NO752622L - - Google Patents

Description

Ifølge tysk patent nr. 1.210,51<*>1 er det kjent en fremgangsmåte til fremstilling av moenomycin ved mikrobiologisk fermentering av moenomycindannende streptomyceter, idet man som ekstra karbonkilde anvender fett.

Det er nå funnet en fremgangsmåte til fremstilling

av moenomycin ved mikrobiologisk fermentering av moenomycin-

dannende streptomyceter på vanlig biologisk måte og i nærvær av fett, idet fremgangsmåten erkarakterisert vedat man til fermenteringsmediet setter et ikke-ionogent tensid med den generelle formel (1)

hvori R betyr en mettet eller enkelt umettet hydrokarbonrest med 8-18 C-atomer, som eventuelt også kan ha en hydroksy-

gruppe og n betyr et tall mellom 18 og 30.

Hydrokarbonresten R er fortrinnsvis rettlinjet;

den kan imidlertid, spesielt ved rester av syntetisk opprinnelse, inneholde inntil ca. 20% forgrenede deler. Spesielt er hydrokarbonrester med 10 til 14 C-atomer foretrukket.

I den generelle formel (1) betyr R spesielt oktyl,

nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, heksadecyl, heptadecyl, oktadecyl samt oktenyl, nonenyl, decenyl, undecenyl, dodecenyl, tridecenyl, tetradeceny1, pentadeceny1, heksadecenyl, heptadecenyl og oktadecenyl. Videre hydroksy-oktyl, hydroksy-nonyl, hydroksy-decy1, hydroksy-undecyl, hydroksy-dode-

cyl, hydroksy-tridecyl, hydroksy-tetradecyl, hydroksy-pentadecyl, hydroksy-heptadecyl samt hydroksy-oktadecy1. Hydroksygruppen kan ved alle ovenfor nevnte rester stå ved første, annet, tredje osv. til nestsiste C-atom: C-^ - Cy ved bktylresten, Cj- Cg ved nonylresten, C-^ - C^ved decylresten, C-^ - C-^q ved undecyl-

resten, C-^- C-^ved dodecylresten, C-^ - C-^ve(3 tridecylresten,

C-^- C-^-zj ved tetradecylresten, C-^ - C-^ved pentadecylresten,

^1 ~ ^15ved heksadecylrestenjC]_~^l6ved heptadecylresten,

Cl~C17ved oktodecylresten.

Med hensyn til hydroksygruppenes stilling i molekylet er de forbindelser foretrukket, som i praksis er lettest til-gjengelig, som eksempelvis 12-hydroksy-A-9,10-oktadecensyre eller 12-hydroksy-A-6,7-oktadecensyre eller 12-hydroksy-A-9,10-tetradecensyre eller 12-hydroksy-A-5»6-tetradecensyre.

Som enkelte umettede hydrokarbonrester kommer det for R i betraktning A-4,5-decenyl, A-9,10-deceny1, A-4,5_dodecenyl, A-5,6-tetradeceny1, A-9,10-tetradecenyl, A-9,10-heksadecenyl, A-6,7-oktadecenyl, A-9,10-oktadeceny1 og A-11,12-oktadecenyl; ved alle ovenfor nevnte umettede hydrokarbonrester kan det i tillegg stå en hydroksylgruppe på hvert .av C-atomene som ikke har dobbeltbinding. Derved kan alle nevnte umettede hydrokarbonrester forekomme såvel i cis- som også i trans-konfigurasjon. Foretrukket er da de konfigurasjoner som fore-kommer naturlig. Dette gjelder også for stillingen av dobbelt-bindingene.

Spesielt foretrukket blant tensidene med den generelle formel (1) er slike hvis molekylvekt ligger mellom 1000 og 1500.,. hvis uklarhetspunkt (1 g stoff i 100 ml 10%-ig koksalt-oppløsning) ligger mellom 73 og 79, hvis hydroksytall ligger mellom 39 og 78 og hvis hydrofil-lipofil balanseverdi ligger mellom 16 og 18.

Blant de spesielt foretrukkede tensider med formel

I har det vist seg spesielt egnet slike, hvori på den ene side

n betyr tallet 25 og R betyr en blanding av 6-9% oktyl, 5~ 7% decyl, 48-54% dodecyl, 18-20% tetradecyl, 7-9% heksadecyl og 8-10% oktadecyl, hvori på den annen side n betyr- tallene 18,

20 eller 22 og R betyr dodecyl.

De nevnte tensider fremstilles ved oksalkylering, spesielt oksetylering, tilsvarende fettalkoholer i alkalisk medium med forskjellige mengder etylenoksyd.

Fermenteringen av streptomyceter gjennomføres under aerobe betingelser i et vandig medium, som ved siden av uorganiske salter som karbonkilde inneholder stivelse, glukose, rørsukker eller melasse og i tillegg et dyrisk plante- eller syntetisk fett samt som nitrogenkilde soyaavfall eller -mel, kornstøpvæske, gjærekstrakt, bomullsfrø- og -kimemel, nitrater eller ammonium-salter samt et tensid med formel (1).

Fermenteringen gjennomføres til oppnåelse av en maksimal antibiotisk aktivitet. Denne kan bestemmes ved måling av konsentrasjonen av det oppløste nitrogen i fermenteringsmediet eller den dannede tørrvektsmasse.

Etter oppnåelse av den maksimale antibiotiske aktivitet avbrytes fermenteringen. For isolering av antibiotikumet blir enten den samlede kultur homogenisert og deretter ekstrahert, eller mycelet adskilles ved sentrifugering fra kul-turoppløsningen og disse to bestanddeler ekstraheres hver gang for seg. Som ekstraheringsmidler kommer det fortrinnsvis i betraktning med vann blandbare eller delvis blandbare oppløsnings-midler, f.eks. metanol, propanol, butanol, etylenglykolmonometyl-eter, aceton eller dioksan.

Fra de således fremstilte ekstrakter utvinnes det rå antibiotikum hensiktsmessig ved avdampning av oppløsningsmidlet under nedsatt trykk. Residuet ekstraheres for ytterligere rens-ning med varme, polare, organiske oppløsningsmidler, f.eks. metanol og antibiotikumet utfelles fra det under nedsatt trykk inndampet ekstrakt ved utfelling med et måtelig polart organisk oppløsningsmiddel som dietyleter, diisopropyleter eller etyl-acetat.

Som moenomycindannende streptomyceter anvendes Streptomyces ghanaensis ATCC 14.672, Streptomyces bambergiensis ATCC 13.879, Streptomyces ederensis ATCC 15-304 og Streptomyces geysiriensis ATCC 15.303 samt deres mutanter og revertanter.

Som dyrisk fett kommer det hensiktsmessig i betraktning dyrekroppfett som svinesmult eller fåretalg eller kunstig fremstilte fraksjoner av slike fett med definert karboninnhold. Som plantefett anvendes hensiktsmessig fete oljer som olivenolje, solsikkeolje, jordnøttolje, kokosolje, ricinusolje. Videre kommer det i betraktning syntetisk fett som oljesyretriglycerid eller stearinsyretriglycerid. Samtlige fett anvendes i konsen-trasjoner mellom 0,1 og 16 vekt%, fortrinnsvis 2 og 5 vekt%.

Den overordentelige befordrende virkning av tilsetningen ifølge oppfinnelsen av et tensid med den generelle formel (1) på dannelsen av moenomycin av streptomycestyper er over-raskende. Riktignok er det kjent stimulerende virkning av f.eks. polyoksyetylenderivater av sorbitananhydrider, som delvis er forestret .med fettsyrer ("Tween"-typer) eller av sukkerfettsyre-estere på enzymproduksjonen av visse mikroorganismer (E.T. Reese et al., Applied Microbiology, 1969, 242-245) samt på dannelse av Riboflavin fra Ashbya gossypii (C.G. Smith et al., Biochim. Biophys. Acta 47 (1961) 344-349). Disse overflateaktive forbindelser har imidlertid ingen positiv virkning på dannelsen av moenomycin. På den andre side har de med moenomycindannelses-befordrende forbindelser med den generelle formel (1) ingen positiv virkning på f.eks. dannelsen av streptomycin. Eksempler.

Streptomyces ghanaensis ATTC 14.672 overpodes i en 300 ml Erlenmeyer-kolbe på 30 ml av et sterilt næringsmedium av følg-ende sammensetning:

4,00% glukose

3,00% soyamel

0,30% drank, tørr

0,25% koksalt

0,25% kalsiumkarbonat

vann ad 30 ml.

Etter påpodning rystes forkulturen ved 28 til 30°C

to dager med en frekvens på 300 omdreininger pr. minutt.

Fermentasjonsmediet for hovedkulturen har følgende

sammensetning:

3,0% soyaolje

3,0% soyamel

3,0% maisstivelse

1,0% sakkarose

0,3% ammoniumsulfat

0,4% kalsiumkarbonat

2,0% gjær

vann ad 30 ml.

Tilsetningen av en av de i følgende tabell 1 opp-førte tensider til fermenteringsmediet foregår i form av en 10 vekt%-ig vandig oppløsning med dobbelt destillert vann. Opp-løsningen steriliseres deretter 10 minutter ved 123 til 127°C.

Nå blandes ovennevnte fermenteringsmedium med 1,5 ml av tensidoppløsningen av 37°C. Deretter tilsettes 5 ml av forkulturen.

Denne hovedkultur rystes ved 28 til 30°C i 120

timer med 260 til 300 omdreininger pr. minutt.

Deretter rystes det hele med 60 ml metanol 2 minutter i vibroblander og deretter filtreres gjennom et foldefilter. I en aliquot del av filtratet bestemmes moenomycininnholdet ved dets innvirkning på en standardisert kultur av Staphylococcus aureus turbidimetrisk sammenlignet til virkningen av en moeno-my cinoppløsning av kjent innhold.

De øvrige i tabellen oppstilte resultater ble dannet ved variasjon av streptomycesstamme, fett-tilsetning og tensid-tilsetning under ellers like betingelser.

De i tabellen angitte tensider har følgende karak-teristika og her betyr moleky.lvekt MG, uklarhetspunkt TB, hydroksyltall HZ og hydrofil-lipofil bålanseverdi HLB:

Claims (3)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av moenomycin ved mikrobiologisk fermentering av moenomycindannende streptomyceter på vanlig biologisk måte og i nærvær av fett, karakterisert ved at man til fermentasjonsmediet setter et tensid med den generelle formel (1)

hvori R betyr en mettet eller enkelt umettet hydrokarbonrest med 8 til 18 C-atomer, som eventuelt også kan ha en hydroksy-gruppe og n betyr et helt tall mellom 18 og 30.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at som moenomycindannende streptomyceter anvendes Streptomyces ghanaensis ATCC 14.672, Streptomyces bambergiensis ATCC 13.879, Streptomyces ederensis ATCC 15.304 eller Streptomyces geysiriensis ATCC 15.303 samt deres mutanter og revertanter.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at det som tensid med den'generelle formel (1) anvendes et slikt hvis molekylvekt ligger mellom 1000 og 1500, hvis uklarhetspunkt ligger mellom 73 og 79, hvis hydroksyltall ligger mellom 39 og 78 og hvis hydrofil-lipofil balanseverdi ligger mellom 16 og 18.