NO840563L - Fremgangsmaate ved fremstilling av oktapeptid-vasopressinantagonister - Google Patents

Description

Foreli-ggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved fremstilling av nye cykliske oktapeptider som er vasopressin-antagonister. -EiorbindeIsene som fremstilles ifølge oppfinnelsen er 9-desGly-vasopressin (VSP) antagonister eller 9-desGly-l-Pmp-vasopressiner. Nærmere bestemt har strukturene til disse oktapeptider en (3-merkapto-3, (3-cykloalkylenpropionsyre og fem aminosyreenheter cyklisert til en 6-enheters ring ved hjelp av et svovel fra en cysteinenhet og et svovel fra propionsyrenheten. Ringen har også en karakteristisk dipeptidhale som mangler en glycinenhet, knyttet ved hjelp av en amidbinding til 6-cysteinenheten. M. Manning, W.H. Sawyer og medarbeidere har publisert en rekke publikasjoner som beskriver forskjellige [ 1-((3-merk-^ apto~3 13-cyklopentametylenpriopionsyre)-4-valin]-arginin-vasopressinarter som har anti-vasopressinaktivitet. Repre-sentativer for disse er EPA nr. 61.356, US-patent nr. 4.367.225 og US-patent nr. 4.399.125.

Alle Mannings forbindelser har en tripeptidkjede knyttet til enhet 6 og er selvfølgelig nonapeptider. Foreliggende forbindelser adskiller seg fra disse ved at de er oktapeptider, at de har en des-Gly-dipeptidhale bundet til enhet 6 og ved å ha sterk vasopressinantagonist aktivitet.

Den sterke biologiske aktiviteten til de foreliggende forbindelser er uventet i lys av at des-glycinamid 9-vasopressin og des-lysin 8 -des-glycinamid 9-vasopressin [T. Barth et al., Collection Czechoslov. Chem. Commun. 39, 506 (1974)] samt des-glycin 9-oksytocin [B. Berde et al., Handb. Exp. Pharm 23 860 (1968)] beholder lite av aktiviteten til sine respek-tive stamforbindelser. Barth angir at des-glycinamid 9-AVP har CNS-aktivitet, men praktisk ingen diuretisk eller uterotonisk aktivitet, belgisk patent nr. 896.509.

Visse betegnelser brukes på peptidområdet betyr i denne beskrivelse og krav følgende: Cap, 3_merkapto-3,3-cyklo-_alkylenpropionsyre ; Pmp', 3_merkapto-3 / 3-cyklopentamety lejn- 1 propionsyre; Chg, cykloheksylglycin; Abu, a-amino-n-smør-syre; Cha, cykloheksylalanin; Pba, aminofenylsmørsyre; Gin, glutamin; Gly, glycin; Tyr, tyrosin; Phe, fenylalanin; Phe(4'-Alk), lavere alkylfenylalanin; Val, valin; Nva, norvalin; Ile, isoleucin; Nie, norleucin; D-alle, D-allo-isoleucin; Leu, leucin; Ala, alanin; Lys, lysin; Arg, arginin; Asn, asparagin; Met, metionin; Tos, tosylat; HF, hydrogenfluorid; BHA, benzhydrylamin; DIEA, diisopropyletylamin; 4-MeBzl, 4-metylbenzy1; TFA, trifluoreddiksyre; DCC, dicykloheksylkarbodiimid; HBT, 1-hydroksybenzotriazol; ADH, antidiuretika hormon; ACM, acetamidomety1; DMAP, dimetylaminopyridin.

Når uttrykket "vasopressin" brukes, bare i beskrivelsen, betyr det L-argininvasopressin (AVP) med mindre annet er nevnt. AVP-derivatene foretrekkes i foreliggende oppfinnelse. "Alk" betyr en lavere alkyl med 1-4 karboner som eventuelt er knyttet til nitrogenet ved Y, til oksygensub-stituenten i tyrosinenheten når en slik foreligger i 2-stilling eller til fenylringen i en fenylalaninenhet på ringen i 3-stilling. Slike alkylsubstituenter er metyl, etyl, n-propyl, isopropyl eller butyl.

I beskrivelsen her og i kravene brukes derfor den vanlige nomenklatur på området peptid og vasopressinkjemi. Når ingen konfigurasjon er angitt, er aminosyreenheten i L eller den naturlige forekommende form.

desGly 9-forbindelsene i oppfinnelsen illustreres ved den følgende strukturformel:

hvor:

I

i P er Phe eller Phe(4'-Alk);

X. er D-Phe, D-Val, D-Nva, D-Leu, D-Ile, D-alle, D-Pba, D-Nle,

D-Cha, D-Abu, D-Met, D-Chg, D eller L-Tyr eller D eller L-Tyr(alk);

Y er NH2, NHAlk, NHBzl eller OH;

W er D-Pro, L-Pro eller A<p>ro (dehydro-Pro);

A er Val, Ile, Abu, Ala, Gly, Lys, Cha, Nie, Phe, Leu, Chg

eller Nva;

Z er D-Arg, L-Arg, D-Lys eller L-Lys;

n er 0, 1 eller 2, eller et farmasøytisk salt, ester for-stadium eller kompleks derav.

En undergenerisk gruppe forbindelser i foreliggende oppfinnelse omfatter forbindelser med formel I hvor X er D-Tyr, D-Cha, D-Phe, D-Ile, D-Leu, D-Val eller D-Tyr(Et); P er Phe• eller Phe(4'-Et), A er som ovenfor definert, Y er NH2; W er Pro, Z er Arg og n er 1.

Forbindelsene med formel I hvor X er D-Tyr(Et) er spesielt aktive ADH-antagonister i likhet med amid 8-typene.

Enkeltf orbindelser av interesse er [ 1- ((3-merkapto-p, 3-cyklopentametylenpropionsyre)-2-D-tyrosin-4-valin-8-arginin-9 - de sg ly ein ] vasopressin , [ 1- (3-merkapto-3 , (3-cyklopenta-metylenpropionsyre)-2-D-tyrosin-4-valin-8-arginin-9-des-glycinamid) vasopressin og, spesielt, [1-(3-merkapto-3,3-cyklopentametylenpropionsyre)-2-(0-etyl-D-tyrosin)-4-valin-8-arginin-9-desglycin]vasopressin.

Oppfinnelsen innbefatter også forskjellige derivater av forbindelsen med formel I såsom addisjonssalter, forstadier i éstere eller amidform og komplekser. Addisjonssaltene kan enten være salter med farmasøytisk akseptable kationer såsom NH^ , Ca^7, K eller Na på den endestående syregruppe (Y = OH) eller med et farmasøytisk akseptabelt salt på en basisk senter i peptidet (som i Arg-enhetene). Acetatsalt-formene er spesielt anvendelige selv om hydrokloridet, hydro-bromidet og saltene med andre sterke syrer er anvendelige. ! F! orbindelsene danner også interne salter eller zwitterioIner<1>når Y er OH. Esterforstadiumsformene er f.eks. lavere alkyl-estere av syrer med formel I som har fra 1-8 karboner i alkylresten eller aralkylestere såsom forskjellige benzyl-estere. Andre latente derivater av forbindelsen med formel I vil være åpenbare for fagmenn. "Komplekser" innbefatter forskjellige solvater såsom hydrater eller alkoholater eller slike som bæres av harpikser, såsom en Merrifieldharpiks.

Forbindelsene med formel I fremstilles ved å cyklisere et lineært oktapeptid ved hjelp av to merkaptogrupper ved cysteinenheten (Cys) i 6-stilling og ved 3-merkapto~3,3-cykloalkylenpropionsyreenheten (Cap) i 1-stilling. Cykli-seringsreaksjonen forløper lett i nærvær av et mildt oksydasjonsmiddel som kan oksydere et merkaptan til et disulfid. Reaksjonen vises som følger:

hvor:

X, P, A og Y er som definert under formel I ovenfor;

Z er som definert for formel I ovenfor eller kan også være

en enkeltbinding når Y er OH;

W er som definert for- formel I ovenfor eller kan også være OH når Z og Y ikke er til stede; og

12

Q og Q er begge hydrogen eller en utskiftbar gruppe.

Mellomproduktene med formel II er nye forbindelser og ut-gjør en del av oppfinnelsen. Forbindelsene med formel III hvor en av, eller både,. W og Z mangler, er også nye forbindelser som kan brukes som mellomprodukter som beskrevet nedenunder. Sistnevnte har VSP-antagonistaktivitet i lavere grad enn oktapeptidene.

Gykliseringsreaksjonen i denne reaksjonsserie utføres nor malt ved oksydasjon. Alle oksyderingsmidler som er kjent for å kunne overføre et dimerkaptan til et disulfid kan brukes. Eksempler på slike reagenser er et alkalimetall-ferricyanid, spesielt kalium eller natriumferricyanid, oksygengass, di-jodmetan eller jod.

Som et eksempel tilsettes kaliumferricyanid til dimerkaptanet med formel II oppløst i et egnet inert løsningsmiddel, f.eks. vann eller vandig metanol ved temperaturer fra 0-40°C. Oksydasjonen foregår ofte ved en pH på 7-7,5 ved omgivelsestemperatur i fortynnet løsning som gir gode utbytter, 40-

50 %, av den cykliske forbindelse.

6 7 Forbindelsene med formel III som er Cys(OH) eller Pro(OH) -

forbindelser omsettes med et dipeptid, et beskyttet (N^)-. WZY eller en aminosyre, (NH2)-Z-Y henholdsvis, som beskrevet senere.

Det lineære merkaptanutgangsmaterialet kan, men behøver

ikke ha, utskiftbare eller beskyttede grupper av samme art

12

(Q og Q. ) på de forskjellige aminosyreenheter. Slike beskyttelsesgrupper innbefatter benzyl, p_-metoksybenzy 1, 1-adamantyl, t-butyl, p-nitrobenzy1, trityl, benzyltiomety1, etylkarbamoy1 eller acetamidomety1. Benzyl, adamantyl eller t-butyl fjernes med kvikksølv (halogen) acetatsalter i vandig metanol ved 0-80°C. Beskyttelsesgruppene fjernes gjerne før cyklisering som under hydrogenfluoridspaltingen av peptidet fra det bærende harpiks. Det kan imidlertid fjernes enten under cykliseringen eller, in situ, før cykliseringen.

S-acetamidometylgruppene er spesielt anvendelige. F.eks. ble S-ACM-Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-S-ACM-Cys-Pro-OBzl behandlet med kaliumkarbonat i vandig metanol og ga det Pro-syreline-ære peptid i 78-84 % utbytte. Dette ble så oksydativt cyklisert ved bruk av jod i vandig metanol og ga det ønskede Pro(OH)<7->produkt i 65-70 % utbytte. Alternativt ble det ! beskyttede produkt cyklisert under de samme betingelser med innledende jodbehandling etterfulgt av kaliumkarbonatfjérning av den beskyttende esterrest. Pro -syren ble så kondensert med Arg(NH2) ved bruk av DCC og DMAP i DMF ved 0-20°C og ga

i 45 % utbytte.

Jod fjerner derfor den S-beskyttende gruppe, spesielt ACM-gruppen, og cykliserer mellomproduktet. Kvikksølvacetat eller blyacetat fjerner også ACM-gruppen og gir et metall-merkaptid. Dette overføres til tiol in situ ved behandling med hydrogénsulfid og oksyderes så i et separat trinn.

Det ønskede cykliske oktapeptid med formel I can lett isoleres ved å surgjøre den vandige oksydasjonsblanding, såsom ved bruk av iseddik, og føre reaksjonsblandingen over en ionebytterkolonne, f.eks. over en svak sur acrylisk harpiks-kolonne med syre-eluering, eller ved gelfiltrering over en kuleformet gel fremstilt ved kryssbinding av dekstran med epiklorhydrin.

Som et alternativ til cykliseringen av det lineære mellomproduktet med formel II foreslått ovenfor, kondenseres de cyklise.rte 6-Cys-syrer eller 7-Pro-syrer (slike med formel I, hvori enten begge haleenheter, W og Z, eller bare en haleenhet, Z, mangler) med et beskyttet dipeptid, W-Z-Y, eller med en aminosyre, Z-Y, henholdsvis-. Reaksjonen av Cys-syren eller Pro-syren med et egnet beskyttet dipeptid eller aminosyre utføres ved å bruke enhver amiddannende reaksjon som er vanlig i peptidkjemien. Normalt omsettes hovedsakelig ekvimolare mengder utgangsmaterialer i nærvær, av et karbodiimid, såsom dicykloheksylkarbodiimid pluss 1-hydroksybenzotriazol eller dimetylaminopyridin i et organisk løsningsmiddel ved fra 0-35°C, fortrinnsvis fra is til romtemperatur. Beskyttelsesgruppene fjernes ved en reaksjon som ikke vil spalte disulfidbåndet til heksapeptid-ringen, f.eks. mild alkali.

De viktige mellomprodukter med formel II fremstilles lett ved å bruke fastfasemetoder for peptidsyntese som omtalt i

i M. Manning et al., J. Med. Chem. 2_5 46 (1982). En kommersiell I 1 benzhydrylaminbærerharpiks (BHR) brukes for å fremstille'i

sluttproduktene med formel I hvor Y er NH2(des-glycinene) og en -klormetylbærerharpiks (CMR) brukes for å fremstille forbindelsene med formel I hvor Y er OH (des-glycinamidene).

Peptidkjeden til de lineære peptider med formel II bygges opp trinnvis, idet man arbeider fra enhet 8 mot enhet 1. Hver enhet beskyttes formålstjenelig som kjent i peptidkjemien og som beskrevet nedenunder. Alternativt kan forskjellige oligopeptider bygges opp ved å bruke væske eller bærerreaksjoner, og deretter kondenseres som et siste trinn i reaksjonsrekkefølgen for å fremstille dimerkaptomellom-produktene.

Den foretrukne sekvens for harpiksbårede trinnreaksjoner ut-føres lett i en Beckman 990B-peptidsyntetiserer uten å iso-lere hvert peptidmellomprodukt. Prosedyrens detaljer finnes i de etterfølgende arbeidseksempler. Oppløsnings- eller enzymreaksjonsbetingelser anvendes her som kjent på området.

De forskjellige aminosyrer som etter hvert settes til den harpiksbårede kjeden beskyttes som kjent på området. F.eks. brukes Boc-beskyttelsesgruppen for en aminosyre spesielt i a-stilling; en eventuelt substituert benzyl for merkapto-gruppene på Pmp- og Cys-enhetene; tosyl for Argenheten; og en eventuelt substituert karbobenzoksy(Z) for Tyr- eller Lys-enhetene. Beskyttelsesgruppene bør helst være slike som er lette å fjerne, det vil si ved bruk av syrebehandling fdr tert.-butyloksykarbonyIgruppen, natrium-flytende-ammoniakk eller katalytisk hydrogenering for benzyl- eller karbo-benzoksygruppene hvor fjerningsreaksjonsbetingelsene ikke fører til reaksjon i andre deler av peptidet såsom disulfid-bindingen.

Som andre eksempler på beskyttelsesgrupper beskyttes aminogruppen til en aminosyre eller oligopeptid lett av en acyl-gruppe såsom formyl, trifluoracetyl, ftaloyl, p-toluensul-fonyl eller o-nitrofenylsulfonylgruppe; en benzyloksy-karbbnylgruppe såsom benzyloksykarbony1, o-brombenzyloksy-karbonyl, p-brombenzyloksykarbony 1, o- eller p-klorbenzyjl- oksykarbony1, p-nitrobenzyloksykarbony1 eller p-metoksy-benzyloksykarbony1, en alifatisk oksykarbonylgruppe såsom trikloretyloksykarbony1, t-amyloksykarbony1, t-butoksykarbo^nyl eller diisopropylmetoksykarbony1, eller en aralkyloksy-karbonylgruppe såsom 2-fenylisopropoksykarbony1, 2-tolyiso-propoksykarbony 1 eller 2-p_-difenylisopropoksykarbony 1. Aminogrupper beskyttes også ved å danne enaminer ved om-setning med et 1,3-diketon såsom benzoylaceton eller acetyl-aceton.

Karboksylgruppene kan beskyttes ved amiddanneIse, hydrazid-dannelse eller forestering. Amidgruppen er, om nødvendig, substituert med en 3,4-dimetoksybenzy1 eller bis-(p-met-oksyfeny1)-metylgruppe. Hydrazidgruppen er substituert med en benzyloksykarbony1, trikloretyloksykarbony1, trifluoracetyl, t-butoksykarbony1, trityl eller 2-p-difenyliso-propoksykarbonylgruppe. Estergruppen er substituert med en alkanol såsom metanol, etanol, t-butanol eller cyano-metylalkohol; en aralkanol såsom benzylalkohol, p-brom-benzylalkohol, p-klorbenzylalkohol, p-metoksybenzylalkohol, p-nitrobenzylalkohol, 2,6-diklorbenzylalkohol, benzhydryl-alkohol, benzoyImetylalkohol, p-brombenzoylmetylalkohol eller p-klorbenzoylmetylalkohol; et fenol såsom 2,4,6-triklorfenol, 2,4,5-triklorfenol, pentaklorfenol, p-nitrofenol eller 2,4-dinitrdfenol; eller et tiofenol såsom tiofenol eller p-nitrotiofenol. Hydroksygruppen i tyrosin er eventuelt beskyttet ved forestering eller foretering. En gruppe beskyttet ved forestering er, f.eks., en O-acetylgruppe; en 0-benzoylgruppe, 0-benzyloksykarbony1 eller 0-etyloksy-karbony 1. En gruppe beskyttet ved foretering er, f.eks. en 0-benzyl, O-tetrahydropyranyl eller 0-t-butylgruppe.

Aminogruppen i guanidinogruppen i arginin kan beskyttes med en saltdannende, nitro, tosyl, benzyloksykarbony1 eller mesitylen-2-sufonylgruppe. Imidlertid er det ikke alltid nødvendig å beskytte guanidinogruppen.

I Det beskyttede lineære peptidmellomproduktet spaltes fra den bærende harpiksmatrisse, f.eks. ved bruk av ammoniakk i et alkoholisk løsningsmiddel, og behandles så for å fjerne de beskyttende grupper, såsom ved bruk av natrium-flytende-ammoniakk. Denne fremgangsmåte gir amidderivatet av det lineære oktapeptid.

Lettere kombineres de to trinn ved å behandle det harpiksbårede peptid med vannfritt hydrogenfluorid i nærvær av en egnet kationfjerner som er kjent, såsom anisol, hvilket gir oktapeptidmellomprodukt med formel II i dimerkaptanform og i godt utbytte.

Forbindelsene i foreliggende oppfinnelse har sterk vasopressinantagonist aktivitet. Vasooressin er kjent for å bidra til den antidiuretiske virkningsmekanisme i nyrer.

Når virkningen av disse forbindelser antagoniserer det naturlige antidiuretiske homonet (ADH), utskiller legemet vann på grunn av en øket permeabilitet i sluttdelen av renaltrakten. Det antas at virkningsmekanismen ligger ved vasopressinreseptorene ' [V^-reseptorer] som befinner seg på plasmamembranen til bestemte renalepiteliale celler.

Den mest bemerkelsesverdige farmakodynamiske virkningen av ADH-antagonistene i oppfinnelsen er som et vanndiuretikum mer enn et natriuretikum såsom et tiazid.

Enhver pasient som lider av syndromet feilaktig antidiuretisk hormonsekresjon (SIADH) eller av en uønsket edematisk tilstand, er et mål for de krevede forbindelser. Eksempler på kliniske tilstander som gir indikasjon for forbindelsene i foreliggende oppfinnelse er hypertensjon, hepatisk cirrhosis, kongestiv hjertesvikt eller en bestanddel enhver traumatisk tilstand som stammer fra alvorlig skade eller sykdom hvori antagonismen av naturlig forekommende vasopressin ved de . VSP-medierte reseptorpunkter er en bidragende faktor.

Den andre gruppe vasopressinreseptorpunkter er de vaskulære pressorpunkter (V^-reseptorer) som befinner seg i selve det kardiovaskulære system. F.eks. ble forbindelse 5 i tabell I 'prøvet i Dyekes protoeol (US patent nr. 4.367.255) for in-1 hibering av vasopressin-indusert vasokonstriksjon hos rotte; in vitro (pA28,40) og in vivo (pA27,71). Antagonisme ved V2~reseptorpunktene fører til vasodilasjon med et slutt-resultat av anti-hypertensiv aktivitet. Behandling av dys-menorrhea er et annet bruksområde for forbindelsene i foreliggende oppfinnelse når de gis intravenøst eller intranasalt.

Forbindelsene i foreliggende oppfinnelse brukes derfor for

å behandle edemer eller for å utskylle vann hos pasienter som trenger slik behandling ved å gi parenteralt eller ved insufflasjon en ikke-toksisk, men virksom mengde av den valgte forbindelse, fortrinnsvis kombinert med en farma-søytisk bærer. Doseringsenheter av den aktive bestanddel velges fra området 0,01 til 10 mg/kg, fortrinnsvis 0,01

til 5 mg/kg, basert på en 70 kg's pasient. 'Dbseringsenhetene gis fra 1 til 5 ganger daglig.

Den farmasøytiske blanding som skal indusere vasopressin-antagonisme inneholder en aktiv bestanddel med formel I i form av en doseringsenhet som ovenfor beskrevet oppløst eller oppslemmet i en standard bærevæske. En standardbærer er isotonisk saltvann i en ampulle eller et fleredosers glass som er egnet for parenteral injeksjon såsom for intravenøs, subkutan eller intramuskulær administrering.

En blanding for insufflasjon er lignende, men gis normalt

i en gradert doseapplikator eller inhalator. Pulveriserte pulverblandinger kan også brukes, sammen med oljeaktige preparater, geler, puffere for isotoniske preparater, emul-sjoner eller aerosoler, som standardpreparatformer.

Forbindelsene i foreliggende oppfinnelse er påvist å ha ene-stående antagonistisk aktivitet mot det naturlige antidiu-retiské hormon (anti-ADH-aktivitet), in vitro, i det margaktige vev fra svin eller menneskenyre, og, in vivo, i hydropenisk rotte eller hydropenisk ape. Detaljer for in vitro forsøkene finnes i F.L. Stassen et al., J. of Pharm. Exp.Ther. 233, 50-54 (1982), men beregningene av cyklase-; aktiviteten og bindingspotensialet på reseptorpunktet er som følger: Forsøksprosedyre for måling av adenylatcyklaseaktivitet: I hvert eksperiment måles mengden av<32>P/cAMP dannet uten den margaktige membran (blindprøve). Blindprøveverdien trekkes fra alle eksperimentelle data. Forbindelsens virkning ble prøvet med hensyn til basal adenylatcyklaseaktivitet og/eller på vasopressinstimulert aktivitet. Hver måling utføres in triplo. Ka-verdien avledes fra en Line-weaver-Burke plotting. Sammenheng^ en V max = (V max drog3 e/Vmax vasopressin) x 100. K i = 1/[Ka<1>/Ka)-1] hvor I er konsentrasjonen- av antagonisten, og Ka' og Ka er de nødvendige vasopressinkonsentrasjoner for å gi halv-maksimal aktivitet av adenylatcyklasen i nærvær eller fravær av anta-gonist henholdsvis.

Forsøksprosedyre for bindingsmåling:

I hvert eksperiment måles mengden av<3>H-vasopressin bundet

i fravær og i nærvær av et overskudd av vasopressin (7,5 x 10 M) in triplo. Disse verdier representerer total og

ikke-spesifik binding henholdsvis. K Bfor en forbindelse avledes fra ligningen for kompetitiv inhibering: K = IC^q/(1 + L/KD), hvor IC^q er den nødvendige konsentrasjon for 50 % inhibering av spesifik ^H-vasopressinbinding, L er konsentrasjonen av liganden og K er dissosiasjons-3 -9

konstanten for H-vasopressin (K = 3,6 x 10 M; 1 SD =

-9

0,4 x 10 M). Dette er den gjennomsnittlige KD~verdi bestemt på 3 preparater fra svinenyremembraner.

Hydropenisk rotteforskrift

For og vann fjernes fra hannrotter cirka 18 timer før prøven. Dyrene holdes 4 stk. pr. metabolisk bur. På 0 timer gis forsøks forbindelsen intraperitonealt til forsøksgruppen og et ekvivalent volum bærestoff gis til begge kontroll-gruppene (fastede og ikke-fastede). Urinvolum og osmolalitet måles hver time i 4 timer. Forsøksverdier registeres som i ml utskilt urin (kumulativ), mEq/rotte elektrolytt utskilt,

.mg/rotte urinstoff utskilt, og osmolalitet i milli-Osmol/kg

H^O. En .toleranseprøve brukes for å bestemme signifikansen. ED300er definert som den dose av forbindelse (ug/kg) nød-vendig for å senke urinosmolalitet til 300 m-Osmol/kg. EDj-qq er definert som den dose forbindelse (ug/kg) som er nødvendig for å senke osmolalitet til 500 m-Osmol/kg. Den hydropeniske apeforskrift er lignende.

Tabell I viser i den beskrevne forskrift anti-vasopressinaktivitet av valgte representative forbindelser hvis okta-peptidstruktur har desGly-dipeptidhale som er karakteristisk for forbindelsene i denne oppfinnelse. Vesentlig antagonistisk aktivitet er uventet fordi des-Gly-oksytocin i agonist-i seriene har den motsatte virkning på blodtrykket sammen-lignet med selve oksytocin (se B. Berde et al., loe..eit.) og forkorting av den lineære halen til oksytocinbg vaso-pressinresultatet er kjent på området og forårsaker "en slående reduksjon av de typiske biologiske aktivitetene til substansene" (se T.Barth et al., loe. eit.).

Forbindelse 5 i tabell I har videre vist seg å være en forbindelse med eksepsjonell antagonistaktivitet på tvers av de forskjellige forsøksforskrifter i svine- og menneskévev in vitro tester samt i hydropeniske rotte- og apeforsøk. Dens anti-ADH-aktivitet, bestemt som den nødvendige dose for å redusere urinosmolalitet til 300M Osm/kg vann hos bevisst hydropenisk ekornapeforsøk, er ED^qq = 8,6 Nmol/kg (i.p.). Sådan for forbindelse 4 i tabell I er 33,1 Nmol/kg. Den 2-D-Phe-analoge av sistnevnte forbindelse er 319,0 Nmol/kg.

De følgende eksempler er bare ment å vise fremstillingen av forbindelser i foreliggende oppfinnelse. Alle temperaturer er angitt i grader Celsius.

I

Eksempel 1

Fastfasesyntese av Pmp( Bzl)- D- Tyr( Br- Z)- Phe- Val- Asn- Cys( Ome-Bzl)- Pro- Arg( Tos)- harpiks.

For fastfasesyntese av det harpiksbårede tittelpeptid ble Boc-Arg(Tos)-harpiks (3mmol/5,4 g harpiks) brukt som utgangsmateriale. De riktige beskyttede aminosyrer ble koblet i rekkefølge på Boc-Arg(Tos)-harpiksen, fremstilt ved omset-ning av Boc-Arg(Tos) som cesiumsalt med Merrifield handels-harpiks (Cl-CI^-harpiks)- som kjent, ved å bruke et manuelt program som beskrevet i de følgende trinn:

1. vasket med metylenklorid (3 ganger, 1 minutt).

2. forvasket med 33 % trifluoreddiksyre i metylenklorid med

1 % indol (1 gang, 1 minutt).

3. avbeskyttelse med 33 % trifluoreddiksyre i metylenklorid med 1 % indol (20 minutter).

4. vasket med metylenklorid (3 ganger, 1 minutt).

5. forvasket med 10 % trietylamin i metylenklorid (1 gang,

1 minutt).

6. nøytralisering med 10 % trietylamin i metylenklorid (10 minutter)..

7. vasket med metylenklorid (3 ganger, 1 minutt).

8. beskyttet aminosyre (10 .mmol) i trietylamin i metylenklorid og 0,5 MN,N'-dicykloheksylkarbodiimid i metylenklorid (20 ml) ble tilsatt.

Reaksjonstiden var opp til 2 timer.

Ved kobling av Ash-resten ble, 1-hydroksybenzotriazol (HBT, 10 mmol) tilsatt med Boc-Asn i tørt dimetylformamid. Tørt

dimetylformamid (DMF) ble også brukt som løsningsmiddel når Pmp(Bzl) ble koblet på peptidharpiksen ved bruk av 4-dimetylaminopyridin (10 mM). Avslutningen av hver koblings-reaksjon ble kontrollert med ninhydrinprøven. 4-metoksy-benzylgruppen ble brukt for å beskytte tiolgruppen i Cys og 1 2-bromkarbobenzoksygruppen ble anvendt for å blokkere den

fenoliske hydroksyl i D-Tyr.

Den resulterende beskyttede Pmp(Bzl)-D-Tyr(Br-Z)-Phe-Val-Asn-Cys(OMe-Bzl)-Pro-Arg(Tos)-harpiks ble vasket godt med metylenklorid og metanol henholdsvis. Etter tørking natten over i vakuum fikk man 8,4 g av den beskyttede tittel-mellomproduktharpiks.

Fremstilling av Pmp- D- Tyr- Phe- Val-Asn- Cys- Pro- Arg- NH^

Pmp (Bzl) -D-Tyr- (p_-bromkarbobenzoksy) -Phe-Val-Asn-Cys (OMe-Bzl)-Pro-Arg (Tos)-harpiks (4 g, ca. 1,5 mmol) ble behandlet ved ammonolyse ved bruk av mettet ammoniakk/metanolløsning (200 ml) i tørt dimetylformamid (50 ml) ved romtemperatur i 48 timer. Etter inndampning til tørrhet ble resten utfelt

med etylacetat/n-heksan og filtrert, hvilket ga det beskyttede oktapeptidamid (1,54 g).

Dette råpeptidet ble oppløst i flytende ammoniakk (250 ml) og behandlet med natrium/flytende ammoniakkløsning, hvilket ga Pmp-D-Tyr-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-Arg-NH^som så ble oksydert ved bruk av 0,01 M kaliumferricyanidløsning i 4 liter vandig løsning ved pH 7-7,5. Etter fullstendig oksydasjonsreaksjon ble pH i den vandige løsningen justert til pH 4,5. ved å til-sette iseddik. Denne løsningen ble ført gjennom en svakt basisk acrylharpiks (Bio-Rex 70) kolonne (11 x 2,5 cm, H+<->form) langsomt. Kolonnen ble eluert med 5 % og 50 % iseddik-løsning. Rått cyklisert Pmp-D-Tyr-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-Arg-NHp ble samlet fra 50 % eddiksyreløsningsfraksjoner (860 mg).

1 1

Rensing av Pmp- D- Tyr- Phe- Val- Asn- Cys- Pro- Arg- NH^

1. Motstrømsfordeling:

Prøve: 860 mg rått n-BuOH/HOAc/^O (4:1:5) 250 overføringer a) fr. 186-204, 436 mg b) fr. 182-185&205-218, 219 mg

■ 2. Fordelingskromatografi: j

Prøve: 250 mg (fra l-a), G-25 fin (2,5 x -55 cm), i

3. Preparat!v HPLC:

Prøve: 40 mg (fra 2-a), Alltech C18, 3000 psig. Flyte forhold: 3,0 ml/min.

Puffer A: 0,1 % TFA

Puffer B: 0,25 % TFA/CH^CN (4:6) 60 % B; isocratisk; 235 nm (2,0 AUFS) Injeksjon: 10 mg/0,5 ml. puffer A

17 mg ren tittelforbindelse.

4. Ionebytterkromatografi:

Prøve.: 365 mg (fra l-a&2-a); CMC; 0,01 M NH4OAc til 0,1 MNH40Ac

Eksempel 2

Fremstilling av. PmI p- D- Tyr- Phe- Val- Asn- Cy( s- Pro- Arg

Pmp (Bzl) -D-Tyr (Br-Z.) -Phe-Val-Asn-Cys (OMe-Bzl) -Pro-Arg (Tos) - harpiks (4,2 g, 1,5 mmol) fra Eksempel 1 i 4,5 ml destillert anisol ble omsatt med vannfritt hydrogenfluorid (40 ml) ved 0°C i 1 time. Etter behandling som beskrevet ovenfor og inndampning i vakuum til tørrhet, ble resten behandlet med vannfritt eter og filtrert fra, hvilket ga 1,33 g rått peptid. Fullstendig fjerning av Bzl-gruppen fra Pmp-resten ble utført ved bruk av natrium i flytende ammoniakkreaks jon som beskrevet i Eksempel 1. Det resulterende ubeskyttede oktapeptid ble cyklisert ved bruk av 0,01 M kaliumferricyanid-løsning ved pH 7-7,5 inntil farge besto i 30 minutter igjen som beskrevet ovenfor under fremstillingen av amidet-Desglycinamidoktapeptid (600 mg) ble oppsamlet etter sur- gjøring av oksydas jonsløsningen med eddiksyre til pH 4 , 5 , og: reaksjonsblandingen fikk løpe gjennom en Bio-Rex 70-kolonne med 1 liter 5 % eddiksyre som eluent.

Rensing av Pmp- D- Tyr- Phe- Val- Asn- Cys- Pro- Arg

1. Motstrømsfordeling:

Prøve: 600 mg fra Bio-Rex 70. n-BuOH/HOAc/H20

(4:1:5); 200 overføringer

2. Preparativ HPLC:

Prøve: 52 mg (fra l-a); Alltech C18 (25 cm 10 mm,

10 mikron);

Puffer A: 0,1 % TFA

Puffer B: 0,2 5 % TFA/CH^CN (4:6)

60 % B, isocratisk; 3000 psig; 3,0 ml/min.

Injeksjon: 10 mg/0,6 ml i puffer A

2 35 nm (2,0 AUFS).

a) 2 4 mg

b) 7,3 mg

Kombinasjon av 2-a og 2-b, renset på HPLC gir 15 mg rent

peptid.

3. Fordelingskromatografi:

Prøve: 117 mg (fra 1-A), G-25 fin (2,5 x 55 cm)

n-BuOH/HOAc/H20 4:1:5

a) fr. 32-36 83 mg rent produkt

Eksempel 3

Fremstilling av Pmp- D- Tyr( Et)- Phe~ Val- Asn- Cys- Pro- Arg- NH2

Tittelforbindelsen ble fremstilt ved fastfasemetoden på benzhydrylaminharpiks (BHA). Således ble 1,0 g BHA-harpiks ; (1,13 mmol NH2/g harpiks) omsatt med 1,5 ekvivalenter Boc-; Arg (Tos), 1,5 ekvivalenter DCC og 3,0 ekvivalenter HBT, jsom ble klargjort i dimetylformamid som 0,1 M i Boc-Arg(Tos). Avblokkering ble utført med 50 % TFA/metylenklorid og nøy-tralisering med 5 % DIEA/metylenklorid. Peptidet ble for-lenget trinnvis ved kopling, ved bruk av fordannet Boc-aminoacyl symmetriske anhydrider i DMF (0,1 M). Boc-Asn, Boc-D-Tyr(Et) og Pmp(MBz) ble i rekkefølge koplet ved bruk av DCC og HBT i DMF. Fullstendig kopling ble styrt med den kvalitative ninhydrinprøven og gjenkopling ble utført som nødvendig. Den fullstendige Pmp(MBz)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(MBz)-Pro-Arg(Tos)-BHA-harpiks ble vasket med metylenklorid og tørket til konstant vekt, 2,34 g.

Peptidet ble avblokkert og spaltet fra harpiksen ved behandling med vannfritt flytende hydrogenfluorid (30 ml) i nærvær av anisol (4 ml) ved 0°C i 1 time. Etter inndampning til tørrhet under vakuum ble harpiksen vasket med etyleter, lufttørket og så ekstrahert med avgasset dimetylformamid

(3 x 20 ml) og 20 % eddiksyre (4 x 20 ml). DMF og syre-ekstrakter ble satt til 4 liter vann (pH 4,5 med eddiksyre). pH ble justert til 7,2 med ammoniumhydroksyd og løsningen ble filtrert med 0,01 M kaliumferricyanat under argon med røring til■vedvarende gul farge (85 ml). pH ble justert til 4,8 med iseddik. Blandingen ble filtrert og filtratet ført over en Bio-Rex 70-kolonne (H ). Etter vasking av kolonnen med vann (200 ml) ble det rå peptid eluert med 300 ml pyridin/eddiksyre/vann (30:4:66 v/v). Eluenten ble fordampet under vakuum ved 30°C. Resten ble oppløst i 100 ml 0,2 N eddiksyre, deretter frysetørket, hvilket ga 507 mg av det rå titteloktapeptidet.

Rensing av Pmp- D- Tyr( Et)- Phe- Val- Asn- Cys- Pro- Arg- NH^

1. Motstrømsfordeling:

Prøve: 607 mg rå, n-BuOH:HOAc:H20, 4:1:5, 240 over- føringer 2. Gelfiltrering ' Prøve: 12 3 mg av prøve b), G-15 (2,5 x 55 cm) ved bruk av 0,2 N HOAc,

2 5 ml/t

Eksempel 4

Fremstilling av Pmp- D- Leu- Phe- Val- Asn- Cys- Pro- Arg- NHC^H-,

1 2 4

En blanding av 0,1 mmol (Pmp -D-Leu -Val -desGlyNH^)AVP, fremstilt som beskrevet ovenfor ved bruk av Boc-D-Leu i 2-stilling, og 0,1 mmol n-propylamin i 20 ml DMF ble omsatt med 23 mg (0,11 mmol) DCC og 14 mg (0,11 mmol) HBT ved romtemperatur i 2 timer. De flyktige bestanddeler ble fordampet og ga et oljeaktig restprodukt. Produktet ble renset som beskrevet ovenfor ved bruk av: (1) gelfiltrering over G-10-Sephadex eluert med 0,2 N eddiksyre; (2) høytrykksvæske-kromatografi ved bruk av 0,05 % TFA i 39 % acetonitril i vann; og igjen, (3) gelfiltrering som ga 20 mg av det rene titteloktapeptid.

Aminosyreanalyse: Asp 0,88, Pro 0,93, Val 1,00, Leu 1,09,

Phe 0,88, Arg 1,0'7. HPLC = 95 % hovedtopp ved 11,33 med 40 %

vandig acetonitril med 0,05 M KHtPO, som puffer. K, . ,

J _,- z 4Lbind

12,1 % inhibering ved 10 M.

Vseom d bi rEuk kseamv pe(Pl mp 2 1 o-Dve-nTyforr (Etog ) 2 b-Venal zy4-ldamesin GlyfNåHr Z ,m)-aAn VP PmI pf-reDm-;sTytril(Ett)-

Phe-Val-Asn-Cys-Pro-ArgNHBzl. Andre N-alkylerte derivater fremstilles på lignende måte.

- Eksempel 5

Fastfasepeptidsyntese av Pmp( 4- MeBzl)- D- Tyr( Et)- Phe- Abu- Cys-( 4- MeBzl)- Pro- Arg( Tos)- BHA- harpiks.

For fastfasesyntese av det harpiksbårede peptid i tittelen, ble Boc-Arg(Tos)BHA-harpiks (1,19 mmol/g harpiks) brukt som ' utgangsmateriale. Det ble fremstilt ved å omsette Boc-Arg-(Tos), 3 mmol med benzhydrylaminharpiksen, 1,0 mmol, i di-metylf ormamid i to timer. Benzhydrylaminharpiksen som hydro-kloridsalt ble dekket med metylenklorid natten over. Den ble deretter vasket med metylenklorid (4x1 min), nøytralisert med 7 % diisopropyletylamin i metylenklorid (2 x 2 min), så 6x1 min med metylenklorid alene, og til slutt 2x1 min med fortørket dimetylformamid. Påsetting av Boc-Arg(Tos) på harpiksen ble utført to ganger på rysteren ved bruk av 1-hydroksybenzotriazol (HBT, 6 mmol) og dicykloheksylkarbodiimid (DCC, 3 mmol). En kvantitativ ninhydrinprøve og aminosyreanalyse ble utført rutinemessig etter påsetting for å bestemme prosentdel påsatt harpiksen. Påsetting i denne spesielle sats var 62,66 %, dvs. 0,74 mmol/g harpiks forelå. Den ettérfølgende aminosyre, Boc-Pro, ble koplet på rysteren ved bruk av den følgende forskrift.

1) Vasket med metylenklorid (6 ganger, 1 minutt).

2) Forvasket med 50 % TFA i metylenklorid (1 gang, 1 minutt). 3) Avbeskyttet med 50 % TFA i metylenklorid (20 minutter).

4) Vasket med metylenklorid (6 ganger, 1 minutt).

5) Forvasket med 7 % DIEA i metylenklorid (1 gang, 1 minutt). 6) Nøytralisert med 7 % DIEA i metylenklorid (8 minutter).

7) Vasket med metylenklorid (6 ganger, 1 minutt).

8) Vasket med dimetylformamid (2 ganger, 1 minutt).

9) Tilsatt beskyttet aminosyre (3 mmol) og HBT, 6 mmol, i DMF, etterfulgt av tilsetning av DCC i metylenklorid,

3 mmol, og kopling i 2 timer.

10) Vasket med dimetylformamid. (2 ganger, 1 minutt).

11) Vasket med metylenklorid (4 ganger, 1 minutt).

12) Vasket med etanol/metylenklorid 1:1 (2 ganger, 1 min.).

13) Vasket med metylenklorid (4 ganger, 1 minutt).

De etterfølgende aminosyrer ble koplet i rekkefølge ved bruk av Beckmans peptidsyntetisator 990-B. Det brukte program for hver kopling bortsett fra BocAsn og Pmp(4-MeBzl) var som følger.

I

1) Vasket med metylenklorid (3 ganger, 1 min). 2) Forvasket med 50 % TFA i metylenklorid (1 gang, 1 min).

3) Avbeskyttet med 50 % TFA i metylenklorid (30 min).

4) Vasket med metylenklorid (3 ganger, 1 min).

5) . Forvasket med 7 % DIEA i metylenklorid (1 gang, 1 min). 6) Nøytralisert med 7 % DIEA i metylenklorid (1 gang, 1 min).

7) Vasket med metylenklorid (3 ganger, 1 min).

8) Beskyttet aminosyrer (3 mmol) i metylenklorid, etterfulgt av tilsetning av DCC, 3 mmol, 10 ml 0,3 M i metylenklorid og kopling i to timer.

9) Vasket med metylenklorid (3 ganger, 1 min).

10) Vasket med etanol/metylenklorid, 1:1, (3 ganger, 1 min).

11) Vasket med metylenklorid (3 ganger, 1 min).

Ved kopling av Asn-resten ble 1-hydroksybenzotriazol (HBT,

6 mmol) brukt, 10 ml 0,6 M dimetylformamid. Tørt dimetylformamid ble også brukt som løsningsmiddel når Pmp(4-MeBzl) ble koplet på peptidharpiksen ved bruk av 4-dimetylaminopyridin (3 mmol).Avslutningen av hver koplingsreaksjon ble kontrollert med ninhydrinprøven. 4-metylbenzy1 (4-MeBzl)-gruppen ble brukt til å beskytte tiolgruppene i Cys og pentametylenmerkaptopropionsyre (Pmp) rester.

Fremstilling av Pmp- D- Tyr( Et)- Phe- Abu- Asn- Cys- Pro- ArgNH^

Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Abu-Asn-Cys-(4-MeBzl)-Pro-Arg-(Tos)BHA-harpiks, 1,25 g, (0,37 mmol) i 2 ml anisol, ble omsatt med vannfritt hydrogenfluorid (20 ml ved 0°C i 50 min). Etter fordampning av HF i vakuum, ble resten vasket med vannfri eter, 4 x 20 ml, og det råe peptid ble ekstrahert med dimetylformamid (50 ml) og 33 % eddiksyre (50 ml)

i 2 liter avgasset vann forut justert til pH 4,5. Det vandige fortynnede disulfhydryloktapeptid ble cyklisert ved bruk av 0,01 M kaliumferricyanidløsning ved pH 7,2 inntil gul farge besto i 30 minutter (50 ml). pH ble justert til 4,5 ved bruk av iseddik og løsningen ble ført gjennom en svakt sur acrylharpiks (Bio-Rex-70)-kolonne (2,5 x 12, H - form), langsomt. Kolonnen ble eluert med pyridin-acetat-puffer (30:4:66; pyridin/iseddik/vann). Pyridinacetatløs-

ningen ble fjernet ved destillasjon i vakuum. Resten ble frysetørket fra 10 % eddiksyre og ga 300 mg (76 %■) rått tittelpeptid.

Rensing av Pmp- D- Tyr ( Et) - Phe- Abu- Asn- Cys- Pro- ArgNH^

1. Motstrømsfordeling: Prøve: 300 mg, n-BuOH/HOAc/H20, 4:1:5, 240 overføringer.

a) fr. 176-186, 99,6 mg rent peptid

b) fr. 170-175 og 187-210, 117,24 mg

Utbytte av renset materiale, 216,84 mg (55 %)

3. Kromatografidata:

Eksempel 6

Fastfase peptidsyntese av Pmp-( 4- MeBzl)- D- Tyr( Et)- Phe- Ala-Asn- Cys- 4- MeBzl)- Pro- Arg( Tos)- BHA- harpiks.

Tetrapeptidet, Boc-Asn-Cys(4-MeBzl)-Pro-Arg(Tos)-BHA, 0,72 g

(0,36 mmol), på harpiksen ble syntetisert på Beckman 990-B peptidsyntetisator ut fra Boc-Arg(Tos) benzhydrylaminharpiks (0,72 mmol/g) ved bruk av en lignende forskrift som i Eksempel 5. De påfølgende aminosyrer ble koplet i rekkefølge på rysteren ved bruk av HBT og DCC i to timer på lignende måte. Etter kopling av den siste rest, dvs. Pmp(4-MeBzl),

ble den peptidholdige harpiks vasket som vanlig, tørket og ga 0,88 g av mellomproduktet i tittelen.

Fremstilling av Pmp- D- Tyr( Et)- Phe- Ala- Asn- Cys- Pro- ArgNH^

Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Ala-Asn-Cys(4-MeBzl)-Pro-Arg(Tos)-BHA-harpiks, i 2 ml anisol ble omsatt med vannfritt HF, 20

ml ved 0°C i 50 minutter. Opparbeidingen ble utført som vanlig og opptaket av K^Fe (CN) g var 45 ml som ga 2 30 mg (60,8 %) av det rå tittelpeptid.

Rensing av Pmp- D- Tyr( Et)- Phe- Ala- Asn- Cys- Pro- ArgNH^

1. Motstrømsfordeling:

Prøve: 230 mg, n-BuOH/HOAc/H20, 4:1:5, 240 overføringer

a) fr. 160-178, 105,2 rent produkt

b) fr. 179-190 og 150-159, 49,5 mg

Utbytte av renset materiale, 154,7 mg (41 %).

3. Kromatografidata:

Eksempel 7

Fastfase peptidsytese av Pmp ( 4- MeBzl)- D- Tyr ( Et)- Phe ( 4 '- Et) - Val- Asn- Cys-( 4- MeBzl)- Pro- Arg( Tos)- BHA- harpiks.

Harpiksen med tittelpeptidet ble fremstilt ut fra Boc-Arg-/Tos)-BHA-harpiks (0,4 mmol/g) på en ryster ved bruk av en forskrift som anvendt forut, dvs. avbeskyttelse-kopling ved bruk av HBT og DCC i to timer, opp til Boc-Val-Asn-Cys-(4-MeBzl)-Pro-Arg(Tos)-BHA-harpiks. De neste to aminosyre-rester ble koplet ved bruk av Beckman peptidsyntetisatoren 990-B.Pmp(4-MeBzl) ble koplet manuelt ved bruk av DMAP-DCC over natten. :Det harpiksholdige peptid ble vasket og tørket som vanlig og ga 2,00 g av mellomproduktet i tittelen.

Fremstilling av Pmp- D- Tyr( Et)- Phe( 4- Et)- Val- Asn- Cys- Pro- ArgNH^

Pmp-(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe(4-Et)-Val-Asn-Cys-4-MeBzl)-Pro-i Arg(Tos)-BHA-harpiks, i 3 ml anisol, ble omsatt med 30 ml j ! vannfritt hydrogenfluorid ved 0 C i én time. Opparbeidingen!

I 'ble utført som beskrevet ovenfor, idet 38 ml K0Fe(CN), ble I tatt opp. Ca. 50 mg av råpeptidet erholdtes fra Bio-Rex-kolonnen og 139 mg ble felt ut fra løsningen, totalutbytte 189 mg (42,7 %) i tittelpeptidet.

Rensing:

1. Fordelingskromatografi på kolonne, "Sephadex", G-25: .

Prøve: 50 mg, n-BuOH/HOAc/H20, 4:1:5,

a) fr. A, 23,86 mg

b) fr. B, 18,5 mg

Preparativ HPLC

Prøve: 43 mg (fra 1, fr. A + fr. B), Altex ODS, 10 mm x 25 cm, 5 u, flyteforhold 4 ml/min., vann/acetonitril/TFA (50:50:0,25), isocratisk, 229 nm (2,0 AUFS), injeksjon 2,0 mg/300 ul og 4,0 mg/420 ml, hvilket ga 30,0 mg rent peptid.

2. Fysikalske data:

3.. Kromatograf idata:

Eksempel 8

Syntese av Boc- Asn- Cys( 4- MeBzl)- Pro- Arg( Tos) MBHA- harpiks.

1 mmol av Boc-Asn-Cys(4-MeBzl)-Pro-Arg(Tos)-BHA-harpiks ble

fremstilt ved å bruke 1 mmol Boc-Arg(Tos)-4-metylbenzhydry1-amin (MBHA)-harpiks som utgangsmateriale ved i rekkefølge å kople med de tilsvarende t-Boc-beskyttede aminosyrer i en Beckman 990-B peptidsyntetisator, 990-B.

1,83 g av den beskyttede peptidharpiks erholdtes og ble oppdelt i to like deler på 0,915 g hver.

Syntese av Pmp- D- Tyr( Et)- Phe- Gly- Asn- Cys- Pro- ArgNH^

En del av den beskyttede peptidharpiks fra ovenfor ble videre i rekkefølge koplet med 1,5 mmol av de tilsvarende Boc-aminosyrer og 3_(S-MeBzl)-Pmp-OH, hvilket ga 1,16 g

av den endelige beskyttede peptidharpiks. Pmp(S-MeBzl)-D~Tyr (Et) -Phe-Gly-Asn-Cys (-4-MeBzl) -Pro-Arg (Tos) -MBHA-harpiks ble oppnådd og tørket i vakuum. Denne beskyttede harpiks ble behandlet med 1,5 ml anisol og 25 ml vannfritt hydrogenfluorid ved 0°C i 1 time. Det avbeskyttede peptid ble behandlet med 0,01 mol kaliumferricyanidløsning med pH 7,2

i 2 'liter vann.. 5 3 ml oksydasjonsmiddel ble brukt.

Den resulterende løsning ble ført gjennom en C-^g-flashkolonne. Kolonnen ble eluert med 50 % acetonitril med 0,25 % trifluoreddiksyre med 20 ml pr. fraksjon. 325 mg råprodukt ble isolert fra fraksjonene. Videre rensing av produktet ved CCD (B/A/W, 4:1:5) ga 188 mg 99 % rent tittelprodukt.

Aminosyreanalyse:

Peptidinnhold 82 %

FAB/MS = m/z (M+H) + 10 37

Eksempel 9

i r 1 Syntese av Pmp- D- Tyr( Et)- Phe- Chg- Asn- Cys- Pro- ArgNH^

En del av den beskyttede peptidharpiks fra Eksempel' 8 ble videre i rekkefølge koplet med 1,5 mmol av de tilsvarende Boc-aminosyrer og (3-(S-4-MeBzl)-Pmp-OH, hvilket ga 1,06 g av den ferdige beskyttede peptidharpiks, Pmp(S-4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Chg-Asn-Cys(S-4-MeBzl)-Pro-Arg(Tos)MBHA-harpiks, etter tørking i vakuum.

Denne beskyttede peptidharpiks ble behandlet med 1,5 ml anisol og 25 ml vannfritt hydrogenfluorid.

Etter den vanlige oksydasjon med kaliumferricyanid og iso-lering over en C^g-kolonne, fikk man 165 mg rått tittelprodukt. Ytterligere rensing med CCD G-I 5- og P-2 gelf iltrering som beskrevet ovenfor ga 55 mg HPLC rent tittelprodukt.

Peptidinnhold: 88 %

FAB/MS: m/z 1119 (M+H)<+>

Eksempel 10

Fremstilling av Pmp- D- Tyr( Et)- Phe- Val- Asn- Cys( OH) og bruk derav for fremstilling av forbindelsen i Eksempel 3.

I 4,87 g (15 mmol) BocCys(4MeBzl) ble oppløst i 30 ml etanol ' og 10 ml vann ble tilsatt. pH ble så justert til 7,1 med en vandig løsning av cesiumbikarbonat.

Blandingen ble konsentrert og resten inndampet tre ganger fra 5 0 ml toluen. Denne resten ble så plassert under høy-våkuum ved omgivelsestemperatur natten over.

Saltet ble oppløst i 35 ml dimetylformamid og 5 g klormetyl-fenylharpiks (handelsvare). Blandingen ble rørt ved 53°C under argon natten over.'

Blandingen ble filtrert og harpiksen vasket med dimetylformamid (5 x 60 ml), DMF/vann, 9:1, (5 x 60 ml), DMF (5 x 60 ml) og etanol (6 x 60 ml). Den ble så tørket natten 4 over under høyvakuum ved romtemperatur over ukeslutt.

Peptidkjeden ble oppbygget i en Beckman syntetisator som beskrevet ovenfor ved bruk av Boc-derivatene av Asn, Val, Phe, D-Tyr(Et) og S-(4-MeBzl) Pmp-derivat. Harpiksen ble fjernet og plassert i en manuell ryster.

0,86 g av peptidharpiksen ble behandlet med 1,5 ml anisol og rørt i -60 minutter ved 0°C i 15 ml hydrogenfluorid. Hydrogenfluoridet ble så fjernet under fordampningstrykk ved 0°C.

Resten ble så vasket med 3 x 25 ml eter (kastet) og peptidet eluert med dimetylformamid og 30 % iseddik (4 x 10 ml). Denne løsningen ble satt til 2 liter gassfritt vann og pH justert til 7,0 med ammoniumhydroksyd. 0,01 M kaliumferri-cyanidløsning ble langsomt tilsatt (35 ral).

pH ble så justert til 4,5 med eddiksyre og blandingen rørt 30 minutter med 25 g (WET) svakt basisk- ionebytterharpiks

(AG-3 x 4 1R-4S). Suspensjonen ble filtrert og harpiksen vasket med 2 x 400 ml 30 % iseddik.

Filtratet ble så ført gjennom en C-^g-f lashkolonne (7 x 16 mm). Kolonnen ble deretter vasket med vann (3 x 400 ml) og peptidet eluert med acetonitril/vann/TFA, 50:50:025. Frak sjonene 30 -'36.ble slått sammen, konsentrert og frysetørket hvilket ga 25 mg av det fri Cys(OH)cykliske tittelmellom-produkt.

FAB massespektrum i glycerol: 827 (M+H)<+>, 825 (M-H)~.

Cys-syren (20 ml) omsettes men en ekvivalent Pro-Arg(NH2)-HC1 (fremstilt fra dihydroklorid [handelsvare] ved behandling med en ekvivalent trietylamin) i nærvær av DCC og HBT

i dimetylformamid, hvilket ga forbindelsen fra Eksempel 3. På lignende måte knyttes Pro(OMe) til Cys-syren, hydro-lyseres med mildt natriumhydroksyd og gir Pro-syren som så omsettes med Arg(HCl)(OMe) og gir utgangssyren av forbindelsen fra Eksempel 3 etter mild hydrolyse av esteren. Denne forbindelsen isoleres som natriumsaltet om ønsket. Se Eksempel 12 nedenunder. Alternativt brukes Pro-Arg (NH,,)

i kondensasjonen direkte.

En blanding av 4,5 mg Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-OH fremstilt som ovenfor og 1 ml metanol ble behandlet med diazometan i eterløsning og renset ved preparativ HPLC

(50 % CH3CN/50 % H2O/0,l % TFA) som ga 4,3 mg av metylesteren (94 %), FABMS m/z 841 (M+H)<+>, homogen i HPLC og TLC.

Eksempel 11

Fremstilling av Pmp- D- Tyr( Et)- Phe- Vaa- Asn- Cys- Pro- Arg( NH2) ved terminal kondensasjon.

BocPro-Merrifieldharpiks ble laget ved kopling av BocPro til Merrifieldharpiks ved bruk av cesiumsaltmetoden som ga Boc-Pro-OCH-j-CgH^-harpiks som ble brukt som utgangsmateriale for syntesen. Syntesen ble utført på Beckman 990-B-peptidsyntetisatoren ved bruk av den følgende forskrift. Tre. ekvivalenter av aminosyrene ble oppløst i sine tilsvarende løsningsmidler [Boc-derivatene av 4MeBzl-Cys, Val, Phe i metylenklorid, Asn i dimetylformamid, X såsom D-Tyr(Et) eller Br-Bz-D-Tyr i 1:1 metylenklorid/dimetylformamid og 4MeBzl-Pmp i metylenklorid] og ble koplet ved bruk av en ekvimolar mengde dicykloheksylkarbodiimid (DCG) og 1-hydrok-sybenzotriazol (HOBT) , bortsett fra koplingen av 4-MeBzl Pmp hvor 1,0 ekvivalent dimetylaminopyridin ble brukt som katalysator. Koplingsgraden ble bestemt ved kvalitative ninhydrinanalyser og koplingene ble gjentatt om nødvendig. Boc-gruppene ble fjernet ved bruk av 1:1 trifluoreddiksyre/ metylenklorid og etter vask ble aminet frigjort ved bruk av 5 % diisopropylety1 amin/metylenklorid. Peptidrekkefølgen ble kontrollert ved bruk av fastfasesekventering før koplingen av 4MeBzi-Pmp og homogeniteten fastslått. Etter sluttkoplingen ble harpiksen tørket og ga 2,24 g av peptidharpiksen i til-feilet D-Tyr(Et) 2 -Pro 7-forbindelsen.

1,1 g (0,5 mmol) av D-Tyr(Et) 2-peptidharpiksen med 3 ml anisol ble rørt i 60 minutter ved 0°C (isbad) i 25 ml hydrogenfluorid (HF). HF ble så fjernet under redusert trykk ved 0°C. Resten ble vasket med etyleter (4 x 20 ml, kastet) og peptidet eluert med dimetylformamid 3 x 10 ml, 20 % eddiksyre i 3 x 10 ml og 0,3N ammoniumhydroksyd 3 x 10 ml..

Filtratet ble. satt til 2 liter gassfritt vann og pH justert .til 7,1 med kons. ammoniumhydroksyd. En 0,01 M løsning kaliumferricyanid ble så dråpevis satt til under røring, inntil en svak gulfarge besto (41 ml). Denne løsning ble justert til pH = '4,7 med eddiksyre og lagret kaldt natten over.

Løsningen ble justert til pH 7 med ammoniakk og rørt i 15 minutter med 30 g AG-3 x 4 Bio Rad ionebytterharpiks (våt, Cl-form). Denne løsning ble så langsomt filtrert gjennom ytterligere 30 g harpiks. Harpiksen ble så vasket méd 4 x 200 ml 20 % eddiksyre og filtratet fikk stå kaldt natten over.

Filtratet ble så ført gjennom en flashkolonne (5 cm x 10 cm) med en kiselgelpakning overtrukket med C-18 silan. Kolonnen ble så vasket med 350 ml vann og peptidet eluert med 500 ml 1:1 acetonitril/vann (0,25 % trifluoreddiksyre) i 20 ml<1>s fraksjoner. Fraksjonene 11-17 ble slått sammen og konsentrert. Resten ble oppløst i kons. eddiksyre, fortynnet med vann og fryse-tørket, hvilket ga 189 mg D-Tyr(Et) 2, prolinpeptid, som ble brukt uten ytterligere rensing for syntesen av de halemodi-fiserte peptider.

Identifikasjon av:

Aminosyreanalyse: peptidinnhold 55 %

Asp, 1,00; Pro, 1,23; Cys, 0,35; Val, 1,04; Tyr(Et),

1,43; Phe,1,51.

HPLC: tilfredsstillende.

Aminosyreanalyse: peptidinnhold 82 %

Asp, 0,97; Pro, 1,10; Cys, 0,39; Val, 1,05; Tyr, 0,99;

Phe, 0,99.

HPLC: tilfredsstillende, 30 % CH3CN/70 % 0,05 m KH2PC>4,

2 ml/min, 5 uC-18, k 1 = 6,14 .

En blanding av 10 mg D-Tyr(Et)-Pro(OH)<7>fremstilt som ovenfor og 1 ml metanol ble behandlet med eterløsning av diazometan og så renset ved preparativ HPLC (50 % CH^CN/50 % H^O/0,1 % TFA), som ga 7,5 mg av metylesteren (74 %), FABMS m/z 938 . (M+H) , homogen i HPLC og TLC.

Til en løsning av D-Tyr(Et) 2-prolinheptapeptid, fremstilt som beskrevet ovenfor, satte man (29,7 mg, 0,0331 mmol),

og Arg(NH2) (0,0996 mmol) i dimetylformamid (400 ul), dicykloheksylkarbodiimid (10,3 mg, 0,05 mmol) og dimetylaminopyridin (0,05 mmol) og rørte reaksjonsblandingen ved 0-20°C i. 4 timer. Dimetylformamidet ble så fjernet under vakuum. Resten ble behandlet som ovenfor i Eksempel 3 i 45 % ut-2 4 i I bytte og ga det ønskede D-Tyr(Et) -Val -amid. ■ !

Eksempel 12'

Syntese og karakterisering av Pmp- D- Tyr( Et)- Phe- Val- Asn- Cys-Pro- D- Arg( NH2).

En lineære peptidylharpiks, Pmp(S-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(S-MeBzl)-Pro-D-Arg(Tos)-BHA-harpiks ble fremstilt ved fastfasemetoden ved bruk av standardforskriften som er beskrevet ovenfor. Således ble 1,5 g benzhydrylaminharpiks tilsvarende 1,0 mmol amin koplet i rekkefølge med Boc-aminosyrederivatene i tre gangers overskudd ved bruk av DCC/HOBt i metylenklorid/DMF, 1:1. Pmp(S-MeBzl) ble koplet med DCC/DMAP. At koplingen var fullstendig ble kontrollert med Kaiserprøven eller en kvantitativ ninhydrinprøve. Re-kopling ble utført inntil prøven var negativ.

Den beskyttede peptidylharpiks ble vasket med påfølgende porsjoner av metylenklorid, metanol, etylacetat og metylenklorid, og deretter lufttørket. Peptidet ble spaltet fra harpiksen med 15 ml flytende hydrogenfluorid i nærvær av 1,0 ml anisol ved 0°C i én time. Etter fordampning av hydrogenfluoridet og tørking under høyvakuum ble harpiksen vasket med 3 x 20 ml eter, og deretter ekstrahert med 2 x 50 ml 50 % eddiksyre, 50 ml 10 % eddiksyre og 50 ml vann. De sammenslåtte ekstrakter ble fortynnet til 4 liter med vann, og pH ble justert til 7,2 med 50 % natriumhydroksyd-løsning. Løsningen ble titrert med 0,01 M K^Fe(CN)g-løsning inntil en gulfarge var bestandig (30 ml). pH ble justert til 4,5 med iseddiksyre og man filtrerte. Filtratet ble satt på en kationbytter (BioRex-70) kolonne (H+-form), vasket med vann og så eluert med 100 ml pyridinacetatpuffer (30 ml pyridin, 4 ml eddiksyre, 66 ml vann). Eluanten ble fordampet til tørrhet. Resten ble oppløst i en liten mengde 10 % eddiksyre og fortynnet med vann til 1 % eddiksyre, så frysetørket, hvilket ga 650 mg av det rå tittelpeptid.

Det rå peptid ble renset ved motstrømsfordeling i n-butanol/ eddiksyre/vann (B/A/W) (4:1:5) som ga 33 mg delvis renset peptid. Dette ble ytterligere renset ved gelfiltrering på en "Séphadex" G-15 kolonne i 1 % eddiksyre■ , som ga 24,5 mg rent peptid. Aminosyreanalyse (hydrolyse i HCl/TFA 2:1, 0,005 % fenol i 1 time) Asp 1,00, Pro 0,72, Cys 0,62, Val 0,99, Tyr 1,04, Phe 1,04, Arg 0,95, 71% peptid. HPLC: (40 % acetonitril/60 % vann/0,1 % TFA), en topp, k' = 5,2; (45 % acetonitril/55 % vann/0,1 % TFA) k' = 3,6; (gradient 20 % acetonitril, 5'; 20-50 % acetonitril, 20'; 50 % acetonitril, 5') k' = 8,7, 97 % rent. TLC: rf 0,32 (B/A/W 1:1:1); 0<,>12 (B/A/W 4:1:1); 0,50 (n-butanol/pyridin/eddiksyre/vann), 15:10:3:12).

Den ekstraherte peptidylharpiks inneholdt fortsatt peptid ved aminosyreanalyse, så den ble ekstrahert med 3 x 50 ml DMF. DMF ble fordampet til tørrhet og resten oppløst i 10 % HOAc, fortynnet til 1 % eddiksyre og frysetørket, hvilket ga ytterligere 260 mg peptid. FAB massespektroskopi av dette materialet ga et Mz 1079 som tilsvarer M+H for det ønskede cykliske peptid.

Eksempel 13

Ved å bruke en støkiometrisk mengde av Boc-D-Phe i stedet for Boc-D-Tyr(Br-Z) som 2-enhet i peptidsyntesen i Eksempel 1 får man Pmp-D-Phe-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-Arg-NH2.

Ved å bruke Boc-D-Val i samme stilling og oksydasjons-spaltningsreaksjoner fra Eksempel 2 får man Pmp-D-Val-Phe-Vål-Asn-Cys-Pro-Arg.

Ved å bruke Boc-D-Leu i Eksempel 1 får man Pmp-D-Leu-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-Arg-NH2.

Ved å bruke Ø-merkapto-3,Ø-cyklotetrametylenpropionsyre (Tmp) i stedet for Pmp i Eksempel 5 får man Tmp-D-Tyr(Et)-Phe-Abu-Cys-Pro-Arg-1(NH_ ) . 3-merkapto-(3 , (3-cykloheksametylenpropion-syre gir Hmp derivatet.

Ved å bruke i Eksempel 1 Boc-D-Nle som 2-enhet og D-Arg(Tos)! som 8-enhet får man Pmp-D-Nle-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-D-ARg-NH2 J

Ved å bruke Boc-D-Cha i Eksempel 2 som 2-enhet får man Prnp-D-^Cha-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-Arg.

Ved å bruke Boc-a-aminofenylbutyrsyre (Pba) som 2-enhe.t i Eksempel 1, får man Pmp-D-Pba-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-Arg-NH2.

Ved å bruke Boc-Lys(ClZ) i Eksempel 3 i stedet for beskyttet Arg, får man Pmp-D-Tyr (Et) -Phe-iVal-ASn-Cys-Pro-Lys-NH2 .

Andre representative forbindelser som fremstilles på lignende måte er:

Eksempel 14

Parenterale doseringsenhetsblandinger:

Et preparat som inneholder 0,5 mg cyklisk oktapeptid fra Eksemplene 1 eller 3 som et sterilt tørt pulver for parenteral injeksjon fremstilles som følger: 0,5 mg peptidamid oppløses i 1 ml vandig løsning av 20 mg mannitol. Løsningen filtreres under sterile betingelser i en 2 ml<1>s ampulle og frysetørkes. Pulveret rekonstitueres før enten intramuskulær eller intravenøs injeksjon til en pasient som lider av edem mistenkt for anti-ADH-virkningsmekanisme. Injeksjonen gjentas om nødvendig fra 1-5 ganger daglig, eller i kontinuerlig i.v. medikamentinjeksjon. Andre oktapeptider i foreliggende oppfinnelse formuleres og brukes på lignende måte.

Nasal doseringsenhetsblandinger:

30 mg finmalt oktapeptid ifølge foreliggende oppfinnelse1' såsom produktet fra Eksempel 2 oppslemmes i en blanding av 75 mg-benzylalkohol og 1,395 g av et suspensjonsmiddel som er en handelsblanding av semisyntetiske glycerider av høyere fettsyrer. Suspensjonen plasseres i en 10 ml aero-solbeholder som lukkes med en måleventil og fylles med aerosoldrivmidler. Inneholdet omfatter 100 enhetsdoser som gis intranasalt til en pasient med e.dem fra 1-6 ganger om dagen.

Claims (14)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en forbindelse med formel (I).

hvor: P er Phe eller Phe (4 '-Alk).; X er D-Phe,.D-Val, D-Leu, D-Ile, D-Nva, D-Pba, D-alle, D-Nle, D-Cha, D-Abu, D-Met, D-Chg, D-Tyr, L-Tyr, D-Tyr(et) eller L-Tyr(alk); Y er NH2, NHAlk, NHBzl eller OH; W er D-Pro, L-Pro, dehydro-Pro eller kan være OH når Y og Z ikke er til stede; A er Val, Ile, Abu, Ala,Gly, Lys, Cha, Nie, Phe, Leu, Chg eller Nva; Z er D-Arg, L-Arg, D-Lys, L-Lys eller kan være en enkel- binding når Y er OH; n er 0, 1 eller 2, eller et farmasøytisk akseptabelt for- stadium eller salt derav,karakterisertved at man cykliserer en eventuelt beskyttet forbindelse med formel (II):

hvor: X, P, A, W,' Z og Y er som ovenfor definert; 12 Q og Q er hver hydrogen eller en utskiftbar gruppe, og Cap er 3, (3-cykloalkylenpropionsyre med S-Q^" i 3-stilling og med 5-7 enheter i cykloalkylenkjeden, og om nødvendig, deretter i hvilken som. helst rekkefølge: (a) fjerner enhver beskyttelsesgruppe, (b) omsetter eventuelle Cys (OH)^- eller Pro(OH)-forbindelser med et dipeptid, W-Z-Y, eller en aminosyre, Z-Y, henholdsvis, enten i syrebeskyttet eller amidform, eller (c) danner et farmasøytisk akseptabelt salt eller et for-stadium.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av forbind- 12 eiser med formel I hvori Q og Q begge er hydrogen,karakterisert vedat man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av forbind- 1 2 eiser med formel I hvor Q og Q begge er acetamidomety1, karakterisert vedat man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

4. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-3,karakterisert vedat man foretar oksydativ cyklisering.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisertved at cykliseringen utføres i nærvær av jod.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisertved at cykliseringen utføres i nærvær av et ferricyanid.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at en Cys(OH)^-forbindelse med formel I omsettes med (NH2)-W-Z-Y i nærvær av et karbodiimid, eventuelt etterfulgt av fjerning av enhver beskyttelsesgruppe.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at en Pro(OH)<7->forbindelse med formel I omsettes med (NH)2-Z-Y i nærvær av et karbodiimid, eventuelt etterfulgt av fjerning av enhver beskyttelsesgruppe.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisertved at Pro(OH)<7>omsettes med Arg(NH2) eller et salt derav'. !

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av forbindelser hvor n er 1, X er D-Tyr(Et), P er Phe, A er Val, W er Pro, Z er Arg og Y er NH2rkarakterisertved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 4 ved fremstilling av forbindelser med formel I hvor n er 1, X er D-Tyr(Et), P er Phe eller Phe(4'-Et), A er Val eller Abu, W er L-Pro eller D-Pro, Z' er Arg og Y er NH2 ,'karakterisertved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer .

12. Fremgangsmåte ved fremstilling av en forbindelse med formelen:

hvor: P er Phe eller Phe(4'-Alk); X er D-Phe, D-Val, D-Leu, D-Ile, D-Nva, D-Pba, D-alle, D-Nle, D-Cha, D-Abu, D-Met, D-Chg, D eller L-Tyr, eller D eller L-Tyr (alk) Y er NH2, NHAlk, NHBzl eller OH; W er D-Pro, L-Pro, dehydro-Pro eller, når Y og Z ikke er til stede, OH; , A er Val, Ile, Abu, Ala, Gly, Lys, Cha, Nie, Phe, Leu, Chg eller Nva; Z er D-Arg, L-Arg, D-Lys, L-Lys eller, når Y er OH, en enkel- binding; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav,karakterisert vedat man avspalter beskyttelsesgrupper i én forbindelse med formel II.

13. Fremgangsmåte, ifølge krav 12,karakterisertved at peptidet med formel II også adskilles.fra en bære-harpiks.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 12 eller 13,karakterisert vedat det som spaltningsmiddel for beskyttelsesgrupper anvendes hydrogenfluorid.