PL118433B1 - Process for preparing 2,5-diketogluconic acid - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu 2,5-dwuketoglikonowego.Kwas 2,5-dwuketoglikonowy jest uzytecznym pólpro¬ duktem w syntezie witaminy C. Z tego wzgledu wytwarza sie go przy pomocy wielu róznych rodzajów bakterii takich 5 jak Acetobacter melanogenum, Acetobacter aurantium, Gluconoacetobacter rubiginosus, Gluconoacetobacter li- auifaciens i Pseudomonas sesami. Jednakze zastosowanie tych drobnoustrojów jest niepozadane z przemyslowego punktu widzenia z powodu powstawania duzych ilosci 10 brunatnych lub zólto-brunatnych pigmentów jako produk¬ tów ubocznych hodowli przez co zmniejsza sie czystosc wytwarzanego kwasu 2,5-dwuketoglikonowego.W opisie patentowym St. Zjedn. Amer. nr 3 790 444 ujawniono sposób wytwarzania kwasu. 2,5-dwuketogliko- 15 nowego bez tworzenia sie towarzyszacych brunatnych pigmentów przez nowy szczep oznaczony jako Acetobacter fragum w hodowli zawierajacej jako pozywke glikoze oraz substancje bedaca zródlem azotu. W sposobie tym stosuje sie poczatkowe pH 5,8 i po 32 godzinach otrzymuje kwas 20 2,5-dwuketoglikonowy z wydajnoscia 87% w przeliczeniu na glikoze.Wynalazek dotyczy ekonomicznego procesu wytwarzania kwasu 2,5-dwuketoglikonowego przy zastosowaniu latwo dostepnego szczepu Acetobacter cerinus. Korzystnymi 25 z tych szczepftw sa dwa: IFO 3263 i 3266, które wytwarzaja kwas 2,5-dwuketoglikonowy z wydajnoscia ponad 95% (w przeliczeniu na glikoze).Kwas 2,5-dwuketoglikonowy jest stosowany jako pól¬ produkt przy wytwarzaniu kwasu askorbinowego. Wodny 30 roztwór kwasu 2,5-dwuketoglikonowego mozna selektywnie redukowac w celu uzyskania mieszaniny 2-ketogulonianu i 2-ketoglikonianu, które mozna przeprowadzic w kwasy askorbinowy i erytorbowy.Sposobem wedlug wynalazku kwas 2,5-dwuketoglikono¬ wy otrzymuje sie latwo przez dzialanie bakterii na glikoze, stosujac znany, latwo dostepny szczep Acetobacter cerinus.Przebadano wszystkie dostepne powszechnie szczepy Acetobacter cerinus. W badaniach tych wydajnosc otrzy¬ mywanych ketokwasów wynosila 50—95 % (w przeliczeniu na glikoze). Gdy stosuje sie Acetobacter cerinus korzystnie IFO 3263 lub 3266, wytwarzanymketokwasem jest wylacznie pozadany kwas 2,5-dwuketoglikonowy a proces przebiega z wydajnoscia ponad 95 % (w przeliczeniu na glikoze).Dostepnymi powszechnie szczepami Acetobacter cerinus sa: IFO 3262 (ATCC 12303), 3263, 3264, 3265, 3266, 3267, 3268, 3269.. Szczepy te sa znane i zarejestrowane w katalogu ATCC, wyd, 11, 1974jako ATCC 12303 oraz w rejestrze prowadzo¬ nym przez Institute for Fermentation w Osace jako Gluco- nobacter cerinus IFO 3262 — IFO 3270 (róznica w nazwie szczepu wynika z odmiennej nomenklatury stosowanej przez Instytut w Osace).Wspomniane szczepy Acetobacter cerinus hoduje sie w srodowisku, w którym glówne zródlo wegla stanowi glikoza. Drobnoustroje te nie wymagaja kosztownych zródel azotu takich jak pepton lub ekstrakt miesny.Zwykle hodowle prowadzi sie na pozywce zawierajacej 2,5—20 % glikozy oraz tanie zródlo azotu takie jak mocznik i nieorganiczne zródla azotu takie jak sole amonowe, 118 433118 433 zwlaszcza siarczan amonu, azotan amonu lub fosforan amo¬ nu, a jako wskaznik wzrostu do pozywki dodaje sie kwas nikotynowy. Pozywka zawiera takze sole mineralne, oraz zródlo fosforu.Stezenie glikozy w srodowisku zmienia sie w granicach 2,5 — 20 % korzystnie 10—12 % w celu najbardziej ekono¬ micznego otrzymania kwasu 2,5-dwuketoglikonowego.Temperatura fermentacji wynosi 20—35 °C. korzystnie 25—30°C a zwlaszcza okolo 28 °C. Poczatkowe pH srodo¬ wiska hodowli wynosi 3,5—7,5, korzystnie 5—6. Podczas przebiegu fermentacji wartosc pH utrzymuje sie na pozio- •mie okolo, 5,5 przez dodawanie roztworu wodorotlenku sodu.' Do regulowania wartosci pH mozna tez stosowac weglan wapnia. Dodaje sie go, do hodowli po sterylizacji para pod zwiekszonym cisnieniem w ilosci okolo 30 g na 110 g glikozy.Po inokulacji, srodowisko fermentacyjne miesza sie przy pomocy mieszadla mechanicznego o szybkosci 1700 obro¬ tów/min i napowietrza z szybkoscia 0,5—1 objetosci po¬ wietrza (objetosc brzeczki) minute..Stosujac Acetobacfer cerinus IfO 3263 lub 3266 fermen¬ tacje prowadzi sie az do uzyskania wydajnosci kwasu 2,5-dwuketoglikonowego co najmniej 90 % (w przeliczeniu na glikoze) (36—40 godzin).Za pomoca chromatografii bibulowej stwierdzono, ze konwersja glikozy do lcwasu 2,5-dwuketoglikonowego przebiega w nastepujacy sposób: glikoza^*" kwas 2-ketoglikonowy -£ kwas 2,5-dwuketogIi- konowy glikoza - kwas 5-ketoglikonowjr -+ kwas 2,5 -dwuketo- glikonowy.Zastosowano bibule Whatman nr 1 i nr 4 i uklad roz¬ puszczalników keton metyloetylowy:aceton:kwas mrów¬ kowy:woda (80:6:2:12). Plamki kwasu identyfikowano przez spryskiwanie 0,2 % roztworem etanolowym o-fenyle- nodwuaminy zawierajacym 1 % kwasu azotowego i ogrzewa¬ nie do temperatury okolo 70 °C (kwas 5-ketoglikonowy- niebieski; kwas 2-ketoglikonowy — zólty; kwas 2,5-dwu- ketoglikonowy — zielony).W celach identyfikacyjnych mozna stosowac równiez ciekla chromatografie wysokocisnieniowa.Kwas 2,5-dwuketoglikonowy mozna oddzielic i odzyskac z koncowej brzeczki fermentacyjnej wjakikolwiekkonwencjo¬ nalny, znany sposób. Odsaczona brzeczke fermentacyjna mozna potraktowac borowodorkiem a otrzymana miesza¬ nine kwasów 2-ketoglikonowego i 2-ketogulonowego poddac hydrolizie, uzyskujac,kwasy askorbinowy i erytorbowy.Przyklad I. Przygotowano nastepujace wodne sro¬ dowisko inoculum.; Skladnik g/litr Glikoza, 25 Roztwór namoczonej kukurydzy 5 KH2PO4 0,5 K2HP04 0,5 MgS04 —7H20 0,2 CaCOs ' '" • 6,3 pH 6,2 Wytrzasana kolbe zawierajaca 1 litr srodowiska poddaje sie sterylizacji pare pod zwiekszonym cisnieniem w ciagu 30 minut w temperaturze 121°C. Wartosc pH oziebionego srodowiska wynosi 5,0. Do kolby dodaje sie komórki Aceto- 5 bacter cerinus IFO 3263 pochodzace ze skosu' agarowego jako pozywki (5 ml z 20 ml sterylnej wodnej zawiesiny) i nastepnie kolbe wytrzasa sie na wytrzasarce obrotowej w temperaturze 28 °C w ciagu 24 godzin.Przyklad II. Czesc hodowli kultury dostateczna 10 do wytworzenia 5%. objetosc/objetosc inoculum dodaje sie do 4-litrowego fermentatora z mieszadlem, zawierajacego 2-litry nastepujacej pozywki produkcyjnej: Skladnik g/litr Glikoza 110 15 Roztwór namoczonej kukurydzy 0,5 (NH4)2HP04 0,58 KH2P04 1,5 MgS04-7H20 0,5 mocznik 0,5 20 CuS04-5H20 1 mg _ kwasnikotynowy 300 r pH 6,0 Fermentacje przeprowadza sie w temperaturze okolo 28 °C, przy mieszaniu z szybkoscia 1700 obrotów/jninute 25 i napowietrzaniu z szybkoscia 0,75 objetosc/objetosc brzeczki/minute. Po okresie fermentacji trwajacym okolo 20 godzin, dodaje sie sterylnej glikozy (55 g/litr). Wartosc pH utrzymuje sie na poziomie 5,5 przez dodanie roztworu wodorotlenku sodu. Fermentacje prowadzi sie az do uzys- 30 kania wydajnosci kwasu 2,5-dwuketoglikonowego powyzej 95% (w przeliczeniu na glikoze). Otrzymany produkt wydziela sie, poddajac surowa brzeczke fermentacyjna chromatografii.Postepujac jak opisano wyzej, lecz stosujac Acetobacter 35 cerinus IFO 3266, otrzymuje sie kwas 2,5-dwuketogliko¬ nowy z wydajnoscia powyzej 95 %. (w przeliczeniu na gliko¬ ze). -40 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania kwasu 2,5-dwuketoglikonowego w hodowli Acetobacter prowadzonej w warunkach aerobo- 45 wych, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle Aceto¬ bacter cerinus, w temperaturze 20—35 °C i poczatkowym pH 3,5—7,5 na pozywce zawierajacej 2,5—20% glikozy i zródlo azotu, zwlaszcza mocznik lub sole amonowe, sole mineralne i zródlo fosforu, w obecnosci kwasu nikotyno- 50 wego, a nastepnie wyosabnia sie zadany kwas w znany sposób. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w temperaturze 25—30 °C, przy poczatkowym pH5—6. 55 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako Acetobacter cerinus stosuje sie szczep IFO 3263. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako Acetobacter cerinus stosuje sie szczep IFO 3266.LDD Z-d 2, z. 1075/1400/82, n. 95+20 egz.Cena 100 zl PL PL PL

Claims (2)

1.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania kwasu 2,5-dwuketoglikonowego w hodowli Acetobacter prowadzonej w warunkach aerobo- 45 wych, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle Aceto¬ bacter cerinus, w temperaturze 20—35 °C i poczatkowym pH 3,5—7,5 na pozywce zawierajacej 2,5—20% glikozy i zródlo azotu, zwlaszcza mocznik lub sole amonowe, sole mineralne i zródlo fosforu, w obecnosci kwasu nikotyno- 50 wego, a nastepnie wyosabnia sie zadany kwas w znany sposób.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w temperaturze 25—30 °C, przy poczatkowym pH5—6. 55 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako 3. Acetobacter cerinus stosuje sie szczep IFO 3263. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako Acetobacter cerinus stosuje sie szczep IFO 3266. LDD Z-d 2, z. 1075/1400/82, n. 95+20 egz. Cena 100 zl PL PL PL