NO862406L

NO862406L - Vasopressin-antagonister.

Info

Publication number: NO862406L
Application number: NO862406A
Authority: NO
Inventors: Fadia Elfehail Ali
Original assignee: Smithkline Beckman Corp
Priority date: 1985-06-18
Filing date: 1986-06-17
Publication date: 1986-12-19
Also published as: ES8707740A1; PH22502A; NO862406D0; IL79091A0; PT82777B; EG17738A; ZW11886A1; ZA864242B; DK285886A; EP0206730A3; EP0206730A2; GR861464B; KR870000360A; JPS61293999A; ES556141A0; CN86104835A; AU5838486A; FI862572A; AU595201B2; HUT41051A

Description

Denne oppfinnelse vedrører bestemte nye cykliske oktapeptider som har sterk vasopressin-antagonist aktivitet. Strukturen til disse oktapeptider er særpreget ved at de har en dipeptidhale som består av to basiske aminosyreenheter og som er direkte knyttet til cysteinenheten til en vasopressinlignende ring. M. Manning et al., Nature, 308 652 (1984) og US patent nr. 4.469.679 har beskrevet at den enestående glycinenhet i 9-stillingen til bestemte vasopressinlignende antagonister kan fjernes eller erstattes av L- eller D-Ala, Ser eller Arg uten nødvendigvis å påvirke bindingen ved vasopressin-reseptorene.

US patent nr. 4.481.194 og 4.481.193 beskriver at enten å fjerne prolin ved 7-stillingen eller både prolin og glycin ved 7-og 9-stillingene fra vasopressin-antagonist-strukturene gir forbindelser som beholder i det vesentlige, men en noe redusert antagonistaktivitet.

De vasopressinlignende forbindelser i denne oppfinnelse har strukturer som adskiller seg fra de tidligere kjente ved at to basiske aminosyreenheter såsom arginin eller lysin er knyttet direkte til disulfid-VSP-ringen. Forbindelsene er meget sterke vasopressin-antagonister.

I beskrivelsen her og i kravene brukes den vanlige nomen-klatur på området peptid- og vasopressinkjemi. Når ingen konfigurasjon er angitt, er aminosyreenheten i L eller den naturlig forekommende form. I visse strukturformler er tio-elementene av Cap-, Mpa- og Cys-enhetene tilføyet for klarhetens skyld.

Visse av peptidfagbetegnelsene som brukes her er de føl-gende: Cap, p-merkapto-p,p-cyklo-alkylenpropionsyre; Pmp, p-merkapto-p,p-cyklopentametylenpropionsyre; Mpr , p-merkapto-propionsyre; dPen, p-merkapto-p,p-dimetylpropionsyre eller desaminopenicillamin; Tyr(alk), O-alkyltyrosin; Abu, a-amino-n-smørsyre; Chg, cykloheksylglycin; Cha, cykloheksylalanin; Pba, a-aminofenylsmørsyre; Gin, glutaminsyreamid eller glutamin; Gly, glycin; Tyr, tyrosin; Phe, fenylalanin; Phe(4'-Alk), 4'-alkyl-fenylalanin; MeAla, N-metylalanin; Val, valin; Ile, isoleucin; Nie, norleucin; Leu, leucin; Ala, alanin; Lys, lysin; Arg, arginin; HArg, homoarginin; MeArg, N-metylarginin; MeHArg, N- metylhomoarginin; MeLys, N-metyllysin; Met, metionin; Asn, aspargin; Sar, sarcosin; Tos, tosylat; BHA, benzhydrylamin; DMAP, 4-dimetylaminopyridin; DIEA, diisopropyletylamin; HF, hydrogen-fluor; 4-MeBzl, 4-metylbenzyl; TFA, trifluoreddiksyre; DCC, dicykloheksylkarbodiimid; Boe, t-butyloksykarbonyl; Z, benzyl-oksykarbonyl; VSP, vasopressin; HBT, hydroksybenzotriazol; ACM, acetamidometyl; Mpa, ikke-cykliske (3-merkaptopropionsyrer. I definisjonene såsom MeArg ovenfor angir Me en metyl som befinner seg på amidonitrogenet i den foreliggende peptidenhet.

"Alk" representerer en lavere alkyl med 1-4 karbonatomer. For eksempel kan disse eventuelt være festet til oksygensub-stituenten til en tyrosinenhet i 2-stilling, til halens N-terminale nitrogen eller til 4'-stillingen av en Phe-enhet i 3-stilling. Slike alkylsubstituenter er metyl, etyl, n-propyl, isopropyl eller butyl. Etyl er foretrukket. Når uttrykket "vasopressin" brukes, betyr det L-arginin vasopressin (AVP) med mindre annet er modifisert. Når 1-((J-merkaptocykloalkylen) - propionsyreenheten (Cap) i 1-stilling kalles her ofte for letthets skyld Pmp da den pentametylenholdige enhet foretrekkes. Alle p-merkaptopropionsyrene kan her stundom kalles Mpr.

De basiske vasopressin-antagonist forbindelser i denne oppfinnelse er illustrert ved den følgende strukturformel:

hvor:

P er en D- eller L-isomer av Arg, Lys, HArg, MeArg, MeLys eller MeHArg;

A er en D- eller L-isomer av Arg, Lys, HArg, MeArg, MeLys eller MeHArg;

B er OH, NH2eller NHAlk;

Z er Phe, Phe(4'-Alk), Tyr(Alk), Ile eller Tyr;

X er en D- eller L-isomer av Phe, Phe(4'-Alk), Val, Nva, Leu, Ile, Pba, Nie, Cha, Abu, Met, Chg, Tyr eller Tyr(Alk);

Y er Val, Ile, Abu, Ala, Chg, Gin, Lys, Cha, Nie, Thr, Phe, Leu eller Gly; og

Ri og R.2er begge hydrogen, metyl eller sett sammen en cykloalkylenring med 4-6 elementer sammen med p-karbonatomet de er knyttet til.

En undergruppe av forbindelser i denne oppfinnelse omfatter forbindelser med formel I hvori P er Arg, A er Arg og B er NH2. I formel I er Ri og R2fortrinnsvis cyklopentametylen.

I denne oppfinnelse inngår også syreaddisjonssalter, komplekser eller forstadier av legemidler såsom estere av forbindelsene i foreliggende oppfinnelse når B er OH, spesielt ikke-toksiske, farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter. Syreaddisjonssaltene fremstilles på standard måte i et hensikts-messig løsningsmiddel fra utgangsforbindelsen og et overskudd av en syre såsom saltsyre, hydrogenbromid, svovelsyre, fosforsyre, eddiksyre, maleinsyre, ravsyre, etandisulfonsyre eller metan-sulfonsyre. Sluttproduktene med formel I har to sterkt basiske grupper i sine oppbygninger, og derfor er deres syreaddisjons-saltderivater lette å fremstille. Esterderivatene av syreformen av sluttproduktene såsom metyl, etyl eller benzyl esterene fremstilles på kjent måte.

Sluttproduktene (I) i denne oppfinnelse fremstilles ved oksydasjon av det følgende lineære heptapeptid:

hvori X, Z, Y, P, A, B, Ri og R2er som definert for formel I ovenfor. Merkaptogruppene er elementer av enhetene i 1- og 6-stilling. Hver Q er hydrogen eller en avspaltbar beskyttelsesgruppe såsom acetamidometyl (ACM). Ditiolen med formel II kan også oksyderes i form av en ester eller et amidderivat av enheten i 8-stilling. F.eks. kan amidet være slike peptider med formel II hvori B er -NHAlk eller -NH2. Esterene vil ha B som OAlk eller OBzl.

Oksydasjonen utføres ved å bruke et overskudd av et alkali-metallferricyanid såsom kalium- eller natriumferricyanid med det lineære mellomprodukt II. Et egnet ikke-reaktivt løsningsmiddel, fortrinnsvis et vannblandbart løsningsmiddel med nøytralt pH, ca. 7-7,5 brukes. Omsetningen utføres ved omgivelsestemperatur eller lavere inntil reaksjonen i det vesentlige er fullstendig. Fortrinnsvis er konsentrasjonene av det lineære peptid dimerkaptan og oksydasjonsmidlet lave, f.eks. 0,01-0,1 molar konsentrasjon av oksydasjonsmiddel i flere liter vandig løsning for å cyklisere 1-5 g dimerkaptan.

Andre milde oksydasjonsmidler med et oksydasjonspotensiale som er omtrent ekvivalent med ferricyanid kan også brukes til ringlukningsreaksjonen. Oksygenpassasje gjennom reaksjons-løsningen i flere dager, jod i metanol, hydrogenperoksyd eller oksydasjon i nærvær av kobber(II)salter er slike alternativer. Cyklisering forekommer også når en avspaltbar tiolbeskyttende gruppe såsom merkaptangruppen i Pmp-enheten fortrenges intra-molekylært.

En spesielt anvendelig tiobeskyttende gruppe er acetamidometyl (ACM). Jod/alkohol brukes for direkte en-sats cyklisering av det bis-ACM-S-lineære peptid.

Selvfølgelig vil en fagmann se at bestemte cykliserings-metoder ikke er egnet hvis et bireaksjonspunkt foreligger i oppbygningen av utgangsmaterialet med formel II. Det lineære merkaptanutgangsmaterialet kan ha felles beskyttende grupper som temporært foreligger i de forskjellige lineære enheter.

Peptidkjeden til de lineære peptider oppbygges normalt trinnvis ved å starte fra A-enheten og arbeide seg opp mot Mpa-eller Pmp-enheten. Hver enhet beskyttes tilsvarende som kjent innenfor peptidområdet og som beskrevet nedenunder. Rekkefølgen av trinnreaksjonene utføres greit i en Beckman 990B peptid-syntetisator eller en ekvivalent derav uten isolering av hvert peptidmellomprodukt. Detaljene av fremgangsmåten er angitt i utførelseseksemplene senere.

De forskjellige aminosyrer (AA) som i rekkefølge settes til den harpiks-bårede kjede beskyttes på kjent måte. For eksempel brukes Boc-beskyttelsesgruppen for en aminogruppe, spesielt i a-stillingen; en eventuelt substituert benzyl for merkaptogruppene i Pmp-, Mpa- eller Cys-enhetene; tosyl for Arg-, HArg- eller MeArg-enheten; og en eventuelt substituert karbobenzyloksy (Z) for Tyr- eller Lys-enhetene. Beskyttelsesgruppene er helst slike som ikke er lette å fjerne ved bruk av mild syrebehandling såsom for fjerning av Boc-gruppen. I stedet bør man bruke HF, natrium/flytende ammoniakk eller, for benzyl- eller karbobenzyl-oksygrupper, katalytisk hydrogenering.

Det harpiks-bårede peptid behandles med et overskudd av vannfritt hydrogenfluorid med en tilsvarende rensemiddelfor-bindelse såsom anisol og gir det lineære peptidmellomprodukt med formel II i godt utbytte.

Forbindelsen med formel I fremstilles også ved å omsette Arg-syren med en beskyttet form av A (som syren eller amidet) i hvilken som helst standard peptidsyntesemetode. Utgangsmaterialet 7-argininsyrer, såsom de med formel I hvori P er en argininlignende enhet som definert ovenfor og A er hydroksy, fremstilles som beskrevet ovenfor ved en harpiks-båret- eller løsningsreaksjonsrekkefølge.

Sluttforbindelsene i oppfinnelsen har Vi og/eller V2vasopressin-antagonist aktivitet. Vasopressin er kjent å bidra til den anti-diuretiske virkningsmekanisme i nyret. Når virkningen av disse forbindelser antagoniserer det naturlige anti-diuretiske hormonet (ADH), utskiller legemet vann på grunn av enøket gjennomtrengelighet av sluttpartiene til det renale rør. Virkningsmekanismen er ved vasopressin-reseptorene (V2-reseptorene) som befinner seg på plasmamembranen til bestemte renale epiteliale celler. Den mest bemerkelsesverdige farmakodynamiske virkningen til ADH antagonistene i oppfinnelsen er som vann-diuretikum istedet for natriuretikum såsom hydroklorotiazid.

Alle pasienter som lider av syndromet utilstrekkelig anti-diuretisk hormonutskillelse (SIADH) eller en uønsket ødemtilstand er et mål for de krevede forbindelser. Eksempler på kliniske indikasjonsbetingelser for forbindelsene i denne oppfinnelse er hypertensjon, hepatisk cirrose, hyponatremi, kongestiv hjerte-svikt eller en del av enhver traumatisk tilstand som stammer fra alvorlig skade eller sykdom. Forbindelser med formel I hvori Ri og R2danner en 5- eller 6-leddet ring er spesielt sterke V2-antagonister.

Den andre gruppe vasopressin-reseptorpunkter er de vaskulære pressorpunkter (Vi-reseptorer) i selve det kardiovaskulære system. Disse kan også antagoniseres av forbindelsene i denne oppfinnelse. Forbindelsene med formel I hvori Ri og R2er hydrogen eller metyl er sterke Vi-antagonister. Disse forbindelser har også betydelig anti-oksytocisk aktivitet.

Forbindelsene i denne oppfinnelse brukes derfor spesielt til å indusere anti-hypertensiv, anti-oksytociske eller diuretisk aktivitet hos pasienter som trenger slik behandling. Sistnevnte omfatter administrering innvendig, parenteralt, kinn eller ved innblåsing av en ikke-toksisk, men virksom mengde av den valgte forbindelse, fortrinnsvis dispergert i en farmasøytisk bærer. Doseenheter av den aktive bestanddel velges fra området 0,01 til 10 mg/kg, fortrinnsvis 0,1 til 1 mg/kg base i forhold til en 70 kg pasient. Doseringsenhetene gis mennesket eller dyret fra 1 til 5 ganger daglig.

Den farmasøytiske blanding som inneholder en aktiv antago-nistbestanddel med formel I omfatter en doseringsenhet som er oppløst eller oppslemmet i en standard flytende bærer såsom isotonisk saltvann, og befinner seg i en ampulle eller et flerdosers glass som er egnet for parenteral injeksjon såsom for intravenøst, subkutan eller intramuskulær administrering. En blanding for innblåsning kan være lignende, men gis normalt i en utmålt dose applikator eller inhalator. Pulveriserte pulver-blandinger kan også brukes sammen med oljeaktige preparater, geler, buffere for isotoniske preparater, kinnpastiller, trans-dermale flekker og emulsjoner eller aerosoler.

V2-antagonistisk aktivitet mot det naturlige anti-diuretiske hormon (anti-ADH aktivitet) bestemmes in vitro i marghulevevet til svin- eller menneskenyrer og in vivo i hydropenisk rotte. In vitro målemetoder for vasopressin stimulert adenylat cyklase aktivering eller vasopressin bindingsaktivitet er beskrevet av F. Stassen et al., J. Pharmacology and Experimental Therapeutics, 223, 50-54 (1982). Vi-antagonistisk aktivitet bestemmes ved fremgangsmåter som anvender rotte toraks aortavev og plasma-membraner fra rottelever. Disse fremgangsmåter er beskrevet i den nevnte Stassen publikasjon og i en publikasjon i den Iste International Conference on Diuretics, Miami, Florida, mars

(1984). Oksytocin antagonisme måles som beskrevet av W. Sawyer et al., Endocrinology, 106 81 (1979).

Målingen av anti-ADH aktivitet in vivo er den hydropeniske rotteforskrift som er beskrevet nedenunder:

Hydropenisk rotteundersøkelse

Mat og vann fjernes fra hannrotter ca. 18 timer før prøvin-gen. Dyrene er 4 pr. metabolisme bur. Ved 0 tidspunktet gis forbindelsen intraperitonialt til prøvegruppen, og et tilsvarende volum bærer gis til begge kontrollgrupper (fastede og ikke-fastede). Urinvolum og osmolalitet måles hver time i 4 timer. Forsøksverdiene registreres som ml utskilt urin (kumultativ), mEg/rotte utskilt elektrolytt, mg/rotte utskilt urea og osmolalitet i milli-Osmol/kg H2O. En toleranseprøve brukes til å bestemme signifikansen. ED300defineres som den dose forbindelse (pg/kg) som kreves for å senke urin osmolalitet til 300 m-osmol/kg.

Forbindelsene i tabell 1 er en rekke forbindelser som har de samme ringelementer. Det sammenlignes mellom en type i denne oppfinnelse (A) og tre tidligere rapporterte forbindelser (B, C og D). Disse data viser at forbindelsen A er den sterkeste vasopressin-antagonist som hittil er kjent i desPro-seriene av VSP-lignende forbindelser. I in vivo rotten er forbindelse A 8 ganger mer aktiv enn forbindelse B og 3 ganger mer aktiv enn forbindelse D. "n" er antall forsøk.

De følgende eksempler har til hensikt å demonstrere frem-stillingen og anvendelsen av forbindelsene i denne oppfinnelse. Alle temperaturer er i grader Celsius.

Eksempel 1

Den beskyttede peptid mellomprodukt harpiks, Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-BHA ble syntetisert ved fastfasemetoder på benzhydrilaminharpiks (BHA). På en rister ble 1,0 mmol av BHA-harpiksen brukt. Alle aminosyrer ble beskyttet som tert.-butyloksykarbonyl (Boe) på nitrogenet, og deretter i rekkefølge koblet ved bruk av DCC/HBT. Pmp(4-MeBzl) ble koblet ved bruk av DMAP. Peptidet ble spaltet fra harpiksen ved avspaltning av de sidekjedebeskyttende grupper ved bruk av vannfritt HF (30 ml) i nærvær av anisol (3,0 ml) ved 0°C i 60 minutter. Etter inndamping til tørrhet i vakuum ble resten vasket med vannfri eter. Det rå peptidet ble ekstrahert med dimetylformamid (100 ml) og 40% eddiksyre (100 ml) i 3,5 liter vann som forut var justert til pH 4,5. Den vandige fortynnede disulfhydryl oktapeptidblanding ble cyklisert oksydativt med 75 ml 0,01 M kaliumferricyanid ved pH 7,2. Løsnings pH ble justert til 4,5 ved bruk av iseddik. Den ble ført gjennom en svakt sur, akrylharpiks (Bio-Rex 70) kolonne. Kolonnen ble eluert med pyridin-acetat buffer (30:4:66, pyridin/iseddik/vann-volumforhold). Pyridinacetatet ble fjernet ved destillasjon i vakuum. Resten ble frysetørket fra fortynnet eddiksyre og ga 284,19 mg delvis renset råpeptid.

Rensing

1) Motstrømsfordeling (CCD):

Prøve: 284,19 mg, n-butanol/eddiksyre/vann (n-BuOH/HOAc/H2O) 4:1:5; 240 overføringer (a) fr.116-144, 112,48 mg (b) fr.112-115 & 145-166, 34,42 mg.

2) Gelfiltrering:

Sephadex G-15, 0,2 M HOAc, brukte 112,48 mg fra (la) for å gi (2a), 19,28 mg; (2b) 50,08 mg og (2c) 7,99 mg.

Prøve 2a, renhet 96%, ble oversent for prøving.

Fysikalske data:

Molekylær formel: Cs 2H79 NigOi 0S2 , Molvekt 1137,543 FAB: (M+H)<+>1138; (M-H) 1136

AAA: Asp (1,00), Cys (0,51), Val (1,07), Tyr (0,78),

Phe (0,95), Arg (2,17).

Peptidinnhold: 93,2%

Kromatografiske data:

1. Tynnsjiktkromatografi (TLC)

a) n-butanol/eddiksyre/vann/etylacetat (B/A/W/E)

(1:1:1:1:), Rf 0,6

2. Høytrykksvæskekromatografi (HPLC), Altex ultrasfære ODS kolonne, 5 u, 4,5 mm x 25 cm

a 0,1% TFA/b CH3 CN

a) Gradient 75 a : 25 b til 45:55

k' = 11,46

b) Isokratisk 60 a/40 b

k' = 4,85

EKSEMPEL 2

Den beskyttede peptidmellomproduktharpiks, Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-D-Arg(Tos)-Arg(Tos)-BHA ble syntetisert på 1,0 mmol benzhydrylaminharpiks som i eksempel 1. HF-spaltningen ble utført og oksydasjon med 0,01 M kaliumferricyanid ble foretatt som i eksempel og ga 371,09 mg (35,2%) delvis renset peptid.

Rensing:

1) Motstrømsfordeling:

Prøve: 371 mg, n-Buoh/HOAc/H2O, 4:1:5, v/v 240 overføringer, 2) 105,59 mg fra (la) ble gjenoppløst i 1% eddiksyre og filtrert gjennom et milliporefilter (0,45 p). Filtratet ble frysetørket og ga 51,06 mg.

3) HPLC repreparering

25 mg prøve fra (2), Altex ODS, 10 mm x 25 cm, 5 m strøm-ningshastighet 5 ml/min, 0,1% trifluoreddiksyre (TFA): Acetonitril (CH3CN) (60:40), isokratisk, 229 nm (2,0 AUFS), som ga 15,37 mg prøve, 96-97% ren.

Fysika lske data:

Molekylformel: C52H?9 NisOioS2 Molekylvekt: 1137,543

FAB: (M+H)<+>1138, (M-H)~1136

AAA: Asp (1,00), Cys (0,5), Val (1,05), Tyr(0,44), Phe (1,10),

Arg (1,94) .

Peptidinnhold: 59,91 (Nz analyse)

Kromatografi data:

1. TLC

a) B/A/W/E (1:1:1:1 v/v) Rf 0,525

B/A/W/P/(15.3:3:10) Rf 0,438

2. HPLC, Altex ultrakule ODS kolonne, 5u, 0,45 mm x 25 cm.

a 0,1% TFA/b CH3 CN

a Gradient 80:20 til 50:50 K' = 10,16

b Isokratisk 55:45 K' = 3,0

Isokratisk 60:40 K' = 5,67

EKSEMPEL 3

Den beskyttede peptidmellomproduktharpiks, Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-D-Arg(Tos)-D-Arg(Tos)-BHA ble syntetisert på 1,0 mmol benzhydrylaminharpiks som i eksempel 1. HF-spaltningen og oksydasjon med 0,01 M kaliumferricyanat ble utført på lignende måte og > 1,0 g oljeaktig materiale.

Rensing:

1) Motstrømsfordeling:

Oljeprøven (rå fra Bio-Rex-70 kolonnen),

BuOH/HOAc/H2O, 4:1:5; 240 overføringer.

(a) fr. 114-154 858 mg (b) fr. 155-200 60 mg 2) Gelfiltrering, Sephadex G-15, 0,2 M HOAc, prøve 123 mg fra la som ga (2a) 74,40 mg, 2b 12,75 mg, 2c^0,61 mg.

3) HPLC repreparering

50 mg prøve fra 2b, Altex ODS, 10 mm x 25 cm 5p, strømnings-hastighet 5,0 ml/min, 0,1% TFA/CHsCN (60:40) isokratisk 229 nm (2,0 AUFS), som gir 11,56 mg (6,5 mg 98%, 5,06 mg

<98% ren).

Fysikalske data:

Molekylformel: Cs 2H?9 Ni 3 Oi 0S2 Molekylvekt: 1137,543

FAB: (M+H)<+>1138

AAA: Asp (1,00), Cys (0,49), Val (1,01), Tyr (0,30),

Phe (1,04) , Arg (1,76) .

Peptidinnhold: 63,4%

Kromatografiske data:

1. TLC

a) B/A/W/E (1:1:1:1) Rf 0,46

b) B/A/W/E (15:3:3:10) Rf 0,393

1. HPLC, a 0,1% TFA; b CH3CH

a Gradient 80:20 til 50:50 k' = 7,83

b Isokratisk 55:45 k' = 2,63

EKSEMPEL 4

Den beskyttede peptid mellomproduktharpiks, Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-D-Arg(Tos)-BHA ble syntetisert på 1,0 mmol benzhydrylaminharpiks som i eksempel 1. HF-spaltningen og oksydasjon med 0,01 M kaliumferricyanid ble utført som i eksempel 1 og ga 252,46 mg peptid.

Rensing:

1) Motstrømsfordeling:

Prøven, 252,46 mg (rå), BuOH/HOAc/H2O, 4:1:5; 240 over-føringer , (a) fr. 82-102 111,47 mg (b) fr. 76-81 & 103-152 65-87 mg

2) Gelfiltrering:

Sephadex G-15, 0,2 M HOAc, 114,47 mg prøve fra la som ga

(2a): 39,85 mg, (2b): 29,83 mg

Fraksjon (2a) var 98% ren etter prøve på biologisk aktivitet.

Fysikalske data:

Molekylf ormel: C52H79N13O10S2Molekylvekt: 1137,543.

FAB: (M+H)<+>1138, -(M-H)- 1136.

AAA: Asp (1,00), Cys (0,56), Val (0,90), Tyr (0,55), Phe (0,93),

Arg (1,87) .

Peptidinnhold: 80,4%; 85,16% (N2analyse).

Kromatografi data:

1. TLC

a B/A/W/E (1:1:1:1), Rf 0,57

b B/A/W/P (15:3:3:10), Rf 0,39

2. HPLC

a 0,1% TFA/b CH3 CN

1. Gradient 80 a : 20 b til 50:50 k' = 9,59

2. Isokratisks 55 a : 45 b k' = 3,05

EKSEMPEL 5

Det beskytte peptidmellomprodukt som ble brukt, Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OCH2CeH4-harpiks ble syntetisert på 1,0 mmol Boc-Arg(Tos)-O-Bzl-harpiks (kjøpt fra Peninsula Laboratories). HF-spaltningen og oksydasjonen av 0,01 M ferricyanid ble utført som beskrevet forut. Den fortynnede løsning ble renset gjennom en reversfase kiselgel C-18 kolonne, og peptidet ble eluert med 50% vandig CH3CN inneholdende 0,1% TFA som ga 549,62 mg (46,7%) peptid.

Rensing:

1) Fordelingskolonnekromatografi G-25 sephadex.

Prøve 120 mg, nBuOH/HOAc/H2O, 4:1:5; v/v.

a 56,0 mg

b 20,68 mg

2) HPLC

25 mg fra 2 a, Altex ODS, 10 mm x 25 cm, 5p, strømnings-hastighet 5,00 ml/min, 0,1% TFA: CH3CN (58:42) isokratisk 22,9 nm (2,0 AUFS) som gir 10,65 (6,16, 96,5%, 4,49 mg

<96%) .

Fysikalske data:

Molekylformel: C52H7a Ni4Oi 1S2 Molekylvekt: 1138,527

FAB: (M+H)<+>1139; (M-H)"1137

AAA: Asp (1,07); Cys (0,53); Val (0,97); Tyr (0,3); Phe (0,92);

Arg (1,71)

Peptidinnhold: 79,8%.

Kromatografiske data:

1. TLC

a B/A/W/E (1:1:1:1), Rf 0,53

b B/A/W/P (15:3:3:10), Rf 0,25

2. HPLC

a 0,1% TFA/b CH3 CN

1. Gradient 80 a : 20 b til 50:50 K' = 8,0

2. Isokratisk 58 a : 42 b K' = 4,27

EKSEMPEL 6

Den beskyttede peptid mellomproduktharpiks, Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Lys(Clz)-Arg(Tos)-BHA ble syntetisert på 1,0 mmol benzhydrylaminharpiks som ovenfor. HF-spaltningen og oksydasjonen med 0,01 M ferricyanid ble utført som beskrevet ovenfor og ga 710,17 mg delvis renset peptid.

Rensing:

1) CCD, prøve 710,17 mg; (B/A/W, 4:1:5 v/v), 240 overføringer

2) Gelfiltrering,

Sephadex G-15, 0,2 M HOAc, prøve 100 mg fra 1 a

2a) 70,21 mg

2b) 22,98 mg

Fraksjon 2a var 98-99% ren.

Fysikalske data:

Molekylformel: Cs 2H79 Ni 3 Oi 0S2 Molekylvekt: 1109,53 FAB: (M+H)<+>1110, (M-H)"1108

Kromatografiske data:

1. TLC a) B/A/W/E, 1:1:1:1 v/v, Rf 0,5

b) B/A/W/P, 15:3:3:10 v/v, Rf 0,19

c) B/A/W, 4:1:5 øvre v/v, Rf 0,27

2. HPLC

1. Gradient 80:20 til 50:50 0,1% TFA/CH3CN k' = 11,32 2. Isokratisk 60:40 0,1% TFA/CH3CN, k' = 6,6

EKSEMPEL 7

Den beskyttede peptid mellomproduktharpiks, Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Lys(Clz)-BHA, ble syntetisert på 1,0 mmol benzhydrylaminharpiks. HF-spaltningen og oksydasjonen med 0,01 M ferricyanid ble utført lignende og ga 702,5 mg.

Rensing:

1) CCD, prøve 702,5 mg (B/A/W, 4:1:5 v/v), 240 overføringer

a) 101-144, 468,82 mg b) 96-100 + 145-160, 36,19 mg c) 55-95, 55,19 mg

2) Gelfiltrering:

Sephadex G-15. 0,2 M HOAc, prøve 100 mg fra 1 a

2a) 67,27 mg

2b) 30,2 mg

2a var 96-97% ren.

Kromatografiske data:

1. TLC

a B/A/W/E, 1:1:1:1 v/v, Rf 0,54

b B/W/A/P, 15:3:3:10 v/v, Rf 0,42

2. HPLC

1. Gradient 80:20 til 50:50 0,1% TFA/CH3CN, k' = 12,11 2. Isokratisk 55:45 0,1% TFA/CH3 CN, k' = 3,69 EKSEMPEL 8

En blanding av 0,1 mmol av det sure endepeptidet fremstilt som i eksempel 5 og 0,01 mmol n-propylamin i 20 ml dimetylformamid omsettes med 23 mg (0,11 mmol) DCC og 14 mg (0,11 mmol) HBT ved romtemperatur i 4 timer. De flyktige bestanddeler fordampes og gir en produktrest som renses som beskrevet ovenfor.

EKSEMPEL 9

Fremstilling ved bruk av fragmenteringskobling

A. Fremstilling av

Den beskyttede peptid mellomproduktharpiks, dvs. Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-OCH2-C6 H4-harpiks ble syntetisert manuelt på en ryster. Boc-Arg(Tos)-OCH2C6H4-harpiks erholdtes fra en produsent ved substitusjon av 0,35 meq./g. Det beskyttede peptidharpiksmellomprodukt ble syntetisert trinnvis ved å avspalte Boc-gruppen ved bruk av 1:1 TFA:CH2Cl2og kobling med de følgende aminosyrer ved bruk av DCC/HBT for å aktivere og katalysere kobling på 1,0 mmol som ga 3,15 g Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)- 0CH2-CeH4-harpiks. Tittelpeptidet erholdtes ved spaltning fra harpiksen, og avbeskyttelse av sidekjedebeskyttelsesgruppen ved bruk av HF 30 ml i nærvær av 3,0 ml anisol ved 0°C i 60 minutter. Etter fordampning i vakuum til tørrhet ble resten fra dette vasket med vannfri dietyleter. Peptidet ble ekstrahert med avgasset dimetylformamid, IN ammoniumhydroksyd, deretter 40% eddiksyre i 3,5 1 vann befridd for luft. Det vandige fortynnede disulfhydryl heksapeptid ble oksydativt cyklisert ved bruk av 60 ml 0,01 M kaliumferricyanid ved pH 7,2 inntil farve vedvarte i 30 minutter. Etter oksydasjonsreaksjonen var ferdig, ble pH justert til 4,5 ved bruk av iseddik. Denne løsning ble filtrert, og filtratet gjennomgikk en C-18 kiselgel kromatografiprosedyre. Peptidet ble eluert med 1:1 0,1% TFA/CHsCN og ga 245 mg (25%) av mellomproduktpeptidet i tre fraksjoner, ca. 90% rene.

Rensing:

22,0 mg av en prøve av den reneste fraksjon ble underkastet HPLC ved bruk av Altex ODS, 10 mm x 25 cm, 5p, strømnings-hastighet 5 ml/mn, 0,1% TFA/CH3CN (60:40) isokratisk, 220 nm (0,5 AVIS), 10,10 mg.

Fysika lske data:

Molekylformel: CoeHeeNi 0 Oi 0S2 Molekylvekt: 982,5

FAB: (M+H)<+>983 og (M-H)"981

AAA: Asp (1,00), Cys (0,27), Val (0,95), Tyr (0,50), Phe (0,99),

Arg (1,07)

Peptidinnhold: 74,93%

Kromatografiske data:

1. TLC

a B/A/W/E (1:1:1:1), Rf = 0,6

b B/A/W (4:1:5 øvre), Rf = 0,3

2. HPLC

a) Gradient k' = 14,6

b) Isokratisk k' = 5,97

B. Fremstilling av

4.87 g (15 mmol) BocCys(4MeBzl) ble oppløst i 30 ml etanol og 10 ml vann ble tilsatt. pH ble så justert til 7,1 med en vandig løsning av cesium bikarbonat.

Blandingen ble konsentrert og resten fordampet tre ganger fra 50 ml toluen. Denne rest ble så plassert under høyvakuum ved omgivelsestemperatur natten over.

Saltet ble oppløst i 35 ml dimetylformamid og 5 g kommer-sielt klormetylfenylharpiks ble tilsatt. Blandingen ble rørt ved 53°C under argon natten over.

Blandingen ble filtrert og harpiksen vasket med dimetylformamid (5x60 ml), DMF/vann, 9:1, (5x60 ml), DMF (5x60 ml) og etanol (6x60 ml). Den ble deretter tørket under høyvakuum ved omgivelsestemperatur over ukeslutt.

Peptidkjeden ble oppbygget på en 0,5 mmol Boc-Cys(4-MeBzl)-harpiks i en Beckman syntetisator som beskrevet ovenfor ved bruk av Boc-derivatene av Asn, Val, Phe, D-Tyr(Et) og S-(4-MeBzl) Pmp-derivatet. Harpiksen ble fjernet, vasket og tørket i vakuum.

0,86 g av peptidharpiksen ble behandlet med 1,5 ml anisol og rørt i 60 minutter ved 0°C i 15 ml hydrogenfluorid. Hydrogen-fluoridet ble så fjernet under aspiratortrykk ved 0°C.

Resten ble deretter vasket med 3x25 ml eter (kastet) og peptidet eluert med dimetylformamid og 30% eddiksyre (4x10 ml). Denne løsningen ble satt til 2 1 avgasset vann og pH-justert til 7,0 med ammoniumhydroksyd. En 0,01 M kaliumferricyanidløsning ble langsomt tilsatt (35 ml).

pH ble deretter justert til 4,5 med eddiksyre og blandingen rørt i 30 minutter med 25 g (våt) svak basisk ionebytteharpiks (ag-3x4 IR-4S). Suspensjonen ble filtrert og harpiksen vasket med 2x400 ml 30% eddiksyre.

Filtratet ble så ført gjennom en Cia kolonne (7x16 mm). Kolonnen ble så vasket med vann (3x400 ml) og peptidet eluert med acetonitril/vann/TFA, 50:50:0,25. Fraksjonene 30-36 ble slått sammen, konsentrert og frysetørket og ga 80 mg av det fri Cys(OH) cykliske tittelmellomprodukt.

FAB masse spektrum i glycerol: 827 (M+H)<+>, 825 (M-H)~.

C. Kondensasjon

6-Cys-syren (20 mg) fra B ovenfor omsettes med en ekvivalent Arg-Arg(NH2)•3HC1 i nærvær av DCC, HBT og en ekvivalent trietyl-amin i dimetylformamid og gir forbindelsen fra eksempel 1. På lignende måte omsettes 7-Arg-syren fra A med Arg(2HCl)(OMe) og gir stamsyren av forbindelsen i eksempel 5 etter mild hydrolyse av esteren. Denne forbindelsen isoleres om ønsket som kalium-saltet. En ekvivalent Arg(NH2)2HCl kobles med 7-Arg-syren fra A ved bruk av DCC/HBT og gir det ønskede produkt.

EKSEMPEL 10

Den beskyttede peptid mellomproduktharpiks, Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-N-MeArg(Tos)-Arg(Tos)-BHA ble fremstilt ved fastfasemetoden på benzhydrylaminharpiks. På en ryster ble 0,5 mmol BHA-harpiks brukt, alle aminosyrer ble beskyttet som tert.-butyloksykarbonyl på nitrogenet og koblet i rekkefølge ved bruk av DCC/HBT. B0C-N-CH3Arg(Tos) ble fremstilt. Pmp(4-MeBzl) ble koblet ved bruk av DMAP. Peptidet ble spaltet fra harpiksen ved avbeskyttelse av sidekjedebeskyttelses-gruppene ved bruk av vannfritt HF (20 ml) og anisol (2 ml) ved 0°C i 60 minutter. Etter fordampning til tørrhet i vakuum ble resten vasket med vannfri dietyleter. Det rå peptidet ble ekstrahert med avgasset 50% eddiksyre (100 ml) og avgasset DMF (60 ml) i 2 1 avgasset vann ved pH 4,5. Det vandige fortynnede disulfhydryloktapeptid ble oksydativt cyklisert med 50- ml 0,01 M ferricyanid ved pH 7,2. Løsningens pH ble justert til 4,5 ved bruk av iseddik. Den ble renset over en svakt sur ionebytter-kolonne (Bio-Rex 70) og ga 375 mg av det delvis rensede peptid.

Rensing:

CCD, 375 mg i B/A/W, 4:1:5 v/v, 240 overføringer som gir;

Prøve a 97-98% ren ble undersøkt biologisk.

Kromatografiske data:

1. TLC

a B/A/W/E, 1:1:1:1, v/v Rf = 0,68

b B/A/W, 4:1:5, v/v øvre Rf = 0,39

2. HPLC

a Gradient 80:20 til 50:50 0,1% TFA/CH3CN k' = 11,93

b Isokratisk 55:45 0,1% TFA/CH3CN K' = 4,29.

EKSEMPEL 11

Ved å erstatte Boc-D-Tyr(Et) med en støkiometrisk mengde Boc-L-Tyr(Et) ved 2-enhetene i peptidsyntesen i eksempel 1 får man cyklisert Pmp-L-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Arg-Arg(NH2).

Ved å erstatte Boc-D-Tyr(Et) i eksempel 1 med Boc-D-Ile ved 2-enheten får man Pmp-D-Ile-Phe-Val-Asn-Cys-Arg-Arg(NH2).

Ved å anvende Boc-L-Phe(4-Me) i stedet for aminosyren ved 3-enheten og Boc-Nle ved 4-enheten i syntetisatorsekvensreaksjonen i eksempel 1 får man Pmp-D-Tyr(Et)-Phe(4-Me)-Nle-Asn-Cys-Arg-Arg(NH2).

Ved å anvende Boc-Cha ved 4-enheten får man Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Cha-Asn-Cys-Arg-Arg(NH2).

Ved å erstatte det ubeskyttede Gin i stilling 4 ved bruk av HBT får man Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Gln-Asn-Cys-Arg-Arg(NH2).

Ved å anvende Boc-D-Pba ved 2-enheten og Boc-Chg ved 4-enheten i den detaljerte reaksjonssekvens i eksempel 1 får man Pmp-D-Pba-Phe-Chg-Asn-Cys-Arg-Arg(NH2).

EKSEMPEL 12

Ved å substituere de tilsvarende beskyttede ringenheter i ovennevnte synteserekkefølge får man det respektive oktapeptid eller et salt derav som følger: a. [l-desaminopenicillamin-2-(O-etyl)-D-tyrosin-3-(4'metyl-fenylalanin)-7-arginin-8-arginin-9-desglycin]-vasopressin acetat; b. [1-(p-merkaptopropionsyre)-2-(O-etyl)-D-tyrosin-4-(a-aminosmørsyre)-7-arginin-8-arginin-9-desglycin]-vasopressin; c. [1-(p-merkaptopropionsyre)-2-valin-4-cykloheksylglycin-7-arginin-8-arginin-9-desglycin]-vasopressin hydroklorid; d. [1-(p-merkaptopropionsyre)-4-glutamin-7-arginin-8-homoarginin-9-desglycin]-vasopressin; e. [l-desaminopenicillamin-2-fenylalanin-7-homoarginin-8-homoarginin-9-desglycin]-vasopressin; f. [l-desaminopenicillamin-2-D-a-aminofenylsmørsyre-4-isoleucin-7-L-arginin-8-L-arginin-9-desglycinamid]-vasopressin. g. [l-desaminopenicillamin-2-tryptofan-4-glutamin-7-D-arginin-8-D-arginin-9-desglycin]-vasopressin; h. [1-(p-merkapto-p,p-cyklopentametylenpropionsyre)-2-L-tyrosin-3-(4'-metylfenylalanin)-7-arginin-8-arginin-9-desglycin] - vasopressin; i. [1-(p-merkaptopropionsyre-)2-(O-etyl)-D-tyrosin-3-isoleucin-4-treonin-7-arginin-8-arginin-9-desglyein]-vasopressin acetat.

EKSEMPEL 13

Parenteral doseringsenhetsblandinger:

Et preparat som inneholder 0,10 mg av peptidet fra eksempel 1 som et sterilt tørt pulver for parenteral injeksjon fremstilles

som følger: 0,5 mg peptid oppløses i 1 ml vandig løsning av

20 mg mannitol. Løsningen filtreres under sterile betingelser i

en 2 ml ampulle og frysetørkes. Den rekonstituerte løsning gis til en pasient som trenger vasopressin-antagonist behandling etter behov fra 1-5 ganger daglig for injeksjon, eller i en ekvivalent kontinuerlig i.v. dryppinjeksjon.

Nasale doseringsenhetsblandinger:

2,5 mg av et finmalt peptid ifølge denne oppfinnelse, såsom produktet fra eksempel 2, oppslemmes i en blanding av 7 5 mg benzylalkohol og 1,395 g av et oppslemmingsmiddel såsom en kommersiell blanding av semisyntetiske glycerider av høyere fettsyrer. Suspensjonen plasseres i en aerosol 10 ml beholder som er lukket med en måleventil og fylt med aerosoldrivmidler. Inneholdene omfatter 100 enhetsdoser som gis intranasalt til en pasient med et behov for dette fra 1-6 ganger om dagen.

Claims

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en forbindelse med formelen:

hvori: P er en D- eller L-isomer av Arg, Lys, HArg, MeArg, MeLys eller MeHArg; A er en D- eller L-isomer av Arg, Lys, HArg, MeArg, MeLys eller MeHArg; B er OH, NH2 eller NHAlk; Z er Phe, Phe(4'-Alk), Tyr(Alk), Ile eller Tyr; X er en D- eller L-isomer av Phe, Phe(4'-Alk), Val, Nva, Leu, Ile, Pba, Nie, Cha, Abu, Met, Chg, Tyr eller Tyr(alk); Y er Val, Ile, Abu, Ala, Chg, Gin, Lys, Cha, Thr, Nie, Phe, Leu eller Gly; og Ri og R2 er hver hydrogen, metyl eller, når de tas sammen og med p-karbonet de er knyttet til, en cykloalkylenring med 4-6 ledd; og Alk er Ci-4 -alkyl; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller forstadium derav, karakterisert ved at man cykliserer en eventuelt beskyttet forbindelse med formelen

hvori X, Z, Y, P, A, B, Ri og R2 er som definert ovenfor; Q er hydrogen eller en avspaltbar gruppe, og eventuelt deretter i ønsket rekkefølge, (a) fjerner enhver beskyttelsesgruppe; (b) omsetter Arg(OH) <7> forbindelsen, om sådan foreligger, med A som definert ovenfor, enten i syrebeskyttet eller amidform; og (c) danner et farmasøytisk akseptabelt salt eller forstadium derav, eller når B er OH, en ester derav.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av forbindelser hvori Ri og R2 tilsammen danner en spiropentametylenring, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av forbindelser hvori P-A-B er Arg-Arg(NH2 ), karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av [l-(p-merkapto-p , p-cyklopentametylen-propionsyre) -2- (O-etyl) -D-tyrosin-4-valin-7-arginin-8-arginin-9-desglycin]-vasopressin eller et farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt derav, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av [l-((3-merkapto-p,p-cyklopentametylen-propionsyre)-2-(O-etyl)-D-tyrosin-4-valin-7-D-arginin-8-D-arginin-9-desglycin]-vasopressin eller et farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt derav, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av [l-(p-merkapto-p,p-cyklopetametylen-propionsyre)-2-(O-metyl)-L-tyrosin-4-valin-7-arginin-8-D-arginin-9-desglycin]-vasopressin eller et farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt derav, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av [l-(p-merkaptopropionsyre)-2-(O-etyl)-D-tyrosin-3-isoleucin-4-treonin-7-arginin-8-arginin-9-desglycin]-vasopressin eller et farma-søytisk akseptabelt syreaddisjonssalt derav, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av [l-(p-merkapto-p,p-cyklopentametylen-propionsyre)-2-(O-etyl)-D-tyrosin-4-valin-7-arginin-8-arginin-9-desglycinamid]-vasopressin eller et farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt derav, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av l-(p-merkapto-p,p-cyklopentametylenpropionssyre-2-(O-etyl)-D-tyrosin-4-valin-8-arginin-7-lysin-9-desglycin]-vasopressin eller et farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt derav, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av [l-(p-merkaptopropionsyre)-2-(O-etyl)-D-tyrosin-4-valin-7-N-metylarginin-8-arginin-9-desglycin]-vasopressin eller et farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt derav, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at Q er hydrogen.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at Q er acetamidometyl.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 1-12, karakterisert ved at man anvender oksydativ cyklisering.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at den utføres i nærvær av jod i metanol.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at den utføres i nærvær av et alkalimetall ferricyanid.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at alkalimetall ferricyanidet er kaliumferricyanid eller natriumferricyanid.