NO803385L - Fremgangsmaate ved fremstilling av en vaksine mot overfoerbar gastroenteritis hos svin - Google Patents

Description

Overførbar gastroenteritis (TGE) hos svin fremkalles

av en coronavirus (TGEV). Sykdommen oppstår overalt hvor svin oppdrettes og er livstruende for smågris under de første-få uker efter fødsel. Hvis imidlertid purken nylig har hatt en TGE infeksjon, overføres beskyttende stoffer til avkommet i råmelk og melk som beskytter smågrisene mot TGE. Bohl et al, Infect.&Immun., 6, 289 - 230 (1972). TGE vaksiner er blitt utviklet som er istand til å gi høye serumvirusnøytra-liserende konsentrasjoner mot TGEV. Slike vaksiner fremstilles av svekket, ikke-ondartet TGEV, hvis stammer kan fremstilles ved kontinuerlig celledyrkning av ondartet TGEV. Se f.eks. US patentskrifter 3.479.430 og 3.585.108. Imidlertid er slike vaksiner ikke meget effektive når det gjelder å danne lactogen immunitet i purken, enten svekket TGEV gis levende eller inaktivert. Tamoglia, J.A.V.M.A., 160, 554 - 558

(1972) .

Undersøkelser har vist at IgA antistoffer produseres i melk ved TGE infeksjon eller ved administrering av levende ondartet TGEV, mens administrering av svekkede vaksiner pro-duserer hovedsakelig IgG antistoffer. Bohl et al, Infect. & Immun., 11, 23 - 32 (1975). Bohl et al antar at effektiv passiv immunisering av smågris kan avhenge av. uavbrutt nøytrali-sering, av virus innen deres intestinale tractus av IgA antistoffer produsert i melk efter at purken har vært utsatt for ondartet TGE. Imidlertid ville vaksiner inneholdende ondartet TGEV være farlig å anvende, da viruset lett overføres blant grisene i en flokk.

Coronaviruser er blitt angitt å inneholde fra 4 til 16 forskjellige proteiner, hvilke er i form av polypeptider, hvorav enkelte er glycosylert. Wege et al, J. Gen. Virol.,

42, 37 - 47 (1979). Eksempelvis har Wege et al analysert proteinene i musecoronavirus og funnet at det inneholder seks proteiner, av hvilke to er glycoproteiner, og at proteinkom-ponentene varierte i molekylvekt fra ca. 170.000 til 22.700. En preliminær rapport vedrørende rensning og fraksjonering av proteinene av TGE virus er blitt presentert av Gough og Ellis. Et sammendrag av Gough og Ellis rapporten er blitt publisert:Abstract of Papers Prensented at Conference of Research Workers in Animal Disease, 57th Annual Meeting Nov. 29-30, 1976, p. 11. De oppdagelser som foreliggende oppfinnelse er basert på, fant sted efter 1976, og er ikke blitt publisert.

Foreliggende oppfinnelse er basert delvis på den oppdagelse at en viktig antigen faktor tapes i det minste delvis

ved gjenvinning av TGE virus for anvendelse i vaksiner. Denne antigene faktor synes å være et protein- forbundet med overflaten av virushodet, fra hvilket det lett kan fraskil-les ved mekanisk nedslipning, slik som vil kunne oppstå når TGE viruset underkastes lydbehandling under en gjenvinnings-prosedyre. For foreliggende formål er denne antigene faktor angitt som "TGE-SPA" eller som "SPA", da det er antatt å væ-re et spesifikt proteinantigen for beskyttelse av svin mot

TGE. Mengden av SPA faktoren forbundet med TGEV synes å væ-re redusert ved svekning, dvs. at ondartede stammer av TGE er antatt å inneholde relativt mer av SPA enn svekkede stammer. At svekkede stammevaksiners svikt når det gjelder å fremkalle samme nivå av lactogen immunitet som erholdes ved naturlig TGE infeksjon eller ved eksperimentell injeksjon av ondartet TGEV i avlspurker skyldes muligens denne forskjell.

Foreliggende oppfinnelse er ytterligere basert på den oppdagelse at TGE-SPA for anvendelse ved fremstilling av vaksiner ifølge oppfinnelsen kan lett separeres fra TGEV eller andre subvirale proteinkomponenter av TGE, oy at SPA kan identifiseres ved fysikalske kriterier som karakteriserer spesifikke proteinmolekyler slik som oppdriftdensitet og elektroforetisk mobilitet.

Denne SPA faktor og vaksinene som kan fremstilles derav

vil bli beskrevet i detalj i det etterfølgende.

TGE-SPA immunogene for anvendelse ifølge oppfinnelsen fremstilles av TGEV, som er blitt mangfoldiggjort i tykktar-mene i smågris eller i grisecellekultur. Da ondartede stammer av TGEV synes å inneholde mer av det ønskede spesifikke antigen, foretrekkes der å anvende ondartet TGEV. SPA kan imidlertid også erholdes fra TGEV som er blitt tilpasset til cellekultur. Hvis viruset skal formere seg i cellekultur, kan det være fordelaktig å-anvende det tilpassede, mindre ondartede virus. Generelt foretrekkes imidlertid å infisere cellene med TGEV som er istand til å fremkalle TGE i svin. Eksempelvis kan Illinois isolat av TGEV anvendes som virus . for mangfoldiggjørelse enten in vivo i grisetarmen, eller in vitro i en kultur av svineceller slik som testikkelceller. Illinois isolatet er et standard laboratorievirus, og kan erholdes fra Veterinary Services Laboratory, U.S.D.A., Ames, Iowa, og andre kilder. Andre egnede ondartede isolater kan lett erholdes fra tarmene hos gris som er naturlig infisert med TGE.

TGEV isoleres fra dyrkningsmediet. Eksempelvis kan jejunum av tynntarmene av grisen oppdeles, slik som ved maling, og en suspensjon kan dannes derav i et egnet vandig medium.

På lignende måte kan de dyrkede celler suspenderes i et egnet medium for ytterligere bearbeidelse. Suspensjonen underkastes sentrifugering for å fjerne cellulære- eller tarm-efterlatenskaper. Den overliggende væske inneholder TGEV. Viruset utfelles fra den overliggende væske med et egnet ut-fellingsmiddel slik som polyethylenglycol eller .*ammoniumsul-, fat. Ved fullførelse av utfellingen oppsamles bunnfallet ved sentrif ugering, f .eks. ved 9500, g i 30 minutter. • Det fraskil-te bunnfall dispergeres pånytt i et egnet vandig medium for ytterligere rensning. Eksempelvis kan denne utføres ved sonegradert sentrifugering gjennom' en diskontinuerlig sucrose-densitetgradient. Oppdriftsdensiteten av TGEV bunnfallet med polyethylenglycol 6000 er 1,122 g/ml. Viruset vil derfor se-dimentere gjennom 10, 25 og 40 % diskontinuerlige sucrosegra-dienter til 25 - 40 % sucrosegrenseflaten.

Det virusholdige bånd separeres. Ved dette trinn er det ønskede SPA fremdeles forbundet med TGEV, idet det tilsy-nelatende er en bestanddel av overflaten av TGE viruset. For å frigjøre SPA kan mekanisk energi tilføres viruset. En fo-retrukken prosedyre er å underkaste TGEV suspensjonen en lydbehandling. Eftersom SPA brytes av, går dette i oppløsning. Det ønskede virale protein er derforkarakteriserti en hen-seende ved dets vannoppløselighet.

Den lydbehandlede suspensjon avTGEVkan inneholde to

virale proteiner i oppløsning, som begge har oppdriftsdensite-ter på 1,02 til 1,03 g/ml. Disse proteiner kan derfor gjen-- - vinnes separat fra rest TGEV ved isopyknisk sentrifugering under anvendelse av en kontinuerlig sucrosedensitetsgradient.

F.eks. kan isopyknisk sentrifugering utføres under anvendelse av en gradient av 10 - 60 % sucrose i 18 - 20 timer ved 260,000 g. Det annet bånd av materiale som kan betegnes som "Bånd B", svarende til ca. 6 - 8 % sucrose, vil inneholde SPA sammen med den annen proteinkomponent. Det separerte bånd B kan anvendes direkte for å danne en vaksine ifølge oppfinnelsen, eller det kan renses ytterligere for å øke konsentrasjonen av SPA i forhold til det annet protein.

På laboratoriebasis kan f .eks. bånd B proteinoppløsnin-gen ytterligere renses ved gelfiltrering under anvendelse av en kolonne av "Sepharose 4B" eller "Sephadex G200". Ved anvendelse av en tris-fysiologisk saltvannbuffer som elueringsmid-del vil det ønskede immunogen (TGE-SPA) være den annen fraksjon som. elueres, hvor den første fraksjon inneholder det annet protein med lignende oppdriftsdensitet. Hvor denne konsentrasjon er over den som ønskes for vaksinen, kan eluatet fortynnes til konsentrasjonen for fremstilling av vaksinen. Hvor alternativt konsentrasjonen av eluatet er under hva som ønskes for vaksinen, kan SPA konsentreres ved prosedyrer slik som elektroforese, ultrafi 1trering, endosmose eller utfelling og resuspendering slik som med polyethylenglycol eller andre utfellingsmidler.

For kommersiell produksjon kan andre teknikker enn isopyknisk sen trif ugering og ge lf i ltrering anvendes for å -isolere SPA. I en forenklet kommersiell prosedyre vil f.eks. det ut-feldte TGE virus bli resuspendert i et vandig medium og under-kastet mekanisk eller kjemisk behandling for å frigi SPA (dvs. lydbehandling, enzymatisk hydrolyse, opprivning med detergen-ter, etc), og derefter<N>bearbeidet ved ultrafiltrering for molekylstørrelseseparasjon. SPA er det minste oppløseliggjor-te proteinmoleky1 som passerer gjennom porene på filtermembra-nen og gjenvinnes i filtratet. De virale restpartikler og me-steparten av det annet protein med lignende oppdriftdensitet kan derved

separeres fra SPA.

SPA proteinet som anvendes som immunogen i vaksiner ifølge oppfinnelsen er ytterligere blittkarakterisert vedsin elektrof ore tiske mobilitet som angis som Rf verdien. Rf-"" verdien bestemmes under ladningsnøytraliserte betingelser slik som i nærvær av natriumdodecylsulfat, og angis i forhold til humant serumalbumin ved polyacrylamidgelelektroforese. Under disse betingelser er Rf verdien for SPA proteinet 1,84 0,01. Det annet protein i bånd B som har samme oppdriftsdensitet har en tilsvarende bestemt Rf verdi på 1,40 + 0,01. Molekylvekt beregnet fra disse Rf verdier gir en tilnærmet molekylvekt for SPA proteinet på 25.000, og for det annet bånd B protein på 32,000.

Som beskrevet er SPA immunogenet fremstilt ifølge oppfinnelsen fritt for TGE virus. Det kan foreligge i blanding med det annet virale protein med samme oppdriftsdensitet som erholdt i form av bånd B. Imidlertid er ytterligere rensning ønskelig slik at det ferdige vaksineimmunogen er hovedsakelig sammensatt bare av SPA proteinet. Fortrinnsvis kan 90 % eller mer av proteinet i immunogenet være SPA protein som er vannoppløselig, har en oppdriftsdensitet på 1,02 til 1,03 g/ ml, og en ladningsnøytralisert elektroforetisk~mobilitet (Rf-verdi) på 1,84 + 0,01 i forhold til humant serumalbumin.

SPA immunogenet kan fremstilles i vaksinedoseform efter velkjente prosedyrer. For parenteral administrering slik som intramuskulær injeksjon, kombineres SPA med et egnet hjelpestoff. Aluminiumhydroxyd er blitt funnet å være et ønskelig hjelpestoff. Aluminiumhydroxydhjelpestoffer kan fremstilles som beskrevet i US patentskrift nr. 3.149.036, eller erholdes fra kommersielle kilder, slik som Merck Adjuvant 65, eller Merck&Co., Inc., Rahway, N.J., USA. Andre standardhjelpe-stof f er kan også anvendes, slik som Freund's Incomplete Adjuvant, som kan ehroldes fra Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA. De relative mengder SPA immunogen og hjelpestoff kan varieres, forutsatt at begge er tils tede i effektive mengder. F.eks. kan aluminiumhydroxydhjelpestoffet være tilstede i en mengde på 0,5 % av vaksineblandingen (A^O^ basis) . På pr. dose-basis kan konsentrasjonen av SPA immunogen variere fra 0,25 til 4,0 mg, men er fortrinnsvis innen området fra 0,5 til 3,0 mg pr. dose. F.eks. er gode resultater opp-nådd med intramuskulær administrering av 1,0 til 2,0 mg SPA pr. dose til drektige purker for beskyttelse av grisekullet. - En hensiktsmessig dosestørrelse er ca. 1 ml. Derfor vil en representativ dose for intramuskulær injeksjon omfatte 1 ml inneholdende 1,0 mg'SPA i blanding med 0,5 % aluminiumhydrox-ydh jelpes tof f . Lignende doseformer kan også fremstilles for parenteral administrering til smågris, men mengden SPA gitt pr. dose kan være mindre, slik som 0,25 - 1,0 mg pr. dose. SPA immunogenet kan også fremstilles i form av en enterisk belagt oral vaksine, f .eks. som beskrevet i US patentskrift nr. 3.823.228.

Virkningsmekanismen av SPA vaksiner er ikke fullt ut forstått. For passiv immunisering av smågris synes det som om den drektige purke stimuleres til å produsere de nødvendi-ge immuniserende antistoffer i råmelk og melk. På grunn av den lille størrelse av SPA molekylet er det imidlertid mulig at noe av antigenet overføres gjennom placenta til grisungene, og derved stimulerer direkte produksjon av immunitet i grisungene før eller like efter fødsel.. Vaksinen er ikke bare meget effektiv når det gjelder slik passiv immunisering, men har også den fordel at den er fullstendig sikker å anvende. Der er ingen mulighet for at TGE infeksjon fremkalles av vaksinen, hvilket er tilfelle'når levende ondartet TGE virus anvendes. Sammenlignet med TGE vaksiner fremstilt av svekkede ikke-ondartede stammer av TGEV, er ennvidere SPA vaksinene meget mer effektive når det gjelder passiv immunisering av smågris. En annen viktig fordel med SPA vaksinene er at de kan anvendes som en del av et program for TGE utryddelse. Anti-stoffene produsert ved SPA vaksinasjon kan skilles fra antistoffer fremkaldt av naturlig TGE infeksjon, og derfor kan infiserte svin skilles fra immuniserte vaksinerte svin.

Oppfinnelsen og de resultater som kan oppnåes derved il-lustreres i de følgende eksempler.

EKSEMPEL I

TGE-SPA immunogenet for anvendelse ved .fremstilling av vaksiner ifølge oppfinnelsen kan frems-tilles som følger: 1. TGEV fremstilles av ondartet Illinois isolat av TGEV som er blitt mangfoldiggjort i tynntarmer i SPF smågris (infisert 48 timer gamle, virus generelt høstet 48 timer efter infeksjon). En 20 %'s suspensjon av malt jejunum av de infiserte svin ble foretatt i minimum essensielt medium (Eagle's) til hvilket var tilsatt 5 lactalbumin hyd-rolysat, 2 % svinefosterserum og antibiotika. Alternativt mangfoldiggjøres isolatet i rullekulturer av svine-testikkelceller. Cellene er 6 dager gamle (efter-overfø-ring) monolag når de infiseres, og høstingen av virus, gjøres 3 dager efter inokulering. Høyere konsentrasjoner av virus erholdes med eldre celler (6-8 dager) enn med yngre (3-5 dager). Dette er spesielt viktig med stammer av TGE virus (slik som Illinois) som ikke er veltil-passet til in vitro betingelser. Virus oppsamles efter

to fryse-tinecycluser av cellemedium.

2. Det' urene virus sentrifugeres ved ca. 5000 g i 20 - 30 minutter for å fjerne cellulære-- eller tarmefterlatenska-per. 3. Viruset utfelles fra den overliggende væske ved tilsetning av 7 % polyethylenglycol 6000-og 2,3 % natriumklorid. Blandingen holdes ved 40°C i 1 1/2 - 2 1/2 time for å

fullføre utfellingen.

4. Bunnfallet oppsamles ved sentrifugering ved 9500 g i 30 minutter. Bunnfallet dispergeres i Eagle's minimum essensielt medium, pH 7.0, til et volum på 1/20 av det opprin-nelige. 5. Dispersjonen underkastes sonegradert sentrifugering gjennom en diskontinuerlig (10, 25, 40 °5 sucrose) sucrosedensitetsgradient (i tris-EDTA bufret fysiologisk saltvan ved pH 7.4) ved 100.000 gil 1/2 time. Oppdriftsdensi--tet av viruset er 1,122 g/ml, og det sedimenterer til 25-40 % sucrosegrenseflaten. 6. Det virusholdige bånd separeres og lydbehandles under anvendelse av en "Biosonic IV Sonic Oscillator" i 10 sekun-der ved lav styrke, hvorved viralt protein brytes av fra TGEV. (Det separerte protein oppløses i vannfasen). Suspensjonen kan derefter dialyseres mot tris-EDTA bufret

fysiologisk saltvann(pH 7,4) for å fjerne sucrose.

7. Suspensjonen inneholdende det oppløseliggjorte virale protein underkastes isopyknisk sentrifugering gjennom en kontinuerlig (10 - 60 % sucrose) sucrosedensitetsgradient i 18 - 20 timer ved 260,000 g. TGE viruset har en opp-drif tsdensitet på 1,18 g/ml (ca. 42 % sucrose). Det ønskede proteinbånd ("Bånd B") har en oppdriftsdensitet på 1,02 til 1,03 g/ml (6 - 8 % sucrose). Bånd B proteinet gjenvinnes som en vandig oppløsning og anvendes for å

fremstille vaksinen.

8. Bånd B oppløsningen analyseres ved nitrogenbestemmelse for å oppnå totalt proteininnhold, slik at proteinkonsentrasjonen kan justeres til det ønskede nivå for vaksine-fremstilling, slik som tilnærmet 1 mg/ml totalt protein. Dette svarer til ca. 0,5 mg/ml SPA, som omfatter ca. 50 % av bånd B proteinet. Sucrosen kan efterlates i oppløs-ningen eller fjernes ved dialyse. Hvis oppløsningen skal fryses for lagring, vil sucrosen virke som et kryobe-skyttende middel. 9. Om nødvendig kan proteinkonsentrasjonen av bånd B oppløs-ningen økes ved dialyse av oppløsningen mot polyethylenglycol, eller nedsettes ved tilsetning av tris-fysiologisk saltvannbuffer for å gi en konsentrasjon på tilnærmet 1 mg/ml totalt protein. 10. Bånd B proteinoppløsningen erholdt i trinn 7 kan separeres og renses ytterligere ved gelfiltrering under anvendelse av "Sephadex G200". Gelfiltreringen kan utføres med opp-adrettot strømning ved en str.ømningshastiyhe t pa 6 ml/ti-me under anvendelse av en tris-fysiologisk saltvannbuffer. To komponenter erholdes som separate eluatf raks j oner-. SPA er den annen fraksjon som elueres, og er det minste av de to proteinmolekyler inneholdt i bånd B. Ved polyacrylamidgelelektroforese i nærvær av natriumdodecyIsulfat har har SPA proteinet en Rf verdi på 1,84 +0,01 (i forhold til humant serumalbumin). Det annet protein i bånd B (som også har en oppdriftsdensitet på 1,02 - 1,03 g/ml)- - har en lignende bestemt Rf verdi på 1,40 + 0,01. Den be-regnede molekylvekt for SPA immunogenet er ca. 25.000,

og det annet bånd B virale protein har en beregnet molekylvekt på tilnærmet 32,000. Det isolerte SPA, fritt for det annet bånd B protein, kan anvendes til å fremstille vaksiner.

EKSEMPEL II

For å fremstille en intramuskulært injiserbar vaksine fra bånd B proteinet i eksempel I eller det isolerte SPA protein, suspenderes det virale protein i en vandig oppløsning av et aluminiumhydroxydhjelpestoff. Vaksinen skal inneholde 1,0 mg av bånd B protein pr. ml, eller 0,5 mg/ml SPA. Alumi-niumhydroxydkonsentrasjonen kan justeres til tilnærmet 0,5 %

(A^O-j basis) . Ved de indikerte konsentrajsoner av bånd B og SPA protein skal en dose på tilnærmet 2 ml anvendes, slik at der derved administreres ca. 1,0 mg SPA pr. dose.

For vaksinasjon av purker kan to-dosesystem anvendes. Den første dose gis fra flere måneder til fem - syv uker før fødsel. F.eks. kan alle purker vaksineres på én gang om høs-ten, slik som rundt den første uke i november. Den annen do-se av vaksinen skal administreres flere uker ef ter første do-se, slik som to -- fire uker senere, og kan gis opp til tids-punktet for fødselen. Alternativt kan SPA immunogenet gis som en enkel 2 ml's dose, slik som fem - syv uker før fødsel. Imidlertid er et to-dosesystem antatt å være foretrukket for mest effektiv passiv immunisering av smågris. Alle admini-streringer kan gis ved intramuskulær injeksjon.

EKSEMPEL III

For eksperimentelle formål ble bånd B protein fremstilt som beskrevet i eksempel I, kombinert med Freund's komplette hjelpestoff under anvendelse av like deler hjelpestoff og en vandig oppløsning av bånd B protein inneholdende ca. 0,5 mg SPA protein pr. ml. Bånd B.proteinoppløsningen ble også kombinert med et aluminiumhydroxydhjelpestoff for å fremstille en vaksine inneholdende ca. 0,5 mg SPA protein pr. ml med én aluminiumhydroxydkonsentrasjon på 0,5 % (A^O-j basis). Begge vaksiner ble anvendt i ca. 2 ml<1>s doser i vaksineprøvninger. _ som angitt i det følgende.

Vaksineprøvninger

Data fra to vaksinasjonsprøver med TGE-SPA immunogenet i avlspurker presenteres. I det første ble en purke immunisert med produktet administrert med Freund's komplette hjelpestoff, og med Freund's ufullstendige hjelpestoff i to forsterkende inokuleringer. Dette dyr nedkom tre ganger. Den annen prøve innbefattet fire gylter immunisert med TGE-SPA immunogen i aluminiumhydroxydhjelpestoffet. Disse dyr nedkom bare én gang.

1. Purke 831 Freund's komplette hjelpestoff

En "duroc" førstekullsgylt, seronegativ for TGE, ble immunisert med 2 ml (ca. 1 mg) TGE-SPA immunogen i Freund's komplette hjelpestoff 6 uker før nedkomst. To uker før nedkomst mottok den en forsterkende inokulering av TGE-SPA immunogen i Freund<1>s ufullstendige hjelpestoff.

a. Forsøk 1, første nedkomst. Purken nedkom med 13 grisunger, alle meget små. Dagen efter nedkomst var TGE antistoff titéren i melken 534, og serumtiter var 178.

Halvparten av grisungene ble oralt utfordret med 1 ml Illinois TGE virus (50-100 PID5Q) 3 dager gamle; den annen halvpart fikk sykdommen naturlig ved at de ble utsatt for infiserte griser. Ingen av grisene viste tegn på klinisk TGE ved noe tidspunkt efter utfordring, men alle hadde serumanti-stoffer da dc ble avlivet 4 1/2 måneder gamle, og intet la-tent virus ble påvist ved dette tidspunkt. Kontrollgriser dø-de av TGE efter oral utfordring.

b. Forsøk 2, annen nedkomst. Purken ble ikke immunisert igjen før til annen nedkomst. Ved dette tidspunkt hadde den serum TGE antistoff på -38. TGE antistofftiteren i råmel-

ken var 125, og i melken 3 dager senere, 34. De fem grisunger utviklet alle kliniske tegn på TGE ved utfordring med 50 - 100 PIDC^ Illinois TGE virus. To av crrisene (40 %) dødé oO

av sykdommen.

c. Forsøk 3, tredje nedkomst. En måned før nedkomst ble purken gitt en forsterkende immunisering av TGE-SPA immunogen i Freund's ufullstendige hjelpestoff. Dens serumtiter ved dette tidspunkt var 33. En svulstlignende dannelse frem-kom ved injeksjonsstedet.- Ved nedkomsten var serum TGE antistofftiteren 231, og råmelk antistofftiteren var større enn 625 (høyeste fortynning). Antistofftiteren i melk 5 dager efter nedkomst var 700.

Ingen av de syv grisunger i kullet fremkaldte kliniske

tegn på TGE efter oral utfordring med 50 - 100 PID5QIllinois isolat av TGE virus. Innen 2 dager efter utfordring av grisungene var svulsten på injiseringsstedet blitt dobbelt så stor..

Da ingen griser hadde utviklet klinisk TGE innen 3 dager efter utfordring med 50 - 100 PID5Q, ble én grisunge gitt 5 X 10 4 PID^0Illinois isolat av TGE virus på den fjerde dag efter utfordring. Kliniske tegn på TGE ble ikke observert hverken i den utfordrede gris eller i de andre grisunger i kullet. Diarré ble fremkaldt i noen av grisungene før av-venning (ca. 2 uker gamle). Diarréen var ikke typisk for TGE, ingen andre tegn på sykdom var synlig, og TGE virus kunne ik-ke isoleres fra eller identifiseres i feces eller fra dyrene selv. Bakterier (korte staver med flimmerhår) ble observert i feces i rik konsentrasjon.

2. Aluminiumhydroxydhjelpestoff

Seks kryssavls-førstekullsgylter, seronegative for TGE virus, ble anvendt i dette forsøk. Fire ble vaksinert 5 uker før nedkomst med 2 mg TGE-SPA immunogen aluminiumhydroxyd (0,5 % A^O-j) , og to tjente som kontrolldyr. En andre dose immunogen ble gitt til de fire tidligere vaksinerte gylter 2 uker før nedkomst. Alle grisunger ble utfordret oralt med 50 - 100 PID50Illinois isolat av TGE virus som en 10 %<1>s tarmoppslemming 1-3 dager efter nedkomst.

Smågrisene fra de to kontrollgylter utviste tegn på infeksjon med TGE virus 32 timer efter utfordring. Der var 100 % sykelighet i de to kontrollkull. Tre av ni griser i ett kull og én av åtte i det annet overlevet infeksjonen - en dødelighetsgrad på 76 %.

Ingen kliniske tegn på TGE ble observert i smågris på to av de fire vaksinerte gylter. Disse kull bestod av ni smågris utfordret 1 dag gamle (Gylt 290) og seks smågris utfordret 3 dager gamle (Gylt 294) med 50 - 100 PID5QIllinois isolat av TGE virus.

Milde kliniske tegn på TGE (f.eks. lett diarré) ble utviklet i smågris fra de gjenværende to kull på vaksinerte gylter efter at grisene var utfordret med Illinois TGE virus (50 - 100 PID50) 3 (Gylt 291) og 2 (Gylt 433) dager gamle. Sykdommen var kjennetegnet ved lett diarré i ni smågris, som kom tilsyne 56 timer ef ter utfordring. Imidlertid døde bare én smågris av TGE. (Tre smågris døde av grunner ikke beslek-tet med TGE infeksjon). To griser døde av andre grunner enn

TGE.

EKSEMPEL VI'

For fremstilling i industriell målestokk av vaksiner fremstilt ifølge oppfinnelsen kan fremgangsmåten ifølge eksempel I følges, under anvendelse av en kontinuerlig strøm-ningsden.sitetsgradientsentrifuge for separasjonen i trinn 7 under dannelse av bånd B proteinet. Alternativt kan andre proteinseparasjon- og renseprosedyrer anvendes, slik som ultrafiltrering, motsatt osmose, og selektiv utfelling.

Ved anvendelse av en ultrafiltreringsteknikk kan f .eks. det resuspenderte bunnfall erholdt i trinn 4 i eksempel I underkastes lydbehandling som beskrevet i trinn 6 (utelatende trinn 5). Den resulterende lydbehandlede vandige suspensjon kan deretter underkastes ultrafiltrering. Bånd B proteinet kan gjenvinnes ved anvendelse av hulfibre eller en membran med en porøsitet som tillater proteiner med en størrelse under 50,000 i molekylvekt å passere gjennom, slik at man derved gjenvinner begge proteiner i bånd B i filtratet. Ultrafil- treringsapparatet fra'Amicon Corporation, Lexington, Mass. kan anvendes. Med apparatur av hulfibertypen kan H10 X 50 fibre fra Diaflo anvendes. For gjenvinning av SPA proteinet-separat fra det annet bånd B protein kan en Amicon tynnkanal-apparatur anvendes, idet man velger en membran med et mole-kylvektkutt på 30,000 slik som "WM30" eller "PM30". SPA proteinet vil bli oppsamlet i filtratet, mens det annet bånd B protein vil bli holdt tilbake.

EKSEMPEL V

I en annen prosedyre utføres trinn 1-4 ifølge eksempel I. Det resuspenderte. bunnfall av TGE virus behandles derefter med en ikke-ionisk detergent for å ekstrahere proteinet. F.eks. kan "Triton X-100" eller "Nonidet P40" tilset-tes til suspensjonen til en konsentrasjon på 0,1 % for eks-traksjon. Det resulterende ekstrakt kan derefter bearbeides ved isopyknisk sentrifugering som beskrevet i trinn 7 i eksempel I, eller ved alternative proteingjenvinningsprosedyrer som beskrevet i eksempel IV. Slike ikke-ioniske detergenters evne i fortynnet oppløsning til å oppløseliggjøre viralt protein er velkjent.

Som anvendt her angir "polyethylenglycol 6000" polyethylenglycol med en molekylvekt på fra 6000 til 7500.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine anvendbar for beskyttelse av svin mot overførbar gastroenteritis (TGE) infeksjon, karakterisert ved at et spesifikt antigent protein (SPA) erholdt ved separering fra TGE virus, hvilket SPA er karakterisert ved (i) at det er oppløselig i vann, (ii) har en oppdriftsdensitet på.1,02 til 1,03 g/ml, og (iii) har en ladningsnøytralisert elektroforetisk mobilitet (Rf verdi) på 1,84 + 0,01 i forhold til humant serumalbumin, blandes med en bærer eller et hjelpestoff egnet for veterinær administrering.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at SPA erholdes fra en ondartet stamme av TGE virus.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at vaksinen holdes fri for TGE virus.

4. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved åt vaksinen holdes fri for TGE viralt protein med annen oppdriftsdensitet enn 1,02 til 1,03 g/ml.

5. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at et TGE-avledet protein anvendes som er sammensatt hovedsakelig fullstendig av SPA sammen med et annet viralt protein med samme oppdriftsdensitet.

6. Fremangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at et TGE-avledet protein anvendes, som er sammensatt hovedsakelig fullstendig av SPA.

7. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-6, karakterisert ved at vaksinen bringes i svine-administrerbar doseringsform.

8. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-7, karakterisert ved at en injiserbar doseringsform erholdes ved å blande et hjelpestoff med det spesifikke antigene protein (SPA) som definert i krav 1, idet hver dose av vaksinen inneholder fra 0,25 til 4,0 mg SPA.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at hver dose av vaksinen justeres til å inneholde fra 0,25 til 3,0 mg SPA.