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CN118956732A - 一种鸭眼角膜上皮细胞悬浮细胞株及其构建方法与应用 - Google Patents

一种鸭眼角膜上皮细胞悬浮细胞株及其构建方法与应用 Download PDF

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CN118956732A
CN118956732A CN202411276253.1A CN202411276253A CN118956732A CN 118956732 A CN118956732 A CN 118956732A CN 202411276253 A CN202411276253 A CN 202411276253A CN 118956732 A CN118956732 A CN 118956732A
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duck
virus
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cells
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方琳
朱辉
邵宝顺
杨义芬
柳国权
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Guangzhou Baisai Biopharmaceutical Technology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Baisai Biopharmaceutical Technology Co ltd
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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸭眼角膜上皮细胞悬浮细胞株及其构建方法与应用。本发明首次在鸭上分离获得成眼角膜上皮细胞，并成功悬浮驯化，名称为麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE‑S，于2024年6月28日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2024189。该细胞株易于培养，生长速度较快，能够稳定传代，细胞密度高，可达6～8×106cells/mL，呈单个分散生长，形态饱满，大小均一，细胞活率高、适用于生物反应器无血清悬浮培养的细胞株。该细胞株可用于培养、分离、检测禽类病毒，制备禽类疫苗，筛选用于预防或治疗禽类病毒感染所致的疾病的药物。

Description

一种鸭眼角膜上皮细胞悬浮细胞株及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸭眼角膜上皮细胞悬浮细胞株及其构建方法与应用。
背景技术
我国是肉鸭生产和消费大国，每年生产消费肉鸭30多亿只，占全球肉鸭销量70％以上，年产值在1000亿元以上，伴随着饲养量的增加，禽病频频发生，禽流感(H5、H7和H9等亚型)、鸭瘟、鸭病毒性肝炎、雏番鸭小鹅瘟、番鸭细小病毒病、鸭细小病毒病、鸭冠状病毒性肠炎、鸭痘、番鸭呼肠孤病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病、鸭副粘病毒病、鸭圆环、鸭坦布苏病毒病等新型病毒性传染病，均是危害水禽养殖业最为严重的疾病，严重制约着养禽业的发展。
疫苗免疫是预防动物疫病最有效的手段，国内禽类疫苗的生产主要依靠鸡胚培养工艺、禽原代细胞培养工艺、传代细胞培养工艺。其中，鸡胚培养工艺培养周期长、操作步骤繁琐、生产成本高，大规模生产时存在鸡胚质量不稳定及潜在外源病毒污染问题，收获完成后废胚难以无害化处理，存在病毒扩散风险和污染环境问题。禽原代细胞培养工艺，每次均需要制备新鲜的原代细胞，且仅可通过贴壁培养工艺生产病毒疫苗，一方面需要血清维持培养，成本高；另一方面，放大规模有限，受基质表面积限制导致病毒产量下降，容易污染和批间质量不一致。传代细胞培养工艺，现有的细胞源疫苗主要采用异源细胞(如用犬肾细胞(MDCK悬浮细胞)培养禽流感病毒)作为培养基质进行病毒生产，疫苗免疫效果比鸡胚培养效果略差。
国内禽类细胞的研发与成果较少，尚无商品化的鸭源细胞系。为了更好更有效的分离、增殖和生产禽类病毒，开发水禽专用疫苗，预防疾病爆发，开发一株适用于工业化大规模生产的鸭源细胞悬浮细胞株，意义重大。
申请号202111338851.3《鹅视网膜上皮细胞系及其构建方法与运用》，主要是获得1株低血清贴壁培养型鹅视网膜上皮细胞系，并非鸭源细胞系，且不能进行无血清悬浮培养。
申请号202210113778.8《猪视网膜上皮细胞系及其构建方法与运用》，主要是获得1株猪视网膜上皮细胞系，非鸭源细胞系，且不能进行无血清悬浮培养。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种细胞系。
本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的细胞系的构建方法。
本发明第三方面的目的，在于提供一种应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种培养病毒的方法。
本发明第五方面的目的，在于提供一种病毒疫苗的方法。
本发明第六方面的目的，在于提供一种病毒疫苗。
为了实现本发明上述的目的，本发明采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一株鸭眼角膜上皮细胞系，名称为麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S（shelduck），于2024年6月28日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2024189。
本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面的鸭眼角膜上皮细胞系构建方法，包括以下步骤：
1)分离鸭胚的眼球，分离眼角膜，剪碎成组织块；
2)加入第一培养基混匀，培养，传代5～15代；
3)使用第二培养基培养，传代3～5代；
4)使用第三培养基培养，传代3～5代；
5)使用第四培养基培养，传代3～5代，
6)使用无血清悬浮培养基培养，传代20～30代，得到。
优选地，所述第一培养基包括8～10v/v％胎牛血清、和基础培养基。
优选地，所述第二培养基包括6～8v/v％胎牛血清、和基础培养基。
优选地，所述第三培养基包括4～6v/v％胎牛血清、和基础培养基。
优选地，所述第四培养基包括2～3v/v％胎牛血清、和基础培养基。
优选地，所述基础培养基包括MEM培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述构建方法包括：1)取7～11日龄鸭胚3枚，用眼科剪分离眼球，放入干净的无菌平皿中，用预冷的D-Hank’s液洗涤3遍，分离眼角膜，剪碎，加入少量8～10v/v％胎牛血清的MEM，吹打破碎组织块，转入培养瓶中培养，培养条件为37℃，5％CO2培养箱；2)细胞分离培养后12～24h，轻轻晃动细胞瓶，将上清弃去，仅留下已贴壁的细胞，补加新鲜8～10v/v％胎牛血清的MEM，持续培养；待细胞长成单层，用0.25wt％EDTA-胰酶进行消化处理至单个细胞，然后，按照平均0.5个细胞/孔的密度接种到96孔板中，标记接种单个细胞的孔，待这些单个细胞孔中的细胞生长成克隆团后即可得到鸭眼角膜上皮单细胞株，持续传代至10代以上；3)采用含6～8v/v％胎牛血清的MEM培养基进行培养，培养条件为37℃，5％CO2培养箱。连续培养3～5代后，采用含4～6v/v％胎牛血清的MEM培养基进行培养；连续培养3～5代后，采用含2～3v/v％胎牛血清的MEM培养基进行培养；连续培养3～5代后，获得低血清贴壁培养型鸭眼角膜上皮细胞；4)待低血清贴壁培养型鸭眼角膜上皮细胞长成单层，用0.25wt％EDTA-胰酶消化，收集细胞悬液，800～1000rpm离心6min，弃去上清，留下细胞沉淀，用无血清悬浮培养基重新悬浮细胞沉淀，将细胞密度调整至1.0×106cells/mL，培养条件为37℃，5％CO2，100～130r/min摇床培养。每24小时取样观察细胞形态，计数。培养2～3天后，离心换液传代，直至每代次细胞的细胞数均≥6.0×106cells/mL。细胞稳定且持续培养传代至30代以上，获得无血清全悬浮培养型鸭眼角膜上皮细胞，即鸭眼角膜上皮细胞悬浮细胞株。
优选地，步骤1)中所述组织碎块的大小为1～2cm3/个。
优选地，所述培养的条件为31～39℃、4～6％ CO2；进一步为33～37℃、5％ CO2。
本发明的第三个方面，在于提供本发明第一方面的鸭眼角膜上皮细胞系在1)～8)中任一项中的应用：
1)培养病毒；
2)制备培养病毒的产品；
3)分离病毒；
4)制备分离病毒的产品；
5)非诊断治疗目的地检测病毒；
6)制备检测病毒的产品；
7)制备病毒疫苗；
8)药物筛选；
所述药物为用于预防或治疗病毒感染所致的疾病的药物。
优选地，所述病毒包括禽流感病毒、鸭圆环病毒、和鸭坦布苏病毒中的至少一种。
优选地，所述禽流感病毒包括H9亚型禽流感病毒。
本发明的第四个方面，提供一种培养病毒的方法，将病毒接种至本发明第一个方面的鸭眼角膜上皮细胞系中，培养。
优选地，所述病毒包括禽流感病毒、鸭圆环病毒、和鸭坦布苏病毒中的至少一种。
优选地，所述禽流感病毒包括H9亚型禽流感病毒。
优选地，所述培养的条件为31～39℃、4～6％ CO2；进一步为33～37℃、5％ CO2。
本发明的第五个方面，提供一种制备病毒疫苗的方法，将病毒接种至本发明第一个方面的鸭眼角膜上皮细胞系中，培养，灭活，得到病毒疫苗。
优选地，所述病毒包括禽流感病毒、鸭圆环病毒、和鸭坦布苏病毒中的至少一种。
优选地，所述禽流感病毒包括H9亚型禽流感病毒。
优选地，所述培养的条件为31～39℃、4～6％ CO2；进一步为33～37℃、5％ CO2。
本发明的第六个方面，提供一种病毒疫苗，通过本发明第五个方面的方法制备得到。
本发明的有益效果是：
本发明通过发明人的大量创造性劳动，首次在鸭上分离获得鸭眼角膜上皮细胞，并成功悬浮驯化，提供了一株鸭眼角膜上皮细胞系，名称为麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S，于2024年6月28日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C2024189。该细胞株易于培养，生长速度较快，能够稳定传代，细胞密度高，可达6～8×106cells/mL，呈单个分散生长，形态饱满，大小均一，细胞活率高、适用于生物反应器无血清悬浮培养的细胞株。该细胞株可用于培养、分离、检测禽类病毒，制备禽类疫苗，筛选用于预防或治疗禽类病毒感染所致的疾病的药物。该细胞株为禽类疫苗的规模化悬浮培养和降本增效提供了重要培养基质。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为实施例1中低血清贴壁培养型鸭眼角膜上皮细胞；其中左侧为培养24小时后结果，右侧为培养48小时后结果。
图2为麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S第25代的生长状态结果。
图3为麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S(F9～F30)不同代次细胞的稳定传代情况。
图4为麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S接种H9亚型禽流感病毒病毒72h的细胞病变结果。
图5为麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S接种鸭圆环病毒病毒60h的细胞病变结果。
图6为麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S接种鸭坦布苏病毒病毒50h的细胞病变结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1鸭眼角膜上皮细胞悬浮细胞株的构建
1、原代鸭眼角膜上皮细胞的快速分离、培养
(1)取孵化10日龄的鸭胚，照检后画出气室边界和胎位；
(2)用75％酒精消毒胚蛋，于无菌操作台中，用消毒镊子轻轻敲碎气室部卵壳并取走之，用另一无菌镊子撕去气室部壳膜，再用另一无菌镊子取出胚体，放入无菌平皿中；
(3)用眼科剪分离眼球，放入干净的无菌平皿中，用预冷的D-Hank’s液洗涤3遍，分离眼角膜，剪碎，加入少量10v/v％胎牛血清的MEM，吹打破碎组织块，转入培养瓶中培养，培养条件为37℃，5％CO2培养箱；
(4)细胞分离培养后24h，轻轻晃动细胞瓶，将上清弃去，仅留下已贴壁的细胞，补加新鲜10％胎牛血清的MEM，持续培养；
(5)待细胞长成单层，用0.25wt％EDTA-胰酶进行消化处理至单个细胞，然后，按照平均0.5个细胞/孔的密度接种到96孔板中，标记接种单个细胞的孔，待这些单个细胞孔中的细胞生长成克隆团后即可得到鸭眼角膜上皮单细胞株。
(6)将鸭眼角膜上皮单细胞株持续传代至10代，获得一株形态统一的贴壁培养型鸭眼角膜上皮细胞。
2、鸭眼角膜上皮细胞悬浮细胞株的构建
(1)低血清贴壁培养型鸭眼角膜上皮细胞的获得：待步骤1的(6)中鸭眼角膜上皮细胞长成单层，用0.25wt％EDTA-胰酶消化，采用含8v/v％胎牛血清的MEM培养基进行培养，培养条件为37℃，5％CO2培养箱。连续培养5代后，采用含6v/v％胎牛血清的MEM培养基进行培养；连续培养5代后，采用含3v/v％胎牛血清的MEM培养基进行培养；连续培养5代后，获得低血清贴壁培养型鸭眼角膜上皮细胞。结果如图1所示。
(2)鸭眼角膜上皮细胞悬浮细胞株的获得：待低血清贴壁培养型鸭眼角膜上皮细胞长成单层，用0.25wt％EDTA-胰酶消化，收集细胞悬液，800rpm离心6min，弃去上清，留下细胞沉淀，用无血清悬浮培养基(BSL-01培养基，广州百赛生物医药科技有限公司)重新悬浮细胞沉淀，将细胞密度调整至1.0×106cells/mL，培养条件为37℃，5％CO2，120r/min摇床培养。每24小时取样观察细胞形态，计数。培养3天后，离心换液传代，直至每代次细胞的细胞数均≥6.0×106cells/mL，细胞稳定且持续培养传代至30代，获得无血清全悬浮培养型鸭眼角膜上皮细胞，即鸭眼角膜上皮细胞悬浮细胞株。
上述鸭眼角膜上皮细胞悬浮细胞株构建过程中每进行5次传代，则冻存细胞，建立细胞库。
上述无血清全悬浮培养型鸭眼角膜上皮细胞，命名为麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S，传代至第25代时，于2024年6月28日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2024189。图2为麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S第25代的生长状态结果。图3为麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S(F9～F30)不同代次细胞的稳定传代情况，以悬浮培养开始的代次记为F1，F9至F30代时麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-SD的细胞密度均稳定在6.0×106cells/mL以上。
实施例2麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S接种H9亚型禽流感病毒测试
取麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S第25代细胞，置于37℃，5％CO2，120r/min摇床培养72h，待细胞密度达到6×106cells/mL以上，加入新鲜培养基将细胞稀释至4×106cells/mL，同时按1‰v/v接种H9亚型禽流感病毒(病毒滴度HA＝9log2,EID50＝10-8.0/0.1mL)，并加入终浓度为5ug/mL的TPCK胰酶，调整温度至35℃，培养72h收获病毒液，检测HA。结果表明，麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S对H9亚型禽流感病毒敏感，HA≥9log2。图4为麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S接种H9亚型禽流感病毒病毒72h的细胞病变图，细胞大量死亡、裂解，细胞碎片较多，活细胞明显减少。
上述毒株已在Qi,Xuefeng et al.“Down-regulation of cellular proteinheme oxygenase-1inhibits proliferation of avian influenza virus H9N2 inchicken oviduct epithelial cells.”The Journal of general virology vol.99,1(2018):36-43.doi:10.1099/jgv.0.000986文献中公开。
实施例3麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S接种鸭圆环病毒(DuCV)测试
取麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S第25代细胞，置于37℃，5％CO2，120r/min摇床培养72h，待细胞密度达到6×106cells/mL以上，加入新鲜培养基将细胞稀释至4×106cells/mL，同时按5‰v/v接种鸭圆环病毒(病毒滴度TCID50＝10-6.0/0.1mL)，调整温度至37℃，培养60h后收获病毒液，检测TCID50。结果表明，麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S对鸭圆环病毒敏感，TCID50≥10-7.0/0.1mL。图5为麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S接种鸭圆环病毒60h的细胞病变图，细胞大量死亡、裂解，细胞碎片较多，活细胞明显减少。
上述毒株已在于新友等.鸭甲型肝炎病毒3型和鸭圆环病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国家禽.文献中公开。
实施例4麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S接种鸭坦布苏病毒(DTMUV)测试
取麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S第25代细胞，置于37℃，5％CO2，120r/min摇床培养72h，待细胞密度达到6×106cells/mL以上，加入新鲜培养基将细胞稀释至4×106cells/mL，同时按0.5‰v/v接种鸭坦布苏病毒(病毒滴度TCID50＝10-7.0/0.1mL)，调整温度至37℃，培养50h后收获病毒液，检测TCID50。结果表明，鸭眼角膜上皮细胞悬浮细胞株对鸭坦布苏病毒敏感，TCID50≥10-7.5/0.1mL。图6为麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S接种鸭坦布苏病毒病毒50h的细胞病变图，细胞大量死亡、裂解，细胞碎片较多，活细胞明显减少。
上述毒株已在祖立闯等.鸭坦布苏病毒一步RT-PCR检测方法的建立与初步应用[J].广东畜牧兽医科技，2015(第40卷)，第5期，37-40.文献中公开。

Claims (10)

1.一株鸭眼角膜上皮细胞系，名称为麻鸭眼角膜上皮悬浮细胞DCE-S，于2024年6月28日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2024189。
2.权利要求1所述的鸭眼角膜上皮细胞系的构建方法，包括以下步骤：
1)分离鸭胚的眼球，分离眼角膜，剪碎成组织块；
2)加入第一培养基混匀，培养，传代5～15代；
3)使用第二培养基培养，传代3～5代；
4)使用第三培养基培养，传代3～5代；
5)使用第四培养基培养，传代3～5代，
6)使用无血清悬浮培养基培养，传代20～30代，得到。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：
所述第一培养基包括8～10v/v％胎牛血清、和基础培养基；和/或
所述第二培养基包括6～8v/v％胎牛血清、和基础培养基；和/或
所述第三培养基包括4～6v/v％胎牛血清、和基础培养基；和/或
所述第四培养基包括2～3v/v％胎牛血清、和基础培养基。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：
所述基础培养基包括MEM培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基中的至少一种。
5.权利要求1所述的鸭眼角膜上皮细胞系在1)～8)中任一项中的应用：
1)培养病毒；
2)制备培养病毒的产品；
3)分离病毒；
4)制备分离病毒的产品；
5)非诊断治疗目的地检测病毒；
6)制备检测病毒的产品；
7)制备病毒疫苗；
8)药物筛选；
所述药物为用于预防或治疗病毒感染所致的疾病的药物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：
所述病毒包括禽流感病毒、鸭圆环病毒、和鸭坦布苏病毒中的至少一种。
7.一种培养病毒的方法，将病毒接种至权利要求1所述的鸭眼角膜上皮细胞系中，培养。
8.一种制备病毒疫苗的方法，将病毒接种至权利要求1所述的鸭眼角膜上皮细胞系中，培养，灭活，得到病毒疫苗。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：
所述病毒包括禽流感病毒、鸭圆环病毒、和鸭坦布苏病毒中的至少一种。
10.一种病毒疫苗，通过权利要求8或9所述的方法制备得到。
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