NO860180L - - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved dyrking av celler, spesielt diploide celler og spesielt diploide celler fra pattedyr så som menneskeceller, blant annet fibroblastceller, i et dyrkningsmedium i nærvær av cellulosefibre av en spesiell type. Cellulosefibrene består av cellulose med positive ladninger og/eller anionbyttercellulose. Denne type cellulose er velkjent, og visse typer av slik cellulose er f.eks. beskrevet i "Techniques in Protein Chemistry", Elsevier Publish-ing Company, 1967, I. Leggett, s. 290-304. Velegnet materiale føres i handelen, f.eks. av Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA. I disse celluloseanionbyttere er vanlige aminogrupper som kan være substituerte på forskjellige måter, bundet til cellu-losemolekyler og gir anionbytteregenskaper.

Cellene som dyrkes ifølge oppfinnelsen består fortrinnsvis av såkalt forankringsavhengige celler som normalt dyrkes f.eks. i suspens jon.

Følgende beskrivelse av forsøk ifølge oppfinnelsen utgjør en del av foreliggende beskrivelse.

Forsøk 1

Medium: "Eagle's minimum essential medium" med tilsetning av 4mM glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 20 mM TRICINE (N-tris(hy-droksymetyl)-metylglycin), pH 7,8, 10% kalveserum og 0,1% natriumhydrogenkarbonat.

Cellulose: Celletilvekst oppnås bare på positivt ladede cellulosefibre (anionbyttere), ingen tilvekst ble observert på negativt ladede fibre (kationbyttere). Alle cellulosematerialer stammet fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA. Følgende cellulosefibre ble prøvet:

(1) QAE (dietyl-(2-hydroksypropyl)-aminoetyl) 0,9 mekv/g

(2) DEAE (dietylaminoetyl) 0,9 mekv/g +0,7 mekv/g

(3) TEAE (trietylaminoetyl) 0,9 mekv/g

(4) Aminoetyl 0,33 mekv/g

(5) Bensyl-DEAE

(6) Bensoylert-naftoylert DEAE

(7) ECTE0LA (epiklorhydrin-trietanolamin) 0,3 mekv/g

(8) PEI (polyetylenimin) 1,07 mekv/g

Likeledes god tilvekst fikk man med QAE, DEAE og TEAE og svakere vekst fikk man med de andre typene av cellulose. Fibrene ble oppslemmet i destillert vann ved en konsentrasjon på 30 mg/ml og ble autoklavert i 30 minutter.

Cellestammer: Humane diploide fibroblaster ble anvendt ved alle forsøk. Disse celler stammet fra embryonisk lungevev og gjennomgikk forskjellige antall passasjer innen de ble frosset og lagret i flytende nitrogen. De er forankringsavhengige celler fordi de krever en egnet overflate som de kan hefte til, spre seg på og etter hvert deles. To cellestammer ble anvendt: (1) MRC-5 erholdt fra England og (2) en cellestamme erholdt i oppfinnerens laboratorium kalt Lu(S). Vekstegenskapene til begge disse cellestammer er grundig undersøkt og har vist seg å være likeartet.

De har begge en levetid in vitro på mellom 70 og 90 populasjonsdelinger.

Frembringelsesmåte for dyrkning av humane fibroblaster: Frosne ampuller av celler ble tint hurtig og podet i Roux-flasker av plast inneholdende 150 mm Eagles medium. Når celleskiktet ble sammenflytende, ble cellene oppslemmet i 50 ml 200 ug/ml krystal-linsk trypsin i fosfatbuffret saltløsning uten kalsium og magnesium, pH 7,8, og cellene innført i nye Roux-flasker med ferskt medium. Etter hvert ble cellene anvendt for poding av en "spinner bottle", en flaske som inneholdt en suspendert magnetisk stang som ble anvendt som røreanordning, inneholdende Eagles medium og en suspensjon av cellulosefibre. Cellepodingen som ble anvendt var 1x10 5 celler/mg cellulose. Cellulosen ble anvendt i en konsentrasjon på ca. 3 mg/ml. De fleste forsøk ble gjennom-ført med QAE-cellulose. Den nødvendige mengde for den omrørte kulturen ble sentrifugert ved 3000 X g i 10 minutter, suppleant-væsken ble suget vekk og cellulosen gjenoppslemmet i dyrkningsmediet og satt til flasken utstyrt med røring.

QAE-cellulosefibrene (grov kvalitet) hadde en lengde som varierte mellom 6 pm og 800 pm eller mer, og deres bredde varierte mellom 10 pm og 35 pm i diameter.

De celler som ble tilsatt cellulosesuspensjonen heftet til noen av fibrene, men spreddes ikke og vokste over fibrenes overflate på den normale måte som forventes av forankringsavhengige celler. De vokste istedet som en cellemasse, hvori cellulosefibre av forskjellig størrelse ble innebygget. Disse aggregater av celler og fibre nådde en størrelse på 150 til 200 um eller mer i diameter etter 7 til 8 døgns inkubering. Det anslåtte antall celler som oppnåddes etter dette tidsrom varierte mellom 1,2x10<6>og 1,8x10<6>celler/ml. Etter 8 til 10 døgns inkubering avtok antallet celler i suspensjonen. Mediet ble tappet med 2 til 3 døgns mellomrom ved at fibercellemassene fikk sette seg på bunnen av flasken, halvparten av mediet ble suget av og et like stort volum ferskt medium tilsatt.

De fibre som ble innebygget i disse aggregater hadde en lengde som varierte mellom 100 um eller mindre og 200 um, idet lengre fibre sjelden ble observert. Bredden til fibrene syntes å være mellom 10 pm og 20 pm i diameter. Resten og hoveddelen av cellulosefibrene var helt frie for celler. Cellene syntes å velge en populasjon av fibre som var best egnet for cellenes hefting og vekst. Denne virkning kan skyldes størrelsen til fibrene eller en ujevn fordeling av ladede kjemiske grupper.

Forsøk 2

Materialer og metoder

Medium: "Eagle's minimum essential medium" med tilsetning av 4mM glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 20 mM TRICINE (N-tris(hydroksy-metyl)-metylglycin), pH 7,8, 10% kalveserum og 0,1% natriumhydrogenkarbonat.

Cellestammer: Diploide lungefibroblaster fra menneskeembryoer ble anvendt ved samtlige forsøk. De fleste forsøk ble utført med en cellestamme isolert i oppfinnerens laboratorium kalt Lu(S) med en populasjons-fordoblingsgrad mellom 20 og 30 delinger. Visse forsøk ble utført med cellestammen MRC5 med en populasjons-fordoblingsgrad mellom 30 og 35 delinger. Resultatene var likeartede for de to stammene.

Cellulose: Cellevekst erholdtes bare på positivt ladede cellulosefibre (anionbyttere), ingen vekst observert på negativt ladede fibre (kationbyttere). All cellulose stammet fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA. Følgende anionbyttere ble undersøkt:

(1) QAE - 2-hydroksypropylaminoetyl 0,9 mekv/g

(2) DEAE - dietylaminoetyl 0,9 mekv/g

(3) TEAE - trietylaminoetyl 0,9 mekv/g

(4) Aminoetyl 0,33 mekv/g

(5) Bensy1-DEAE

(6) Bensoylert-naftoylert DEAE

(7) ECTEOLA - epiklorhydrin-trietanolamin 0,3 mekv/g

(8) PEI - polyetylenimin 1,07 mekv/g

Mikroskopisk undersøkelse av cellulosecellesuspensjonen (figur 4) viste at cellene ikke heftet til og ble spredd på fibrene under dannelse av et monoskikt, hvilket er den vanligste form for cellevekst in vitro. Istedet dannedes aggregater av celler og cellulosefibre og øket i diameter ettersom inkubasjonen skred frem.

Cellulosepreparatene som ble anvendt i begynnelsen av disse forsøk ble klassifisert som "grov kvalitet" (coarse grade) av fabrikanten og fibrene hadde en lengde som varierte mellom 6 pm og 800 pm eller mer, og deres bredde varierte mellom 10 pm og 35 pm i diameter. Som det fremgår av figur 4a, b, c, og f var en stor del av fibrene ikke knyttet til cellefiberaggregatene. De fibre som var innbygget i disse aggregater, hadde en lengde varierende mellom mindre enn 100 pm og 200 pm, lengre fibre ble sjelden observert. Fibrenes bredde syntes å være mellom 10 pm og 20 pm i diameter. Celle-fiberaggregatene kan nå størrelser på 150 til 200 pm i diameter etter 7 til 8 døgn inkubasjon. Noen ganger observertes større aggregater.

Cellene syntes å velge en populasjon av fibre som er best egnet for cellenes hefting og tilvekst. Dette utvalg synes å stå i forbindelse med fibrenes størrelse. En cellulosesuspensjon som ble filtrert gjennom et 200 mesh nett av rustfritt stål, ble podet med cellene. Som det fremgår av figur 4d, e, blir større deler av fibrene med en lengde på ca. 100 pm eller mindre knyttet til celler. Forforsøk på å dyrke fibroblaster på TLC-(tynnskiktkromatografi)-preparater av QAE- og DEAE-cellulose, som har fiberlengder på 100 pm eller mindre, gir tegn på at disse preparater er bedre egnet for celle-fiberaggregater enn cellulosematerialer av grov kvalitet.

Diploide menneskefibroblasters evne til å vokse i form av disses celle-fiberaggregater er ikke tidligere rapportert såvidt oppfinneren vet.

Folkman & Greenspan har vist at sfæroider av cellemasser kan vokse til en diameter på flere millimeter, men ved en diameter på 1 mm ble cellene i sentrum nekrotiske. Ettersom imidlertid celle-fiberaggregatene var meget mindre og gjennomtrengt av fibre, som eventuelt kan hjelpe til å lede medium til de indre deler av aggregatene, er det mulig at største delen av cellene var levende i de aggregater som ble dannet under minst 8 døgns inkubasjon. Lengre inkubasjon medførte imidlertid ofte en reduksjon av celleproteinet, selv med ofte gjentatte utskift-ninger av medium, og det må derfor finnes en grense for stør-relsen og livskraften til cellene i disse aggregatene.

Metoden som er beskrevet, har vist seg gunstig for produk-sjon i stor skala av f.eks. virusvaksiner med humane diploide fibroblaster.

Anionbyttercellulosen som anvendes ifølge oppfinnelsen, inneholder fortrinnsvis aminogrupper og har fortrinnsvis en anionbytterkapasitet på minst 0,01 mekv/g, eventuelt minst 0,05 mekv/g eller minst 0,1 mekv/g. Fortrinnsvis er anionbytterkapasiteten opptil 5 mekv/g, eventuelt opptil 3 mekv/g eller opptil 1,5 mekv/g eller også opptil 1 mekv/g, bestemt ved vanlige metoder.

Den anvendte anionbyttercellulosen foreligger fortrinnsvis i form av fibre hvorav i forhold til vekten, minst 20%, fortrinnsvis minst 50% og i særdeleshet minst 75% eller minst 90% har en fiberdiameter på maksimalt 200 pm, fortrinnsvis maksimalt 100 um, spesielt maksimalt 50 pm eller maksimalt 25 pm. Fiberlengden er fortrinnsvis maksimalt 1000 pm, spesielt maksimalt 200 pm eller maksimalt 100 pm. Også fiberlengdeverdier på maksimalt 50 pm eller maksimalt 20 um har vist seg å være betydningsfulle. Fiberlengden er samtidig fortrinnsvis minst 0,1 pm, i særdeleshet minst 1 um, spesielt minst 5 um eller minst 10 pm. Fiberlengde-verdiene beregnes herved på minst 50%, fortrinnsvis minst 75%, minst 90% eller minst 99% av cellulosematerialvekten.

Den anvendte celluloseanionbytter tilhører fortrinnsvis en av typene: QAE (dietyl-(2-hydroksypropyl)-aminoetyl)-cellulose, fortrinnsvis med ionebytterkapasitet ca. 0,9 mekv/g,

DEAE (dietylaminoetyl)-cellulose, fortrinnsvis med ionebytterkapasitet ca. 0,7 til 0,9 mekv/g,

TEAE (trietylaminoetyl)-cellulose, fortrinnsvis med ionebytterkapasitet ca. 0,9 mekv/g,

aminoetylcellulose, fortrinnsvis med ionebytterkapasitet 0,33 mekv/g,

bensyl-DEAE-cellulose,

bensoylert-naftoylert DEAE.

Ifølge oppfinnelsen dyrker man fortrinnsvis diploide celler fra pattedyr, fortrinnsvis menneskeceller, såsom fibroblastceller, og denne dyrking kan utføres også for virusdyrking eller vaksinefremstilling.

Ifølge et aspekt av oppfinnelsen bringes cellene til å vokse på fibre eller fibrene som celleansamlinger, fortrinnsvis av sfærisk eller cylindrisk form og fortrinnsvis med en diameter opptil 1000 pm, eventuelt opptil 500 pm eller opptil 300 pm eller også opptil 200 eller 100 pm. Celleansamlingene dyrkes gjerne til minst 10%, minst 50% eller minst 90% av cellematerialvekten foreligger i form av slike celleansamlinger med en diameter på minst 10 pm, fortrinnsvis minst 25 pm eller minst 50 pm, eventuelt minst 100 pm. Cellene i slike celleansamlinger danner en ansamling av mer enn ett monoskikt av celler. Disse celleansamlinger innelukker fortrinnsvis i det minste deler av to eller flere fibre innenfor celleansamlingen. Disse fibre har fortrinnsvis fiberlengder og fiberdiametre innenfor de ovenfor nevnte grensene, f.eks. en fiberlengde på maksimalt 500 pm og i særdeleshet maksimalt 300 pm og f.eks. en diameter mellom 3 og 50 pm, i særdeleshet mellom 5 og 30 pm, f.eks. 10-20 pm. Veksten utføres fortrinnsvis inntil antall celler pr. ml av dispersjonen når minst 10<4>, minst 10<5>eller minst 10<6>celler pr. ml dispersjon. Passende verdier for den øvre grense av cellemengden er f.eks. maksimalt 10 9 , maksimalt 10 8 eller maksimalt 10 7celler/ml dispersjon. Celledyrkingstiden kan varieres, f.eks. gå opp i minst 1 døgn, minst 2 døgn eller minst 3 døgn eller minst 5 døgn. Passende Øvre grenseverdier for celledyrkingstid kan f.eks. være opp til 14 døgn, opptil 10 døgn, opptil 7 døgn eller opptil 5 døgn.

Passende konsentrasjoner av cellulosefibre i dyrkningmediet kan være minst 0,01 mg/ml, minst 0,1 mg/ml eller minst 1 mg/ml, eventuelt minst 5 mg/ml. Passende øvre grenseverdier har vist seg f.eks. å være maksimalt 500 mg/ml, maksimalt 100 mg/ml, maksimalt 50 mg/ml eller maksimalt 10 mg/ml.

Passende dyrkningsmedier og dyrkningsbetingelser forøvrig for forskjellige celletyper er velkjente for en fagmann og kan anvendes ifølge oppfinnelsen. I så henseende kan det f.eks. vises til publikasjonen "Microcarrier Cell Culture Principles & Methods" fra Pharmacia Fine Chemicals og til de litteratur-referanser som er angitt i denne publikasjonen.

Anvendelsen av diploide menneskefibroblaster for polio-vaksinefremstilling har tidligere vært begrenset på grunn av tekniske vanskeligheter med dyrking av disse celler på tidligere tilgjengelige mikrobærere. Cellene vokser til forholdsvis lave konsentrasjoner, og kulturene har vært så følsomme for håndtering at et stort antall celler på mikrobærerne kunne gått tapt i de forskjellige behandlingstrinn som en kultur utsettes for. Anvendelsen av mikrobærere av positivt ladet cellulose ifølge oppfinnelsen for celledyrking har utelukket mange av disse problemer. De diploide menneskefibroblastcellene har blitt dyrket med godt resultat som celle-fiberaggregat med flere cellulosefibre som ble prøvet, som nevnt i det foregående, f.eks. dietyl-2-hydroksypropyl-aminoetyl (QAE), dietylaminoetyl (DEAE), trietylaminoetyl (TEAE).

I det følgende angis resultater erholdt med suspensjonskulturer av slike celle-fiberaggregater fra diploide menneske-fibroblastceller infisert med poliovirus.

Materialer og metoder:

Cellestammer: To stammer av embryonale menneskelunge-fibroblaster ble anvendt: (1) MRC5 erholdt fra The National Institute for Biological Standards and Control, England, og (2) Lu(S) isolert fra embryonalt menneskelungevev i oppfinnerens laboratorium.

Celluloseanionbytterfibre: De fleste forsøk ble utført med QAE- eller DEAE-cellulose, spesielt preparat med korte fiberlengder tilvirket for tynnskiktskromatografi (TLC). Andre cellulosematerialer som ble anvendt, var TEAE og bensyl-DEAE. Alle cellulosematerialer hadde en ionebytterkapasitet på ca. 0,9 mekv/g. Cellulosen ble anvendt i en konsentrasjon av 3 mg/ml.

Medium og celledyrking: Mediet for celledyrkingen var "Eagle's minimum essential medium" komplettert med 10% kalveserum, 4 mM glutamin, 20 mM TRICINE-buffer, pH 7,8 og 1 mM Na-pyruvat.

Cellene ble først dyrket til et sammenflytende monoskikt i Roux-flasker av plast, oppslemmet med trypsin (200 um/ml krystal-linsk trypsin (Sigma) i fosfatbuffret saltløsning inneholdende 20 mM TRICINE, pH 7,7-7,8 og 0,08% natriumbikarbonat), ble sentrifugert, vasket en gang og tilsatt en konsentrasjon på ca. 1,5x10^ celler/mg cellulose. Etter 5-7 døgns inkubering ble celle-fiber-massen vasket tre ganger med fosfatbuffret saltløsning, pH 7,4, gjenoppslemmet til det opprinnelige volum i "Parkers 199 medium" uten serum og infisert med poliovirus. I de fleste av disse forsøkene anvendtes poliovirus av type 1 (Brunender) samt poliovirus av type 2 (MEF-1) i ett forsøk. Infeksjonsevnen til disse virus ble målt ved poding av viruspreparatene i ti gangers fortynning i vevskulturer og den fortynning ved hvilken 50% av kulturene ble infisert, ble beregnet og betegnet "vevskultur-infeksjonsdose", 50% sluttpunkt (VKID5Q). Alle styrkeverdier er angitt i log1QVKID5Q.

Resultat:

Tabell II viser resultatene fra 5 uavhengige 100 ml suspensjonskulturer av Lu(S)-celler med 3 mg/ml QAE-cellulose infisert med 6,3 VKIDC_ poliovirus type 1.

DU

Tabell III viser resultatene fra fem 100 ml suspensjonskulturer av MRC 5-celler med 3 mg/ml av de angitte cellulosemateri-alene. Kulturene ble infisert med 6,0 VRID^/ml poliovirus type 1 .

Suspensjonskulturer med større volumer enn 100 ml ga også opphav til likeartede virusstyrkeverdier. Tabell IV beskriver noen resultater av poliovirus type 1 dyrket i MRC 5-celler sammen med 3 mg/ml DEAE-TLC-cellulose. Viruspodingen utgjorde 6,0 VKID50</ml.>

Poliovirus av type 2 ble podet i en konsentrasjon på 5,0 VKID5Q/ml i en 5 liter suspensjonskultur av MRC 5 med 3 mg/ml DEAE-TLC-cellulose. Etter 24 timer hadde styrkeverdien steget til 6,5 og etter 48 timer til 6,8 VKIDc_/ml. Selv om disse styrkeverdier var lave, antagelig på grunn av at inokuleringen var så lav, viser de at virus kunne øke på det nærmeste hundre ganger, hvilket er omtrent samme økning som oppnås med poliovirus av type 1.

Diploide menneske-fibroblaster utgjør det beste tilgjengelige cellesubstrat for fremstilling av menneske-virusvaksine, ettersom cellestammene lett kan reguleres og standardiseres, er meget godt undersøkte, underholder vekst av de fleste humane virustyper og er fullstendig normale, hvilket utelukker risikoen for at onkogen DNA kommer inn i vaksinepreparatet. Det har imidlertid vært vanskelig å anvende disse celler for vaksinefremstilling på grunn av vanskelighetene med å dyrke cellene i stor skala på mikrobærere. Ifølge foreliggende oppfinnelse har det vist seg at diploide menneske-fibroblaster kan dyrkes opp til tilstrekkelige cellekonsentrasjoner sammen med cellulosemikro-bærere (f.eks. mellom 1,5 og 2x10^ celler/ml), slik at ved infeksjon med virus, f.eks. poliovirus, kan styrkeverdier oppnås som er vesentlig høyere enn det som kan oppnås hos monokulturer av disse celler på f.eks. apnjurceller.

I det følgende beskrives sammenlignende forsøk som ble utført med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og med konvensjo-nelle celledyrkingsunderlag. De dyrkede cellene bestod av diploide menneske-fibroblastceller, "strain MRC5". Denne cellestamme beskrives f.eks. i en artikkel av Jacobs, Jones, Baille: "Characteristics of a human diploid cell designated MRC5" i Nature, bind 227, s. 168-170, 1970, og stammet fra National Institute for Biological Study and Control.

Dyrkningsmediet bestod av "Eagle's minimum essential medium" i samtlige forsøk og dette var komplettert med 10% kalveserum, 20 mM Tricine, pH 7,8, 4 mM glutamin, 1 mM Na-pyruvat og 0,08% hydrogenkarbonat.

Følgende mikrobærere ble anvendt:

1. Mikrobærere ifølge oppfinnelsen: DEAE-cellulosefibre (small fibre) for tynnskiktkromatografi, kapasitet 0,96 mekv/g. 2. Biosilon, som består av mikrobærere av plastkuler og ble tilsatt et medium som sterilt pulver. 3 og 4. Cytodex og Gelibeads (tiogelatinkuler) klargjort ifølge fabrikantens instruksjoner.

Cellulosen ifølge oppfinnelsen ble anvendt i en konsentrasjon av 3 mg/ml, biosilon i en mengde på 60 mg/ml, cytodex og gelibeads i en konsentrasjon på 4 mg/ml.

Resultat

Forsøket vedrører bestemmelse av styrkeverdier for poliovirus type 1 erholdt fra de ovenfor angitte celledyrkinger på mikrobærere.

MRC5 , passasje 21, ble podet i suspensjonskulturer i en konsentrasjon på 4x10 5 celler/ml. Kulturene ble rørt med en hastighet på ca. 40 omdreininger/minutt. Mediet ble utskiftet en gang etter 4 døgns inkubering ved at celle-mikrobærermassen fikk sette seg på bunnen av kolben, det gamle mediet ble avsuget og et like stort volum ferskt medium tilsatt.

Etter 7 døgns inkubering ved 37°C ble celle-mikrobærermassen vasket tre ganger med fosfatbuffret saltløsning pH 7,4 og serumfritt Parkers 199-medium tilsatt. Kulturene ble deretter infisert med poliovirus type 1 (podemengde ca. 10 5 ' 5 TCID^Q/ml). Resultatene er angitt i tabell V. Tidligere forsøk har vist at den optimale tiden for å oppnå antigenmateriale for poliovirus-vaksine er 72 timer etter infeksjon.

Cellene som er dyrket ifølge oppfinnelsen består fortrinnsvis av normale celler, d.v.s. celler med begrenset delbarhet, f.eks. i gjennomsnitt ofte maksimalt 150, maksimalt 100 eller maksimalt 70 delinger (såkalte populasjonsdelinger). Defini-sjoner av slike celler er å finne i litteraturen, f.eks. Haeflick, Moorhead: "The serial cultivation of human diploid strains" Experimental Cell Research, bind 25 (1961), s. 585-621, og Haeflick: "The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains", Experimental Cell Research, bind 37 (1965), s. 614-636.

Man kan imidlertid også dyrke celler av krefttype eller celler som er modifisert for kombinasjon av celler av krefttype eller ved innføring av genetisk materiale fra kreftceller eller i kreftceller.

Som eksempel på celleopprinnelse kan nevnes animalske celler generelt, celler av hvirveldyr så som celler fra fugler, f.eks. hønsefugler, pattedyrceller, f.eks. celler fra rotter, mus, ape, gnavere, hest, svin, får, hund, katt og spesielt menneskeceller. De dyrkede cellene består ofte av embryoceller (fosterceller) av ovenfor nevnte opprinnelse, for eksempel mannsceller eller kvinnelige embryon. Cellene kan videre stamme fra spesielle organer, f.eks. lunge, hud, forhud, epitelceller. Som eksempel på embryoceller kan også nevnes kyllingembryofibroblaster.

Celledyrkingen kan anvendes for fremstilling av forskjellige produkter, f.eks. enzymer, hormoner, f.eks. interferon, som underlag for virusdyrking og fremstilling av vaksine mot disse, f.eks. polio, rabies, røde hunder, influensa, meslinger, herpes, pseudorabies, munn- og klovsyke, aids-forårsakende virus o.s.v. Man anvender gjerne cellekulturer som er godkjent for vaksinefremstilling av WHO.

Passende dimensjoner på cellulosefibrene er angitt forut.

En fiberlengde på minst 20 um, minst 40 pm eller minst 60 um har ofte vist seg passende. Samtidig kan fiberlengdens øvre grense ligge på de forut nevnte grenseverdiene, f.eks. maksimalt 200 um eller maksimalt 150 um, eller også maksimalt 100 pm. Fiber-lengdeverdiene beregnes herunder liksom for de forutnevnte fiber-lengdeverdiene på minst 30%, fortrinnsvis minst 50%, spesielt minst 75%, minst 90% eller minst 99% av cellulosematerialvekten.

Cellulose som blir anvendt som underlag for de anionbyttende cellulosematerialer som ble anvendt ifølge oppfinnelsen, består normalt av en polymer av glukose med ca. 2000-4000 eller flere, f.eks. 3500 eller flere gjentatte enheter i en kjede. Glykosid-bindingen sitter ved 0, cellulose kan defineres som en polymer av (3-D-glukose.

Figur 1 - Vekst av Lu(S)-celler i 100 ml suspensjonskulturer som inneholder 3 mg/ml QAE-, DEAE- eller TEAE-cellulose og podet med 20x10<6>celler. Celleantallet anslås fra målte proteinverdier. Figur 2 - Virkningen av forskjellig QAE-cellulosekonsentrasjoner på veksten av Lu(S)-celler i 100 ml suspensjonskulturer podet med 20x10<6>celler. Celleantallet ble bestemt fra målte proteinverdier . Figur 3 - Virkningen av cellepoding på tilvekst av Lu(S)-celler i 100 ml suspensjonskulturer inneholdende 3 mg/ml QAE-cellulose. Celluloseantallet ble anslått fra den målte proteinverdi. Figur 4 - Morfologisk utseende av diploide menneskefibroblast-celle-fiberaggregater (se pil).

A og B: 4 døgns MRC 5 dyrking med DEAE-cellulose, 380 ganger.

C: 13 døgns MRC 5-dyrking med 3 mg/ml QAE-cellulose, 380 ganger. D: 8 døgns Lu(S)-dyrking med ca. 1 mg/ml QAE-cellulose filtrert gjennom et nett av rustfritt stål med maskevidde 200 mesh, 48 ganger.

E: 8 døgns Lu(S)-dyrking med ca. 1 mg/ml QAE-cellulose filtrert gjennom et nett av rustfritt stål med maskevidde 200 mesh, 960 ganger.

F: 13 døgns MRC 5-dyrking med 3 mg/ml QAE-cellulose, 120 ganger.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte ved dyrking av normale diploide celler i suspensjon i et dyrkningsmedium, karakterisert ved at veksten utføres i en suspensjon omfattende fibre av cellulose med positive ladninger og/eller anionbytterevne.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at cellulosen består av en anionbyttercellulose, fortrinnsvis med aminogrupper og spesielt med en anionbytterkapasitet på minst 0,01 mekv/g og eventuelt opptil 5 mekv/g.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at man anvender fibre av anionbyttercellulose, hvorav, i forhold til vekten, minst 20% har en fiberdiameter på maksimalt 100 um, og fortrinnsvis en mengde på maksimalt 1000 pm og minst 1 pm.

4. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1 til 3, karakterisert ved at anionbyttercellulosen tilhører en av typene QAE (dietyl-(2-hydroksypropyl)aminoetyl)-cellulose, fortrinnsvis med en ionebytterkapasitet på ca. 0,9 mekv/g, DEAE (dietylaminoetyl)-cellulose, fortrinnsvis med en ionebytterkapasitet på ca. 0,7-0,9 mekv/g, TEAE (trietylaminoetyl)-cellulose, fortrinnsvis med en ionebytterkapasitet på ca. 0,9 mekv/g, aminoetylcellulose, fortrinnsvis med en ionebytterkapasitet på 0,33 mekv/g, bensy1-DEAE-cellulose, bensoylert-naftoylert DEAE.

5. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1 til 4, karakterisert ved at den omfatter dyrking av diploide celler fra pattedyr, spesielt menneskeceller, spesielt fibroblastceller, eventuelt for dyrking av virus eller vaksine-produksjon.

6. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1 til 5, karakterisert ved dyrking av cellene på fiber eller fibrene som celle-aggregater, fortrinnsvis med i det vesentlige sfærisk eller sylindrisk form og spesielt til en diameter opp til 1000 pm og fortrinnsvis med en diameter på minst 10 pm i en mengde som overskrider et monoskikt av celler, idet celle-aggregatet innelukker i det minste deler av to eller flere fibre innenfor celle-aggregatet, fortrinnsvis fibre med en lengde på maksimalt 500 pm og fortrinnsvis en diameter på mellom 3 og 50 pm, idet dyrkingen fortrinnsvis utføres inntil celleantallet pr. ml i dispersjonen når minst 10 4 celler pr. ml dispersjon og fortrinnsvis til maksimalt 10 g celler pr. ml dispersjon, spesielt over et tidsrom på minst 1 dag og fortrinnsvis opptil 14 dager.

7. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1 til 6, karakterisert ved at konsentrasjonen av cellulosefibre i dyrkningsmediet er minst 0,01 mg/ml og fortrinnsvis maksimalt 500 mg/ml.