PT78094B - Process for preparing octapeptide vasopressin antagonists - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO DO INVENTO

Esta invenção refere-se a um processo de preparação de

novos octapêptidos cíclicos que são vasopressina-antagonistas.

Os compostos preparados usando esta invenção são 9-desGly-vasopressina (VSP) antagonistas ou 9-desGly-l-Pmp-vasopressinas.

Mais especificamente, as estruturas destes octapeptidos tem um ácido fi -mercapto- fi , fi -cicloalquilenopropiónico e cinco unidades de aminoácido ciclizadas num anel de 6 unidades por meio de um enxôfre derivado de uma unidade de cisteína e um enxôfre, da unidade de ácido propiónico. 0 anel também tem uma cauda dipeptido distinta, que não tem uma unidade glicina, presa a uma unidade 6-cisteína por meio de uma ligação amido.

M. Manning, W. H, Saujyer e colaboradores tem publicado uma série de publicações descrevendo vários congéneres de £~1-(ácido fi -mercapto- p , A -ciclopentametilenopropiónico)-4-valina_7-arginina-vasopressina que tem actividade anti-vasopressina. São representativos disto EPA l\|S, 61.356, NS. 4 367 225 e Patente U.S. NS. 4 399 125.

Todos os compostos de Manning tem uma cadeia tripêptido

ligada à unidade 6 e são, portanto, nonapêptidos. Os presentes

compostos distinguem-se além disso por serem octapêptidos, por

terem uma cauda dipêptido des-Gly ligada à unidade 6 e por terem

potente actividade vasopressina-antagonista.

A potente actividade biológica dos compostos da presente 9

invenção ê inesperada visto que a des-glicinamida -vasopressina

e a des-lisina -desglicinamida -vasopressina /T. Barth et al.,

Collection Czechoslov. Chem. Comrnun. 39, 506 (l974)__/ tal como

a desglicina⁹-oxitocina /""Β. Berde e al., Handb. Exp. Pharm. 23

860 (1968) retêm uma pequena parte da actividade dos seus respes

ctivos aparentados compostos. De facto, Barth relata que a des9

glicinamida -AUP tem actividade CNS mas praticamente nenhuma actividade antidiurêtica ou uterotónica, Belgian Patent No.896 509

Certãs designações da arte dos pêptidos usadas nas especi. ficações e reivindicações são as seguintes: Cap, ácido -mercapto- A , 6 -cicloalquilenopropiónico; Pmp, ácido -mercapto - fi , h-ciclopentametilenopropionico} Chg, ciclohexilglicina; Abu, ácido {>4 -amino-n-butíricoJ Cha, ciclohexilalanina; Pba, ácido aminofenilbutírico; Gin, glutamina; Gly, glicina; Tyr,

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-3

tirosina, Phe, fenilalaninaj Phe(4’-Alk), alquilfenilalanina ijn ferior? Vai, valina? Nva, norvalina; Ile, isoleucina; Nle, norleucina? D-alle, D-alo-isoleúcina; Leu, leucina; Ala, alanina; Lys, lisina; Arg, arginina; Asn, asparagina; Met, meti, onina; Tos, tosilato? HF, ácido fluorídrico; BHA, benzidrilami, na; DIEA, diisopropiletilamina; 4-MeBzl, 4-metilbenzilo; TFA, ácido trifluoroacêtico; DCC, diciclohexilcarbodiimida; HBT, 1-hidroxibenzotriazolo; ADH hormona antidiurêtica; ACM, acetamidometilo; DMAP, dimetilaminopiridina.

Quando o termo "vasopressina” á utilizado, somente na es, pecificação, significa L-arginina vasopressina (AVP) excepto quan do alterado. Os derivados AVP deste invento têm preferência. "Alk" representa um alquilo inferior de 1-4 carbonos que é opcio nalmente ligado ao azoto em Y, ao oxigénio substituinte da unidja de tirosina quando aquele está presente na posição 2 ou ao anel fenilo da unidade fenilalanina na posição 3 do anel. Aqueles substituintes alquilo incluem metilo, etilo, n-propilo, isopropj. lo ou butilo.

Por isso, na descrição aqui incluída e nas reivindicações, utiliza-se a nomenclatura comum na arte da química dos pêjo. tidos e da vasopressina. Quando não é assinalada nenhuma configuração, a unidade amino-ácido está na forma L ou naturalmente ocorrente.

g

Os compostos desGly do invento são ilustrados pela seguinte fórmula de estrutura

123455 78

CH,

CO-X-P-A-Asn-Cys-W-Z-Y

CH_O—CH / ²

<^CH2>n

ch₂—ch₂

S

na qual:

P ê Phe ou Phe(4’-Alk);

X ê D-Phe, D-Val, D-Nva, D-Leu, D-Ile, D-AIle, D-Pba, D-Nle, D-Cha, D-Abu, D-Met, D-Chg, D ou L-Tyr ou D ou L-Tyr(alk);

Y é NH₂, NHAlk, NHBzl ou OH;

W ê D-Pro, L-Pro ou /\Pro (dehidro-Pro);

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-4A ê Vai, Ile, Abu, Ala, Gly, Lys, Cha, Nle, Phe, Leu, Chg

□u Nvaj

Z ê D-Arg, L-Arg, D-Lys ou L-lisj

n é O, 1 ou 2, ou um sal aceitável farmaceuticamente, ás. ter prodroga ou seu complexo.

Um grupo subgenérico de compostos deste invento compreen de compostos de fórmula I na qual X é D-Tir, D-Cha, D-Phe, D-Ile, D-Leu, D-Val, ou D-Tir(Et)j P é Phe ou Phe(4’-Et), A é conforme definido acima, Y é W ê Pro, Z é Arg e n é 1.

Os compostos de fórmula I nos quais X é D-Tir(Et) sáo ari tagonistas ADH particularmente activos como sáo os congéneres amida8.

Os compostos individuais com interesse são /~l-(ácido fi> -mercapto- fi , fi -ciclopentametilenopropiónico)-2-D-tirosina-4~valina-8-arginina-9-desglicina_7 vasopressina, /""l-(ácido fl -mercapto- p , ^-ciclopentametilenopropiónico)-2-D-tirosina-4-vaiina-8-arginina-9-desglicinamida)vasopressina e, especialmente, /"í-Cácido -mercapto- /5 , ^-ciclopentametilenopropiónico)-2-(0-etil-D-tirosina)-4-valina-8-arginina-9-desgiicina_7vasopres,

sina.

Estão tambám incluídos neste invento vários derivados dos compostos de fórmula I tais como sais de adição, prodrogas na fo£ ma éster ou amida e complexos. Os sais de adição podem ser quer sais com catiães farmaceuticamente aceitáveis tais como NH^®, Ca^, ou Na® no.grupo terminal ácido (Y = OH) ou com um sal farmaceuticamente aceitável num centro básico do péptido (como nas unidades Arg). As formas de sal acetato são espeeialmente óteis embora os cloretos, brometos e sais de outros ácidos fortes sejam óteis. Os compostos, também, formam sais internos ou iães ziuitter como quando Y é OH. As formas éster prodroga são por exemplo, ésteres alquilo inferiores de ácidos de fórmula I a qual tem de 1-8 carbonos no radical alquilo ou ésteres aralquilo tais como vários ésteres benzilo. Outros derivados latentes dos compostos de fórmula I serão óbvios para aqueles que são peritos na arte. "Complexos” incluem vários solvatos tais como hidratos ou alcoolatos ou aqueles com resinas de suporte, tais como uma resina Merrifield.

Os compostos de fórmula I são preparados por ciclização de um octapeptido linear por meio de dois grupos mercapto, na

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unidade cisteína (Cys) na posição 6 e na unidade ácido ,^J -mercapto- , p -cicloalquilenopropiónico (Cap) na posição 1. A re acção de ciclização ocorre imediatemente na presença de um agente de oxidação brando capaz de oxidar um mercapto a dissulfureto. A reacção representa-se como segue:

Cap-X-P-A-Asn-Cys-W-Z-Y —> Cap-X-P-A-Asn-Cys-W-Z-Y

ί ι I ₂ ^{1 1}

S-CT 3—Ci S-S

II

III

na qual:

X, Ρ, A e Y são conforme definido na fórmula I, acima;

Z é conforme definido na fórmula I acima ou também pode ser uma ligação simples sempre que Y á OH;

W é como definido para a fórmula I acima ou também pode

ser OH sempre que Z e Y estão ausentes; e 1 2

Q et) são, cada um, hidrogénio ou um grupo deslocável.

Os intermédios de fórmula II são novos compostos e são uma parte desta invenção. Os compostos de fórmula III na qual W e Z ou ambos estão ausentes são também novos compostos óteis como intermediários conforme descrito abaixo. 0 óltimo tem acti^i dade antagonista VSP num nível mais baixo do que a dos octapepti dos.

A reacção de ciclização desta sequência de reacções ê a mais proveitosamente conduzida por oxidação. Qualquer agente de oxidação conhecido da arte para conseguir converter um dimercapto em dissulfureto, pode ser usado. São exemplos de tais agentes um ferricianeto de metal alcalino, especialmente ferricianeto de potássio ou sódio, oxigénio gasoso, diiodometano ou iodo.

Como exemplo, 0 ferricianeto de potássio ê adicionado ao dimercaptan de fórmula II dissolvido num solvente inerte adequado, por exemplo, água ou metanol aquoso à temperatura de 0-402C. Muitas vezes, a oxidação é a um pH de 7-7,5 à temperatura ambiejç te em solução diluída dando bom rendimento, 40-50/á, de composto cíclico.

Os compostos de fórmula III que são compostos Cys(OH)^

ou Pro(OH) reagiram com um dipéptido, um (!\1H₂)-WZY protegido,

ou um amino-ácido, (NH^J-Z-Y, respectivamente, conforme descrito

daqui em diante.

A matéria prima mercaptan linear pode ter ou não grupos

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1 2

deslocáveis ou protectores comuns à arte (Q e Q ) presentes em várias unidades de amino-ácidos. Aqueles grupos protectores inç luem benzilo, p-metoxi-benzilo, 1-adamantilo, t-butilo, p-nitrobenzilo, tritilo, benziltiometilo, etilcarbamoilo ou acetamidome tilo. Benzilo, adamantilo ou t-butilo são removidos pelo mercúrio (halo) sais de acetato em metanol aquosa a 0-80SC. 0 grupo protector á usualmente removido antes da ciclização tal como durante o fendimento do ácido sulfídrico do péptido da resina de suporte. Ele pode, contudo, ser removido quer durante a cicliza ção ou, no local, antes da ciclização.

Os grupos S-acetamidometilo são especialmente úteis. Por exemplo, 5-ACM-Pmp-D-7yr(Et)-Phe-Val-Asn-S-ACM-Cys-Pro-0Bzl foi tratado com carbonato de potássio em metanol aquoso para dar o peptido Pro ácido linear com 78-84/ de rendimento. Este foi, e_n tão, ciclizado por oxidação usando iodo em metanol aquoso para dar o produto desejado Pro(OH) com 65-70/ de rendimento. Alte_r nativamente, o produto protegido foi ciclizado sob as mesmas cori dições com tratamento inicial de iodo seguido pela remoção do

7

carbonato de potássio do radical éster protector. 0 ácido Pro foi, então, condensado con Arq)NH^), usando DCC e DMAP em DMF a 0-202 para dar o Pmp-D-TyrÍEtJ-Phe-Ual-Asn-Cys-Pro-ArgÍNH^) com 45/ de rendimento.

0 iodo, portanto, remove o grupo S-protector, especialmente o grupo ACM e cicliza o intermediário. 0 acetato de mercúrio ou o acetato de chumbo também remove o grupo ACM para dar um mercapto de metal. Este é convertido em tiol, no local, por tratamento com ácido sulfídrico e, então, oxidado numa fase em separado.

0 octapéptido cíclico desejado de fórmula I pode ser con venientemente isolado por acidificação da mistura aquosa de oxidação tal como usando ácido acético glacial, e passando a mistura de reacção sobre uma coluna cromatográfica troca-iões (permutadora de iões) por exernplo, sobre uma coluna de resina acrílica fracamente ácida com eluição ácida, ou por filtração de gel sobre uma cama formada com gel preparada por ligação cruzada de dextran com epiclorohidrina.

Como alternativa â ciclização dos intermediários lineares de fórmula II sugerida acima, os ácidos 6-Cys ou 7-Pro ciclizados (os de fórmula I na qual ou ambas as unidades de cauda,

ÒZ 3>51

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W e Z, ou somente uma unidade da cauda, Z, estão ausentes) são condensados com um dipeptido protegido, W-Z-Y, ou com um amino-ácido, Z-Y, respectivamente. A reacção do ácido Cys ou do áci. do Pro com um amino ácido ou dipeptido adequadamente protegidos ô conduzida usando qualquer reacção em que se forma amida, comum à arte dos péptidos. Usualmente, fazem-se reagir quantidades substancialmente equimoleculares das matérias primas na presença de uma carbodiimida, tal como a diciclohexilcarbodiimida, mais 1 -hidroxibenzotriazolo ou dimetilaminopiridina num solvente orgânico entre 0-359C, de preferência, desde o gelo até à temperatura ambiente. Os grupos protectores são removidos por uma reacção que não irá romper a ligação dissulfureto do anel hexapeptido, por exemplo, alcali fraco.

Os intermediários importantes de fórmula II são convenientemente preparados usando métodos de fase sélida de síntese de péptido conforme discutido em M. Manning e outros, 0, Med. Chem 25 46 (1982). Uma resina de suporte benzidrilamina comercial (BHR) é usada para preparar os produtos finais de fórmula I em que Y é NH^ (as des-glicinas) e uma resina de suporte clorometilo (CMR) é usada para preparar os compostos de fórmula I nos quais Y é OH (as des-glicinamidas).

A cadeia peptídica dos péptidos lineares da fórmula II é construída, pouco a pouco, partindo da unidade 8 em direcção à unidade 1. Cada unidade é protegida convenientemente conforme ê sabido na arte dos péptidos e como é descrito mais abaixo. Alternativamente, vários oligopeptidos podem ser constituídos usan do reacções de líquidos ou de suportes, e depois condensados como um óltimo passo na sequência da reacção para preparar os intermediários dimercapto.

A sequência preferida das reacções da fase de suporte de resina é conduzida convenientemente num sintetizador de péptidos Beckman 990 B sem isolamento de cada péptido intermédio. Os deta lhes do processo são apresentados aqui a seguir nos exemplos de trabalho. As condições, de solução ou reacção enzimática são aplicáveis aqui conforme é sabido na arte.

Os vários amino-ácidos, que são adicionados consecutivamente â cadeia de resinas suporte são protegidos como é sabido

na arte. Por exemplo, o grupo de protecção Boc é usado para um

grupo amino especialmente na posição j um benzilo opcional62 351

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-8- gi

mente substituído, para os grupos mercapto nas unidades Pmp e Cysj tosilo, para a unidade Argj e um carbobenzoxilo (z) opcio nalmente substituído para as unidades Tyr ou Lys. Os grupos pro tectores serão, mais convenientemente, aqueles que são facilmente removidos, isto é, usando tratamento ácido para o grupo terc.-butiloxicarbonilo, sódio liquido amónia ou hidrogenação catalíti ca para os grupos benzilo ou carbobenzoxilo onde as condições da reacção de remoção não conduzem à reacção em outras porções do pêptido tais como a ligação dissulfureto.

Como outros exemplos de grupos protectores, o grupo amino de um amino ácido ou oligopêptido é protegido convencionalmente por um grupo acilo tal como formilo, trifluoroacetilo, ftaloílo, p-toluenossulfonilo ou o-nitrofenilsulfonilo5 um grupo benziloxicarbonilo tal como benziloxicarbonilo, o-bromobenziloxicarboni lo, p-bromobenziloxicarbonilo, o- ou p-clorobenziloxicarbonilo, p-nitrobe.nziloxicarbonilo ou p-metoxibenziloxicarbonilo, um grupo alifático oxicarbonilo tal como tricloroetiloxicarbonilo, t-amil. oxicarbonilo, t-butoxicarbonilo ou diisopropilmetoxicarbonilo ou um grupo aralquiloxicarbonilo tal como 2-fenilisopropoxicarbonilo, 2-tolilisopropoxicarbonilo, ou 2-£-difenilisopropoxicarbonilo. Grupos amino são também protegidos formando enaminas por reacção com uma 1,3-dicetona tal como benzoilacetona ou acetilacetona.

Os grupos carboxilo podem ser protegidos pela formação de amida, formação de hidrazida ou por esterificação. Se necessário o grupo amida ê substituído pelo grupo 3,4-dimetoxibenzilo ou pelo grupo bis-(p-metoxifenil)-metilo. 0 grupo hidrazida é substituído por benziloxicarbonilo, tricloroetiloxicarbonilo, trifluoroacetilo, t-butoxicarbonilo, tritilo ou 2-p-difenil-isopropoxicarbonilo. 0 grupo ester é substituído por um alcanol co mo o metanol, etanol, t-butanol ou cianometilalcool; por um aralcanol como o benzilalcool, benzidiilalcool, benzoilmetilalco ol, p-bromobenzoilmetilalcool ou o p-clorobenzoilmetilalcool5 por um fenol como o 2,4,6-triclorofenol, 2,4,5-triclorofenol, pentaclorofenol, p-nitrofenol ou o 2,4-dinitrofenol; ou por um tiofenol como o tiofenol ou o p-nitrotiofenol. 0 grupo hidroxilo na tirosina é opcionalmente protegido por esterificação ou eterificação. Um grupo protegido por esterificação é, por exemplo, um grupo 0-acetil-, 0-benzoil-, O-benziloxicarbonil- ou 0-etiloxicarbonil-. Um grupo protegido por esterificação é, por

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exemplo, um grupo Q-benzil-, O-tetrahidropiranil- ou 0-t-butil-.

0 grupo amino do grupo guanidino na arginina pode ser protegido pela formação de um sal, pelo grupo nitro, tosilo, ben ziloxicarbonilo ou mesitileno-2-sulfonilo. Nem sempre, porém, é necessário proteger o grupo guanidino.

0 péptido linear protegido intermédio é separado da matriz portadora de resina, por exemplo, pela amónia num solvente alcoólico e depois é tratado para remover grupos protectores usando por exemplo sódio-amoníaco líquido. Este processo dá o derivado amida do octapéptido linear.

Mais conveniente será combinar as duas operações tratando o péptido fixado sobre resina com ácido fluoridrico anidro na presença de um catião "varredor” ("scavenger") adequado, como é conhecido na arte, tal como o anisolo, para dar o octapéptido in termédio de fórmula II, na forma de dimercaptan e com bom rendimento.

Os compostos deste invento têm potente actividade vasopressina-antagonista. Sabe-se que a vasopressina para o mecanis mo de acção anti-diurética no rim. Quando a acção destes compo£ tos antagoniza a da hormona anti-diurética natural (ADH), o corpo excreta água devido a um aumento de permeabilidade das porções terminais dos tubos renais. Julgamos que o mecanismo de a_c ção esteja nos vasopressina-receptores /~^2~^receP^^ores—localizados sobre a membrana do plasma de certas células epiteliais re nais. 0 efeito farmacodinâmico mais notável dos ADH-antagonistas do invento é o diurético de água mais do que um natriurêtico como por exemplo a tiazida.

Os compostos reivindicados têm como objecto qualquer paciente que sofra do síndroma de secreção hormonal antidiurêtica inadequada ("Syndrome of Inappropriate Antidiuretic Hormone Secretion" - SIADH) ou de um estado edematoso indesejável. São exemplos de estados clínicos indicados para os compostos deste invento a hipertensão, cirrose hepática, falência cardíaca congestiva ou um componente de qualquer estado traumático resultahte de dano sério ou doença nos quais seja factor relevante o ag_o nismo da vasopressina que ocorre naturalmente aos receptores mediados pela VSP.

0 segundo grupo de locais vasopressina-receptores é o dos locais de pressores vasculares (V^-receptores) localizados dentro

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-io- «g

do próprio sistema cardiovascular. Por exemplo, o Composto 5 do

Quadro I, baixo, foi ensaiado, com o protocolo Dyckes (U.S. Pat.

NS. 4 367 255) quantio à inibição da vasoconstrição induzida pela

Uasopressina no rato, in vitro (pA^ 8,40) e in vivo (pA₂ 7,7l).

0 antagonismo no receptor U₂ resultou em vasodilatação e, por fim, em actividade anti-hipertensora. 0 tratamento da dismenorreia á outra aplicação dos compostos deste invento quando administrados endovenosamente ou por via intranasal.

Qs compostos deste invento são portanto usados para tratar edema ou para expelir água em pacientes que necessitem tal tratamento, por administração parentêrica ou por insuflação de uma quantidade efectiva, mas não tóxica, do composto escolhido, de-preferência combinado com um suporte farmacêutico. As unidades de dosagem do ingrediente activo são escolhidas de 0,01 atê 10 mg/kg, de preferência de 0,01 atê 5 mg/kg, com base num paciente de 70 kg. As unidades de dosagem são aplicadas 1 a 5 vezes por dia.

A composição farmacêutica para induzir antagonismo de va sopressina contêm um ingrediente activo de fórmula I sob a forma de dose unitária como acima de descreveu, dissolvida ou suspensa num suporte líquido padrão. Um suporte padrão ê o soro salino isotónico, contido numa ampôla ou num pequeno frasco de doses múltiplas, adequado para injecção parentêrica tal como por administração endovenosa, subcutânea ou intramuscular. A composição para insuflação Ó semelhante mas ê habitualmente administrada num inalador ou aplicador de doses medidas. As composiçães em pó podem também ser usadas com preparações oleosas, geles, tampões para preparações isotónicas, emulsões e aerosoles, sob forma padronizada.

Os compostos deste invento provaram ter actividade antagonistica única, em relação à hormona anti-diurêtica natural (ajç tividade anti-ADH), in vitro, no tecido medular do porco-de-engorda ou do rim humano e, in vivo, no rato ou no macaco hidropénicos. Encontram-se detalhes dos protocolos in vitro em F. L. Stassen et al., 3. of Pharm. Exp. Ther., 233, 50-54, (1982)J os cálculos da actividade da ciclase e de potencial de ligação no receptor são os seguintes:

Ensaio de Avaliação da Actividade Ciclase Adenilato:

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32

Em cada experiência a quantidade de P/cAMP formada na ausência de membrana medular é avaliada e constitui o valor do "branco". Subtrai-se este valor de todos os dados experimentais. 0 produto é avaliado quanto ao seu efeito na actividade da ciclase adenilato basal e/ou na actividade estimulada pela va sopressina. Cada determinação é realizada em triplicado. 0 valor ka è obtido a partir de um gráfico Lineu/eaver-Burke, Rei,

V = (V droga/V vasopressina) x 100 x Ki = l//~(Ka*/Ka)-1_7

onde I ê a concentração do antagonista, Ka’ e Ka são as concentrações da vasopressina necessária para dar metade da actividade máxima de ciclase adenilato, na presença e na ausência de antaqs nista, respectivamente.

Ensaio de ligação:

Em cada experiência, a quantidade de ^H-Vasopressina ligada na ausência e na presença de um excesso de vasopressina (7,5χ10~^Μ), ê medida em triplicado. Estes valores representam, respectivamente, a ligação total e a não-específica. A Κθ de um composto resulta da equação para a inibição competitiva: K₀ =

= IC_5Q/(1 ₊ L/K_d), onde IC_5Q á a concentração necessária para 50/o de inibição da ligação específica de ^H-vasopressina, L á a concentração do ligante e K^ ê a constante de dissociação da ^H-vasopressina (K_D = 3,6xiO”⁹Mj 1 SD = 0,4x10^-9M). Este é o valor médio de K^ determinado em 3 preparações de membranas de rim de barrasco (porco-de-engorda).

Protocolo para Ratos Hidropênicos

Retira-se a alimentação e água de ratos machos, aproxima damente 18 hores antes do ensaio. Os animais são instalados aos 4 por gaiola de metabolismo. A hora 0, o composto do ensaio ê administrado intraperitonealmente ao grupo de ensaio e urn volume equivalente de veículo é administrado a ambos os grupos de controle (alimentados e não alimentados). Mede-se o volume de urina e a osmolaridade em cada hora e durante 4 horas. Os valores do ensaio são expressos em ml de urina excretada (cumulativa), mEq/rato de electrólito excretado, mg/rato de ureia excretada e a osmolaridade em mili-Osmoles/kg H^O. Usa-se o teste da tolerância para determinar a significância. Defini-se ED^qq como a dose de produto(J< g/kg) necessária para baixar a osmolaridade da urina até 300 m-Osmoles/kg. ED_5Q0 define-se como a dose do produto (kg/kg) necessária para baixar a osmolaridade da urina atê

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-12«

500 m-Osmoles/kg. 0 protocolo para o

lhante.

QUADRO I

macaco hidropênico é semeÇH

/

CH„ £

\² /1

ch₂-c^h2 s.

CO-X-Phe-A-Asn-Cys-Pro-Arg-Y

S

	X	Y	A
1.	D-Tyr	Gly-NH2	Vai
2.	D-Tyr	wh2	Vai
3.	jD—T yr	OH	Vai
4.	D-Tyr(Et)	Gly-NH	Vai
5.	D-Tyr(Et)	nh2	Vai
6.	D-Tyr(Et)	nh2	Abu

actividade anti-ADH in vivo (Rato) in vitro (Porco) ED₃₀₀ ( ítg/kg)* Ki(nM) K₀ (uM)

32	30	0,082
63	27	0,065
156	160	0,35
9,9	5,9	0,011
5,8	3,0	0,0078
13	7,6	0,018

x Dose estimadgáje péptido libertado i.p.imediatamente^tg/kg) de que resulta uma redução de U _m dos níveis hidropênicos até 300 m-Osmoles/kg H^O.

0 Quadro I demonstra, nos protocolos descritos, a activi. dade anti-vasopressina de compostos representativos escolhidos cujas estruturas de octapéptido têm a cauda desGly dipéptido que ê característica deste invento. A presença de substancial actividade antagonistica é inesperada pois que, nas séries de agonis tas, a des-Gly-cxitocina tem um efeito oposto na pressão sanguínea quando comparada com a própria oxitocina (Ver B. Berde et al., cit. loc.) e o efeito, conhecido na arte, de encurtar a cauda lj. near da oxitocina e vasopressina é provocar "um marcado decréscj_; mo das actividades biológicas típicas das substâncias” (ver T. Barth et al., cit. loc.).

Além disso, o composto 5 dc Quadro I provou ter uma excepcional actividade antagonista ao longo dos vários protocolos

de análise em tecido de barrasco ou humano, em ensaios in vitro,

bem como nos ensaios do macaco e rato hidropênicos. A sua actividade anti-ADH, manifestada como a dose necessária para baixar

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a osmolaridade da urina até 3Q0M Osm/kg H^O no ensaio do macaco esquilo ("squinel monkey") hidropénico consciente, ê = 8,6

Nmoles/kg (i.p.). A do composto 4 do Quadro I é 33,1 Nmoles/kg. A do análogo 2-D-Phe do óltimo composto é 319,0 Nmoles/kg.

Os seguintes exemplos destinam-se somente a ensinar a preparaç3o dos produtos deste invento. Todas as temperaturas e_s tão em graus centígrados.

EXEMPLO 1

Síntese em fase sólida de Pmp(Bzl)-D-Tyr(Br-Z)-Phe-Val-Asn-Cys

(QMe-Bzl)-Pro-Arq(Tos)-resina

Para a síntese em fase sólida do pêptido fixado em resina, do título, usou-se como matéria prima a Boc-Arg(Tos)-resina (3 mmol/5,4 gramas de resina). Os amino ácidos adequadamente protegidos foram ligados sequencialmente sobre a Boc-Arg(Tos)-re sina, preparada pela reacção de Boc-Arg(Tos), sob a forma de sal de césio, com a resina comercial Merrifield (Cl-CF^-resina), como ê conhecido da arte pelo uso de um programa manual a seguir detalhado:

1. lavagem com cloreto de metileno (3 vezes, 1 minuto)

2. prelavagem com ãcido trifluoroacético a 33% em cloreto de me tileno com 1% indolo (l vez, 1 minuto)

3. desprotecção com ácido trifluoroacético a 33% em cloreto de metileno com 1% indolo (20 minutos)

4. lavagem com cloreto de metileno (3 vezes, 1 minuto)

5. prelavagem com trietilamina a 10%. em cloreto de metileno (l vez, 1 minuto)

6. neutralização com trietilamina a 10% em cloreto de metileno (10 minutos)

7. lavagem com cloreto de metileno (3 vezes, 1 minuto)

8. adição de amino ácido protegido (10 mmol) em trietilamina em cloreto de metileno e Ν,Ν'-diciclohexilcarbodiimida 0,5M em cloreto de metileno (20 ml)

0 tempo de reacção foi atê 2 horas.

No caso da ligação da parte Asn juntou-se 1-hidroxibenzotriazolo (HBT, 10 mmol) com Boc-Asn em dimetilformamida seca.

A dimetilformamida (DMF) seca foi também usada como solvente

quando se ligou Pmp (Bzl) num pêptido-resina, usando a 4-dimetilaminopiridina (10 mM). 0 fim de cada reacção de acoplamento

foi controlada pelo ensaio da ninidrina. Usou-se o grupo 4-me62 351

CASE: SKB 14142

-14toxibenzilo para proteger o grupo tiol da Cys e empregou-se o grupo 2-bromo-carbobenzoxilo para bloquear o hidroxilo fenólico da D-Tyr.

A resultante Pmp(Bzl)-D-Tyr(Br-Z)-Phe-Val-Asn-Cys(OMe-Bzl)-Pro-Arg4"Tos )-resina, protegida, foi lavada muito bem com cloreto de metileno e metanol, sucessivamente. Depois de secar no vácuo durante a noite, recolheram-se 8,4 gramas da resina protegida do título.

Preparação de PSip-D-Tyr-Phe-Val-Asn-Cfrs-Pro-Arq-NHg

Submeteu-se a Pmp (Bzl)-D-fyr-(j3-bromocarbobenzoxi)-Phe-Val-Asn-Cys(OMe-Bzl)-Pro-Arg(Tos)-resina (4 g, ca. 1,5 mmol) a amonólise, usando solução (200 ml) de amónia saturada/metanol em dimetilformamida seca (50 ml) à temperatura ambiente durante 48 horas. Após evaporação ã secura, o resíduo foi precipitado pelo acetato de etilo/n-hexano e filtrado para dar a amida de octapêq tido protegido (l,54 g).

Este péptido em bruto foi dissolvido em amónia (250 ml) e tratado com solução sódio/amónia para dar Pmp-D-Tyr-Phe-Val-Asn-Cys-Pro-Arç-NH₂ que foi então oxidado usando solução de fer, ricianeto de potássio 0,01 M em 4 1 de solução aquosa a pH 7-7,5. Depois da reacção de oxidação se completar, o pH da solução aquosa foi ajustado atê pH 4,5 pela adição de ácido acético glacial. Passou-se lentamente esta solução através de uma resina acrílica fracamente ácida (Bio-Rex 70) numa coluna (llx2,5 cm forma H⁺). A coluna foi eluída com ácido acético a 5% e 50%, s_u cessivamente. Recolheu-se o produto ciclizado Pmp-D-Tyr-Phe-Val -Ásn-C^s-Pro-Arg-N^ em bruto (860 mg) a partir das fracçães da solução a 50% de ácido acético.

Purificação do PAip-D-Tyr-Phe-Val-Asn-Cls-Pro-Arq-NH^

1. Distribuição em contra-corrente:

Amostra: 860 mg de produto bruto, n-Bu0H/H0Ac/H₂0 (4:1:5) 250 transferências

a) fr. 186-204 436 mg

b) fr. 182-185 e 205-218, 219 mg

2. Cromatografia de partição:

Amostra: 250 mg (de 1-a), G-25 fina (2,5x55 cm), n-Bu0H/

/H0Ac/H₂0 (4:1:5)

a) fr. 32-46

222 mg

62 351

CASE: SKB 14142

-15>

3. HPLC preparativa:

Amostra: 40 mg (de 2-a); Alltech C18, 3000 psig. Caudal: 3,0 ml/min.

Tampão A: 0,1% TFA

Tampão B: 0,25% TFA /cH^CN (4:6) 60% B; isocrática; 235 nm (2,0 AUFS)

Injecção: 10 mg/0,5 ml, tampão A.

17 mg do produto puro do título

4. Cromatografia de Permuta de Iães

Arfiostra:	365	mg (de 1-a e 2-a); CMC;	0,01M NH^OAc	atê
	0,1	M NH^OAc
			Gradiente	linear
a)	fr.	51-70	93,5	mg
b)	fr.	71-89	86,5	mg
c)	f r.	91-110	65	mg
d)	f r.	111-121	24,5	mg

EXEMPLO 2

Preparação de Pmp-D-Tyr-Phe-Val-Asn-C(<s-Pro-Arq

Fez-se reagir Pmp(Bzl)-D-Tyr-(br-Z)-Phe-Val-Asn-Cys(OMe-Bzl)-Pro-Arg(Tos)-resina (4,2 g; 1,5 mmol) do Exemplo 1, em 4,5 ml de anisolo destilado, com ácido fluorídrico anidro (40 ml) a OS durante uma hora. Depois do tratamento acima descrito e de evaporar à secura em vãcuo, tratou-se o resíduo com êter anidro e separou-se por filtração obtendo-se 1,33 g de pêptido em bruto. Para completar a remoção do grupo Bzl da parte Pmp usou-se o sódio em amónia líquida, reacção que se descreveu no Exemplo 1. 0 octapêptido não-protegido resultante foi ciclizado usando uma sjo lução de ferricianeto de potássio 0,01 M a pH 7-7,5 até que a cor persistiu por 30 minutos como acima se descreve na preparação da amida.

Recolheu-se o desglicinamida-octapéptido (600 mg) depois de acidificar a solução de oxidação com ácido acético até pH 4,5 e de passar a mistura reagente por uma coluna Bio-Rex-70 com 1 lí de ácido acético a 5% como eluente.

Purificação do PÁip-D-Tyr-Phe-Val-Asn-C^s-Pro-A rg

1. Distribuição em contra-corrente:

amostra: 600 mg de Bio-Rex 70, n-Bu0H/H0Ac/H₂0 (4:1:5);

200 transferências

a) fr. 150-161

169 mg

62 351

CASE: SKB 14142

-16b) fr. 133-149 e 162-163

2. HPLC preparativa:

Amostra: 52 mg(de 1-a); Alltech C18 (25 cms 10 mm, 10 micron);

Tampão A: 0,1/ TFA

Tampão B: 0,25/ TFA/CH^CN (4:6) 60/ B, isocrática; 3000 psig; 3,0 ml/min. Injecção: 10 mg/0,6 ml em tampão A, 235 nm (2,0 AUFS)

a) 24 mg

b) 7,3 mg.

Juntou-se 2a e 2b, repurificou-se em HPLC, obtendo-se 15 mg de páptido puro.

3. Cromatografia de partição:

Amostra: 117 mg (de 1-A), G-25 fina (2,5x55 cm), n-Bu0H/ /H0Ac/H₂Q (4:1,5)

a) fr. 32-36 83 mg de produto puro

EXEMPLO 3

Preparação de Pfnp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cls-Pro-Arq-l\iH₂

0 composto do título foi preparado pelo método da fase

sólida aplicado na benzidrilamina-resina (BHA). Assim, fez-se reagir 1,0 g de BHA-resina (l,13 mmol NH₂/g resina) com 1,5 equivalentes de Boc-Arg(Tos), 1,5 equivalentes de DCC e 3,0 equi valentes de HBT postos em dimetilformamida de modo a ficar 0,1 M em Boc-Arg(Tos). 0 desbloqueamento fez-se com 50/ TFA/cloreto de metileno e a neutralização com 5/ DIEA/cloreto de metileno. 0 pêptido foi alongado, aos poucos, por acoplamento, usando anidri dos simétricos de Boc aminoacilo preparados em DMF (0,1 M). Ligaram-se Boc-Asn, Boc-D-Tyr(Et) e Pmp(MBz), sucessivamente, usan do DCC e HBT em DMF. 0 fim do acoplamento foi controlado pelo ensaio qualitativo da ninidrina e fez-se o re-acoplamento quando necessário. A Pmp (MBz)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(MBz)-Pro-Arg (Tos)-BHA-resina completa foi lavada com cloreto de metileno e seca atê p^o constante, 2,34 g.

0 pêptido foi desbloqueado e separado da resina por tra tamento com ácido fluorídrico líquido (30 ml) na presença de anisolo (4 ml) a 02 durante uma hora. Depois de^vaporar atê à secura em vácuo, lavou-se a resina em éter etílico, secou-se ao ar e depois extraiu-se com dimetilformamida desgaseificada (3x x20 ml) e ãcido acético a 20/ (4x20 ml). A DMF e os extractos

62 351

CASE: SK8 14142

ácidos foram juntos a 4 1 de água (pH 4,5 com ácido acético). Ajustou-se o pH a 7,2 com hidróxido de amónio e titulou-se a solução com ferricianeto de potássio 0,01 M, em argon, com agitação atê persistir uma cor amarela (85 ml). Levou-se o pH atê 4,8 com ácido acético glacial. Filtrou-se a mistura e passou-se o filtrado por uma coluna (H⁺ ) de Bio-Rex 70. Depois de lavar a coluna com água (200 ml), o péptido bruto foi eluído com 300 ml de piridina/ácido acêtico/água (30:4:66 v/v). Evaporou-se o eluente em vácuo a 302. Dissolveu-se o resíduo em 100 ml de ácido acético 0,2 N, depois liofilizou-se, obtendo-se 507 mg do octapéptido, em bruto, do titulo.

Purificação de P|Çip-D-Tyr(Et)-Phe-"Val-Asn^C|s-Pro-Arq-NH^

1. Distribuição em contracorrente

Amostra: 607 mg em bruto; n-BuOH:HOAc: 0 (4:1:5), 240 transferências

a) fr. 154-170 e 190-192 71 mg

b) fr. 171-139 230 mg

2. Filtração Gel

Amostra: 123 mg de 1-b, G-15 (2,5x55 cm) usando 0,2 N HOAc,

25 ml/h

a) fr. 46-50 ~ 20 mg

b) fr. 51-77 60 mlg de pé£

tido puro.

EXEMPLO 4

Preparação de Plnp-D-Leu-Phe-Val-Asn-C^s-Pro-Arq-IMHC,H„

Fez-se reagir uma mistura de 0,1 mmole de (Pmp -D-Leu -Val^-desGly-P^) AVP, preparada como acima mas usando Boc-D-Leu na posição 2, e de 0,1 mmole de n-propilamina em 20 ml de DMF, com 23 mg (0,11 mmol) de DCC e 14 mg (0,11 mmol) de HBT, à temperatura ambiente durante 2 horas. Evaporaram-se as matérias vo láteis obtendo-se um residuo oleoso. 0 produto foi purificado como acima usando: (l) filtração gel sobre G-10-Sephadex eluída com ácido acético 0,2 N; (2) cromatografia líquida de alta pressão usando 0,05,( TFA em 39/ acetonitrilo em água; e de novo (3) filtração gel para dar 20 mg de octapéptido puro do título.

Análises de amino ácidos: Asp 0,88, Pro 0,93, Vai 1,00,

Leu 1,09; Phe 0,88, Arg 1,07. HPLC = 95/; pico maior a 11,33

com acetonitrilo 40% aquoso com KH^PO. 0,05 M como tampão. K.. =

= 12,1% inibição a 10"-^?M.

62 351

CASE: SKB 14142

Usando (Pmp^-D-TyrÍEt^-Ual^-desGlyNH^-AVP, preparada como no Exemplo 2, e benzilamina cbtêm-se PAip-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-c|s-Pro-ArgNHBzl. Preparam-se de modo semelhante outros de. rivados N-alquilados.

EXEMPLO 5

Síntese Peptídica em Fase Sólida de Pmp-(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Abu-Cys(4-MeBzl)-Pro-Arq(Tos)-BHA-resina

Para a síntese em fase sólida do péptido fixado em resina, do titulo, usou-se como matéria prima Boc-Arg(Tos)BHA-resina (1,19 mmol/g de resina). Foi preparada fazendo reagir Boc-Arg(Tos), 3 mmol, com a resina de benzidrilamina, 1,0 mmol, em dime tilformamida durante duas horas. A resina de benzidrilamina sob a forma de cloridrato foi coberta com cloreto de metileno durante a noite. Foi então lavada com cloreto de metileno (4x1 min.) neutralizada com diisopropiletilamina 7/ em cloreto de metileno (2x2 min.), depois 6x1 min. com cloreto cie metileno sozinho e finalmente 2x1 min. com dimetilformamida pré-seca. A associação do Boc-Arg(Tos) à resina realizou-se por 2 vezes num agitador ("shaker") usando 1-hidroxibenzotriazolo (HBT, 6 mmol) e diciclja hexilcarbodiimida (DCC, 3 mmol). Depois da associação executou-se, como rotina, o ensaio quantitativo da ninidrina e a análise de amino ácidos para determinar a percentagem de "carga" sobre a resina. Nesta experiência a carga foi de 62,66/, isto é, estavam disponíveis 0,74 mmol/g de resina. 0 amino ácido que se seguiu, Boc-Pro, foi associado usando o seguinte protocolo:

1 - Lavado com cloreto de metileno (6 vezes, 1 min.)

2 - Prelavado com TFA 50/ em cloreto de metileno (l vez, 1 min.)

3 - Desprotegido com TFA 50/ em cloreto de metileno (20 min.)

4 - Lavado com cloreto de metileno (6 vezes, 1 min.)

5 - Prelavado com DIEA 7/ em cloreto de metileno (l vez, 1 min.)

6 - Neutralizado com Dl£A 7/ em cloreto de metileno (8 min.)

7 - Lavado com cloreto de metileno (6 vezes, 1 min.)

8 - Lavado com dimetilformamida (2 vezes, 1 min.)

9 - Adicionado de amino ácido protegido (3 mmol) e HBT, 6 mmol,

em DMF, seguido da adição de DCC em cloreto de metileno, 3 mmol, e associação (acoplamento) durante 2 horas.

10 - Lavado com dimetilformamida (2 vezes, 1 min.)

11 - Lavado com cloreto de metileno (4 vezes, 1 min.)

12 - Lavado com etanol/cloreto de metileno (l:l) (2 vezes, 1 min,)

CASE: SKB 14142

-19- -Z1

ι \

13 - Lavado com cloreto de metileno (4 vezes, 1 min.) *

Estas operações realizaram-se no agitador ("shaker'·).

Os amino ácidos subsequentes foram acoplados sequencialmente usando o sintetizador de péptidos Beckman 990-B. 0 progra

ma usado para cada acoplamento, excepto para BocAsn e Pmp(4-MeBzl), foi o seguinte:

1 - Lavado com cloreto de metileno (3 vezes, 1 min)

2 - Prelavado com TFA 50% em cloreto de metileno (l vez, 1 min.)

3 - Desprotecção com TFA 50% em cloreto de metileno (30 min.)

4 - Lavado com cloreto de metileno (3 vezes, 1 min.)

5 - Prelavado com DIEA 7% em cloreto, de metileno (l vez, 1 min.)

6 - Neutralizado com DIEA 7% em cloreto de metileno (l vez, 10

min.)

7 - Lavado com cloreto de metileno (3 vezes, 1 min.)

8 - Adicionados amino ácidos protegidos (3 mmol) em cloreto de

metileno, seguindo-se a adição de DCC, 3 mmol, 10 ml de 0,3 M em cloreto de metileno e acoplamento durante 2 horas.

9 - Lavado com cloreto de metileno (3 vezes, 1 min.)

10 - Lavado com etanol/cloreto de metileno (l:l) (3 vezes, 1 min,

11 - Lavado com cloreto de metileno (3 vezes, 1 min.)

No caso de acoplamento de Asn usou-se 1-hidroxibenzotria zolo (HBT, 6 mmol) em 10 ml de dimetilformamida 0,6 Μ. A dimetil. formamida seca foi também usada como solvente quando se acoplou Pmp (4-MeBzl) ao pêptido-resina usando a 4-dimetilaminapiridina (3 mmol). 0 termo de cada reacção de acoplamento foi controlado pelo ensaio da ninidina. 0 grupo 4-metilbenzilo (4-MeBzl) foi usado para proteger os grupos tiol da Cys e do ácido pentametilenomercaptopropiónico (Pmp).

Preparação de Pmp-D-Tyr^Et)-Phe-Abu-Asn-Cys-Pro-ArqNH₂

Pmp(4-MeBzl)-D-T yr(Et)-Phe-Abu-Asn-Cys-(4-MeBzl)-Pro-Arg (Tos)-BHA-resina, 1,25 g (0,37 mmol) em 2 ml de anisolo, reagiu com ácido fluorídrico anidro (20 ml a 06 durante 50 min.). Após evaporação do HF no vácuo lavou-se o resíduo com 'eter anidro, 4x20 ml, e extraiu-se o pêptido em bruto com dimetilformamida (50 ml) e ácido acético 33% (50 ml) em 2 litros de água desgaseificada previamente ajustada até pH 4,5. 0 disulfidriloctapéptido diluído em água foi ciclizado usando solução 0,01 M de

ferricianeto de potássio a pH 7,2 atê a cor amarela persistir

por 30 min. (50 ml). Ajustou-se o pH a 4,5 usando ácido acético

62 351

CASE: SKB 14142

-20- ~

glacial e passou-se a solução através de uma coluna (2,5x12, H®) de resina acrílica fracamente ácida (Bio-Rex-70) lentamente. Eluiu-se a coluna com tampão de acetato de piridina (30:4:66) (piri dina/âcido acético glacial/água). A solução de acetato de piridina foi removida por destilação no vácuo. 0 resíduo foi liofilizado a partir de ácido acético a 10% obtendo-se 300 mg (76%) do péptido do título, em bruto.

Purificação do Pkip-D-Tyr(Et)-Phe-Abu-Asn~C^s-Pro-ArqNH₂

1. Distribuição em contra-corrente:

Amostra: 300 mg, n-BuOH/HOAc/H^O, 4:1:5, 240 transferências

a) fr. 176-186 99,6 mg de péptido

puro

b) fr. 170-175 e 187-210 117,24 mg

Rendimento em material purificado 216,84 mg (55%).

2. Fórmula Molecular ^50^72^12^10^2

Peso Molecular: 1064,53

Análise de Amino Ácidos: Asp (l,00), Abu + Cys (l,70), Tyr (0,64), Phe (0,98), Arg (0,9l).

Teor em Péptidos: 68,06-91,52% a partir da análise de amino ácidosj 87,33% a partir da análise de az.o to.

3. Cromatografia

	Solvente	Rf
TLC	n-Bu0H/H0Ac/H20/Et0Ac (1:1:1:1)	0,56
	n-Bu0H/HÒAc/H20 (4:1:5) têpo	0,42
HPLC	coluna-C^g	K’
Isocrática	H20/CH3CN/TFA (60:40:0,25) 0,05 MKH2P04:	3
	:acetonitrilo (60:40)	7,33
Gradiente	h2o/ch3cn/tfa de 80:20:0,25 até 50:50:0,25	8,82

Bombardeamento Atómi

co Rápido (Fast Atom

Bombardment-FAB): m/z 1065 (M+H)⁺;

1063 (M-H)"

62 351

CASE: SKB 14142

-21EXEMPLO 6

Síntese Peptidica em Fase Sólida de Pmp-(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Ala-Asn-Cys-(4-MeBzl)-Pro-Arq(Tos)-BHA-resina

0 tetrapéptido fixado em resina Boc-Asn-Cys(4-MeBzl)-Pro-Arg(Tos)-BHA, 0,72 g (0,36 mmol) foi sintetizado no sintetizador de póptidos Beckman 990-8 partindo da Boc-Arg(Tos)-benzidrilamina-resina (.0,72 mmol/g) usando um protocolo como o do Exemplo 5.

Os amino ácidos subsequentes foram acoplados sequencialmente no agitador ("shaker") usando HBT e DCC durante 2 horas, de modo idêntico. Depois de ligar o último resíduo, isto é, Pmp(4-MeBzl), a resina contendo pêptido foi lauada como habitualmente e seca, obtendo-se 0,88 g do intermédio do título.

Preparação de Prfip-D~Tyr(Et)-Phe-Ala-Asn-CÇs-Pro-ArqNH^

Fez-se reagir a Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Ala-Asn-Cys

(4-MeBzl)-Pro-Arg(Tos)-BHA-resina, em 2 ml de anisolo, com HF anidro, a 02 durante 50 minutos. 0 trabalho foi conduzido como habitualmente e a toma de K^Fe(CN)₆ foi de 45 ml obtendo-se 230 mg (60,8/) do pêptido em bruto do título.

Purificação de Pilip-D-Tyr(Et)-Ph^^lã-KsníCls-Pro-Arql\IH₂

1. Distribuição em contra-corrente:

Amostra: 230 mg, n-BuOH/HOAc/^O (4:1:5), 240 transferências

a) fr. 160-178

b) fr. 179-190 e 150-159 Rendimento em material purificado:

105,2 mg prod» puro 49,5 mg

154,7 mg (4l/)

2"

Fórmula Molecular: ^49^70^70^10^2

Peso Molecular: 1050,449

Análise de Amino Ácidos: Asp (l,00), Pro (l,03), Ala (0,94), Cys (0,46), Tyr (0,65), Phe (0,9l), Arg (0,92).

Teor em pêptidos: 59,18-81,77/ de 2 análises.

3.

Cromatografia

TLC

HPLC

Isocrática

Gradiente

Solvente

nBu0H/H0Ac/H₂Q/Et0Ac (1:1:1:1) coluna C^g

h₂o/ch₃cn/tfa

60:40:0,1

h₂o/ch₃cn/tfa

de 60:40:0,1 até 50:50:0,1

0,64

K*

2,18

6,47

62 351

CASE: SKB 14142

-22

Bombardeamento Atómico Rápido (FAB): m/z 1051 (M+H)⁺;

1049 (M-H)“

EXEMPLO 7

Síntese Peptídica em Fase Sólida de Prop(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe

(4¹-Et)-Val-Asn-Cys-(4-MeBzl)-Pro-Arq(Tos)-BHA-resina

0 póptido fixado em resina, do título, foi preparado a

partir da BOC-Arg(Tos)-BHA-resina (0,4 mmol/g) num agitador ('‘shaker”) usando um protocolo atrás referido, isto ó, desprotecção-acoplamento usando HBT e DCC durante 2 horas, ató se obter Boc-Val-Asn-Cys-(4-MeBzl)-Pro-Arg(Tos)-BHA)-resina. Os dois resíduos de aminoácidos seguintes foram acoplados usando o sintetizador de pêptidos Beckman 990-B. 0 Pmp(4-MeBzl) foi liga

do manualmente usando DMAP-DCC durante a noite. 0 póptido contenda resina foi lavado e seco como usualmente, obtendo-se 2,00 g do produto intermédio do titulo

Preparação de Pilip-D-Tyr(Et)-Phe(4-Et)-Val-Asn-C{s-Pro-Arql\IH₂

Fez-se reagir Pmp-(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe(4-Et)-Val-Asn-Cys-(4-MeBzl)-Pro-Arg(Tos)-BHA-resina, em 3 ml de anisolo, com 30 ml de ácido fluorídrico anidro a 02 durante uma hora. 0 desenvolvimento do trabalho foi feito como acima, com 38 ml de K^Fe(CN)^. Obtiveram-se cerca de 50 mg de póptido em bruto da coluna de Bio-Rex e 139 mg por precipitação da solução, num total de 189 mg (42,7;á) do póptido do título.

Purificação:

1. Cromatografia de coluna de partição, Sephadex G-25:

Amostra: 50 mg, n-BuOH/HOAc/F^O (4:1:5)

a) fr. A, 23,B6 mg

b) fr. B, 18,5 mg HPLC de Preparação:

Amostra: 43 mg (De 1, Fr. a + Fr. b), Altex ODS, 10 mmx25 cm, 5 Jvl , caudal 4 ml/min., água/acetpnitrilo/TFA (50:50:0,25), isocrática, 229 nm (2,0 AUFS), injecção 2,0 mg/JOO^Lxl e 4,0 mg/420 ml obtendo-se 30,0 mg de póptido puro.

2. Características Físicas:

Fórmula Molecular: ^5^^73^12^10^2

Peso Molecular: 1106,47

Análise de Amino Ácidos: Asp (l,00), Pro (0,78-0,84), Cys

(0,45), Vai (1,02), Tyr (0,63,)

62 351

CASE: SKB 14142

-23Phe(]3-Et) (1,50), Arg (1,00-0,96) Teor em Pêptidos: 73,3-89,6%

3. Cromatografia:

TLC	Solvente nBu0H/H0Ac/H20/Et0Ac (1:1:1:1) nBu0H/H0Ac/H20 (4:l:5)Tôpo	Rf 0,70 0,299
HPLC	Coluna C^g	K*
Isocrática	f^o/ch^ch/tfa (55:45:0,1)	4,43
Gradiente	h2o/ch3cn/tfa de (60:40:0,1) até (50:50:0,1)	8,7
FAB	m/z 1107 (M+H)+,·

1105 (Μ-H)”

EXEMPLO 8

Síntese de Boc-Asn-Cys(4-MeBzl)-Pro-Arq(Tos)-MBHA-resina

Preparou-se uma milimole de Boc-Asn-Cys(4-MeBzl)-Pro-Arg (Tos)-BHA-resina usando 1 mmole de Bóc-Arg(Tos)-4-metilbenzidrij. amina (MBHA)-resina como material de partida por acoplamento sequencial com os aminoácidos de _t-Boc protegidos adequados num sintetisador de pêptidos Beckman 990-B.

Obtiveram-se 1,83 gramas de resina de péptido protegido que foi dividida em duas partes iguais (0,915 g cada).

Síntese de Pfrip-D-Tyr(Et)-Phe-Gly-Asn-C)s-Pro-ArqNH₂

Uma parte da resina de péptido protegido, supra, foi depois sequencialmente acoplado com 1,5 mmoles de aminoácidos Rnc adequados e de -(S-MeBzl)-Pmp-OH obtendo-se 1,16 g da resina de pêptidos protegidos final. Obteve-se Pmp(S-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Gly-Asn-Cys(4 MeBzl)-P ro-Arg-(Tos)MBHA-resina que se secou em vácuo. Esta resina protegida foi tratada com 1,5 ml de anis_o lo e 25 ml de ácido fluoridrico anidro a 02 durante 1 hora. 0 péptido desprotegido foi tratado com 0,01 mole de solução de fe_r ricianeto de potássio a pH 7,2 em 2 litros de água. Usaram-se 53 ml de agente oxidante.

A solução resultante passou por uma coluna C^g "flash".

A coluna foi eluída com 50;» de acetonitrilo com 0,25/ ácido tri

fluoroacêtico em 20 ml por fracção. Isolaram-se das fracções

325 mg de produto em bruto. Nova purificação do produto por CCD

62 351

CASE: SKB 14142

(B/A/W, 4:1:5) deu 188 mg do produto 99/ puro do título. Análise de Amino Ácidos:

Teor de pêptidos	82/
Asp 1,04	Tyr 0,92
Pro 1,15	Phe 1,01
Gly 1,00	Arg 0,91
Cys 0,54
FAB/MS = m/z (M+H)+ 1037

EXEMPLO 9

Síntese de PÁip-D-TyrtEtJ-Phe-Chq-Asn-C^s-Pro-ArqNH^

Uma parte da resina de péptidos protegidos do Exemplo 8 foi depois sequencialmente acoplada a 1,5 moles dos arnino ácidos Boc adequados e -(S-4-Me8zl)-Pmp-0H para dar 1,06 g da resina de pêptidos protegidos final Pmp(S-4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Chg-Asn-Cys(S-4-MeBzl)-Pro-Arg-(Tos)-M8HA-resina, obtida após secagem em vácuo.

Esta resina de péptidos protegidos foi tratada com 1,5 ml de anisolo e 25 ml de ácido flucrídrico anidro.

Depois da oxidação usual com ferricianeto de potássio e isolamento numa coluna C^g obtiveram-se 165 mg de produto em bru to do título. Outra purificação por CCD G-15 e filtração gel P-2, como acima se descreveu, deu 55 mg de produto HPLC puro do título.

Teor em péptidos: 88/

FAB/MS: m/z 1119 (M+H) ⁺

EXEMPLO 10

Preparação de Pfo-D-Tyr(Et)~-Phê-l/al-fisn-C^s( OH) e o seu uso na

preparação do composto do Exemplo 3

Dissolveram-se 4,87 g (15 mmol) de BocCys (4MeBzl) em 30 ml de etanol e juntaram-se 10 ml de água. 0 pH foi então ajustado atê 7,1 com uma solução aquosa de bicarbonato de césio.

Concentrou-se a mistura e evaporou-se o resíduo três vezes com 50 ml de tolueno. 0 resíduo foi então colocado em alto vácuo à temperatura ambiente durante a noite.

Dissolveu-se o sal em 35 ml de dimetilformamida e juntaram-se 5 g de clorometilfenil-resina comercial. Agitou-se a mis.

tura a 53S em árgon durante a noite.

Filtrou-se a mistura e lavou-se a resina com dimetilformamida (5x60 ml), DMF/água (9:l) (5x60 ml) DMF (5x60 ml) e eta62 351

CASE: SKB 14142

-25- H

nol (6x60 ml). Foi então seco em alto vácuo à temperatura ambiente durante o fim-de-semana.

A cadeia peptídica foi construída num sintetizador Beckman como acima se descreveu usando os derivados Boc de Asn, Vai, Phe, D-Tyr(Et) e o derivado S-(4-MeBzl)Pmp. Retirou-se a resina e colocou-se num agitador ("shaker") manual.

Trataram-se 0,86 g da resina peptídica com 1,5 ml de anisolo e agitou-se durante 60 min. a 03 em 15 ml de ácido fluorídrico. 0 ácido fluorídrico foi então removido sob pressão de aspiração a QS,

Lavou-se então o resíduo com 3^25 ml de êter (deitado fo ra) e eluíu-se o péptido com dimetilformamida e 30/ de ácido acé tico (4x10 ml). Ountou-se esta solução a 2 1 de água desgaseifi cada e ajustou-se o pH a 7,0 com hidroxido de amónio. Ountou-se lentamente uma solução (35 ml) de ferricianeto de potássio 0,01M

Ajustou-se então o pH a 4,5 com ácido acético e agitou-se a mistura durante 30 minutos com 25 g (WET) (não secos) de uma resina permutadora· de iães (AG-3x4 1R-45) fracamente básica. Filtrou-se a suspensão e lavou-se a resina com 2x400 ml de ácido acético a 30/,

0 filtrado foi depois passado por uma coluna C^g "flash" (7x16 mm). A coluna foi então lanada com água (3x400 ml) e o péptido eluido com acetonitrilo/água/TFA (50:50:0,25). Ountaram-se as fracçães 30 a 36, concentrou-se e liofilizou-se obtendo-se 25 mg do produto intermédio livre de Cys(0H)-cíclica do tí tulo.

Massa espectral por FAB em glicerol: 327 (M+H) ⁺ , 825

(M-H)".

Fez-se reagir o ácido Cys (20 mg) com um equivalente de Pro-Arg(NH₂)-HCl (preparada a partir do dicloridrato comercial por tratamento com 1 equivalente de trietilamina) na presença de DCC e HBT em dimetilformamida, produzindo o composto do Exemplo

3. De modo semelhante liga-se Pro(OMe) ao ácido Cys, hidroliza-se com hidróxido de sódio fraco obtendo-se o ácido Pro que se faz então reagir com Arg(HCl)-(OMe) para dar o ácido próximo do composto do Exemplo 3 após hidrólise branda do éster. Isola-se este composto, se tal for desejado, sob a forma de sal de potássio. Veja o Exemplo 12 abaixo. Em alternativa usa-se o Pro-Arg (NH2) directamente na condensação.

62 351

CASE: SKB 14142

A mistura de 4,5 mg de Pmp-D-Tyr(Et)~Phe-Val-Asn-Cys-OH preparada como acima e de 1 ml de metanol, foi tratada com diazci metano etéreo e foi purificada por HPLC (50/ó CH^CN/50/ Η^Ο/Ο,ΐ/ TFA) obtendo-se 4,3 mg do éster metílico (94/), FABMS m/z 841 (M+H) ⁺ , homogéneo pela HPLC e TLC,

EXEMPLO 11

Preparação de P4ip-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-C}s-Pro-Arq( NH^) por condensação terminal

Preparou-se a BocPro-(resina Merrifield) ligando a BocPro à resina Merrifield por meio do método do sal de césio obtendo-se Boc-Pro-OCH^-C^H^-resina que foi usada como material de partida para a síntese. Esta foi realizada no sintetizador de pêptidos Beckman 990-B por meio do seguinte protocolo: Dissolvem-se três equivalentes dos amino ácidos nos solventes adequados /”"os derivados Boc de 4MeBzl-Cys, Vai e Phe em cloreto de metileno; Asn em dimetilformamida; X, por exemplo, D-Tyr (Et) ou BrBz-D-Tyr em 1:1 de cloreto de metileno/dimetilformamida; e 4MeBzl-Pmp em cloreto de metileno_y e ligam-se usando uma quantidade equimo lar de diciclohexilcarbodiimida (DCC) e de 1-hidroxibenzotriazolo (HOBT) excepto para a ligação de 4MeBzl Pmp onde se usou 1,0 equivalente de dimetilaminopiridina como catalizador. A extensão da ligação foi determinada por análises qualitativas de nini drina e as ligações (acoplamentos) foram repetidas quando necessário. Removeram-se os grupos Boc usando ácido trifluoroacético/ /cloreto de metileno (lsl) e, apés lavagem, obteve-se a amina li. vre usando 5/ diisopropiletilamina /cloreto de metileno. Verifi cou-se a sequência de pêptidos usando o método da fase sólida ajn tes da ligação do 4MeBzl-Pmp, e confirmou-se a sua homogeneidade. Depois da ligação final, secou-se a resina obtendo-se 2,24 g de péptido-resina no caso do composto D-Tyr(Et) -Pro .

o

Agitou-se 1,1 g (0,5 mmole) da péptido-resina D-Tyr(Et)^z com 3 ml de anisolo, durante 50 min. a 02 (banho de gelo), em 25 ml de ácido fluorídrico (HF). Removeu-se depois o HF sob pressão reduzida a 02, Lavou-se o resíduo com éter etílico (4x20 ml deitar fora) e eluiu-se o péptido com dimetilformamida 3x10 ml, ácido acético a 20/, 3x10 ml, e hidróxido de amónio 0,3N, 3x10 ml.

3untou-se o filtrado a 2 1 de água desgaseificada e ajus tou-se o pH a 7,1 com hidróxido de amónio concentrado. 3untou-se

62 351

CASE: SKB 14142

-27- M

então, gota a gota, uma solução 0,01M de ferricianeto de potássio, sob agitação, atê persistiu uma cor ligeiramente amarela (41 ml). Ajustou-se o pH a 4,7 com ácido acético e guardou-se em refrigeração durante a noite.

Ajustou-se o pH da solução a 7 com amónia e agitou-se d_u rante 15 min. com 30 g de resina permutadora de iães Bio-Rad AG-3x4 (molhada, forma Cl). Filtrou-se então a solução, lentamente, através de 30 g adicionais de resina. Lavou-se a resina com 4x200 ml de ácido acético a 20/ e guardou-se c filtrado em refri geração durante a noite.

Passou-se então o filtrado por uma coluna "flash'’ (5 cmx xlO cm) de uma embalagem de sílica gel revestida com um silano C^g. A coluna foi então lavada com 350 ml de água e o péptido foi eluído com 500 ml de acetonitrilo/água (0,25/ ácido trifluoroacêtico) (l:l) em fracçães de 20 ml.

As fracçães 11-17 foram juntas e concentradas. Dissolveu-se o resíduo em ácido acético conc., diluiu-se com água e 2

liofilizou-se obtendo-se 189 mg da D-Tyr(Et) -prolina-pêptido, que foi usado, sem mais purificação, para a síntese dos péptidos de cauda modificada.

Identificação de:

P /np-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-C) s - P r o (0 H)

Análise de Amino ácidos: Teor de péptidos 55/, Asp, 1,00; Pro, 1,23; Cys, 0,35; Vai, 1,04; Tyr(Et) 1,43; Phe, 1,54.

HPLC: Satisfatória.

P Aip-£-Tyr-Phe-Val-Asn-C^ s-Pro(OH)

Análise de Amino ácidos: Teor de péptidos 82/; Asp 0,97; Pro

1,10; Cys 0,39; Vai 1,05; Tyr 0,99, Phe 0,99

HPLC: satisfatória, 30/ CH^CN/70/ 0,05 m KH^PO^, 2 ml/min.,

5 uC₁₈, K' = 6,14.

Uma mistura de 10 mg de £-Tyr(Et)-Pro(OH)^, preparada como acima, e de 1 ml de metanol, foi tratada com diazometano etéreo e depois purificado por HPLC (50/ CH^CI\l/5O/ Η₂θ/θ,ΐ/ TFA) obtendo-se 7,5 mg do éster metílico (74/), FABMS m/z 938 (M+H⁺), homogéneo pela HPLC e TLC.

2

A uma solução do D-Tyr(Et) -prolina-heptapéptido, preparado como acima se descreveu (29,7 mg, 0,0331 mmol) e Arg (NH₂)

62 351

CASE: SKB 14142

-28(0,0996 mmol) em dimetilformamida (400 JUL-l) juntaram-se diciclohexilcarbodiimida (10,3 mg; 0,05 mmol) e dimetilaminopiridina (0,05 mmol) e agitou-se a mistura reagente a 0-202 durante 4 horas. A dimetilformamida foi enteio removida sob vácuo. 0 resíduo foi tratado como acima no Exemplo 3, com um rendimento de

2 4

45$, obtendo-se a desejada D-Tyr(Et) -Vai -amida.

EXEMPLO 12

Síntese e caracterização de Pihp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Ásn-CÍ<s-Pro-DzAra£NH₂l

A peptidil-resina linear Pmp(S-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(S-MeBzl)-Pro-D-Arg(Tos)-BHA-resina foi preparada pelo método da fase sólida usando o protocolo padrão acima descrito. Assim, 1,5 g de benzidrilamina correspondente a 1,0 mmol de amina foi sucessivamente ligada aos derivados de amino ácidos Boc, em excesso 3X, usando DCC/HOBt em cloreto de metileno/DMF (l:l).

0 Pmp(S-MeBzl) foi acoplado com DCC/DMHP. 0 fim do acoplamento foi verificado pelo ensaio Kaiser ou pelo ensaio quantitativo da ninidrina. Fez-se o reacoplamento quando o ensaio era negativo.

A peptidil-resina protegida foi lavada com porções suces sivas de cloreto de metileno, metanol, acetato de etilo e cloreto de metileno e depois seca ao ar. 0 péptido foi separado da resina por 15 ml de ácido fluorídrico líquido na presença de 1,0 ml de anisolo a 02 durante uma hora. Após evaporação do ácido fluorídrico e secagem sob vácuo elevado, lavou-se a resina com 3x20 ml de éter e extra£u-se com 2x50 ml de ácido acético a 50$, 50 ml de ácido acético a 10$ e 50 ml de água. Os extractos juntos foram diluídos em água até 4 1 e o pH foi ajustado a 7,2 com solução a 50$ de hidróxido de sódio. A solução foi titulada com solução 0,01 M de K^Fe(CN)₆ atê persistir uma cor amarela (30 ml) Ajustou-se o pH a 4,5 com ácido acético glacial e filtrou-se. Apl cou-se o filtrado a uma coluna permutadora de catiães Bio-Rex-70 (forma H⁺), lavou-se com água e eluiu-se com 100 ml de tampão de acetato de piridina (30 ml de piridina, 4 ml de ácido acético,

66 ml de âgua). 0 eluente foi evaporado à secura. Dissolveu-se o resíduo numa pequena quantidade de ácido acético a 10$ e diluiu-se com água até a solução ficar a 1$ de ácido acético e liofilizou-se obtendo-se 650 mg do péptido em bruto, do título.

0 péptido em bruto foi purificado por distribuição em contra-corrente de n-butanol/ácido acêtico/água (B/A/w) (4:1:5)

62 351 Η

CASE: SKB 14142 ’;r-Jj

-29- |

obtendo-se 33 mg do pêptido parcialmente purificado. Este foi de novo purificado por filtração gel sobre coluna Sephadex G-15 em ácido acético a 1% obtendo-se 24,5 mg de pêptido puro. A aná lise de amino ácidos (hidrólise em HCl/TFA 2:1, fenol 0,005% durante 1 hora) deu: Asp 1,00, Pro 0,72, Cys 0,62, Vai 0,99, Tyr 1,04, Phe 1,04, Arg 0,95, 71% de pêptido. HPLC (40% acetonitrilo/60% água/0,1% TFA), um pico, K’=5,2 (45% acetonitrilo/55% água/0,1% TFA) K’=3,6 (gradiente 20% acetonitrilo, 5'; 20-50%

acetonitrilo, 20'; 50% acetonitrilo, 5’) K^r=8,7, 97% puro» Tlc:

rf 0,32 (B/A/W l:l:l); 0,12 (3/A/W 4:1:1); 0,50 (n-butanol/piridina/ácido acêtico/água, 15:10:3:12).

A peptidil-resina extraída ainda continha péptidos pela análise de amino ácidos, de modo que foi extraída com 3x50 ml de DMF, A DMF foi evaporada à secura e o resíduo foi dissolvido em HOAc a 10%, diluído atê ficar a 1% de ácido acético e liofilizado, obtendo-se 250 mg adicionais de pêptido. A espectrometria de massa FAB deste material deu um m/z 1079 que corresponde a M+H para o desejado pêptido cíclico.

EXEMPLO 13

Substituindo uma quantidade estequeomêtrica de Boc-D-Phe por Boc-D-Tyr(Er-Z) na unidade 2 do pêptido sintetizado no Exemplo 1 obtem-se PÍip-D-Phe-Phe-Val-Asn-C^s-Pro-Arg-NH^.

Substituindo Boc-D-Val na mesma posição, usando as reacçães de cisão e oxidação do Exemplo 2, obtérn-se Ptfip-D-Val-Phe-Val-Asn-C}s-Pro-Arg.

Substituindo Boc-D-Leu no Exemplo 1 dá Ρ Aip - D - L êu-Phê^ -Val-Asn-C^s-Pro-Arg-NH^.

Substituindo o ácido fi -mercapto- A. /’ -ciclotetrametilenopropiénico por Pmp no Exemplo 5 dá T/np-D-Tyr(Et)-Phe-Abu-C^s-Pro-Arg(PJH ). 0 ácido /6-mercapto

* ' j.

lenopropiónico dá o derivado Hmp .

Substituindo nc Exemplo 1 Boc-D-Nle na unidade 2 e D-Arg(Tos) na unidade 8 dá Ρ ιϊιρ - D - ΝΪ e-Phe-Val-Asn-C))s-Pro-D-Arg-nh₂.

Substituindo no Exemplo 2 Boc-D-Cha na unidade 2 dá

P iVp-D-Cha-Phe-Val-As n-C^ s-Pro-Arg.

Substituindo no Exemplo 1 o ácido Boc- ¢( -aminofenilbutírico (Pba) na unidade 2 dá Pdip-D-Pba-Phe-Val-Asn-Oys-Pro-Arg-nh₂.

A A -ciclohexameti62 351

CASE: SKB 14142

-30- WigWI

Substituindo Eoc-Lys(Clz) no Exemplo 3 por Arg protegido dâ Plnp-D-Tyr(E t) - Phe-Val-Asn-C^s-Pro-Lys-NH^.

Outros compostos representativos, preparados de modo semelhante, são:

P mp-D-Met-Phe-Val-Asn-C^s-Pro-Arg -ΝΗ'^,

P ínp-D-Tyr(Me)-Phe-Val-Asn-CA s-Pro-D-Lys,

P /np-D-Tyr (E t) -Phe-Val-Asn-Cji s-Pro-Arg-NH^,

P Ínp-D-T yr( i-Pr)-Phe-Val-Asn-C|' s-Pro-Arg,

P Inp-D-alle-Phe-Val-Asn-C s-Pro-Arg, P/np-D-Nva-Phe-Val-Asn-C^s-Pro-Arg-NH^,

P top-D-Abu-Phe-Val-Asn-Cl' s-Pro-Arg-NH^.

EXEMPLO 14

Composições de Dose Unitária Parentérica

Uma preparação que contém 0,5 mg do octapêptido cíclico

dos Exemplos 1 ou 3, como pó seco estéril para injecção parentêrica, prepara-se do seguinte modo: 0,5 mg de péptido-amida ê dis. solvido em 1 ml de uma solução aquosa de 20 mg de manitol. Filtra-se a solução, em condições de esterilidade, para uma ampôla de 2 ml e liofiliza-se. 0 pó é reconstituído antes da injecção, quer intramuscular quer endovenosa, ser aplicada a um paciente que sofra de edema susceptivel a um mecanismo de acção anti-ADH. Repete-se a injecção, se necessário, de 1 a 5 vezes por dia ou numa injecção contínua i.v.. Preparam-se e usam-se de modo seme lhante outros octapéptidos deste invento.

SomposiçÕes de Dose Unitária Nasal

Suspendem-se 30 mg de octapêptido, finamente moído, deste

invento por exemplo o produto do Exemplo 2 numa mistura de 75 mg de álcool benzílico e 1,395 g de um agente de suspensão tal como uma mistura comercial de glicéridos semi-sintéticos de ãcidos gordos de alto peso molecular. Coloca-se a suspensão numa bomba de 10 ml de aerosol que é fechada com uma válvula medidora e cheia com propulsores de aerosol. 0 conteúdo conterá 100 doses unitárias para serem administradas via intranasal a um paciente edematoso, de 1 a 6 vezes por dia.

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Processo de preparação de um composto de fórmula (i)

   /CH₂—CH

   ⁽Ç^H2>n ^CH,_CH,

   ²\'

   c

   /1

   CH,

   CO-X-P-A-Asn-Cys-W-Z-Y

   (Ό

   62 351

   CASE: SKB 14142

   -31na qual

   P ê Phe ou Phe(4’-Alq);

   X ê D-Phe, D-Val, D-Leu, D-Ile, D-Nva, D-Pba, D-alle, D-Nle, D-Cha, D-Abu, D-Met, D-Chg, D-Tyr, L-Tyr, D-Tyr (Et) ou L-Tyr(alq);

   Y ê NH₂, NHAlq, NHBzl ou OH,

   W ê D-Pro, L-Pro, dehidro-Pro ou pode ser OH sempre que Y e Z estão ausentes;

   A ê Vai, Ile, Abu, Ala, Gly, Lys, Cha, Nle, Phe, Leu, chg ou Nva;

   Z ê D-Arg, L-Arg, D-Lys, L-Lys ou pode ser urna ligação simples sempre que Y ê OH;

   n ê 0, 1 ou 2, ou uma prodroga oi^éal derivado farmaceuti camente aceitáveis, que compreendem a ciclização de um composto opcionalmente protegido de fórmula (ll); C^p-X-P-A-Asn-Cys-W-Z-Y

   S-Q

   s-r

   (n)

   na qual

   X, P, A, W, Z e Y são conforme definido acima;

   1 2

   Q e Q são, cada um, hidrogénio ou um grupo substituível, e

   ,1

   Cap é um ácido f -cicloalquileno propiónico com S-Q* ligado na posição β e tendo 5-7 unidades na cadeia cicloalquileno e, se necessário, depois, por qualquer ordem,

   (a) removendo quaisquer grupos de protecção,

   (b) fazendo reagir os citados compostos Cys(OH)^ ou Pro 7

   (OH)', se estiverem presentes, com um dipeptido, W-Z-Y, ou um amino-ácido, Z-Y, respectivamente, quer na forma protegida por ácido quer na forma amida, ou

   (c) formando um sal de prodroga aceitáveis farmaceuticamente.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1 onde Q¹ e

   2

   Q são ambos hidrogénio.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1 em que e

   2

   Q são ambos acetamidometilo.
4. 4 - Processo de acordo com as reivindicações 1-3 que coni preende ciclização oxidativa.
5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 4 que ê condiu zido na presença de iodo.

   62 351

   CASE: SKB 14142

   -32-
6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 4 que é conduzido na presença de uma ferricia
7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 1 na qual um

   composto Cys(OH) de fórmula I reage com W-Ζ-Y na presença

   de uma carbodiimida, opcionalmente seguido pela remoção de quais, quer grupos protectores.
8. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 1 no qual um

   7

   composto Pro(OH) de fórmula I reage ccm (NH^-Z-Y na presença de uma carbodiimida, opcionalmente seguido pela remoção de quais quer grupos protectores.
9. 9 - Processo de acordo com a reivindicação 8 no qual a 7

   Pro(OH) reage com Arg(NH)₂ ou um sal seu derivado.
10. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 1 no qual n é 1, X ê D-Tyr(Et), P é Phe, A é Vai, W é Pro, Z ê Arg e Y é nh₂.
11. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 4 no qual n Ó 1, X ê D-Tyr(Et), Ρ ê Phe ou Phe(4’-Et), A é Vai ou Abu, W é L-Pro ou D-Pro, Z ê Arg e Y ê NH₂·
12. 12 - Processo para preparar um composto de fórmula:

    Cap-X-P-A-Asn-Cys-W-Z-Y

    (11)

    S-H S-H

    na qual:

    P ê Phe ou Phe(4’-Alq);

    X ê D-Phe, D-Val, D-Leu, D-Ile, D-Nva, D-Pba, D-alle, D-I\)le, D-Cha, D-Abu, D-Met, D-Chg, D ou L-Tyr ou D ou L-Tyr(alq);

    Y ê NH₂, NHAlq, NHBzl ou OH;

    W é D-Pro, L-Pro, dehidro-Pro ou, sempre que Y e Z estão ausentes, OH;

    A ê Vai, Ile, Abu, Ala, Gly, Lys, Cha, Nle, Phe, Leu,

    Chg ou Nva;

    Z ê D-Arg, L-Arg, D-Lys, L-Lys ou, sempre que Y ê OH, uma ligação simples; ou um sal derivado farmaceuticamente aceitável, que compreende a desprotecção de um derivado protegido de um composto de fórmula II,
13. 13 - Processo segundo a reivindicação 12 em que o peptido de fórmula II ê também separado de uma resina suporte.
14. 14 - Processo segundo as reivindicaçães 12 ou 13 onde o agente desprotector é o ácido fluorídrico,