Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych 9-hydroksyalkilopuryn o wzorze ogólnym 1, w którym X oznacza grupe OH, R1 oznacza a- tom wodoru lub alkil o 1—8 atomach wegla, R2 oznacza atom wodoru lub metyl.Otrzymywane sposobem wedlug wynalazku zwiazki sa immunomodulatorami, wykazuja dzia¬ lanie przeciwwirusowe i przeciwnowotworiowe jak równiez sa inhibitorami enzymów. Moga one rów¬ niez reagowac z solami amin i kwasu p-acetami- dobenzoesowego tworzac kompleksy, co w pewnych przypadkach wzmacnia wyzej wspomniane dziala¬ nie. Zwiazki kompleksowe przedstawia wzór ogól¬ ny 1A, w którym Y oznacza sól aminy o wzorze IB, w którym R3 i R4 oznaczaja nizsze grupy al¬ kilowe, to jest o 1—4 atomach wegla np. grupe metylowa, etylowa, propylowa, butylowa, izopropy- lowa lub izobutylowa, a n oznacza liczbe calkowi¬ ta 2—4, z kwasem p-acetamidobenzoesowym, zas z oznacza liczbe 1—10. Najkorzystniejsze sa sole o wzorze 1A, w którym Y oznacza p^acetamido- banzoesan dwumetyloa»minopropanolu-2 (skrót DIP.PAcBA).Dzialanie immunoregulujace wydaje sie zwiek¬ szac w miare wzrostu dlugosci lancucha w pod¬ stawniku R1, przynajmniej od grupy metylowej do heksylowej. Korzystnie R1 oznacza grupe n-alkilo- wa, to jest metylowa, etylowa, n-propylowa, n-bu- tylowa, n-amylowa, n-heksylowa, n-heptylowa lub n-oktylowa. i« 15 Nowe 9-hydrokfiyalkilopuryrny o ogólnym wzorze 1, w którym X oznacza grupe OH, R1 oznacza atom wodoru lub alkil Oy£—8 atomach wegla, a R2 oznacza atom wodoru lub metyl sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie, wprowadzajac do odpo¬ wiedniej 9-podstawiofiej 6-aminOpuryny w pozycji 6 grupe -OH przez dwuazowanie azotynem sodu.Korzystnie jako substrat stosuje sie 9-podstawio- na puryne, w której R1 oznacza n-alkil, zwlaszcza n-heksyl lub metyl.W tabeli 1 przedstawiono szereg substratów o- raz zwiazków wytworzonych z nich sposobem we¬ dlug wynalazku, a takze ich soli. Wszystkie tem¬ peratury podano w °C, a czesci i procenty wyra¬ zono wagowo.Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalaz¬ ku sa immunomodulatorami to jest zwiazkami re¬ gulujacymi immunoreakcje. Dotyczy to zarówno immunostymulacji (wzmocnienie immunoreakcji), jak i immunoinhibicji. Immunostymulacja jest o- czywiscie uzyteczna dla wyrobienia odpornosci. Im- munoinhibicja jest takze uzyteczna w wielu dzie¬ dzinach, np. przy przeszczepianiu organów, takich jak nerka lub serce, w celu zapobiegniecia odrzu¬ cenia organu. Zwiazki te wywieraja takze wzbu- dzajaco na rozmnazanie sie komórek w czasie immunizacji, dzialaja wiec jak mitogen.Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wyna¬ lazku sa uzyteczne w leczeniu ssaków (oraz komó¬ rek ssaków). I tak mozna je stosowac u swin, 134 228 •3 124 228 4 arna •+j £ leme M Anal o ¦i ^ 8 *-< WZO o zek ar • i-H £ N NPT £ W u W P< « co •N 1 CD* 5 +j i-H C/2 S s ^ X a 5 «^ go ^ ° ^ cci pera Lieni a §, 0) O H ^ ^ X tó t i-i co °l p. i-T i-T i-H i-H LO co oi CO r-\ co co o o LO LO CO CO ^H L Cvi 1 1 X o X X LO co ^ LO i-H O i-l CO LO CO" i-H LO i-H co co Th LO CO t i-H csT co co co co LO^ oo" LO co LO o CO < PQ o < PU PU hH Q X O X X co co tf LO t i-H o co ¦-T o" i-H i-l LO co o CO CO CO CO O O LO LO co co LO 1 4< T^ co 1 1 X o co X u X co "^ Tj< LO o !-) i-H co" i-H LO co co co -^ LO co [ LO co" LO co co co co co co" LO co co ^ 1—( < PQ a < PU CU )—i Q X 0 eo X o X [ ^ -^ LO LO CO co^ co^ co" co" co co ^ co r- co LO" LO" co co L^ LO oi" oi" tt* Tf • N 3 £ o o I i-H O i-H °°~ ^ ^ LO" LO" LO" i-H i-H i-H 00 H W co co co co co co i-H Ol i-H CO LO LO co co co 00 00 i-H 1 1 £ eo w o w i-H co ^ LO L Cr- co" LO co LO co co 1—I CD co o Ol 1—1 < PQ o < PU PU h-1 Q X £ co X u X co co ^ LO L i-\ CD CO LO CO co" co" i-H tH 00 i-H co co co co LO^ t-4 Ol CO LO co co co i-H 1 1 LO i-H co 1 1 X £ X eo o co co tH LO o tH o 00 co" i-H LO ^ co co i-H co co L LO i-T ^f CD co co LO^ i—r co co Ol co i-H < CQ o < PU PU t—1 Q £ w co o tF co ^ LO L i-H CO y-t LO^ O^ L" CD" co co CO H co co o o LO LO co co Ol Ol 1 1 co Ol i-H 1 1 w o X co *U u co ^ ^ LO o i-H i-H O) L" LO LO co co L- LO^ co" ^ LO LO co co LO LO co Ol LO co o LO i-H < PQ CJ < CU Pu I-H Q X o X co o ^ TjH ^ LO CD T^ i-^ CO^ i-T i-T co co LO LO *°L lo t" [" L i-H oT of LO LO • N 3 ^ p o t i-H O iH CT L^ CO O 00^ Oi^ i-i" o^ i-T i-H i-H i-H ^ o co co co co co co co O O LO LO LO LO co co co co co co 1 1 w o X co X co u C"" '-' ^ LO L L ^" co LO Ol co co LO co" co co LO o co < pq a < PU CU I-H Q X o X eo X co o 00 1—1 ^ LO CO 00 i-H O o" o" CO cvq co co Ol 00 I" t" HJ L <2 <= CO co • N ,3 U p o t i-\ O i-H ,-i CO^ i-l csf co" ^ ,-H rH i-H U*« co o co co co co co co o co ^ LO Tf< LO co co co co o co 1 1 ffi o eo X o co co u co Ol co LO L °l i-T "i-H LO ^ co co LO^ co" LO co 00 Ol i-H < PQ o < CU CU h-1 p X o eo X u co 1-1 co o o 1—l ^ LO co co co" co 1—1 L L" 00 LO co" LO 3 o L L [ Ol" o co co i-H co co 6—9 t i-H o X t__, -o Ul X X eo X o co X co o CD co Tt« LO ^ co co" co L co t" co LO co" LO si o i-H O i-H O L co^ i Ol" Ol CO LO co co co co Ol i-H LO LO co co124 228 5 6 psów, kotów, bydla, koni, owiec, kóz, myszy, kró¬ lików, szczurów, swinek morskich, chomików, malp i innych.Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalaz¬ ku mozna .podawac ssakom znanymi metodami, np. doustnie, donosowo, doodbytniczo, dopochwowo lub pozajelitowo. Mozna je stosowac w postaci roztwo¬ rów do wstrzykniec, np. roztworów wodnych albo w postaci tabletek, pigulek, kapsulek itd.Wzmacnianie dzialania biologicznego przez DIP.PAcBA.Stwierdzono, ze zwiazki oznaczone w tabeli 1 jako NPT 15392, NPT 15417 i NPT 15426 wykazu¬ ja jako takie silne dzialanie przeciwgrypowe. W jednym przypadku {zwiazku NPT 15392) addycja soli DIPPAcBA do NPT 15392 w celu otrzymania 15410 nie wzmaga dzialania przeciwgrypowegb. W przypadku NPT 15417 addycja soli DIPPAcBA w celu otrzymania 15418 zwieksza dzialanie przeciw¬ grypowe. Zestawienie wzglednej zdolnosci soli DIP.PAcBA do wzmacniania róznych dzialan biolo- ©icznych przedstawiono w tabeli 2.Tabela 2 Zwiazek 15392 15417 15446 15431 15433 15443 Sól DIP.PAcBA 15410 15418 15447 15432 15434 15444 Dzialanie przeciw¬ grypowe Oba równie aktywne tak ' tak tak tak tak Wzmoc¬ nienie dzialania przeciw- bialaczce tak — — — — — Wzmóc- immuno- reakcji tak tak — — — — Dzialanie NPT 15392 i NPT 15410 na myszy in vivo: wplyw na stymulowanie in vitro prolifera¬ cji komórek sledziony in vitro pod wplywem Con- kanawaliny A.Celem tego badania bylo okreslenie efektów le¬ czenia in vivo myszy zwiazkami oznaczonymi ja¬ ko NPT 15392 i 15410 na nastepna aktywnosc splenocytów wyizolowanych z tych zwierzat i oce¬ na in vitro ich proliferacji w odpowiedzi na mi- togen Conkanawaline A (Con A).Sposób postepowania. Dzialanie in vivo.Dziewiec samców myszy Balb w wieku 8—9 ty¬ godni, o ciezarze 18—20 g, podzielono na trzy pod¬ grupy. Jednej z nich podawano 2 razy dziennie {w ciagu jednego dnia) rano i po poludniu, doust¬ nie zwiazek NPT 15392 w dawce 10 mg/kg. Druga podgrupe traktowano podobnie zwiazkiem NPT 15410 w dawce 20 mg/kg. Trzecia podgrupa otrzy¬ mywala sól fizjologiczna i sluzyla jako grupa po¬ równawcza. Badania splenocytów in vitro: przy¬ gotowanie komórek.Nastepnego dnia zwierzeta poszczególnych pod¬ grup zabijano, usuwano im sledziony i zbierano w obrebie podgrup. Sledziony rozdrabniano, a uzy¬ skane komórki przemywano pozywka RPMI-1640 (Grand Island Biological), zawierajaca dodatkowo 2 mm glutaminy i antybiotyki. Oznaczono stezenie * komórek w kazdym preparacie za pomoca licznika Coultera i wartosc stezenia doprowadzono do 5 X X 10* komórek/ml pozywka RPMI. Próba mikro- miareczkowania na plytce.Próby mikromiareczkowania prowadzono w obje- tosciach 0,2 ml zawierajacych 5:X 10s komórek i Con A lub Con A i badane zwiazki w podanych stezeniach. Wszystkie próby prowadzono z 6 po¬ wtórzeniami i porównywano ze slepa próba zawie¬ rajaca tylko komórki. Plytki do prób inkubowano w ciagu 4 dni w inkubatorze"w temperaturze 37° w atmosferze 5°/o COz. W ciagu ostatnich 18—20 godzin inkubacji do studzienek dodawano 0,5 ml 8HTdR (10 juCi/ml, 6 ^Ci/milimol). Z hodowli po¬ brano próbki za pomoca urzadzenia automatycz¬ nego do pobierania próbek (MASH) i okreslono za pomoca cieczowego licznika scyntylacyjnego Beck- man IS 8000 ilosc wprowadzonego 3HTdR jako mia¬ re proliferacji komórek. Wyniki zestawiono tabe¬ larycznie jako stosunek aktywnosci proliferacyjnej uzyskanej w hodowli zawierajacej Con A lub Con A i badano zwiazki w odniesieniu do slepej pró¬ by.Podawanie in vivo zwiazku 15392 lub zwiazku 15410 wzmaga nastepujaca reakcje splenocytów w warunkach hodowli in vitro na stymulacje za po¬ moca Con A przy suboptymalnym stezeniu mito- genu (5 ng/ml). W przypadku Splenocytów wyizo¬ lowanych z myszy poddanych dzialaniu 15392 sto¬ sunek stymulacji wynosil 120:1, podczas gdy sto¬ sunek ten w przypadku splenocytów wyizolowa¬ nych z myszy z grupy kontrolnej wynosil 40:1.Nie zanotowano znacznych róznic w przypadku za¬ równo zwiazku 15392, jak i 15410, gdy stymulacje komórek prowadzono przy bardziej optymalnym stezeniu Con A (10 figjml).Badano równiez dzialanie NPT 15392 i 15410 przy dawce 1 M-gtal na stymulowane komórki in yjtro przez Con A. Oba badane zwiazki wykazaly ^znaczna zdolnosc zwiekszania stymulacji Con A, zwlaszcza przy suboptymalnym stezeniu mitogenu (5 ,ag/ml) oraz w mniejsznym stopniu przy 10 pg/ /ml. Przy stezeniu Con A 5 Lig/ml stymulacja zwiazkiem NPT 15392 byla 2,8 raza wieksza niz w przypadku samej Con A, a w obecnosci NPT 15410 3,3 raza wieksza.Rezultaty te wskazuja na fakt, ze badane zwiaz¬ ki wywieraja wplyw immunomodulujacy na roz¬ mnazanie splenocytów. Uprzednie podzialanie ha zwierzeta kazdym z badanych zwiazków uczula komórki na zachodzaca nastepnie stymulacje mi- togeniczna, podczas gdy podzialanie badanymi zwiazkami na komórki in vitro, po których naste¬ puje stymulacja mitogeniczna, wzmacnia reakcje proliferacyjna.Sposób wedlug wynalazku jest blizej wyjasniony w nastepujacych przykladach.Przyklad I. Wytwarzanie 9-{2-hydroksypropy- lo-l) hipoksantyny (NPT 15446).Przebieg reakcji przedstawiono na schemacie 1. u 20 25 30 35 40 48 50 55 60 $124 228 8 9-(2-hydroksypropylo-l)adenine (NPT 15431) (4,0 g, 20,7 milimoli) przeprowadza sie w zawiesine w 50% kwasie octowym (20 ml) i powoli dodaje azo¬ tyn sodowy, (4 g, 58 milimoli), Calosc miesza sie w temperaturze 25° w ciagu 3 godzin. Powstaly roztwór odparowuje sie do sucha i do pozostalo¬ sci dodaje izopropanol.Zabieg ten powtarza sie ponownie. Stala pozo¬ stalosc zagofowuje sie w izopropanolu i saczy. Prze¬ sacz odtparowuje sie, a pozostalosc krystalizuje do¬ dajac aceton, a nastepnie przekrystalizowuje z mieszaniny izopropanol/metanol (98 :2). Uzyskuje sie bezbarwny krystaliczny produkt w ilosci 3,3 g (wydajnosc 82°/o) o temperaturze topnienia 244— 250°. i widmie . w ultrafiolecie UV (H2Ó: pH 5,5) A. max 25Q nm, zidentyfikowany jako 9(2-hydro- ksypropylo-Dhipoksantyna (NPT 15446).Wyjsciowa 9^(2-hydroksypropylo-l)adenine (NPT 15431) wytwarza sie stosujac w pierwszym etapie sposób opisany przez Schaeffera, HJ, Vogela D. i Vince R., J. Med. Chem. 8, 502 (1965) oraz Schaef¬ fera JL J. i Vinee R., J. Med. Chem. 10, 689 (1967).Roztwór 20 g (0,12 mola) 5-amino-4,6-dwuchloro- pirymidyny w lla/o etanolowym roztworze izopro- paoioloaminy (2Q0 ml) ogrzewa sie w ciagu 8 go¬ dzin w warunkach wrzenia pod chlodnica zwrotna.Mieszanine reakcyjna odparowuje sie do uzyskania syropu^ do którego dodaje sie etanol i ponownie - odiparowuje..r—. operacje te powtarza sie jednokrot¬ nie. Otrzymany syrop wylewa sie do wody (300 »ml), otrzymujac krystaliczna mase, która odsacza sie, przeinywa woda i suszy, otrzymujac 19 g su¬ rowej 9^2-hydroksypropyloa-mino*l)-5-amino-6- . ^chloropirymidyny^ Otrzymany surowy produkt przeprowadza sie w zawiesine w ortomrówczanie trójetyhl (120 ml), do któpego dostaje sie kwas e- tanoaulfonowy <5 kropli). Po 15 minutach calosc sta^j substancji rozpuszcza sie i roztwór prze¬ chowuje w ciagu nocy w temperaturze 25°C. Po odparowaniu pod zmniejszonym cisnieniem otrzy¬ muje sie gesty syrop, który odparowuje sie pod wyaoce zmniejszonym cisnieniem w celu usuniecia nadmiaru izopropanoloaminy. Po krystalizacji z /ksylenem v otrzymuje sie 5 g surowej 9-(2-hydro- k^ypropylo-i)^6-«hloropuryny. % g (4$5 milimoli) 9-(2-hydroksypropylo-l)-6-chlo- ropuryny rbzpuazcza sie w nasyconym metanolo¬ wym rotftworze amoniaku i chlorku amonu (50 mg). Mieszanine ogrzewa sie w bombie do prowa¬ dzenia reakcji w ciagu 6 godzin w' temperaturze *13Q°C* Otrzymafcy roztwór odparowuje sie do su¬ cha i przekrystalizowuje z mieszaniny etanol/ace¬ ton. Otrzymuje sie 6,68 g bezbarwnego krystalicz¬ nego produktu (wydajnosc 81%) o temperaturze . topnienia 193r*-184?C, widmie w ultrafiolecie (H^O, pH^ 5,5) imax 260 nm i wskazniku Rf przy podda¬ waniu chromatografii cienkowarstwowej w miesza¬ ninie CHC13 : MeOH (5 :1) wynoszacym 0,44. Pro¬ dukt ten stanowi 9-(2-hydxoksypropylo-l)adenina (NPT 15431)..Przyklad II. Wytwarzacie Ml-hydroksypro- pylo-2)-hipoksantyny (NPT ,15443).Przebieg reakcji przedstawiono na schemacie 2. 9-(l-hydrctaypropylo-2)^denine (4 g, 21 mili¬ moli) rozpuszcza sie w 50"9/© kwasie octowym (20 ml) dodaje sie azotyn sodowy (4 g, 58 milimoli) i calosc miesza sie w temperaturze 25° w .ciagu 3,5 5 godzin. Roztwór odparowuje sie dwukrotnie do su¬ cha z izopropanolem. Pozostalosc roztwarza sie w izopropanolu i saczy, odrzuca osad, a przesacz od¬ parowuje sie, uzyskujac zel zestalajacy sie po do¬ daniu acetonu. Otrzymuje sie 3,65 bezbarwnych 10 krysztalów (wydajnosc 9(M). Po przekrystalizowa- niu z mieszaniny izopropanol/metanol (98 :2), pro¬ dukt topnieje w temperaturze 202—207°. Poddany chromatografii cienkowarstwowej przy uzyciu CHCla: MeOH (5 :1) wykazuje 1 plamke przy 15 Rf = 0,30. Widmo w ultrafiolecie (H20 pH 5,5) W 250 nm.Wyjsciowa 9-(l-hydroksypropylo-2)adenine (NPT 15433) wytwarza sie w nastepujacym ciagu reak¬ cji. 20 Wytwarzanie 9-(l-hydroksypropylo-2)-6-chloropu- ryny (NPT 15423). Stosuje sie sposób opisany przez Schaeffera H. J. i Schwendera C. F., J. Med. Chem. 16, 6 (1974).Roztwór 5-amino-4,6-dwuchloropirymidyiny (6,56 g, 40 milimoli) i 2-aminopropanoIu-l (3,3 g, 44 mi- limola) ogrzewa sie w 288 ml n-pentanolu i 96 ml Illrz.butyloaminy w ciagu 45 godzin w wa¬ runkach wrzenia pod chlodnica zwrotna w atrtios- 30 ferze azotu. Roztwór odparowuje sie do otrzyma¬ nia syropu, do którego 4-krotnie dodaje sie etanol i odparowuje. Otrzymany syrop przeprowadza sie w zawiesine w 150 ml ortomrówczanu trójetylu i dodaje sie 10 kropli kwasu etanosulfonowego. Za- ^ wiesine miesza sie intensywnie w ciagu nocy, na¬ stepnie odparowuje sie do sucha dodaje etanol i operacje te powtarza sie 3nkrotnie.Podczas odparowania nastepuje krystalizacja bez¬ barwnego produktu. Krysztaly odsacza sie, a prze- 40 sacz odparowuje, dodaje etanol i operacje te po¬ wtarza sie 3-krotnie, otrzymujac 3,6 g surowego produktu. Po przekrystalizowaniu • z 98*/o wodnego roztworu etanolu otrzymuje sie 2,79 g 9-(l-hydro- ksypropylo-2)-6-chloropuryny (NPT 15423) o tem- «9 paraturze topnienia 201-^203°C i widmie w ultra¬ fiolecie (H20, pH 5,5) Xmax 265 nm (wydajnosc 32M).Wyniki analizy elementarnej: dla C8H9N4OCL obliczono: C 45,20, H 4,26, N 26,36, Cl 16,68 so znaleziono: C 45,U, H 4,27, N 26,25, Cl 16,71.Wytwarzanie 9-(l-hydroksypropylo-2)adeniny.(NPT 15433).Postepuje sie zgodnie ze sposobem opisanym przez Schaeffera H. i Schuendera C, J. Pharm. 55 Sci., 60, 1204 (1971). A takze Schaeffera i innych, J. Med. Chem. 15, 456 (1972). ~9-(l-hydroksypropylo-2)-6-chloropuryne (2,0 g, 94 milimola) przeprowadza sie zawiesine w miesza¬ ninie metanol/amoniak (30 ml) i jako katalizatora 60 dodaje sie 50 mg chlorku amonu, mieszanine 0- grzewa sie- w. ciagu 4,5 godz. w temperaturze 130°C i powstaly roztwór odparowuje sie do sucha.. Prze- krystalizowanie otrzymanego surowego produktu z etanolu daje zwiazek NPT 15433 w postaci bez- .15 barwnych igiel w ilosci 1,15 g (wydajnosc 63P/t) o9 124 228 10 temperaturze topnienia 215—216°C i widmie w ul¬ trafiolecie (H2O, pH 5,5) Amax 260 nm.Przyklad III. Wytwarzanie erytro-9-(2-hydro- ksynonylo-3)hipoksantyny (NPT 15392).Synteze erytax-&(2-hydroksynonylo-3)hipoksantyny (Nottylohypoksantyna) pokazano na schemacie 4, a wytwarzanie wyjsciowej erytro-9-(2-hydroksyno- nylo-3)adeniny na schemacie 3. Stanowi on ulep¬ szenie w stosunku do metody Schaeffera H. J. i Schwendera C. F., J. Med, Chem. 17, 6 (1974) pro¬ wadzacej do powstania erytro-9-(2-hydroksynony- lo-3)-6-chloropuryny.Wytwarzanie erytro-9^(2-hydroksyrionylo-3)-hy- poksantyny (przez odaminowanie substratu) jak przedstawiono na schemacie 4.Do roztworu erytro-9-<2-hydroksynonylo-3)-ade- niny (4,0 g, 14 mmoli) w SOP/t kwasie octowym (20 ml) i 1 N HC1 (3,2 ml), o temperaturze 25°, do¬ daje sie mieszajac azotyn sodu (5,6 g, '71. mmoli).Calosc miesza sie w temperaturze 25°C w. ciagu dwóch godzin. Po tym czasie analizuje sie widmo w ultrafiolecie. Gdy wartosc maksymalna osiaga 250 nm, roztwór neutralizuje sie 2 N NaOH. Uzy¬ skany w efekcie osad odfiltrowuje sie i przemywa H20. Wydajnosc 3,03 g (75*/e) temperatura topnie¬ nia 195°C. Badana próbke przekrystalizowuje sie (3 X) z wody, otrzymujac produkt o temperatu¬ rze topnienia 202Q.Wynik analizy dla C14H22N4O2: .obliczono: C 60,40, H 7,96, N 20,13 znaleziono: C 60,40, H 7,90, N 20,12.Wyjsciowa erytro-9-(2-hydroksy-3-nonylo)adenine wytwarza sie, jak wspomniano poprzednio, w wie^ loetapowej syntezie przedstawionej na schemacie 3, wychodzac z kwasu 1-aminokaprylowego. Licz¬ by pod strzalkami na schemacie 3 oznaczaja wy¬ dajnosc reakcji.Etap 1. Wytwarzanie 3-acetamidononanonu-2.Mieszanine kwasu 1-aminokaprylowego (200 g, 1,26 mola) i bezwodnika octowego (960 ml) oraz pi¬ rydyny (640 ml) ogrzewa sie na lazni z wrzacej wody w ciagu 4 godzin. Mieszanine reakcyjna od¬ parowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem, a po¬ zostalosc ekstrahuje 6—8 razy 5tyo wodnym roz¬ tworem NaHC03 (400 ml) i eterem (400 ml). Po¬ laczone ekstrakty eterowe suszy sie bezwodnym MgSO* i odparowuje do sucha, otrzymujac 154 g (70P/o) surowego 3-acetamidononanQnu-2.Etap 2. Wytwarzanie chlorowodorku 3-aminono- , nanonu-2^ Surowy 3-acetamidononanon otrzymany jak opi¬ sano w etapie 1, (154 g) rozpuszcza sie w steze- nym wodnym roztworze HC1 (1540 ml) i ogrzewa w temperaturze wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 2 godzin, a nastepnie odparowuje do su¬ cha pod zmniejszonym cisnieniem. Powstala stala substancje przekrystalizowuje sie z cieplego roz¬ tworu W etanolu (200 ml), a nastepnie ochladza sie d$r temperatury 25° i dodaje eter (600 ml). Wy¬ traca sie krystaliczna stala substancja bialej bar¬ wy, która pozostawia sie w ciagu nocy w tempe¬ raturze &QC- Wytracona substancje odsacza sie i przemywa raz eterem (100 ml), otrzymujac 125 g (67M) krystalicznego produktu bialej barwy, top¬ niejacego z rozkladem w temperaturze 112°C.Gdy krystaliczny produkt nie ma bialej barwy lub topi sie w nizszej temperaturze, nalezy pod¬ dac go rekrystalizacji z tetrahydrofurainu z uzy¬ ciem wegla aktywnego. W jednym takim zabiegu uzyto 150 ml hydrofuranu na 100 g surowego chlo¬ rowodorku.Etap 3. Wytwarzanie erytro-3-aminononanolu-2.Chlorowodorek 3-aminononanolu-2 (43,8 g 0,226 mola) rozpuszcza sje w absolutnym metanolu (150 ml) i ochladza w kapieli z lodu i sola do tempe¬ ratury ^10° (1). W ciagu 2—3 godzin dodaje sie w malych porcjach borowodorek potasu (2). Mie¬ szanine pozostawia sie w temperaturze od —10° do —15°C, w ciagu 3 godzin (3, 4), po czym pozwala jej powoli osiagac temperature pokojowa (22°), a nastepnie poddaje sie ja mieszaniu w ciagu no¬ cy (20 godzin) w temperaturze pokojowej. Nastep¬ nie mieszanine odparowuje sie do sucha (syrop) pod zmniejszonym cisnieniem i ekstrahuje H20 (150 ml) i chloroformem (150 ml). Warstwe wodna poddaje sie dalszej ekstrakcji (3 X) chloroformem (100 ml za kazdym razem). Warstwe chloroformo¬ wa suszy sie MgS04 i odparowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem, otrzymujac oleisty produkt lek¬ ko zóltawej barwy. Ciecz te poddaje sie destyla¬ cji pod bardzo niskim cisnieniem w temperaturze 95°—100° (20 Pa) otrzymujac czysty erytro-3-ami- nononanol-2, w ilosci 26,4 g, z wydajnoscia 7&/t, o temperaturze topnienia 81°—86°. (1) W czasie chlodzenia roztworu chlorowodorku 3-aminononanonu-2 wytraca sie nieco substancji, co nie ma wplywu na przebieg reakcji. (2) W tym punkcie tok postepowania rózni sie od przyjetego przez Schaeffer'a. i wspólpracowni¬ ków. Schaeffer dodaje kwas octowy razem z KBH4, utrzymujac pH 5—6. Stwierdzono, ze zobo¬ jetnienie pociaga za soba straty KBH4 oraz ze pH powyzej 5 nie jest szkodliwe. Wazniejszy jest fakt, ze równoczesne dodawanie kwasu octowego i KBH4 (co proponuje Schaeffer) bardzo utrudnia kontrole reakcji. Temperatura znacznie wzrasta, a wydaj¬ nosc i/lub jakosc produktu ulegaja pogorszeniu. (3) Zaleca sie stosowanie intensywnego miesza¬ nia dla zapewnienia prawidlowego przebiegu reak¬ cji, która dobiega konca gdy znikna wszystkie ma¬ le kawalki i czastki borowodorku potasu. (4) Chlodzenie w temperaturze 0°, jak to opisa¬ li Schaeffer i wspólpracownicy (Biochemistry 4, 71 (1965) jest niewystarczajace. Ulepszenie polega na utrzymywaniu temperatury reakcji znacznie po¬ nizej 0°, najlepiej przez caly czas ponizej —10°.Gdy dopusci sie do wzrostu temperatury powyzej —10°, wydajnosc moze sie powaznie zmniejszyc.Etap 4. Wytwarzanie erytro-5-ammo-4-chloro-6- ^(2-hydroksynonyloamino-3)pirymidyny.Sporzadza sie mieszanine 4,6-dwuchloro-5-ami- nopirymklyny (24,6 g, 0,15 mola) i erytro-3Tamino- nonanolu-2 (26,2 g, 0,164 mola) w pentanolu-1 (1030 ml) i trójbutyloaminie (350 ml) mieszajac skladni¬ ki w temperaturze 25°. Powstala zawiesine ogrze¬ wa sie w atmosferze azotu w temperaturze wrze¬ nia pod chlodnica zwrotna w ciagu 28 godzin (roz- 10 15 20 25 30 35 40 45 60 55 6011 twór powstaje po uplywie okolo 0,5 godziny). W tym czasie wartosc ^max w widmie UV próbki pro¬ duktu reakcji wynosi 267 i 297 nm (H20, pH 5,5).Powstaly roztwór zateza sie na lazni z goraca woda pod cisnieniem 1333,22 Pa do konsystencji syropu, po czym odparowuje dalej na lazni olejo¬ wej w temperaturze 100° i pod cisnieniem 13,33 Pa, otrzymujac lepka ciecz, do której dodaje sie n-heksan (450 ml). Mieszanine ogirzewa sie w tem¬ peraturze wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 1 godziny, po czym od cieczy na dnie okragloden- nej kolby oddziela sie górna goraca warstwe cie¬ czy zawierajacej heksan, zabarwiona zólto.Otrzymany jasnobrazowy olej, z którego odparo¬ wano pod zmniejszonym cisnieniem wszelkie po¬ zostalosci heksanu, rozpuszcza sie w chloroformie (150 ml). Roztwór chloroformowy poddaje sie o- smiokrotnie ekstrakcji nasyconym wodnym roz¬ tworem NaHCC3 (250 ml za kazdym razem). War¬ stwe chloroformowa oddziela sie, suszy (za pomo¬ ca siarczanu sodowego lub magnezowego) i odpa¬ rowuje pod bardzo niskim cisnieniem (13,32 Pa) w temperaturze 40° (laznia wodna), otrzymujac olej jasnobrazowej barwy, który zestala sie po ochlo¬ dzeniu. Substancje te mozna stosowac bezposrednio w nastepnym etapie lub oczyszczac w nastepujacy sposób. Powstaly olej rozpuszcza sie w 75—100 ml chloroformu i dodaje n-heksanu (okolo 300 ml) w celu wytracenia krystalicznej substancji stalej o bialej barwie, która odsacza sie z ochlodzonego roztworu (Ekstrakcje prowadzi sie 4—8 razy, az przestaje sie wydzielac dwutlenek wegla). Ten tok postepowania powtarza sie dwukrotnie. Wydajnosc: 23,3 g (54°/©), widmo UV: Xmax 267, 297 (HsO, pH 5,5), temperatura topnienia 113—116°.Etap 5. Wytwarzanie erytro-9-(2-hydroksynonylo- -3)-6-chloropuryny.Surowy syrop otrzymany jak opisano w etapie 4 zawierajacy erytro-5-amino-4-chloro-6-(2-hydro- ksynonyloamino-3)pirymidyne (11,48 g, 40 milimoli) rozpuszcza sie w ortomrówczanie etylu (106 ml) i dodaje chloroform {34 ml) oraz kwas etanosulfono- wy (10 kropli). Roztwór pozostawia sie w ciagu nocy w temperaturze 25°, a nastepnie odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem do konsystencji sy¬ ropu. Wydajnosc 11,7 g (ilosciowa). Syrop ten, któ¬ ry stanowi surowa erytro-9-(2-hydroksynonylo-3)- -6-chloropuryna uzywa sie w nastepnym etapie.JL,, 264 nm. max Etap 6. Wytwarzanie erytro-9-(2-hydroksynony- lo-3)-adeniny.Surowa oleista erytro-9-(2-hydro^ksynonylo-3-)-6- -chloropuryne (6,15 g) otrzymana jak opisano w etapie 5 rozpuszcza sie w nasyconym metanolowym roztworze amoniaku (300 ml) i chlorku amonowe¬ go (1 gj, prowadzac rozpuszczenie w temperaturze 80—100° w ciagu 1 godziny w kolbie ze stali nie¬ rdzewnej (Parr Instruments). Po ochlodzeniu -roz¬ twór odparowuje sie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem.Do pozostalosci dodaje sie metanol i odparowuje ponownie (3 razy) w celu odpedzenia nadmiaru a- moniaku. W celu identyfikacji, pozostalosc o kon¬ systencji syropu przeprowadza sie w postac chlo- !4 228 12 rowodorku rozpuszczajac ja w alkoholu metylo¬ wym i przeprowadzajac przez roztwór pecherzyki bezwodnego HC1, utrzymujac temperature ponizej 20° (laznia wodno-lodowa). HC1 przepuszcza sie w 5 ciagu 1/2 godziny, po czym mieszanine chlodzi sie do temperatury 5°. Osad odsacza sie przez lejek z wkladka ze spiekanego szkla, przemywa alkoho¬ lem metylowym i suszy na powietrzu. Wydajnosc 6,0 g (92!°/o), temperatura topnienia 173—175° (z 10 rozkladem), widmo UV: Xmax 260 nm (w H20, pH 5,5).Przyklad IV. Oczyszczanie erytro-9-(2-hydro- ksynonylo-3)hipoksantyny.Surowa nonylohipoksantyne oczyszcza sie droga rekrystalizacji. Surowa substancje rozpuszcza * sie przez ogrzanie z 6—10-krotnym wagowym nadmia¬ rem alkoholu etylowego, po czym dodaje sie wo¬ de w ilosci równej pod wzgledem objetosci. Roz- twór poddaje sie w kolbie Erlenmeyera dzialaniu wegla aktywnego i przesacza na goraco przez ce- lit. Roztwór odparowuje sie przy ciaglym miesza¬ niu na goracej plytce. Dla nastapienia odparowu¬ jacej cieczy dodaje sie malymi porcjami wode do chwili pojawienia sie duzej ilosci wytracajacej sie substancji. Odparowanie rozpuszczalnika w celu odpedzenia alkoholu etylowego prowadzi sie nadal, dodajac H20 do osiagniecia objetosci odpowiada¬ jacej 8—12-krotnej wadze substancji. W kaidym 30 zabiegu rekrystalizacji strata substancji wynosi o- kolo lOtyo. Dwa zabiegi rekrystalizacji powoduja wzrost temperatury topnienia do 202°, przy czym otrzymuje sie bezbarwny produkt krystaliczny, podczas gdy produkt surowy ma zabarwienie nieco 35 zólte lub rózowe i topnieje w temperaturze 192°.Przyklad V. Wytwarzanie kompleksu 9-(2-hy- droiksy-3-nonylo)-6-hydroksypuryny (oznaczonego symbolem NPT 15410). 0,1 mmoli 9-(2-hydroksy-3Hnonylo)-6-hydroksypu- 40 ryny (NPT 15392) (27,9 mg) i 0,3 mmoli 4-(aoetylo- amino)benzoesanu dwiumetylo-2-hydroksypropyloa- moniiowego (DIPPAcBA) (77,1 mg) odwaza sie do¬ kladnie i rozpuszcza w 105 ml 25% weglanu sodu (Na2C03), otrzymujac Ó,l»/o roztwór NPT 15410 45 (zwiazek powstaly z NPT 15392 i DIP.PAcBA w stosunku molowym 1 :3. Zwiazek ten po wykrysta¬ lizowaniu ma temperature topnienia 198°C.Postepujac jak opisano wyzej i stosujac rów¬ nowazne ilosci zwiazku wyjsciowego, otrzymuje 50 sie nastepujace kompleksy: 9-(2-hydroksy-l^propylo)hipoksantyna. DIP.PAcBA (oznaczony jako . NPT 15447) o temperafairze top¬ nienia 142°C, 9- 55 (oznaczony jako "NPT 15444) o temperaturze top¬ nienia 150°C, 9-(l-hydrofcsy-2-oktylo)hiipoksantyna. DIPPAcBA (oznaczony jako NPT 15418) o temperaturze top¬ nienia 205°C, 60 9-(l-hydroksy-2-etylo)-hipoksantyna. DIPPAcBA (o- znaczony jako NPT 15428) o temperaturze topnie¬ nia 205°.Dowód na powstanie kompleksu. Badania roz¬ puszczalnosci fazowej, prowadzone z NPT 15392 «5 i DIPPacBA wykazaly, ze NPT 15392 posiada s124 22$ 13 zwiekszona rozpuszczalnosc przy zwiekszajacych sie stezeniach DIP.PAcBA, w warunkach zacho¬ wania stalej wartosci pH. Jest to dowodem wska¬ zujacym na powstawanie kompleksu w roztwo¬ rze.Przy uzyciu innych stosunków molowych niz 1:3 (NPT 15392 i DIP.PAcBA), takich jak 1:1 i 1:10, powstaja inne kompleksy.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych 9-hydroksyalki- lopuryn o wzorze ogólnym 1, w którym X ozna- 14 10 cza OH, R1 oznacza atom wodoru lub alkil o 1—8 atomach wegla, R2 oznacza atom wodoru lub me¬ tyl, znamienny tym, ze do odpowiedniej 9-pod- stawionej 6-aminopuryny wprowadza sie w po¬ zycji 6 grupe -OH przez dwuazowanie za pomo¬ ca azotynu sodu. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako substrat stosuje sie 9-podstawiiona pury- ne, w której R1 oznacza n-heksyl, a pozostale podstawniki maja znaczenie jak w zastrz. 1. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako substrat stosuje sie 9-podstawiona pu- ryne, w której R1 oznacza metyl, a pozostale podstawniki maja znaczenie jak w zastrz. 1.HC-CH-R2 R10H Wzór i (Y): HC-CH-R2 R1 OH Wzór iA Y Ac OH CH2-CH-CH3 OH Schemat -1 Sny CH2-CH-CH3 OH124 228 NH2 _ OH ? ^"^ %kX u AcOH ry h/*\h£H H,C H CH20H Schemat 2 EtapJ. ICH3C0)20 CH3-[CH2]5-CH-C00H—7 CH3- [CHJ5- CH2-C0CH3 l\IH2 ° NH2 CH3-[CH2]5-CH-C0CH3-^r CH3- [CH^-CH - C0CH3 NH2 - NH2•HCl —p— KBH4 CH3- [CH2]5-CH - C0CH3-^- CH3- [CH2]5-CH- CH-CH3 NH2-HCl /b r, NH2 ÓH ^P-^ Cl .... C^ K^/NH2 m^NH2 [CH2]5 _ 'ULJH J™ CH3-[CH2]/ XHOH CH3 CH3 Schemat 3 PL PL