Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych 9-(hydroksyalkilo)puryn o wzorze ogólnym 1, w którym X oznacza grupe OH, R1 oznacza atom wodoru lub alkil o 1—3 atomach wegla a R2 ozna¬ cza atom wodoru lub metyl.Otrzymywane sposobem wedlug wynalazku zwiaz¬ ki sa immunomodulatorami, wykazuja dzialanie przeciwwirusowe i przeciwnowotworowe jak rów¬ niez sa inhibitorami enzymów. Moga one równiez* reagowac z solami amin i kwasu p-acetoamidóben- zoesowego tworzac kompleksy, co w pewnych przypadkach wzmacnia wyzej wspomniane dziala¬ nie. Zwiazki/kompleksowe przedstawia wzór ogól¬ ny 1A, w którym Y oznacza sól aminy o wzorze IB, w którym R8 i R4 oznaczaja nizsze grupy alki¬ lowe, to jest grupy o 1—4 atomach wegla, np. gru¬ pe metylowa, etylowa, propylowa, butylowa, izo- propylowa lub izobutylowa, a n oznacza liczbe cal¬ kowita 2—4, z kwasem p-acetamidobenzoesowym, zas z oznacza liczbe 1—10.Dzialanie immunoregulujace wydaje sie zwiek¬ szac w miare wzrostu dlugosci lancucha w pod¬ stawniku R1, przynajmniej od grupy metylowej do heksylowej, R1 korzystnie oznacza grupe n-alkilo- wa, to jest' metylowa, etylowa, n-propylowa, n-bu- tylowa, n-amylowa, n-heksylowa, n-heptylowa lub n-oktylowa. Typowymi przykladami amin tworza¬ cych sole z kwasem p-acetamidobenzoesowym sa dw\imetyloaminoetanol, dwumetyloaminoizopropa- nol, dwuetyloaminoetanol, dwuefyloaminoizobuta- 2 nol, dwuetyloaminoizopropanol, metyloetyloamino- etanol, dwuizobutyloamino-N-butanol, dwumetylo- aminopropanol, dwumetyloamino-N-butanol, dwu- izobutyloaminoetanol, dwumetyloaminobufenol, 5 dwubutyloamino-N-butanol, dwubutyloaminoetanol dwupropyloaminoetanol i dwuizopropyloaminoeta- Korzystna amina jest dwumetyloaminoizopropa- nol. Gdy obecny jest podstawnik Y, z oznacza 1—10, korzystnie z oznacza 3. 10 Oprócz zwiazków o wzorze 1A, w których Y oznacza sól aminy o wzorze IB z kwasem p-acefe- midobenzoesowym, mozna takze otrzymywac sole, w których amina jest taka sama jak opisano wy¬ zej, a kwas jest farmakologicznie dopuszczalnym 15 kwasem innym niz kwas p-acetamidobenzoesowy, np. kwasem solnym, kwasem siarkowym, kwasem bromowodorowym, kwasem fosforowym, kwasem octowym, kwasem propionowym, kwasem malono- wym, kwasem mlekowym, kwasem cytrynowym, 20 kwasem winowym, kwasem p-toluenosulfonowym, kwasem adypinowym, kwasem maleinowym. ^ kwasem bursztynowym, kwasem metanosulfono- wym, kwasem salicylowym, kwasem acetylosalicy¬ lowym. 25 w ponizszym opisie zwiazków, w których obecny / jesf podstawnik Y skrót DIP.PAcBAoznacza p-ace- tamiidobenzoesari dwumetyloaminopropanolu-2. Gdy skrót ten nie jest oznaczony liczba w nawiasie, np. (10), oznacza to, ze Y równe jest 3. Gdy po skrócie 30 DIP.PAcBA wystepuje liczba w nawiasie, to liczba 124 1773 124 177 4 ta oznacza liczbe grup y obecnych w 1 molu 9- -(hydraksyalkilo)puryny.Nowe 9-(hydroksyalkilo)puryny o ogólnym wzo¬ rze 1, w którym X oznacza grupe OH, R1 oznacza atom wodoru lub alkil o 1—8 atomach wegla, R2 oznacza atom wodoru lub metVl sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie, wprowadzajac do odpo¬ wiedniej 9-podstawiomej 6-chloropuryny w pozycji 6 grupe OH przez hydrolize w roztworze alkalicz¬ nym jjodczas ogrzewania.Korzystnie jako substrat stosuje sie 9-podstawio- na 6^chloropuryne *w której R1 oznacza n-alkil, zwlaszcza n-heksyl lub metyl.W tabeli 1 przedstawiono szereg zwiazków, wy- twrzonych sposobem wedlug wynalazku o wzorze 1, a tfakze ich soli o wzorze 1A. Wszystkie tempe¬ ratury podano w °C a czesci i procenty wyrazono wagowo. 10 15 munoinhibicja jest takze uzyteczna w wielu dzie¬ dzinach, np. przy przeszczepianiu organów, takich jak nerka lub serce, w celu zapobiegniecia odrzu¬ ceniu organu. Zwiazki te dzialaja takze wzbudza- jaco na rozmnazanie sie komórek w czasie immu- nizacji, dzialaja wiec jak mitogen.Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalazku sa uzyteczne w leczeniu ssaków (oraz komórek ssaków). I tak, mozna je stosowac u swin, psów, kotów, bydla, koni,, owiec, kóz, myszy, królików, szczurów, swinek morskich, chomików, malp i in- fiych.Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalazku mozna podawac ssakom znafrymi metodami, np. do¬ ustnie, donosowo, doodbytniczo, dopochwowo lub pozajelitowo w postaci srodków farmaceutycznych takich jak roztwory do wskrzykniec, np. roztwory wodne, albo tabletki, pigulki, kapsulki dtd.Tabela 1 Zestawienie wlasciwosci chemicznych 9-(hydroksyalkilo)puryn o wzorze 1 lub 1A 1 Nr 15425 | 115428' 15446 | 1(51447 154413 1 15444 H5I4H7 1540J8 ¦l'53te 1£410 Zwiazek o wzorze 1 lub 1A Ri ¦'H.H H H CH3.CH3 C6H13 CeHi3 CeHu CoHia | Rt H ]H OH3 <3H3 H' HI H' • qH3 iX OH OH PH OH OH OH] OH OH OH OH, Y !—1 1 DIP.PAcBA ~~* DIP.PAcBA DIP.PAcBA DIP.PAcBA DIP.PAcBA Widmo UV Tempe¬ ratura topnienia °C 2^4 20)5 244—5j 14? ! Iflft—199 1|50 2|26 • 205 . 1 202 198 • Xmax #50 [250 254 25(8|,5 J2J50 S0O 2|54 258,2 250 200 2155 25-9f 250 250 255 2ft2,5 1 250 248 2i54 | 25(8'b5 tanin [222,5 219 2(2/1,5 228 1223,5 220 2^3,5 2123,2 223 218 225,5 225,5 224 220 223 229,5 224 222 220 | 224,5 1 Stez. 10-s 11,93 111,a 12,53 62,1: 11,0 10,6 IV 5^5 7,52 ©,91 7,91 48,5 Hi 64,7 I 124 13,3 14,1 11,9 1 pH 7 1! 10 7 7 1 10 7 7 10 7 7 10 7 7 1 10 7 Analiza elementarna C . ObL 59,07 59,01 Obi. 60,41 60,47 H' 7,65 7,55 7,92( 7,86 N 21,16, 121,24 20,13 2/0,08 Zwiazki w tabeli 1 uwazane sa za czyste z wy- 55 jatkiem zwiazku 15443, w przypadku którego uwa¬ za sie, iz oprócz zwiazku otrzymanego sposobem wedlug wynalazku zawiera on domieszke soli.Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalazku *o sa immumomodulatorami, to jest zwiazkami regu¬ lujacymi immunoreakcje. Dotyczy to zarówno im- munostymulacji (wzmocnienie immunoreakcji), jak i imimunoinhibicji. Immunostymulacja jest oczy¬ wiscie uzyteczna dla wyrobienia odpornosci. Im- w Wzmacnianie dzialania biologicznego przez DIP.PAcBA.Stwierdzono, ze zwiazki oznaczone w tabeli 1 ja¬ ko NPT 15392, NPT 15417 i NPT 15426 wykazuja jako takie silne dzialanie przeciwgrypowe. W jed¬ nym przypadku (zwiazku NPT 15392) addycja soli DIP.PAcBA do NPT 15392 w celu otrzymania 15410 nie wzmaga dzialania przeciwgrypowego. W przy¬ padku NPT 15417 addycja' soli DIP.PAcBA w celu otrzymania 15418 zwieksza dzialanie przecfw- grypowe. Zestawienie wzglednej zdolnosci soli5 124 177 6 DIP.PAcBA do wzmacniania róznych dzialan bio¬ logicznych przedstawiono w tabeli 2.Tabela 2 Zwia¬ zek 1,53192 15417 115446 154143 Sól DIP, PAc BA 15410 L541S 15447 115444 Dzialanie przeciw- gtypowe Oba równie aktywne tak tak tak Wzmocnie¬ nie Dzialanie przeciw- bialaczko- we tak Wzmocnie¬ nie immuno- reakcji tak tak Dzialanie NPT 15392 i NPT 15410 in vivo na myszy; wplyw na stymulowanie rozmnazania ko¬ mórek sledziony in vilro konlcanwalwia A.Celem tego badania bylo okreslenie efektów le¬ czenia in vivo myszy zwiazkami oznaczonymi jako NPT 15392 i 1541G na nastepna aktywnosc spleno- cytów wyizolowanych z tych zwierzat, i ocena in vitro ich proliferacji w odpowiedzi na mitogen, konkanawaline A (Con A.).Sposób postepowania. Dzialanie in vivo.Dziewiec samców myszy Balb w wieku 8—9 ty¬ godni, o ciezarze 18—20 g,* podzielono na trzy pod¬ grupy. Jednej z nich podawano dwa razy dziennie (w ciagu jednego dnia), rano i po poludniu, do¬ ustnie zwiazek NPT 15392 w dawce 10 mg/kg. Dru¬ ga podgrupe traktowano podobnie zwiazkiem NPT 15410 w dawce 20 mg/kg. Trzecia podgrupa otrzy¬ mywala sól fizjologiczna i sluzyla jako grupa po¬ równawcza.Próba na splenocytach in vitro:* przygotowanie komórek.Nastepnego dnia" zwierzeta poszczególnych pod¬ grup zabijano, po czym usunieto im sledziony i zbie¬ rano w obrebie podgrup. Sledziony zmielono a uzy¬ skane komórki przemyto pozywka RPMI-1640 (Grand Island Biologicals), zawierajaca dodatkowo 2 mm glutaminy i antybiotyki. Oznaczono stezenie komórek w kazdym preparacie za pomoca licznika Coultera i wartosc stezenia doprowadzono do 5X106 komórek/ml za pozywki RPMI.Próba mikromiareczkowania na plytce.Próby mikromiareczkowania prowadzono w obje- tesciach w 0,2 ml, zawierajacych 5X105 komórek i Con A lub Con A i badane zwiazki w podanych stezeniach. Wszystkie próby prowadzono z 6 powtó¬ rzeniami i porównywano ze slepa próba zawiera¬ jaca tylko komórki. Plytki do prób inkubowano w oiagu 4 dni w inkubatorze w temperaturze 37 ° w obecnosci 5% C02, W ciagu ostatnich 18—20 godzin inkubacji do studzienek w plytkach dodawano 0,5 ml *HTdR (lO^i Ci/mol, 6\i Ci/milimil). Z hodowli pobrano próbki za pomoca urzadzenia automatycz¬ nego do pobierania próbek (MASH) i okreslono7 za pomoca cieczowego licznika scyntylacyjnego Bec- kman IS 8000 ilosc wprowadzonego *HTdR jako mia¬ re proliferacji komórek. Wyniki zestawiono w tabli¬ cach jako stosunek aktywnosci proliferacyjnej aktywnosci uzyskanej w hodowli zawierajacej Con A lub Con A i badane zwiazki do aktywnosci w próbach kontrolnych. 5 Dzialanie in vdvo zwiazku 15392 lub zwiazku 15410 wzmaga nastepujaca reakcje splenocytów w wa¬ runkach hodowli in yitro na stymulacje za pomoca Con A przy suboptymalnym stezeniu mitogenu (5 |Ag/ml). W przypadku splenocytfów wyizolowanych io z myszy poddanych dzialaniu 15392 stosunek sty¬ mulacji wynosil 1,20:1, podczas gdy stosunek ten w przypadku splenocytów wyizolowanych z myszy z grupy kontrolnej wynosil 40:1. Nie zanotowano znacznych róznic w przypadku zarówno zwiazku 15 153912, jak i 15410,, gdy stymulacje komórek prowa¬ dzono przy bardziej optymalnym stezeniu Con A (10 lig/ml).Badano równiez dzialanie NPT 15392 i 15410 przy dawce 1 ng/mol n akomórki stymulowane in vitro 20 przez Con A. Oba badane zwiazki wykazaly znacz¬ na zdolnosc zwiekszania stymulacji Con A, zwla¬ szcza przy suboptymalnym stezeniu mitogenu <5 Hg/ml) oraz w mniejszym stopniu przy 10 [Ag/ml.Przy stezeniu Con A 5 |»g/ml stymulacja w obec- 21 nosci zwiazku NPT 15392 byla 28 razy wieksza niz w przypadku samej Cen A, a w obecnosci zwiazku NPT 15410 3,3 razy wieksza. Rezultaty te wskazuja na fakt, ze badane zwiazki wywieraja wplyw im- monumodulujacy na rozmnazanie splenocytów. 30 Uprzednie podzialanie na zwierzeta kazdym z tych zwiazków uczula komórki na zachodzaca nastepnie stymulacje mitogeniczna, podczas gdy podzialanie badanymi zwiazkami na komórki in vifro, po któ¬ rym nastepuje stymulacja mitogeniczna, wzmacnia 35 reakcje proliferacyjna.Sposób wedlug wynalazku jest blizej wyjasnio¬ ny w nastepujacych przykladach, w których wszy¬ stkie temperatury wyrazono w °C.Przyklad I. Wytwarzanie 9-hydroksyetylohi- *o poksantyny (zwiazek NPT 15425). Przebieg reakcji przedstawiono na schemacie 1. 6-chloro-9-hydroksyefylopuryne (4 g), dodaje sie powoli do cieplego IN NaOH (30 ml), a nastepnie ogrzewa w warunkach wrzenia pod chlodnica zwrot- « na w ciagu 2 godzin. Mieszanine reakcyjna chlodzi sie lodem i zobojetnia lodowatyni kwasem octo¬ wym. Po przesaczeniu, czesc ndeprzereagowanego zwiazku usuwa sie. Produkt rekrystalizuje sie z me¬ tanolu i przemywa acetonem, otrzymujac bezbarw- 50 ne krysztaly. Wydajnosc 1 g (28%); Temperatura topnienia 274°; Widmo UV (H20), pH 5,5/Xroax 250 nm. ^ Przyklad II. Wytwarzanie £rytro-9-(2-hydro- ksynonylo-3)hipoksantyny (zwiazek NPT 15352). 58 Synteze erytro-9-(2-hydroksynonylo-3)hipóksanty- ny przedstawiono na schemacie 2, a wyjsciowej etrytro-6-chloro-9-(2-hedroksynonylo-3)puryny na schemacie 3. Stanowi ona ulepszenie w stosunku do sposobu H.J. Schaeffera i C.F. Schwendera; J.•• Med. Chem. 17, 6 (1974).Wytwarzanie erytro-9-(2-hydroksynonylo-3)hipo- ksantyny przez hydrolize substratu, jak przedsta¬ wiono na schemacie 2 Zawiesine erytro-6-chloro-9-(2-hydroksynonylo-3, •5 puryny (4,0 g, 13,4 milimoli) w 0,5 n NaOH (40 ml)9 124 177 10 (150 ml). Roztwór chloroformowy poddaje sie osmio¬ krotnie ekstrakcji nasyconym wodnym roztworem NaHC03 (250 ml za kazdym razem). Warstwe chlo¬ roformowa oddziela sie, suszy (za pomoca siarcza¬ nu sodowego lute magnezowego) i odparowuje pod bardzo niskim cisnieniem (13,32 Pa) w temperatu¬ rze 40° (laznia wodna), otrzymujac olej jasnobra- zowej barwy, który zestala sie po ochlodzeniu. Sub¬ stancje te mozna stosowac bezposrednio w nastep¬ nym etapie lub oczyszczac w nastepujacy sposób.Powstaly olej rozpuszcza sie w 75—100 ml chloro¬ formu i dodaje n-heksanu (okolo 300 ml) w celu wytracenia krystalicznej substancji stalej o bialej barwie, która odsacza sie z ochlodzonego roztworu (Ekstrakcje prowadzi sie 4—8 razy, az przestaje sie wydzielac dwutlenek wegla). Ten tok postepowania powtarza sie dwukrotnie. Wydajnosc: 23,3 g (54%), widmo UV: JUaX 267, 297 (H20, pH 5,5), tempera¬ tura topnienia 113—116°.Etap 5. Wytwarzanie erytro-9-(2-hydroksynony- lo-3)-6-chIoropuryny.Surowy syrop otrzymany jak opisano w etapie 4 zawierajacy erytro-5-ainino-4-chloro-6-(2-hydroksy- nonyloamino*3)pirymidyne (11,48 g, 40 milimoli) rozpuszcza sie w ortomrówczanie etylu (106 ml) i dodaje chloroform (34 ml) oraz kwas etanosulfo- nowy (10 kropli). Roztwór pozostawia sie w ciagu nocy w temperaturze 25°, a nastepnie odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem do konsystencji syro¬ pu. Wydajnosc 11,7 g (ilosciowa). Syrop ten, który stanowi surowa erytro-9-(2-hydroksynonylo-3)-6- -chloropuryna uzywa sie w nastepnym etapie, Xmax 264 nm.Przyklad III. Oczyszczanie erytro-9-(2-hydro- ksynonylo-3)hipoksantyny.Surowa nonylohipoksantyne oczyszcza sie droga rekrystalizacji. Surowa substancje rozpuszcza sie przez ogrzanie z 6—10-krotnym wagowym nadmia¬ rem alkoholu etylowego, po czym dodaje sie wode w ilosci równej pod wzgledem objetosci. Roztwór poddaje sie w kolbie Erlenmeyera dzialaniu wegla aktywnego i przesacza na goraco przez celit. Roz¬ twór odparowuje sie przy ciaglym mieszaniu na goracej plytce. Dla zastapienia odparowujacej cie¬ czy dodaje sie malymi porcjami wode do chwili po¬ jawienia sie duzej ilosci wytracajacej sie substan¬ cji. Odparowanie rozpuszczalnika w celu odpedze¬ nia alkoholu etylowego prowadzi sie nadal, dodajac H2O do osiagniecia objetosci odpowiadajacej 8—12- -krotnej wadze substancji. W kazdym zabiegu re¬ krystalizacji strata substancji wynosi okolo 10% Dwa zabiegi rekrystalizacji powoduja wzrost tem¬ peratury topnienia do 202°, przy czym otrzymuje sie bezbarwny produkt krystaliczny, podczas gdy produkt sucowy ma zabarwienie nieco zólte lub ró¬ zowe i topnieje w temperaturze 192°.Przyklad IV. Wytwarzanie kompleksu 9-(2- -hydroksy-3-nonylo)-6-hydroksypuryny (oznaczonego symbolem NPT 15410). 0,1 mmoli 9K2^hydroksy-3-nonylo)-6-hydroksypu- ryny (NPT 15392) (27,9 mg) i 0,3 mmóli 4-(acetylo- amino)benzoesanu dwumetylo-2-hydroksypropylo- amoniowego (DIP.PAcBa) (77,1 mg) odwaza sie do¬ kladnie i rozpuszcza w 105-ml 25% weglanu sodu (Na2C03) otrzymujac 0,1% roztwór NPT 15410 (zwia¬ zek powstaly z NPT 15392 i DIP.PAcBA w stosun¬ ku molowym 1:3. Zwiazek ten po wykrystalizowa¬ niu ma temperature topnienia 198°C.Postepujac jak opisano wyzej i stosujac równo¬ wazne ilosci fzwiazku wyjsciowego, otrzymuje sie nastepujace kompleksy 9^2-hydroksy-l-propylo)hipoksantyna. DIP.PAcBA (oznaczony jako NPT U5447) o temperaturze topnie¬ nia 142°C,. 9^1-hydroksy-2-propylq)hipoksantyna. DIP.PAcBA . (oznaczony jako NPT 15444) o temperaturze topnie¬ nia 150°C, 9-(l-hydroksy-2-oktylo)hipoksantyha. DIP.PAcBA (oznaczony jako NPT 15418) o temperaturze topnie¬ nia 205°C; 9-(l-hydroksy-2-etylo)-hipoksantyna. DIP.PAcBA (oznaczony jako NPT 15428) o temperaturze topnie¬ nia 205°C.Dowód na powstanie kompleksu. Badania rozpu¬ szczalnosci fazowej, prowadzone z NPT 1|5392 i DIP.PAcBA wykazaly, ze NPT 15392 posiada zwiekszona rozpuszczalnosc przy zwiekszajacych sie stezeniach DIP.PAcBA, w warunkach zachowania stalej wartosci pIL Jest to dowodem wskazujacym na powstawanie kompleksu w roztworze.Przy uzyciu innych stosunków molowych niz 1:3 (NPT 15392 i DIP.PAcBA), takich jak 1:1 i 1:10, po¬ wstaja inne kompleksy.Zastrzezenia patentowe . 1. Sposób wytwarzania nowych 9-(hydroksyalki- lo)ipuryn o wzorze ogólnym 1, w którym X oznacza grupe OH, R1 oznacza atom wodoru lub alkil o 1—8 atomach wegla, Rf oznacza atom wodoru lub me¬ tyl, znamienny tym, ze do odpowiedniej 9-podsta- wionej 6-chloropuryny wprowadza sie w pozycji 6 * grupe -OH przez hydrolize w roztworze alkalicz¬ nym podczas ogrzewania. 2. Sposób wedlug zastrz. I, znamienny tym, ze jako* substrat stosuje sie 9-podstawiona puryne, w której R1 oznacza n-heksyl. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako substrat stosuje sie 9-podstawiona puryne, w której R1 oznacza metyl. 10 15 20 25 30 35 40 45 50124 177 -D* HC-CH-R R1ÓH Wzór 1 .(Y)z R; R< HC-CH-R2 R' OH mór 1A N(CriH2n)0H Wzór 1B Cl ^Y^H OH INNoOH ffVN\ CHj-CHgOH CHgCHgOH Schemat 1 Cl N OH CH CH3-[CH2]^NCH0H CH3 Schemat 2 OH i- CH [ch/5 xchoh CH, CH, Etap_5 Cl CH CH3-[CH2]5 CHOH CH, (C2H50)3CH "100% CH, Cl 11 M N CH [CHJ5 XCHOH CH, Schemat 3 0gp_L (ch£0)2o CHj-ECH^-CH-COOH — CH3-[CH2]5-CH2-C0CH3 NHZ 70/* nH2 3BPJL Hf I CH3-[CH2]5-CH-CXH3^rCH3- [CH2]5"CH -C0CH3 Etap_3_ NH* ' ^H2;HCl CH3-[CH2]5-CH -COCH3 -~CH3-[CH2VCH-- CH-CH3 „ , NH2-HCl Etap_4 ci CH3- YrWz^ [CH2]5 _ VXI CH-NH2 5Z,0/ CHOH CH, 13 NH2 OH ¦NHj *N^NH CH3-[CH2]^ NCHOH 13 CH- ZGK 1243/1331/5 — 80 egz.Cena 100 zl PL PL