CN106085947B - Mdck克隆细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株MDCK克隆细胞株及其应用，属于MDCK细胞的克隆及应用领域。本发明首先公开了一株MDCK克隆细胞株MDCK‑3D6，其微生物保藏编号：CGMCC No.12040。本发明克隆细胞株MDCK‑3D6比母本细胞生长速度快且对禽流感病毒高度适应。本发明还公开了一种禽流感灭活疫苗的生产方法，包括：将克隆细胞株MDCK‑3D6接种到生物反应器的微载体上，培养细胞；接种并增殖禽流感病毒，收获病毒液，灭活，加入佐剂混合，乳化，即得。本发明制备的灭活疫苗对鸡只安全，免疫鸡HI抗体效价高，对禽流感病毒的攻击实现100％免疫保护。本发明为以哺乳动物细胞为基质大规模增殖病毒及制备禽流感疫苗提供了依据。

Description

MDCK克隆细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及MDCK克隆细胞株，还涉及所述细胞株的应用，属于MDCK细胞的克隆及应用领域。

背景技术

禽流感是目前危害世界养禽业发展的重要疾病，特别是高致病力禽流感的暴发，给养禽业带来了毁灭性的灾难。疫苗免疫是防止禽流感暴发的主动措施和关键环节。

鸡胚是禽流感病毒最为常用的一种培养基质，常用它来分离禽流感病毒和制备疫苗，但存在生产周期长，易污染，不易于控制，效率低，不利于应对大规模的流感爆发等缺陷。为此，世界卫生组织鼓励发展细胞培养技术替代目前的鸡胚培养技术来生产流感疫苗。

狗肾来源的MDCK细胞系是禽流感病毒最易感的细胞，具有容易扩大，容易收集细胞等优势。但是，仅仅依靠动物细胞培养生产病毒的量有限，因此将微载体培养技术应用于禽流感疫苗的生产，无疑将既保持细胞培养的优势又克服了其生产产量有限的缺点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株MDCK克隆细胞株，其生长速度较母本细胞快，且对禽流感疫苗株的适应性高；

本发明进一步提供了一种利用微载体大规模培养所述MDCK克隆细胞株，增殖禽流感病毒制备灭活疫苗的方法，为以哺乳动物细胞为基质大规模增殖病毒及制备禽流感疫苗提供依据。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先将MDCK细胞采用有限稀释法进行单细胞克隆，并选取单个克隆进一步亚克隆，经3次亚克隆，最终获得6株单克隆细胞，分别命名为MDCK-3D2、MDCK-3D3、MDCK-3D5、MDCK-3D6、MDCK-3D7和MDCK-3D9。

生长曲线测定结果显示，克隆细胞株MDCK-3D6与母本细胞相比，生长速度快。通过克隆细胞株对禽流感病毒的适应性分析表明，克隆细胞株MDCK-3D6对禽流感病毒的适应性高，传代至11-20代，病毒HA达到256；传代至21-25代，病毒HA达到512；显著高于克隆细胞株MDCK-3D2、MDCK-3D3、MDCK-3D5、MDCK-3D7和MDCK-3D9以及母本细胞。因此，本发明选择禽流感病毒高敏感适应株MDCK-3D6。

本发明将获得的MDCK克隆细胞株MDCK-3D6提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.12040；分类命名是：犬肾细胞；保藏时间是：2016年02月02日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明所述MDCK克隆细胞株MDCK-3D6能够应用于培养病毒。其中，所述病毒包括：流感病毒(Influenza virus)、狂犬病病毒(Rabies virus)或副流感病毒(ParainfluenzaViruses)。所述流感病毒包括：禽流感病毒(Avain Influenza Virus)、人流感病毒(HumanInfluenza Viruses)或马流感病毒(Equine Influenza virus)；优选为禽流感病毒。所述副流感病毒包括人类副流感病毒(Human Parainfluenza Viruses)。

本发明进一步公开了一种禽流感灭活疫苗的生产方法，包括以下步骤：(1)将所述MDCK克隆细胞株MDCK-3D6接种到生物反应器中的微载体上，培养细胞；(2)接种禽流感病毒，增殖所述病毒，收获病毒液；(3)将病毒液灭活，加入佐剂混合，乳化，即得。

其中，步骤(1)所述MDCK克隆细胞株MDCK-3D6按照1.5×10⁵-4.5×10⁵个细胞/ml，优选为3.0×10⁵个细胞/ml的初始密度接种到微载体上；所述微载体的浓度为1-5g/L，优选为3-5g/L，最优选为3g/L；更优选的，其中所述微载体是Cytodex-1。步骤(1)所述培养细胞的搅拌速度为50-120r/min，优选为100r/min；所述培养细胞的时间为72h；更优选的，所述培养细胞还包括：在细胞放大培养过程中，培养基灌注量为3-4体积；中后期细胞维持阶段，培养基灌注量为1-2体积。

步骤(2)所述接种禽流感病毒的病毒感染复数MOI为0.005-5；优选的，病毒感染复数MOI为0.1。所述增殖的过程中，病毒维持液中TPCK-胰酶的浓度为1-10μg/mL，优选为1-5μg/mL，最优选为2μg/mL。所述收获病毒液的时间为接种禽流感病毒后24-96h，优选为48-72h，最优选为48h。优选的，所述禽流感病毒为禽流感H5N1亚型病毒株Re-6。本发明方法对禽流感病毒的具体种类没有特殊限制，适用于任何一种可获得的禽流感病毒。

步骤(3)所述将病毒液灭活包括：将病毒液离心，取上清液；将上清液浓缩，加入灭活剂，灭活；优选的，将上清液进行10倍浓缩后灭活；病毒灭活前调整至每0.1ml的病毒含量≥10^7.0EID₅₀，HA滴度≥2⁹，符合配苗要求。其中，所述灭活剂是甲醛溶液；按照体积比计，所述灭活剂的终浓度为病毒液上清总体积的0.1％；所述灭活为37℃灭活16h；灭活的病毒液与佐剂按照体积比1：1.5混合；所述佐剂为油佐剂。

本发明对生物反应器培养克隆细胞株MDCK-3D6以及禽流感病毒在反应器中的增殖条件进行了优化。细胞初始接种密度优化结果表明，低初始密度(1.5×10⁵个细胞/ml)使MDCK细胞的延迟期延长，细胞生长缺乏初始密度效应而造成生长相对缓慢，最大细胞密度也最低。4.5×10⁵个细胞/ml的初始密度可以使MDCK细胞快速进入生长期，但细胞存活率相对较低，这是由于接种后细胞存在聚团和游离细胞不黏附的现象，虽然单个微载体上分配的细胞个数很多，但不能提供有效的黏附生长表面，不利于细胞生长。3×10⁵个细胞/ml的细胞初始密度，既能均匀分布细胞于每个微载体表面，促使细胞快速生长，同时也为细胞的生长预留了充裕的生长表面，最终获得较好的培养效果，维持较高的细胞存活率。

搅拌速度优化结果表明，当搅拌速度为50r/min时，细胞密度缓慢上升，最高细胞密度仅为9.3×10⁵cell/ml，这可能是因为搅拌速度过低，转瓶中氧传质速度不能满足细胞消耗，因此细胞生长不出现对数生长期；搅拌速度为120r/min时，最高密度大于前者，但也明显小于搅拌速度为100r/min时的最高细胞密度，说明搅拌过度对细胞产生了严重的剪切伤害。搅拌速度为100r/min时，细胞快速进入对数生长期，56h时细胞最高密度为1.5×10⁶cell/ml。因此，本发明确定100r/min为最佳搅拌速度。

微载体浓度优化结果表明，当微载体浓度为1g/L时不能提供足够的表面积供细胞生长，细胞受到较严重的接触抑制，60h时细胞密度只有1.0×10⁶cell/ml；而微载体浓度为3g/L和5g/L时，36h前细胞密度无明显差别，36～60h前者细胞密度略高于后者，最高细胞密度分别为1.5×10⁶cell/ml和1.3×10⁶cell/ml。考虑到使用成本，微载体浓度选择3g/L。

生物反应器细胞培养代谢分析表明，在MDCK细胞进入对数生长期过程中葡萄糖含量迅速下降到最低值5mmol/L，代谢乳酸由0mmol/L快速升高到20mmol/L，随着细胞总数接近最大值，细胞的葡萄糖消耗逐渐趋于稳定，同时乳酸含量也下降到一个较低的水平。在细胞生长期，葡萄糖消耗量略低于乳酸生成量，说明葡萄糖不是完全代谢生成乳酸，低于50％的葡萄糖完全氧化供给细胞能量。因此，在细胞放大培养过程中，早期细胞以葡萄糖代谢产生大量乳酸为特征，灌注培养基以控制乳酸浓度在较低水平为目的，灌注量3～4体积；中后期以细胞维持生存为灌注目的，灌注量1～2体积，逐步减少以达到较高培养基利用率。

禽流感病毒感染MDCK细胞的条件优化结果表明，病毒感染复数为0.1时可以获得最高的AIV增殖效价，达到10^8.9TCID₅₀/ml。此外，接毒后48h的病毒效价均高于接毒后72h的病毒效价，说明接毒后48h为收获病毒最适时间。TPCK-胰酶浓度为2.0μg/ml时，培养48-72h时AIV病毒最高血凝价从8log2提高到10log2，优于其它处理；TPCK-胰酶浓度为7.5和10μg/ml，因浓度过高对细胞破坏作用较大，导致细胞全部死亡。因此，本发明增殖AIV病毒的病毒维持液中TPCK-胰酶浓度为2.0μg/ml。本发明中，H5N1亚型禽流感病毒在反应器中增殖温度为38℃。

本发明使用5L生物反应器(B5，Sartorius，Germany)。本发明对生物反应器的种类没有特殊限制，一般搅拌式生物反应器均适用于本发明。

本发明方法生产的禽流感灭活疫苗能够应用于预防禽流感。安全性检验表明，接种本发明各批次疫苗的鸡只无全身反应，注射部位吸收较好，无眼观病变，证明本发明疫苗对鸡只安全。免疫实验结果表明，本发明制备的疫苗免疫鸡HI抗体平均效价在7.5log2～9.4log2之间；攻毒后，保护率达100％，明显优于同类型产品免疫组。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明获得的克隆细胞株MDCK-3D6比母本细胞生长速度快，且对禽流感病毒的适应性高，传代至11-20代，病毒HA达到256。本发明优化了利用微载体大规模培养克隆细胞株MDCK-3D6及增殖禽流感病毒的条件，所制备的灭活疫苗对鸡只安全，免疫鸡HI抗体效价高，对H5N1亚型禽流感病毒的攻击实现100％免疫保护。本发明为以哺乳动物细胞为基质大规模增殖病毒及制备禽流感疫苗提供了依据。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“单细胞克隆”意指将一个细胞进行培养，使之不断分裂，形成一个细胞群的过程，这一群细胞来源于一个共同的祖先细胞。

术语“亚克隆”意指在细胞克隆中，对培养的细胞，从原有的克隆中再筛选出具有某种特性的细胞进行培养。

术语“传代”意指当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液的过程，否则将影响细胞的继续生存。

附图说明

图1为克隆细胞株的一步生长曲线图；

图2为不同初始密度的MDCK细胞在3g/L微载体上生长曲线；

图3为不同初始密度的MDCK细胞在3g/L微载体上培养6h时的黏附效率比较；

图4为搅拌速度对微载体培养MDCK细胞生长的影响；

图5为微载体浓度对微载体培养MDCK细胞生长的影响；

图6为5L生物反应器培养MDCK细胞的葡萄糖、乳酸含量曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、材料与试剂

1.1 毒株与细胞

禽流感H5N1亚型病毒株Re-6血凝效价为1:512，病毒粒子浓度约为3×10⁸PFU/mL，由国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪病分子诊断实验室惠赠；MDCK(Madin-Darbin caninekidney)细胞购自北京博大泰克公司，在本发明人实验室传代培养至89代。

1.2 主要设备与试剂

5L生物反应器(B5，Sartorius，Germany)；TPCK-胰酶购自Sigma公司；Cytodex-1购自GE Healthcare公司；DMEM购自Life technology；其他试剂均为进口或国产分析纯产品。

实施例1 MDCK克隆细胞株的克隆

1、实验方法

1.1 MDCK克隆细胞株的克隆

(1)选择种细胞MDCK；

(2)细胞传代：首先复苏步骤(1)所选择的种细胞到T25的细胞瓶中，生长48h左右，按照1：4的比例进行传代，克隆前继续传代20次；

(3)采用有限稀释法在96孔板内进行MDCK单细胞克隆，消化后的MDCK细胞计数后稀释到1个细胞/毫升，将稀释好的细胞铺于96孔板，0.1ml/孔，37℃5％CO₂培养箱内培养，观察10日；

(4)选取单个克隆进一步亚克隆，经3次亚克隆，选取单克隆株进行扩大培养，培养液为DMEM(含10％FBS)，然后，对克隆细胞进行进一步鉴定。

1.2 MDCK克隆细胞株对禽流感病毒的适应性分析

培养MDCK克隆细胞株，15代以后采取1:10的比例进行传代，每隔5代冻存一次直到25代。将单克隆细胞接种于细胞培养瓶(T25Corning)中，37℃，5％CO₂培养48h形成单层后，弃去培养基，PBS(pH 7.2)冲洗两次，按照感染复数(MOI)＝0.1加入禽流感病毒H5N1 RE-6株，37℃，5％CO₂培养箱中吸附1h，加入9ml DMEM维持液(含终浓度5μg/ml TPCK-胰酶，0.5％FBS)，37℃，5％CO₂继续培养，逐日观察。当病变达到80％(5天内)，反复冻融2次，2,000rpm 4℃离心20分钟后收获上清，进行HA检测。分别测定不同代次MDCK克隆细胞株的HA，以母本MDCK细胞为对照。

2、实验结果

2.1 MDCK克隆细胞株的获得

本发明采用有限稀释法进行MDCK单细胞克隆，然后选取单个克隆进一步亚克隆，经3次亚克隆，最终获得6株单克隆细胞，分别命名为MDCK-3D2、MDCK-3D3、MDCK-3D5、MDCK-3D6、MDCK-3D7和MDCK-3D9。

2.2 MDCK克隆细胞株的生长特性分析结果

生长曲线测定结果显示，克隆细胞株MDCK-3D6与母本细胞相比，生长速度快(图1)；而另外5株细胞MDCK-3D2、MDCK-3D3、MDCK-3D5、MDCK-3D7和MDCK-3D9与母本细胞的生长速度基本一致或略慢。

2.3 MDCK克隆细胞株对禽流感病毒的适应性分析

克隆细胞MDCK-3D2、MDCK-3D3、MDCK-3D5、MDCK-3D6、MDCK-3D7和MDCK-3D9对禽流感疫苗株的适应性实验结果见表1。

结果表明，克隆细胞MDCK-3D6对禽流感疫苗株的适应性高，传代至11-20代，病毒HA达到256；传代至21-25代，病毒HA达到512；显著高于克隆细胞株MDCK-3D2、MDCK-3D3、MDCK-3D5、MDCK-3D7和MDCK-3D9以及母本细胞。

表1 克隆细胞对禽流感疫苗株的适应性实验结果

因此，本发明将获得的MDCK克隆细胞株MDCK-3D6提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.12040。

实施例2 微载体培养MDCK克隆细胞株增殖禽流感病毒

本实施例所述MDCK细胞为实施例1获得的MDCK克隆细胞株MDCK-3D6，其微生物保藏编号为：CGMCC No.12040。

1、实验方法

1.1 微载体处理

用无Ca²⁺、Mg²⁺离子的磷酸缓冲液清洗并浸泡微载体至少3h后，经121℃高压蒸汽灭菌25min，冷却后储于4℃密封待用。使用前用37℃的细胞培养液清洗2遍。

1.2 MDCK细胞的反应器培养优化

1.2.1 不同初始密度细胞对细胞生长的影响

不同初始密度1.5×10⁵个细胞/ml、3.0×10⁵个细胞/ml、4.5×10⁵个细胞/ml的MDCK细胞分别接种于5L反应器中，微载体用量为3g/L，观察不同初始密度对细胞生长的影响，确定最佳接种细胞密度。

1.2.2 搅拌速度对细胞生长的影响

分别考察搅拌速度为50/min、100r/min和120r/min时MDCK细胞在DMEM培养基中的生长情况，微载体浓度为3g/L。以3.0×10⁵cells/ml细胞密度接种于5L反应器中，工作体积为2L，每隔12h进行监测，取样计数细胞。

1.2.3 不同微载体浓度对细胞生长的影响

微载体供应商GE公司推荐的微载体浓度为2～3g/L，分批培养细胞时一般不超过5g/L。本发明考察了微载体浓度为1g/L、3g/L和5g/L时细胞的生长情况。

1.2.4 代谢产物对细胞生长的影响

MDCK细胞培养过程中，乳酸和葡萄糖的代谢情况是细胞生长的主要指标。因此，本发明检测细胞生长过程中葡萄糖、乳酸代谢情况，并对灌注策略进行分析。

1.3 微载体培养禽流感病毒条件优化

1.3.1 病毒感染量(MOI)的确定

细胞培养72h后，分别以MOI＝0.005、0.01、0.1、0.5、1和5接种病毒，分别培养48、72h后，检测病毒滴度。

1.3.2 TPCK-胰酶浓度的确定

为了考察TPCK-胰酶对MDCK细胞生长和病毒滴度的影响，本发明在MDCK细培养到优化的感染时间时，病毒维持液中分别添加1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL和10μg/mL的TPCK胰酶，检测病毒滴度。

1.3.3 病毒测定

病毒血凝值和TCID₅₀值按照WHO手册提供的方法测定。

(1)病毒血凝值测定：在“U”形96孔板上进行，自左至右各孔加50μL生理盐水；于左侧第1孔加50μLL病毒液(尿囊液或冻干疫苗液)，混合均匀后，吸50μL至第2孔，依次2倍比稀释至第11孔，吸弃50μL，第12孔为红细胞对照；自右至左依次向各孔加入0.5％鸡红细胞悬液50μL，在振荡器上振荡，室温下静置10min后观察结果。

(2)样品TCID₅₀测定：将在含血清培养基中培养好的MDCK细胞消化，稀释至所需的细胞密度(0.8～1.0×10⁵cells/mL，即每孔8000～10000个细胞)，向96孔板中每孔加100μL细胞悬液；置培养箱中37℃孵育24h至细胞铺成单层约60％丰度；取出孔板，吸去培养液，每孔添加约100μL PBS摇晃洗涤2遍以除去血清；将10倍比系列稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100μL，从1到11作11个梯度，从A到H作8个重复，最后一列(A12-H12)做阴性对照(各加100μL病毒稀释液)，置培养箱37℃孵育1h；吸除病毒液，加入100μL细胞维持液；置培养箱37℃孵育72h后观察细胞病变确定TCID₅₀值。

2、实验结果

2.1 初始细胞密度的确定

当微载体用量为3g/L时，初始细胞密度1.5×10⁵个细胞/ml、3.0×10⁵个细胞/ml和4.5×10⁵个细胞/ml使得MDCK细胞在微载体上生长曲线有所差异(图2)。低初始密度(1.5×10⁵个细胞/ml)使MDCK细胞的延迟期延长，这是由于单个微载体上分布的细胞过少，同时还存在较高的微载体空载比例(图3A)，细胞生长缺乏初始密度效应而造成生长相对缓慢，最大细胞密度也最低，但细胞存活率始终维持在较高水平。4.5×10⁵个细胞/ml的初始密度可以使MDCK细胞快速进入生长期，但细胞存活率相对较低，这是由于接种后细胞存在聚团和游离细胞不黏附的现象，虽然单个微载体上分配的细胞个数很多，但不能提供有效的黏附生长表面，不利于细胞生长(图3C)。所以细胞接种于微载体上培养时，合适的细胞初始密度(3×10⁵个细胞/ml)既能均匀分布细胞于每个微载体表面，促使细胞快速生长，同时也为细胞的生长预留了充裕的生长表面，最终获得较好的培养效果，维持较高的细胞存活率(图2和图3B)。

2.2 搅拌速度对细胞生长的影响

微载体培养过程中为了使微载体充分悬浮，必须要有足够高的搅拌速度；但过度的搅拌会延长细胞贴壁时间，严重损伤已贴壁细胞，尤其对有丝分裂周期细胞的伤害更大，导致细胞密度降低。因此本发明分别考察了搅拌速度为50r/min、100r/min和120r/min时MDCK细胞在DMEM培养基中的生长情况。结果如图4所示，当搅拌速度为50r/min时，细胞密度缓慢上升，最高细胞密度仅为9.3×10⁵cell/ml，这可能是因为搅拌速度过低，转瓶中氧传质速度不能满足细胞消耗，因此细胞生长不出现对数生长期；搅拌速度为120r/min时，最高密度大于前者，但也明显小于当搅拌速度为100r/min时的最高细胞密度，说明这时搅拌过度，对细胞产生了严重的剪切伤害。搅拌速度为100r/min时，细胞快速进入对数生长期，56h时细胞最高密度为1.5×10⁶cell/ml。因此，本发明确定100r/min为最佳搅拌速度。

2.3 微载体浓度的确定

微载体浓度影响种子细胞的准备量、最高细胞密度、细胞代数、换液频率和策略，又因为微载体价格昂贵，对培养成本也有很大影响，所以选择合适的微载体浓度对大规模工业化细胞培养有重要意义。微载体供应商GE公司推荐的微载体浓度为2～3g/L。本发明考察了微载体浓度为1g/L、3g/L和5g/L时细胞的生长情况，实验结果如图5所示，微载体浓度为1g/L时，不能提供足够的表面积供细胞生长，细胞受到较严重的接触抑制，60h时细胞密度只有1.0×10⁶cell/ml；而微载体浓度为3g/L和5g/L时，36h前细胞密度无明显差别，36～60h前者细胞密度略高于后者，最高细胞密度分别为1.5×10⁶cell/ml和1.3×10⁶cell/ml。考虑到使用成本，选择3g/L作为微载体的使用重量。

2.4 生物反应器细胞培养代谢分析和灌注策略

在MDCK细胞进入对数生长期过程中葡萄糖含量迅速下降到最低值5mmol/L，代谢乳酸由0mmol/L快速升高到20mmol/L，随着细胞总数接近最大值，细胞的葡萄糖消耗逐渐趋于稳定，同时乳酸含量也下降到一个较低的水平(图6)。由于1分子葡萄糖完全代谢为乳酸的情况下，可以生成2分子乳酸。在细胞生长期，葡萄糖消耗量略低于乳酸生成量，说明葡萄糖不是完全代谢生成乳酸，低于50％的葡萄糖完全氧化供给细胞能量。因此，在细胞放大培养过程中，早期细胞以葡萄糖代谢产生大量乳酸为特征，灌注培养基以控制乳酸浓度在较低水平为目的，灌注量3～4体积；中后期以细胞维持生存为灌注目的，灌注量1～2体积，逐步减少以达到较高培养基利用率。

2.5 禽流感病毒感染MDCK细胞的条件优化

2.5.1 病毒感染量(MOI)及收毒时间的确定

不同的感染复数对AIV增殖效价的影响结果如表2所示。过高或过低的感染复数(5和0.005)均导致较低的AIV增殖效价，说明接毒剂量直接影响病毒的增殖效率。感染复数为0.1时可以获得最高的AIV增殖效价，达到10^8.9TCID₅₀/ml。此外各组试验结果均显示，接毒后48h的病毒效价均高于接毒后72h的病毒效价，说明接毒后48h可以作为收获病毒的最适时间。

表2 不同感染复数(MOI)对AIV增殖效价的影响

2.5.2TPCK-胰酶对AIV病毒增殖的影响

按MOI＝0.1接种AIV病毒，TPCK-胰酶浓度分别为1.0、2.0、5.0、7.5和10μg/ml，38℃培养，每隔12h，收获病毒，测定血凝价(HA)，结果见表3。

表3 不同TPCK-胰酶浓度接毒后不同时间病毒血凝价(log2)

从表3中可以看出，TPCK-胰酶浓度为2.0μg/ml时，培养48-72h时AIV病毒最高血凝价从8log2提高到10log2，优于其它处理。因此，本发明利用增殖AIV病毒的病毒维持液中TPCK-胰酶浓度为2.0μg/ml。7.5和10μg/ml的TPCK-胰酶因浓度过高对细胞破坏作用较大，导致细胞全部死亡。

2.6 禽流感病毒在5L反应器中增殖条件的优化结果

综上，本发明确定H5N1亚型禽流感病毒在5L反应器中增殖的最佳条件为：初始细胞密度3.0×10⁵细胞/ml，搅拌速度为100r/min，微载体浓度为3g/L；按MOI＝0.1接种AIV病毒；病毒维持液中同时含2.0μg/ml的TPCK-胰酶；38℃培养48-72h。

实施例3 禽流感灭活疫苗的评估

1、实验方法

1.1 禽流感病毒培养

按照实施例2优化的结果利用5L生物反应器进行禽流感病毒的培养。本实施例所述MDCK细胞为实施例1获得的MDCK克隆细胞株MDCK-3D6，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.12040；禽流感病毒为禽流感H5N1亚型病毒株Re-6。

1.2 收获病毒

培养至80％以上的细胞出现致细胞病变效应(CPE)时，即可收获病毒。

1.3 病毒灭活与配苗

灭活前调整至每0.1ml的病毒含量≥10^7.0EID₅₀，HA滴度≥2⁹，符合配苗要求。

病毒液5000r/min离心30min，去除死细胞和碎片，取上清；将上清液进行10倍浓缩后，采用甲醛溶液灭活，使灭活剂终浓度为病毒液上清总体积的0.1％，37℃灭活16h，可以完全灭活；经过无菌性检验之后，将灭活病毒分别与进口油佐剂按体积比(1：1.5)混合，乳化后用于动物免疫。

1.4 免疫实验

设计实验，比较本发明生产的经检查合格的H5N1亚型禽流感病毒灭活疫苗与哈药集团生物疫苗有限公司和哈尔滨维科生物技术开发公司2个厂家生产的H5亚型禽流感疫苗预防禽流感的效果。

1.4.1 安全性检验

本发明方法生产的各批次疫苗用40日龄SPF鸡10只，各颈部皮下或胸部肌肉注射疫苗2羽份，观察14日。

1.4.2 免疫保护

将4周龄的SPF鸡随机分成A、B和C试验组，每组10只；D组为阴性对照组，SPF鸡5只。将本发明制备的禽流感病毒灭活疫苗免疫A试验组；国内2个厂家生产的H5N1亚型禽流感疫苗分别免疫B和C试验组；其中，哈药集团生物疫苗有限公司的禽流感灭活疫苗免疫B试验组，哈尔滨维科生物技术开发公司的禽流感灭活疫苗免疫C试验组；每组疫苗颈部皮下接种试验鸡10只，接种剂量0.3mL/只；对照组不免疫。

免疫后第7、14、21天，采集每只鸡血清，按现行《中国兽药典》附录方法测定试验组和阴性对照组每只鸡的HI抗体效价。

免疫3周后，用H5N1亚型禽流感病毒静脉注射攻击试验组和对照组鸡，攻击5天后，采集泄殖腔棉拭子，用10日龄SPF鸡胚进行病毒分离。以从泄殖腔没有分离到病毒判定为免疫攻毒保护。

2、实验结果

2.1 H5N1亚型禽流感灭活疫苗的安全性检验

安全性检验结果表明，接种2羽份本发明方法制备的各批次疫苗的鸡只无全身反应，注射部位吸收较好，无眼观病变。证明本发明方法制备的疫苗对鸡只安全。

2.2 免疫实验结果

3种疫苗接种试验鸡3周后，采血检测抗体效价，结果表明(表4)，对照鸡几何平均效价均低于2log2，免疫鸡HI抗体几何平均效价在7.5log2～9.4log2之间。攻毒后，A组的保护率达100％，明显优于同类型产品免疫的B组和C组。表明，本发明方法制备的疫苗能对H5N1亚型禽流感病毒的攻击实现100％免疫保护。

表4 3组疫苗的免疫保护试验结果

Claims (15)

1.一株MDCK克隆细胞株MDCK-3D6，其特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCCNo.12040。

2.权利要求1所述MDCK克隆细胞株MDCK-3D6在培养病毒中的应用。

3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于，所述病毒包括：流感病毒、狂犬病病毒或副流感病毒。

4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，所述流感病毒包括：禽流感病毒、人流感病毒或马流感病毒。

5.按照权利要求4所述的应用，其特征在于，所述流感病毒为禽流感病毒。

6.一种禽流感灭活疫苗的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将权利要求1所述MDCK克隆细胞株MDCK-3D6接种到生物反应器中的微载体上，培养细胞；(2)接种禽流感病毒，增殖所述病毒，收获病毒液；(3)将病毒液灭活，加入佐剂混合，乳化，即得。

7.按照权利要求6所述的生产方法，其特征在于：步骤(1)所述MDCK克隆细胞株MDCK-3D6按照1.5×10⁵-4.5×10⁵个/ml的初始密度接种到微载体上；

所述微载体的浓度为1-5g/L。

8.按照权利要求7所述的生产方法，其特征在于：步骤(1)所述MDCK克隆细胞株MDCK-3D6按照3.0×10⁵个/ml的初始密度接种到微载体上；

所述微载体的浓度为3-5g/L。

9.按照权利要求7所述的生产方法，其特征在于：所述微载体的浓度为3g/L；

所述微载体是Cytodex-1。

10.按照权利要求6所述的生产方法，其特征在于：步骤(1)所述培养细胞的搅拌速度为50-120r/min。

11.按照权利要求10所述的生产方法，其特征在于：步骤(1)所述培养细胞的搅拌速度为100r/min；

所述培养细胞的时间为72h。

12.按照权利要求6所述的生产方法，其特征在于：步骤(2)所述接种禽流感病毒的病毒感染复数MOI为0.005-5；

所述增殖的过程中，病毒维持液中TPCK-胰酶的浓度为1-10μg/mL；

所述收获病毒液的时间为接种禽流感病毒后24-96h。

13.按照权利要求12所述的生产方法，其特征在于：步骤(2)所述接种禽流感病毒的病毒感染复数MOI为0.1；

所述增殖的过程中，病毒维持液中TPCK-胰酶的浓度为1-5μg/mL；

所述收获病毒液的时间为接种禽流感病毒后48-72h；

所述禽流感病毒为禽流感H5N1亚型病毒株Re-6。

14.按照权利要求12所述的生产方法，其特征在于：步骤(2)所述增殖的过程中，病毒维持液中TPCK-胰酶的浓度为2μg/mL；

所述收获病毒液的时间为接种禽流感病毒后48h。

15.按照权利要求6所述的生产方法，其特征在于：步骤(3)所述将病毒液灭活包括：将病毒液离心，取上清液；将上清液浓缩，加入灭活剂，灭活；

其中，所述灭活剂是甲醛溶液；所述灭活剂的终浓度为病毒液上清总体积的0.1％；所述灭活为37℃灭活16h；

灭活的病毒液与佐剂按照体积比1：1.5混合；所述佐剂为油佐剂。