体を作成する方法は医薬品製造に使用する
技術としては未完成なものでしかない。
工業的な生産に有利に等物細胞を選択する場合、通常
用いられる細胞はDHFR遺伝子を発現する野性型である。
このような野性型細胞に対し野性型DHFR遺伝子を優性選
択マーカー遺伝子として使用することはその不安定性の
故に形質転換体を選択する上で困難が伴い、現実にチャ
イニーズ・ハムスター野性型細胞に野性型DHFR遺伝子を
使用した場合に安定なｔ−PA発現株は得られていない
（特開昭59−192089）。
そこで野性型細胞を材料としてDHFR欠損株を作成でき
れば、野性型DHFR遺伝子を選択マーカー遺伝子として使
用可能となると考えられるが、DHFR欠損株を作成する方
法それ自体が複雑かつ時間もかかり容易でないことの詳
細はUrlanb,G,＆ Chas−in,L.A,1980,Proc.Natl.Acad.S
ci.U.S.A.,77:4216に見られる通りである。
工業的生産に利用可能な動物細胞で野性型DHFR遺伝子
を優性選択マーカーとして使用可能となれば、変異DHFR
遺伝子使用の場合の欠点は消滅し、安定してヒトｔ−PA
等有用外来蛋白質を生産する再現性の良い極めて有利な
方法を与えるので発明者らはこの点につき鋭意研究を行
った。
（４） 問題点を解決するための手段 野性型動物細胞は有効濃度MTX存在下で細胞の内在的D
HFRは不活性化されてもはや生存はできない。
その野性型細胞に外来の野性型DHFR遺伝子が導入され
た場合、外来のDHFR遺伝子は内在するDHFRと同様上記の
有効濃度MTX存在下で不活性化されてしまうであろうか
ら、安定な形質転換体は得られないと言うことは従来技
術に基づいて容易に考えられることである。
しかしながら発明者らは、この点に関し工業的生産に
有利な動物細胞を宿主細胞として選び、その宿主細胞で
導入された野性型DHFR遺伝子が発現する条件あるいは組
み合わせを種々検討した結果、特許請求の範囲で示す構
成で全く意外にも上記の有効濃度MTX存在下で安定な形
質転換体を得ることに成功し一連の本発明を完成した。
本発明を利用すると、得られた形質転換体について従
来技術におけるより低い濃度（例えば0.25μＭ）のMTX
の存在下で遺伝子増幅の操作を行うので有効物質の生産
性が安定して高い形質転換体が得られる。
以下に本発明の具体例をｔ−PA生産を例にとって詳細
に説明する。
本発明の方法ではヒトｔ−PA遺伝子及び野性型DHFR遺
伝子を含むベクターを動物細胞に導入し、有効濃度MTX
を含む選択培地で形質転換体を選択し得られた形質転換
体について50μＭ以下の濃度のMTX存在下で選択マーカ
ー遺伝子増幅の操作を行いヒトｔ−PA遺伝子の同時増幅
したヒトｔ−PA高生産形質転換体を得、その形質転換体
でヒトｔ−PAが生産される。
ｔ−PAは、線維素溶解系（fibrinolysis）で働く酵素
であり、ｔ−PAが働くことにより血栓の構成成分である
フィブリンクロット（fibrin−clot）の溶解が始まるこ
とから血栓症における新規な治療薬として有用である。
ヒトｔ−PA遺伝子は癌細胞（Bowes melanma株）のmRN
Aより得たcDNA（Goeddel,D.V.et al.,1983,UK Patent
Application No.8312221）、正常細胞のmRNAより得たcD
NA、あるいはヒト染色体DNAより得たゲノムDNAクローン
（Ny,T.et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81:5
355）、として入手できる。
癌細胞由来のｔ−PA遺伝子と正常細胞由来のｔ−PA遺
伝子との間にはDNA塩基配列上いくつかの違いが認めら
れているので（Ny,T.et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.,81:5355）、その違いが細胞の癌化と無関係で
あるという証明がない現状では医薬の製造に正常細胞由
来ｔ−PA遺伝子を使用しなければならない。
ヒトｔ−PA遺伝子を動物細胞で発現させる為にはヒト
ｔ−PA遺伝子と発現制御DNA塩基配列が機能的に結合さ
れたベクターを使用してその動物細胞の形質転換を行
う。
発現制御DNA塩基配列とはプロモーター、読取終止及
びポリＡ付加シグナル、エンハンサー及びその他の発現
制御塩基の配列のことをいうが、宿主細胞として用いる
特定の動物細胞で効果的に働く必要がありまたその作用
が強い程良い。
例えば宿主細胞がチャイニーズ・ハムスター細胞であ
る場合SV40（Simian Virus 40）の発現制御DNA塩基配列
を用いれば良いが、これに限らずチャイニーズ・ハムス
ター細胞で高い発現を与える制御DNA塩基配列ならいか
なるものでも良い。
高活性を与えることが期待される発現制御DNA塩基配
列にはヒトメタロチオネインプロモーター（Krain,M.et
al.,1984,Nature,308:513）、マウスメタロチオネイ
ンプロモーター（Pavlakis,G.N.and Hamer,D.H.,1983,P
roc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80:397）、マウスMuLV−LTR
プロモーター（Anson,D.S.,et al.,1985,Nature.315:6
83）、ヒートショックプロモーター（ペーター・ブロム
レイ，リチャード・ボエルミー，特開昭59−192091）、
Adeno Virusプロモーター（Wood,W.I.,et al.,1984,Na
ture.312:330）、ヒトサイトメガロウイルスプロモータ
ー（Boshart,M.et al.,1985,Cell,41:521）等がある。
野性型DHFR遺伝子は野性型細胞からcDNAクローンある
いはゲノムDNAクローンとして単離でき得、例えばマウ
ス野性型DHFR遺伝子はcDNAクローンとして得られており
発現ベクターに組み込まれている（Lee,F.et al.,198
1,Nature.294:228）ので簡単に使用することができる。
動物細胞内で葉酸はDHFR（ジヒドロ葉酸還元酵素）に
よりテトラヒドロ葉酸に還元され、活性型となってチミ
ジル酸合成に関与する。葉酸のアナログであるMTXはDHF
Rに結合しDHFRの作用を阻害する。MTXによりDHFRの働き
が抑制されると核酸成分を含まない培地で細胞はもはや
生存できない。
野性型DHFR遺伝子を野性型動物細胞に導入し、普通な
ら宿主細胞の生存できない程の高い濃度のMTX存在下で
敢て形質転換体を得る為には、宿主である野性型細胞に
おいて外来のDHFR遺伝子の高発現がその生存のために必
要なことである。
外来のDHFR遺伝子の高発現の為には人工的に発現制御
DNAN塩基配列をDHFR遺伝子に結合しベクターを構築す
る。例えば宿主細胞がチャイニーズ・ハムスター細胞の
場合SV40（Simian Virus 40）の発現制御DNA塩基配列を
用いることができるが、これに限らずチャイニーズ・ハ
ムスター細胞で高発現を与える制御DNAならいかなるも
のでも良い。
ヒトｔ−PA遺伝子と野性型DHFR遺伝子が同一の発現ベ
クター上に存在している場合にはそのベクターによっ
て、ヒトｔ−PA遺伝子と野性型DHFR遺伝子が異なる発現
ベクター上に存在する場合にはそれぞれの発現ベクター
を適当な割合で混合したものによって宿主細胞を形質転
換する。
本発明のいう動物細胞とは、野性型細胞であればいか
なる細胞でも良い。
ヒトｔ−PAの工業的生産に使用する宿主細胞として望
ましい性質を列挙すれば、細胞がじょうぶで培養が容易
であること、成長速度が速いこと、高密度培養が可能で
あること、培養の血清の要求が低いこと、異種たんぱく
質の発現及び分泌能が潜在的に高いこと、異種たんぱく
質に糖付加を行う能力を有すること、内在的なｔ−PA様
物質の生産量が低いこと等の特徴である。
特にヒトｔ−PA遺伝子が癌細胞由来の遺伝子でない場
合、宿主細胞についても癌細胞由来でない細胞を選択す
ることが癌細胞由来でないことの特徴を出せるので望ま
しい。
実施例においてはチャイニーズ・ハムスター株化細胞
のなかでその卵巣細胞（CHO）及び肺細胞（CHL）のなか
から、上記の特徴をある程度満足する細胞を見出してこ
の細胞を宿主として用いるが、勿論宿主細胞はこれに限
るものではない。
本発明においてベクターDNAを宿主細胞へ導入する方
法には、後の段階の形質転換体の選択が過酷な条件で行
われるので高い収率でベクターDNAが導入できる方法で
あることが望まれる。例えばグリセリンショックを伴っ
た改良リン酸カルシウム法でベクターDNAを宿主に導入
する方法を用いると良い結果が得られる。
形質転換体を選択する選択培地は優性マーカー遺伝子
であるDHFAR遺伝子に対する選択圧をかける為に核酸成
分を含まないものを用いる。選択培地には宿主細胞が生
存できず形質転換細胞が生存できるもの、例えば宿主細
胞がチャイニーズ・ハムスター細胞である場合、選択培
地のMTX濃度として0.1μＭ〜10μＭ、好ましくは0.25μ
Ｍ〜１μＭを用いると良い。
形質転換体に導入された野性型DHFR遺伝子の遺伝子増
幅、及びそれに伴うヒトｔ−PA遺伝子の同時増幅は通常
の方法で行えば良い。DHAR遺伝子の増幅についてはよく
知られているがSchimake,R.T.,1982,in Gene Amplifica
tion,Edited by Schimke,R.T.,Cold Spring Harbor Lab
oratory,p1はこの場合の参考になるだろうし、形質転換
体中でのDHFR遺伝子と所望の遺伝子の同時増幅について
はRingold,G.et al.,1981,J.Mol.Appl.Genet.,１;16
5）が参考になるだろう。
本発明においてはある濃度のMTXには耐性である形質
転換細胞を更に２〜４倍高い濃度のMTX存在下で培養
し、より高い濃度のMTX耐性となった細胞を得、得られ
た細胞のうちｔ−PA生産量の高くなった細胞を選択する
といった方法を繰り返すことでｔ−PA高生産株を得るこ
とができる。
本発明の特色はMTXとの親和性の低い変異DHFR遺伝子
の代わりに野性型DHFR遺伝子を使用することにあるが、
このことが次の効果に結ついている。
すなわち変異DHFR遺伝子を用いる場合の遺伝子増幅で
使用するMTX濃度（50μＭ〜1,000μＭ）に比較して相当
低いMTX濃度0.25μＭ〜50μＭ、より好ましくは0.25μ
Ｍ〜20μＭ）で遺伝子増幅を行なうことができ、その結
果安定したｔ−PA高生産形質転換体を得ることができる
のである。
従来技術の延長で考えられるより遥かに低いMTX濃度
を用いるから本発明における（ｔ−PA高生産）形質転換
体は成長も良く、また継代培養後のｔ−PA生産能につい
ても安定している。
次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する
が、これにより本発明は何等制限されるものではない。
実施例 （１） プラスミドpSV−２のチャイニーズ・ハムスタ
ー細胞への導入及びヒトｔ−PA遺伝子の発現 いくつかのヒト正常細胞（染色体2n＝46）のうちｔ−
PA生産能の高い一株（MTC 017）を選び大量に培養し、
その培養細胞から全mRNAを抽出しオリゴdTセルロースを
使用してポリ（Ａ）+mRNAを分離回収した。
そのmRNAを用いてGublerとHoffmanの方法（Gubler,U.
and Hoffman,B.J.,1983,Gene,25:263）でcDNA遺伝子バ
ンクを作成した。
ヒトｔ−PAのアミノ酸配列を反映した合成オリゴヌク
レオチドプローブを用いてｔ−PAをコードするcDNAをク
ローン化した。ｔ−PA遺伝子の全塩基配列はMaxam−Gil
bert法（Maxam,A.M.and Gilbert,W.,1977,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.,74:560）で決定した。
発現プラスミドpSV−２（図面にその構成を示す）はp
ML（Lusky,M.and Botchan,M.,1981,Nature,239:79）由
来の細菌性複製起点とアンピシリン耐性マーカーを含む
DNA断片に、上記のヒトｔ−PA cDNA配列とマウスDHFR c
DNA配列（Lee,F.et al.,1981,Nature,294:228）のそれ
ぞれにSV40由来のエンハンサー，複製起点，プロモータ
ー，読取終止及びポリＡ付加シグナルを連結して組み込
み作成した。
宿主細胞としてはチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞
（CHO）及び肺細胞（CHL）を用いた（Elkind,M.M.and S
utton,H.,1960,Radiation Research,13:556）。
チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（CHO）あるいは
肺細胞（CHL）は５％牛胎児血清（FCS）を添加したダル
ベッコ変法イーグル培地（DME）で５％CO2を含む空気中
で37℃で培養した。
細胞を直径60mmのシャーレに５×105細胞／シャーレ
となるようにプレーティングした。
16時間培養後、細胞にpSV−2 DNA（５μｇ又は10μg/
シャレー）をリン酸カルシウム法（Graham,F.L.and Van
der Ed,A.J.,1973,Virology.52:456）にグリセロール
ショック（Parker,B.A and Stark,G.R.,1979,J.Virol.,
31:360）を加えた変法で導入した。
48時間培養した後、細胞をトリプシナイズし、数枚の
直径35mmのシャーレに細胞密度を1/10に減少させてプレ
ーティングし、0.25μＭのDHFR阻害剤であるMTXを含み
核酸成分を含まないDME−10％透析血清（選択培地）で
培養した。
３週間後、２枚のシャーレから39個のコロニーが出現
した。0.5μＭのMTXを含む選択培地を使用して同様の実
験を行うと0.25μM MTXの場合に比べ形質転換体の出現
頻度は低下した。
pSV−２のDNAを導入しなかった場合、宿主細胞は0.25
μM MTXを含む選択培地で全て死滅し、コロニーは出現
しなかった。
また、0.1μM MTXを含む選択培地では、宿主細胞はpS
V−2 DNA導入の有無に係わらず、耐性を示しコンフルエ
ントになるまで増殖した。
0.25μM MTX耐性となった16コロニーをクローニング
リングで分離し、12ウェルプレートに移して0.25μM MT
Xを含む選択培地でコンフルエントになるまで増殖させ
た。
新鮮な培地に交換して細胞を24時間培養し、培養上清
を15μ採取してフィブリンプレート法（Rijken,D.C.e
t al.,1979,Biochim.Biophys.Acta.,580:140）でフィ
ブリンクロット溶解活性を測定すると、12コロニーが活
性（10〜40U/ml）を示していた。
次に培養上清に抗ｔ−PA血清を混合するとフィブリン
クロット溶解活性は消失したが、同培養上清に抗UK血清
を混合しても活性は消失しなかった。
すなわち培養上清にｔ−PAが含まれていることが明ら
かである。
上述の12クローンについてそれぞれ25cm2フラスコで
増殖させた後、直径10cmのシャーレに低密度（102〜103
細胞／シャーレ）にプレーティングし、0.25μM MTXを
含む選択培地で約２週間培養して160の単一クローンを
分離した。
（２） ｔ−PA活性測定法 被験細胞が生産するｔ−PA量は以下の方法で検定し
た。
細胞が付着し増殖した25cm2フラスコから培地を取り
除き生理食塩水で洗浄後、少量の0.25％トリプシンを加
えて細胞をフラスコ底面から剥離した。
適当量の培地を加えて細胞を充分に懸濁した後、細胞
数を計算して希釈し、２×105または１×105細胞/mlの
細胞懸濁液を作成した。この懸濁液1mlを12ウェルプレ
ートのウェルに入れて24時間培養した後、培養上清15μ
を採取して前述のフィブリンプレート法でｔ−PA活性
を測定した。この24時間の細胞で細胞数の顕著な増大は
みられなかった。
このフィブリンプレート法では、50U/ml前後でｔ−PA
活性を測定すると再現性が良好であったので、高活性の
培養上清は、1/2〜1/8に希釈して測定に用いた。
（３） MTXによる遺伝子増幅 ｔ−PA生産形質転換体のｔ−PA生産量を増大させるた
めに前記（１）で得た160の単一クローンを材料とし、
以下の操作で遺伝子増幅を行った。
0.25μM MTX耐性形質転換体を直径10cmのシャーレに1
03〜105細胞／シャーレとなるようプレーティングし、
１μM MTXを含む選択培地で約２週間培養した。
出現したコロニーをクローニングリングで単離して24
ウエルプレートに移し90％コンフルエントまで増殖させ
た。
新鮮な培地に交換し、細胞を24時間培養後、培養上清
15μを採取してフィブリンプレート法でｔ−PA活性を
測定した。
高活性を示したクローンについては細胞を25cm2フラ
スコに移して培養し、前記（２）で述べた活性測定法に
より一定細胞数当たりのｔ−PA活性を測定し、ｔ−PA生
産能のより高いクローンを選んだ。
得られたｔ−PA高生産形質転換細胞をさらに高い濃度
のMTX存在下で培養し、耐性となった細胞のうちｔ−PA
生産量のより高い細胞を選択する操作を繰り返してｔ−
PA高生産形質転換体を得た。その結果の一部を表に示し
た。
得られたｔ−PA高生産形質転換体を約３ケ月間選択培
地で継代培養した後、再度活性を測定したところｔ−PA
生産能の低下は認められなかった。また、選択培地での
ｔ−PA高生産形質転換体の成長速度は細胞の倍加時間で
24〜40時間であった。
以上の通り本発明に依って、野生型DHFR遺伝子を選択
マーカーとして動物細胞に導入し、その一次転換体を一
旦得た後更にDHFR阻害剤を含む選択培地によって有用物
質の生産性の高い高次形質転換体を得ることが明らかで
ある。
【図面の簡単な説明】
図面は本発明にかかわる発現プラスミドpSV−２の構成
を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】野生型DHFR遺伝子、構造遺伝子及びSV40の
    発現制御DNA塩基配列を含み、該野生型DHFR遺伝子が機
    能的にSV40の発現制御DNA塩基配列に連結しているとこ
    ろのベクターを野生型哺乳動物細胞に導入して得られた
    一次転換体を、0.25μＭから１μＭの濃度のメトトレキ
    セート（MTX）を含む選択培地で培養し、その結果得ら
    れた細胞をさらに0.25μＭから50μＭの濃度のMTXを含
    む増幅培地で培養することにより該野生型DHFR遺伝子と
    該構造遺伝子の増幅を行って得られる有用物質生産性高
    次形質転換体。
  2. 【請求項２】野生型DHFR遺伝子がマウス由来である特許
    請求の範囲第１項記載の有用物質生産性高次形質転換
    体。
  3. 【請求項３】野生型DHFR遺伝子がマウス由来cDNAである
    特許請求の範囲第２項記載の有用物質生産性高次形質転
    換体。
  4. 【請求項４】構造遺伝子がヒトｔ−PA遺伝子である特許
    請求の範囲第１項記載の有用物質生産性高次形質転換
    体。
  5. 【請求項５】ヒトｔ−PA遺伝子が正常細胞由来である特
    許請求の範囲第４項記載の有用物質生産性高次形質転換
    体。
  6. 【請求項６】正常細胞がMTC 017株である特許請求の範
    囲第５項記載の有用物質生産性高次形質転換体。
  7. 【請求項７】MTC 017株由来のヒトｔ−PA遺伝子がcDNA
    である特許請求の範囲第６項記載の有用物質生産性高次
    形質転換体。
  8. 【請求項８】野生型哺乳動物細胞がチャイニーズ・ハム
    スター細胞である特許請求の範囲第１項記載の有用物質
    生産性高次形質転換体。
  9. 【請求項９】チャイニーズ・ハムスター細胞が野生型チ
    ャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（CHO）である特許請
    求の範囲第８項記載の有用物質生産性高次形質転換体。
  10. 【請求項１０】チャイニーズ・ハムスター細胞が野生型
    チャイニーズ・ハムスター肺細胞（CHL）である特許請
    求の範囲第８項記載の有用物質生産性高次形質転換体。
  11. 【請求項１１】野生型DHFR遺伝子、構造遺伝子及びSV40
    の発現制御DNA塩基配列を含み、該野生型DHFR遺伝子が
    機能的にSV40の発現制御DNA塩基配列に連結していると
    ころのベクターを野生型哺乳動物細胞に導入して得られ
    た一次転換体を、0.25μＭから１μＭの濃度のMTXを含
    む選択培地で培養し、その結果得られた細胞をさらに0.
    25μＭから50μＭの濃度のMTXを含む増幅培地で培養す
    ることにより該野生型DHFR遺伝子と該構造遺伝子の増幅
    を行って有用物質生産性高次形質転換体を得る方法。
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