JPH08506486A - ブタ生殖及び呼吸症候群ウイルスの増殖方法並びにワクチンにおけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＰＲＲＳに対して動物を防御するために、或いは該ＰＲＲＳを診断し又は組換え製品の開発用にＰＲＲＳＶの分子構造を同定するために使用するのに、十分な量まで該ウイルスを複製するための、感染されやすい組織培養物中における該ＰＲＲＳＶの増殖方法であって、該ウイルスを該組織培養物上に接種しそして複製されたウイルスを採取することを含んでなる該方法。

Description

【発明の詳細な説明】 ブタ生殖及び呼吸症候群ウイルスの増殖方法 並びにワクチンにおけるその使用発明の背景 発明の分野： 本発明はブタ生殖及び呼吸症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）単離体に関する。さ らに詳細には、本発明はブタ生殖及び呼吸病の診断用及び感染防御用の抗原及び ワクチン、並びにそれらの製造方法及び使用方法に関する。先行技術の簡単な記述 ： ブタ生殖及び呼吸症候群は、米国及びヨーロッパのブタ飼育業者にとって経済 的打撃を受ける病気問題として急速に出現した。この症候群は１９８７年に米国 で最初に記載され、２〜３年後にヨーロッパ及びカナダで同様の記載が現れた。 この病気症候群は、謎のブタ病、青流産、青耳ブタ病、ブタ流行性流産及び呼吸 症候群（ＰＥＡＲＳ）、ブタ不妊及び呼吸症候群（ＳＩＲＳ）を含む多くの異な る名称で呼ばれてきている。これ以後、ブタ生殖及び呼吸症候群ウイルス（ＰＲ ＲＳＶ）という名称を採用する。 この病気症候群を再現し得る病原剤は、エンベロープで囲まれ、６２ｎｍの平 均ビリオン直径及び２５〜３０ｎｍコアを有し、エンベロープを有する球状の小 さなＲＮＳウイルスとして同定された。このウイルスを、トガウイルス科内のア ルテリウイルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）属の一員として仮に分類した。本明 細書中で記述されるブタ生殖及び呼 吸症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）単離体はこの仮の分類に適合し、そしてこの病 気症候群を再現することが示された。 ＰＲＲＳＶに関連する病気症候群は、成体の雌ブタにおける急性及び慢性の生 殖不全並びに若いブタにおける重症から軽症までの呼吸病により特徴づけられる 。生殖不全は、乾性壊死の、死産のブタ、及び生存する機会が著しく少ない虚弱 に生まれたブタの増大した発生率を伴う後期流産により特徴づけられる。また、 感染雌ブタの発情期への遅延した回復についての慢性的な問題が記載されている 。呼吸病後遺症は、著しい発熱及び間質性肺炎から穏やかな上部呼吸徴候（即ち 、くしゃみ、咳及び鼻又は目の分泌物）の範囲に及ぶ。最近（１９９０年）の血 清学及び集団病歴研究は、米国のブタ集団の少なくとも５０％がＰＲＲＳＶにさ らされたか或いはＰＲＲＳＶ感染を示す生殖不全及びＰＲＲＳＶ感染を示す呼吸 病を経験したことを示している。 この病気症候群は最近出現したので、病気の病因論、疫学及び制御は限られて いる。理解されるように、ＰＲＲＳＶを含む抗原の効率的な増殖及び加工は、ブ タ生殖及び呼吸症候群の予防及び制御の助けとしてＰＲＲＳＶワクチンの開発を 促進する。発明の概要 上記に従い、本発明は、ブタ生殖及び呼吸症候群の診断用の抗原の調製並びに ブタ生殖及び呼吸症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に対する感染防御免疫応答の誘 発に有用であるＩＳＵ−Ｐと表示されるウイルス単離体を包含する。また、本発 明は抗原の製造方法及び使用方法を包含する。 本発明の実施態様において、ＰＲＲＳＶ単離体は、ウイルス感染ブタ由来の１ ０％重量／容量（ｗ／ｖ）肺ホモジネートを一次ブタ肺胞マク ロファージ又は連続細胞系培養物と３５℃で同時培養して、ＰＲＲＳＶを単離す る方法で得ることができる。 本発明は、さらに、アフリカ・グリーン・モンキー腎臓連続細胞系（ＭＡ １ ０４）及びクローンされた独特なその誘導体（９００９Ｂ）等のような特定の細 胞系中におけるウイルスの高力価に至るまでの増殖を包含する。 また、本発明は、生ウイルス又は死滅ウイルス抗原（通常の又は組換えの）、 並びに免疫学的に有効な量のウイルスと希釈剤及び／又はアジュバントをそれぞ れ組み合わせてそれら抗原から得られるワクチンの、調製方法及び使用方法を包 含する。 生ウイルスを用いる雌ブタの直接実験免疫化或いは生ウイルスで免疫化された 雌ブタとの接触は、悪性ＰＲＲＳＶによる鼻控内攻撃に伴う生殖不全を防御する ことが見い出された。 また、非ワクチン接種対照ブタと比較した場合のワクチン接種体におけるウイ ルス複製の欠如により測られるように、不活化されアジュバントを添加されたワ クチンは、攻撃後のＰＲＲＳ感染からブタを防御したことも見い出された。発明の詳細な説明 上述したように、本発明は、ワクチン及び診断アッセイに使用するウイルス抗 原を得る目的でＰＲＲＳＶウイルス単離体ＩＳＵ−Ｐの単離に関する。ＩＳＵ− Ｐ単離体は虚弱に生まれたブタの肺組織から得られた。具体的に説明すると、汚 染の可能性を低減するために、肺、脾臓及びリンパ節由来の１０％ ｗ／ｖ組織 ホモジネートを、抗生物質を補強した最小必須培地（ＭＥＭ＋Ａ）中で調製した 。粗ホモジネートを４℃で１ ５分間１５００ ｘ ｇで遠心して澄ませた。澄ませた上清をＭＥＭ＋Ａ中で１ ：５に希釈し、そして１．０ｍｌを２５ｃｍ²フラスコ中のＭＡ １０４細胞の ４８時間経過した集密的細胞単層又は一次肺胞マクロファージ上に吸着させた。 ３５℃での２時間の吸着期間に引き続き、単層をＭＥＭ＋Ａで２回洗浄し、そし て５．０％のガンマ線照射されたウシ胎児血清を補強した５．０ｍＬのＭＥＭ＋ Ａを添加した。ウイルス単離体が入ったフラスコを５％ ＣＯ₂雰囲気下で３５ ℃でインキュベートし、そして細胞変性効果（ＣＰＥ）の形跡を毎日観察した。 ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ−Ｐ細胞変性効果は、５から１０個の細胞の小さなフォーカ スの球状化とともに始まり、そして感染後４〜７日間にわたって多くの細胞が核 濃縮され、そして基質から分離するにつれて進行した。 ＰＲＲＳＶ基特異的モノクローナル抗原を用いた蛍光抗原染色により、ＩＳＵ −Ｐ単離体はＰＲＲＳＶ単離体として確認され、公にＳＤＯＷ１７と表示された 。さらに、ネガティブ染色されたウイルス感染細胞を、ウイルス粒子の存在につ いて透過型電子顕微鏡で検査した。観察されたウイルス粒子は、球状であり、そ して６２ｎｍの平均ビリオン直径及び２７ｎｍのコアを有し、エンベロープを有 している。この方法で特性決定された組織培養ウイルスを、妊娠雌ブタの後期流 産及び生殖不全を実験的に再現するために使用した（表１）。表１は、ＩＳＵ− Ｐ感染肺ホモジネート（ＰＲＲＳ−ｈｍ）或いは細胞培養物（ＰＲＲＳ−ｔｃ） 中で成長したＩＳＵ−Ｐのいずれかにさらされた妊娠雌ブタが、ブタ生殖及び呼 吸症候群（ＰＲＲＳ）の典型的な病気徴候を示すことを示している。ＰＲＲＳ− ｈｍ群では、正常に分娩したブタはいなかった。ＰＲＲｓ−ｔｃ群では、３３匹 のブタのうち４匹のみが正常に分娩した。対照 的に、３０匹の非暴露ブタのうち２９匹（９６．７％）が分娩の際に正常であっ た。細胞培養物中での精製後でさえも、ＩＳＵ−ＰがＰＲＲＳの病気を再現でき る事実は、この単離体がトガウイルス科内のアルテリウイルス属の一員として正 しく分類されたことを確認している。またこの単離体は実験感染ブタに穏やかな 間質性肺炎を起こさせることが見い出された。 本発明の特徴は、本発明に従うＰＲＲＳＶが、ワクチンに配合するのに必要と される抗原の塊を十分に供給できるレベルまでウイルスを効率的に複製する特定 の組織培養細胞中で成長できることであり、このワクチンはブタ及び／又は妊娠 雌ブタをＰＲＲＳ攻撃から感染防御できるものである。具体的に説明すれば、Ｐ ＲＲＳＶはＷｈｉｔｔａｋｅｒ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓによりＭＡ １０４と 表示された組織培養細胞中で成長できる。３つの異なる給源から得られたＭＡ １０４細胞を用いて同じ培養条件を採用したウイルス増殖実験により、高力価に 至るまでのＰＲＲＳＶ複製を助ける能力の点から、ＭＡ １０４細胞間に高度の ばらつきが存在することが示された。Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ．、農業部門、動物健 康製品グループによりＭＡ １０４（Ｍ）と表示され、そして本明細書中で記述 された研究に使用した、１つのＭＡ １０４細胞培養物は、高力価に至るまでの ＰＲＲＳＶ複製を一貫して助けた。さらに、ＭＡ １０４（Ｍ）由来の、９００ ９Ｂと表示された、Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ．、農業部門、動物健康製品グループに より作出された細胞系クローンは、親の細胞系よりも高い力価に至るまでＰＲＲ ＳＶ複製を助けた。それ故、ＩＳＵ−Ｐの成長のための好適な組織培養細胞は９ ００９Ｂである。以下に、ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ−Ｐの細胞培養増殖をさらに詳細 に 説明する。 組織培養細胞［ＭＡ １０４（Ｍ）及び９００９Ｂ］を、５％のウシ胎児血清 を補強しそして１．３ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムで緩衝化した、高グルコースのダ ルベッコ改変最小必須培地（ＤＭＥＭ／ＨＧ）で維持した。十分な細胞数で細胞 継代を行い、４８時間で８０〜１００％の集密的細胞単層を達成した。ＰＲＲＳ Ｖ ＩＳＵ−Ｐウイルス株を、ＤＭＥＭ／ＨＧ及びＰＩＰＥＳでｐＨ６．８に緩 衝化した５％のウシ胎児血清により希釈した。ウイルスを低い感染多重度（ＭＯ Ｉ）で細胞シート上に接種し、３６℃でインキュベートした。感染培養物をＣＰ Ｅについて４〜７日間毎日観察した。９０〜１００％のＣＰＥが明らかになった ときに感染培養物を採取した。１回の−７０℃での解凍融解サイクル後、最大の ウイルス抗原の塊を得た。ＭＡ １０４（Ｍ）中での増殖から得られた平均ウイ ルス・力価は１０^3.0〜１０^4.5蛍光抗体感染用量₅₀／ｍｌ（ＦＡＩＤ ₅₀／ｍｌ ）の範囲に及ぶ。９００９Ｂ細胞クローンでの増殖で達成されるウイルス・力価 は１０^5.5〜１０^6.5ＦＡＩＤ ₅₀／ｍｌの範囲に及ぶ。この大きさの力価は、十 分な抗原の塊を５０Ｌ容量より大きい商業規模のＰＲＲＳＶワクチン製剤中に配 合することを可能にする。 当業者に理解されるように、ＰＲＲＳＶが一旦高レベルの抗原の塊に増殖され 得ると、本発明に従い有効であるそのサブユニットを含むこのウイルスの誘導体 は、例えばウイルスからの抽出のような当業者に公知の方法で得ることができる 。さらに、感染防御抗体は分子レベルで同定でき、そして組換え法を用いて再生 できかつ発現できる。 ワクチン製剤のためのウイルス流体は２つの方法で不活化された。選 択された不活化剤はホルマリン及びバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）であっ た。不活化は本明細書中でより詳細に述べられる標準法で遂行された。ウイルス 流体を３７％ホルムアルデヒド原液と混合して０．０５％の最終ホルマリン濃度 とすることにより、ホルマリン不活化を達成した。ホルマリン−ウイルス混合物 を室温（約２５℃）で２４時間一定に攪拌しながら維持した。試料を０、８、１ ２及び２４時間で採取しそして９００９Ｂ細胞中の生ウイルスをアッセイした。 細胞変性効果及び基特異的モノクローナル抗体を用いた蛍光染色により、０時間 で生ウイルスが検出された。 ０．１Ｍ ＢＥＩ原液（０．１７５ Ｎ ＮａＯＨ中の２０．５ ｇ／Ｌ ２ −ブロモーエチルアミン ＨＢＲ）をウイルス流体と組み合わせて１．０ ｍＭ ＢＥＩの最終濃度とすることで、ＢＥＩを用いた不活化を達成した。ＢＥＩ− ウイルス混合物を室温で４８時間一定に攪拌しながら維持することで、不活化を 達成した。２時間攪拌しながら１．０ Ｍチオ硫酸ナトリウムを添加し０．１ｍ Ｍの最終濃度とすることで、ウイルス不活化を停止した。試料を０、２、４、８ 、１２、２４及び４８時間で採取しそして上述したように生ウイルスをアッセイ した。わずか０、２及び４時間で生ＰＲＲＳＶが検出された。 本発明の改変された生の或いは弱毒化されたワクチンの調製の際に、制限され た態様で宿主をいまだ感染できるが宿主中で病気徴候を引き起こせないように、 ＰＲＲＳＶを改変した。通常、ウイルスのそのような改変は、アフリカ・グリー ン・モンキー腎臓細胞のような非宿主細胞を介して継代させることにより生じる 。最初、ウイルスは良好に成長できないか或いは全く成長することができない。 後者の場合、ウイルスを細 胞培養物での成長に適応させることが必要となるかもしれない。ウイルスを細胞 培養物の高い又は低い感染多重度（ＭＯＩ）で添加することで、これが達成でき る。あるいは、十分な細胞変性効果が観察され、それ故ウイルスが適応したこと が示されるまで、ウイルスを細胞と一緒に強制継代又は盲継代することができる 。適応が起こり、ＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ−ＰのＭＡ １０４（Ｍ）細胞系から ９００９Ｂ細胞系への継代が起こる場合に観察されるように、ウイルス・力価が 増大するであろう。表１は、組織培養継代ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ−Ｐ（ＰＲＲＳ− ｔｃ）が肺ホモジネートから単離されたものより悪性がより少ないこと、即ち適 応の典型的な結果を示す。表２に開示されたデータは、本発明に従うワクチンの 製造方法がＰＲＲＳに対する感染防御に特に有効であることを示す。 不活化されたＰＲＲＳＶ ＩＳＵ−Ｐに、以下のようにしてアジュバントを添 加した。 不活化された液に、完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）、不完全フロイン トアジュバント（ＦＩＡ）、カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌｅ）を基材とする アジュバント及びダイアモンド・サイエンティフィク・アジュバントＢ（Ａｄｊ Ｂ）からなる群から選択されるアジュバントを添加した。これらアジュバント はワクチン製造で使用される主要な種類を示している。油を基材とするアジュバ ントはＦＣＡ、ＦＩＡ及びＡｄｊ Ｂにより示される。水を基材とするアジュバ ントはカルボポールにより示される。不活化されたＰＲＲＳＶ ＩＳＵ−Ｐは、 場合により、適当な保存剤を含んでいてもよい。 不活化されたワクチンを乳化して、代表的には等容量の不活化された ウイルス流体及びアジュバントを使用し、１８ゲージ二重ルアー式ロック装置及 び２本の注射器を用いて、ＦＣＡ及びＦＩＡを含有するワクチン製剤が調製でき る。濃厚な半固体エマルジョンが形成されるまで、注射器間のアセンブリを介し て液を繰り返ししぼり出した。エマルジョンを投与用の注射器に直接詰め込んだ 。 Ａｄｊ Ｂ原液を等容量の不活化されたＰＲＲＳＶ ＩＳＵ−Ｐウイルス流体 と混合して、Ａｄｊ Ｂを含有するワクチン製剤を調製した。アジュバントとウ イルスとを室温で１時間攪拌して混合した。アジュバントが添加されたワクチン を多用量滅菌瓶に無菌的に移し、そして投与前４℃で貯蔵した。 カルボポール・アジュバント原液を不活化されたウイルス流体と混合し、１０ ％ ｖ／ｖの最終アジュバント濃度にして、カルボポールを基材とするワクチン 製剤を調製した。アジュバントとウイルスとを室温で４時間攪拌して混合した。 アジュバントが添加されたワクチンを多用量滅菌瓶に無菌的に移し、そして投与 前４℃で貯蔵した。 不活化前の力価が１０^5.0 ＦＡＩＤ ₅₀／ｍｌと低いＲＲＳＶ ＩＳＵ−Ｐ ウイルスを、記載されている種々のワクチン製剤に使用した。 ＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ−Ｐがブタ生殖及び呼吸症候群に対して防御できるこ とを示すために、２つのワクチン接種／攻撃研究を行った。第一の研究では、ウ イルスを口鼻にさらし、直接ルート或いは病気に罹患したブタとの接触のいずれ かを介して、４匹の雌ブタを生ＰＲＲＳＶＩＳＵ−Ｐで免疫化した。同年齢の２ 匹の雌ブタを未免疫（未暴露）のままにし、分離して住まわせて対照群とした。 直接暴露ワクチン接種を受けたブタ（＃５７及び＃５８）は３．０ｍＬのウイル ス接種原を鼻控 内から受けた。間接蛍光抗体試験に従うと、暴露後１４日までにそれらは血清変 換した。接触暴露雌ブタ（＃４７６及び＃４８０）は病気に罹患したブタと接近 して接触された後に口鼻ルートで免疫化された。これらブタは暴露後９０日まで に血清変換した。血清変換は１：２０より大きいＩＦＡ力価で示される。 免疫化した雌ブタを血清変換した後、それらの発情現象が同時に発生し、そし てそれらは受精された。妊娠を超音波で確認した。妊娠９０日に、ワクチン接種 を受けた妊娠雌ブタ及び対照の妊娠雌ブタは、鼻控内から１ ｘ １０⁴ ＦＡ ＩＤ ₅₀の力価の３．０ｍＬのＰＲＲＳウイルス攻撃を受けた。 対照の雌ブタ＃５２及び＃４７７は、攻撃後２乃至３日間低減した食欲及び高 い体温（１０３〜１０４℃）を示し、病気の初期徴候を示した。ＩＳＵ−Ｐ暴露 （ワクチン接種を受けた）雌ブタでは、病気の臨床的徴候は認められなかった。 これら結果は、臨床的な呼吸病症候群に対する防御を示している。 すべての雌ブタをブタが離乳するまで（分娩後４週間）維持した。表２はこの 実験の分娩結果を示す。 分娩結果は妊娠期間（妊娠はＰＲＲＳ感染で通常短縮される）、死産又は死ん だ胎児、虚弱なブタ及びひからびた死体として記録された。これら分娩の困難さ はすべて妊娠雌ブタにおけるＰＲＲＳ感染を示す。さらに、正常なブタの数が書 き留められた。 対照雌ブタは正常なブタを分娩しなかった（２２匹のブタのうち０匹が正常で あった）。２２匹のブタのうち７匹が死産であって２２匹のうち１５匹が虚弱に 生まれたブタであった。対照雌ブタの妊娠期間は、妊 娠ブタにおけるＰＲＲＳに典型的な２．５日だけ短縮された。免疫化群（ｎ＝５ ０）では、４０匹のブタ又は８０％が正常に生まれた。５０匹のブタのうち６匹 が死産であって５０匹のうち４匹の胎児が分娩の際にひからびて見えた。ワクチ ン接種群では、虚弱なブタはいなかった。雌ブタにおける病気の直接的な臨床徴 候の欠如及びそれらがみごもった胎児の防御により例証されているように、生Ｐ ＲＲＳＶ ＩＳＵ−Ｐにさらされた後、受精され次に攻撃された雌ブタは、攻撃 に対して防御されていることが明らかである。 理解されるように、この研究で雌ブタの血清状態を調べるために使用されたＩ ＦＡ試験試薬はＰＲＲＳＶ ＩＳＵ−Ｐ由来のものであり、そして、雌ブタの血 清状態とＰＲＲＳに対する防御との間に直接的な相関関係があるので、ＰＲＲＳ Ｖ ＩＳＵ−Ｐ単離体は、例えば本明細書において例証された間接蛍光抗体法、 ＥＬＩＳＡ、血清中和アッセイ、直接蛍光抗体アッセイ法及び当業者に公知の他 の診断アッセイのような診断試験に有用であることができる。従って、ＰＲＲＳ Ｖ ＩＳＵ−Ｐから得られる抗体由来の診断アッセイが調製でき、本発明に従っ て使用できる。 第二のワクチン接種／攻撃研究では、若いブタ（４〜６週）に、不活化され、 アジュバントが添加された数種のＰＲＲＳＶ ＩＳＵ−Ｐワクチンを接種した。 ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ−Ｐを上述したＢＥＩで不活化しそしてカルボポール、ＦＣ Ａ／ＦＩＡ又はＡｄｊｉ Ｂのいずれかのアジュバントを添加して、ワクチン抗 体プールを調製した。ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ−Ｐを上述したホルマリンで不活化し そして上記同じ３種のアジュバントのいずれかを添加して、第二のワクチン抗体 プールを調製した。 アジュバント及び細胞が偽免疫応答を刺激できないことを確認するために、３種 の偽ワクチンを製造した。未感染組織培養細胞にアジュバントを添加して偽ワク チンを調製した。２匹のブタに各ワクチンを接種した。ワクチンを０、２１、４ ２及び６４日目に皮下投与した。最終のワクチン接種後７日目に、ブタを１０^{3. 5} ＦＡＩＤ₅₀の悪性の生ＰＲＲＳＶで鼻控中から攻撃した。攻撃後毎日すべて のブタの病気の臨床徴候について観察した。さらに、血液試料を採取し、そして 組織培養物中でウイルスを回収するために加工した。攻撃後に血流中に見い出さ れた生ウイルスは、ウイルス血症が生じたことを意味する。 血清中和力価は研究の始めの、攻撃の日と攻撃後１９日目に評価された。血清 中和試験は上述した研究に使用したＩＦＡ試験よりも感度が低いことに留意すべ きである。したがって、これら力価結果を上述した力価結果と比較することはで きない。 表３は攻撃の結果を列挙する。ワクチン接種を受けた又は対照のブタでは、病 気の臨床徴候が観察されなかった。さらに、ワクチン接種を受けた又は対照のブ タのいずれもワクチン接種期間中に血清中和力価を上昇させなかった。このこと は、この期間中に生ウイルスにさらされなかつた（対照群はネガティブのままで あった）ことを示し、また、ワクチンは血清中和試験で測定されるのに十分に高 い体液性応答を刺激しなかったことを示している。攻撃後の血清中和力価応答が 顕著であるという事実は、すべてのブタが生ＰＲＲＳウイルスで有効に攻撃され たことを示している。この攻撃暴露はウイルス血症を示す対照ブタの率で立証さ れている。対照ブタの１匹以外のすべて（８７．５％）が感染された。ワクチン 接種を受けたブタの免疫応答があまりに強力なため、それらはウ イルス血症を防御できた。ワクチン接種を受けたブタの１２匹のうちの１匹（８ ．３％）のみがウイルス血症を示した。したがって、ワクチンは９１．７％のブ タを防御した。 特異的に適応させたＭＡ １０４（Ｍ）のクローンである、アフリカ・グリー ン・モンキー細胞（９００９Ｂ）を介する原ＰＲＲＳＶ単離体の強制継代は、ウ イルスの１個以上のエピトープを成功裏に改変することができ、その結果、他の 科学者等が失敗した分野においてワクチンの製造を可能にするようにこのウイル スの抗原性を高めることができたものと、本発明のどのような特定の理論にも拘 束されることなく、信じられている。 本発明は、具体的に説明する目的で先に詳述されているが、そのような詳細は その目的のためのみであり、請求の範囲により限定されている以外は本発明の精 神及び範囲から逸脱しない限りにおいて、当業者が改変することができるものと 理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＫ，ＵＡ (72)発明者 マクギンリー，マイケル・ジエイ アメリカ合衆国カンザス州66216レネク サ・モンロビアストリート7703 (72)発明者 ジマーマン，ジエフリー・ジエイ アメリカ合衆国アイオワ州50010アメス・ アールアール ナンバー３ (72)発明者 ヒル，ハワード・テイ アメリカ合衆国アイオワ州50046ケンブリ ツジ・ボツクス６・ルート１ (72)発明者 ミーツ，マイケル・シー アメリカ合衆国アイオワ州50501ネバダ・ ボツクス24・アールアールナンバー２ (72)発明者 パートル，ユージーン・シー アメリカ合衆国アイオワ州50010アメス・ ブルツクリツジ アベニユー810 (72)発明者 スウエンソン，サブリナ・エル アメリカ合衆国アイオワ州50158マドリツ ド・ノースウエスト ワンハンドレツドア ンドシツクステイシツクススアベニユー 11000 (72)発明者 シブリー，ジヨージ・ピー アメリカ合衆国カンザス州66209リーウツ ド・ウエスト 128テラス4149

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＰＲＲＳに対して動物を防御するために、或いは該ＰＲＲＳを診断し又は組 換え製品の開発用にＰＲＲＳＶの分子構造を同定するために使用するのに、十分 な量まで該ウイルスを複製するための、感染されやすい組織培養物中における該 ＰＲＲＳＶの増殖方法であって、該ウイルスを該組織培養物上に接種しそして複 製されたウイルスを採取することを含んでなる該方法。 ２．組織培養物が細胞系を含んでなる請求の範囲第１項記載の方法。 ３．組織培養物がアフリカ・グリーン・モンキー腎臓細胞系である請求の範囲第 ２項記載の方法。 ４．アフリカ・グリーン・モンキー腎臓細胞系がＭＡ １０４（Ｍ）と表示され る種類のものである請求の範囲第３項記載の方法。 ５．細胞系がアフリカ・グリーン・モンキー細胞系のクローンであり、該クロー ンが９００９Ｂと表示される請求の範囲第４項記載の方法。 ６．請求の範囲第１項記載のＰＲＲＳＶを含んでなる組織培養物。 ７．請求の範囲第２項記載のＰＲＲＳＶを含んでなる組織培養物。 ８．請求の範囲第３項記載のＰＲＲＳＶを含んでなる組織培養物。 ９．〉１０^5.0／ｍＬのＦＡＩＤ₅₀力価で〉２５リットルの商業規模で、請求の 範囲第１項の記載に従って製造されるＰＲＲＳＶを含んでなる組織培養物。 １０．請求の範囲第１項に記載されているようにＰＲＲＳＶを供給し、該ウイル スを組織培養細胞から取出し、抗体塊を希釈、濃縮又は抽出により調整して、改 変された生の（弱毒化された）、不活化されたサブユニット用或いは組換え製剤 用の免疫学的に有効な量の該抗体塊を製造す ることを含んでなる、ＰＲＲＳに対してブタを防御するのに有効なワクチンの調 製方法。 １１．ウイルスがＰＲＲＳの徴候を生じなくなるまで非宿主細胞及び細胞系を介 してＰＲＲＳＶを強制継代することにより、改変された生の又は弱毒化されたワ クチンを製造するように該ＰＲＲＳＶを適応させる方法。 １２．ＰＲＲＳＶが改変された生のもの（弱毒化された）であり、そして液体、 凍結又は粉末形態である、請求の範囲第１０項記載の方法で調製されるワクチン 。 １３．ＰＲＲＳＶが不活化されそしてアジュバントを添加され、そして場合によ り適当な保存剤を含んでなる、請求の範囲第９項記載の方法を用いて調製される ワクチン。 １４．アジュバントが油を基材とするものであるか或いは水を基材とするもので ある、請求の範囲第１３項記載のワクチン。 １５．アジュバントが、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュ バント、カルボポールを基材とするアジュバント及びダイアモンド・サイエンテ ィフィク・アジュバントＢからなる群から選択される、請求の範囲第１３項記載 のワクチン。 １６．不活化剤がバイナリーエチレンイミン、ベータ プロピロラクトン又はホ ルマリンである、請求の範囲第１３項記載のワクチン。 １７．組織培養物がアフリカ・グリーン・モンキー細胞として分類される種類の 細胞系である、請求の範囲第１０項記載の方法に従い調製されるワクチン。 １８．アフリカ・グリーン・モンキー細胞が９００９Ｂと表示される細 胞系クローンである、請求の範囲第１０項記載の方法に従い調製されるワクチン 。 １９．抗原の塊が不活化され、改変された生の（弱毒化された）、抽出されたも のであり、そしてサブユニットとして用いられるか或いは組換え法を介して得ら れる、請求の範囲第１０項記載の方法に従い調製されるワクチン。 ２０．ＰＲＲＳＶが複数のＰＲＲＳＶ単離体を含んでなる、請求の範囲第１０項 記載の方法により調製されるワクチン。 ２１．ＰＲＲＳＶがＩＳＵ−Ｐとして表示される単離体である、請求の範囲第１ ０項記載の方法により調製されるワクチン。 ２２．９００９Ｂと表示されるアフリカ・グリーン・モンキー腎臓細胞系を介し てウイルスを強制継代することにより、抗原性を高めるためのＰＲＲＳＶのエピ トープを改変する方法。 ２３．請求の範囲第２２項記載のＰＲＲＳＶから調製されたワクチン。