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Nährmedium zur Herstellung von Neomycin Die Erfindung betrifft ein
neues Gärungsmedium zur Herstellung von Neomycin in erhöhten Ausbeuten aus neomycinerzeugenden
Mikroorganismen.
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Bisher wurde Glukose (Dextrose) als Kohlenstoffquelle bei der Herstellung
von Neomycin verwendet, wobei jedoch verhältnismäßig geringe Ausbeuten an Neomycin
erzielt wurden, was offenbar darauf zurückzuführen ist, daß mit zunehmendem Glukosegehalt
die Anhäufung von durch Glykolyse entstehenden Stoffen, z. B. organische Säuren,
dazu neigt, die Neomycinbildung nachteilig zu beeinflussen. Es ist auch bereits
vorgeschlagen worden, Stärke als Kohlenstoffquelle zu verwenden; jedoch wurden hierbei
nach Dulmage, Applied Microbiology, Bd.I, S. 103 bis 106 (1953), nur geringes Wachstum
und geringe Ausbeuten an Neomycin erhalten.
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Es wurde nun gefunden, daß überraschend hohe Ausbeuten an Neomycin
erhalten werden, wenn man die Glukose mit Stärke ergänzt und die Menge des proteinhaltigen
Stoffes entsprechend erhöht. So werden erfindungsgemäß unverhältnismäßig hohe Ausbeuten
an Neomycin erhalten, wenn man Streptomyces fradiae oder einen ähnlichen neomycinerzeugenden
Organismus in einem wäßrigen Gärungsnährmedium züchtet, das mindestens etwa
30/, eines proteinhaltigen Stoffes (bezogen auf seinen Proteingehalt), etwa
1 bis 4°/o eines leicht assimilierbaren Kohlehydrats, d. h. eines solchen, das leicht
durch den Mikroorganismus umgesetzt wird, wodurch ein schnelles Wachstum bzw. eine
rasche Vermehrung der Mikroorganismen und die Erzeugung großer Mengen Myzel bewirkt
wird, sowie mindestens etwa 30/, eines langsam assimilierbaren Polysaccharids
enthält.
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Geeignete Quellen für proteinhaltige Stoffe sind z. B. Bierhefe, Fleischextrakt,
Sojapepton (einschließlich Sojapepton, das durch saure oder enzymatische Hydrolyse
von Sojabohnenprotein hergestellt wird), Caseinhydrolysat (saures oder enzymatisches),
lösliche Alkoholdestillationsrückstände, Sojabohnenmehl (einschließlich ausgestoßenes
Mehl, Auszugsmehl, fein gemahlenes Mehl oder ganzes Sojabohnenmehl), Eipepton, feines
Sojabohnenmehl u. dgl., wobei Sojabohnenmehl besonders bevorzugt wird. Es ist vorteilhaft,
zwei oder mehr derartiger proteinhaltiger Stoffe zu verwenden.
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Der proteinhaltige Stoff sollte in dem Gärungsnährmedium in einer
Menge von nicht weniger als 3 Gewichtsprozent, vorzugsweise etwa 3,5 bis 8 °/o,
bezogen auf den Proteingehalt des zugegebenen Stoffs, vorhanden sein, obwohl auch
größere Mengen verwendet werden können, soweit dies das jeweils verwendete Verfahren
zuläßt.
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Die obengenannten, proteinhaltigen Stoffe können ferner durch Stickstoffquellen,
z. B. organische Verbindungen, wie Harnstoff, Harnstoffnitrat, Ammoniumcarbamat
u. dgl., sowie anorganische Verbindungen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat,
Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat u. dgl., ergänzt werden. Dextrine, einschließlich
Gummidextrin u. dgl., Stärken, wie Kartoffelstärke, Maisstärke, Manjokstärke, Reisstärke,
Weizenstärke u. dgl. sowie verschiedene lösliche Stärken, gehören zu der Gruppe
der langsam assimilierbaren Polysaccharide, von denen mindestens eines in dem Gärungsmedium
anwesend sein muß, und zwar in einer Menge von mindestens etwa 3 Gewichtsprozent,
vorzugsweise etwa 4 bis 5 Gewichtsprozent. Es kann auch eine größere Menge, die
keine übermäßige Verdickung des Mediums verursacht, verwendet werden. Im allgemeinen
ist es jedoch nicht erforderlich oder erwünscht, mehr als etwa 6 °/o Stärke zu verwenden.
Im Falle des Dextrins können Konzentrationen von mehr als 6 °/o verwendet werden,
ohne die Viskosität des Mediums nachteilig zu beeinflussen.
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Zur Klasse der leicht assimilierbaren Kohlehydrate gehören Dextrose,
Fructose u. dgl. Dextrose sollte z. B. in einer Menge von nicht weniger als etwa
1 °/p, vorzugsweise etwa 2 bis 2,5 °/o, in dem Gärungsnährmedium vorhanden sein.
Es kann auch eine größere Menge, die die Neomycinausbeute nicht nachteilig beeinflußt,
verwendet werden. Im allgemeinen ist es jedoch nicht erforderlich oder ratsam, mehr
als etwa 3 °/a zu verwenden.
Zur Sicherstellung erhöhter Ausbeuten
an Neomycin sollte das Gärungsnährmedium die genannten Stoffe, d. h. einen proteinhaltigen
Stoff, ein leicht assimilierbares Kohlehydrat und ein langsam assimilierbares Polysaccharid,
in den angegebenen Mengen gemeinsam enthalten. Die Kombination dieser Stoffe ist
wichtig, und wenn einer der erforderlichen Bestandteile fehlt oder nicht in den
angegebenen Mengen anwesend ist, so wird die Neomycinausbeute nachteilig beeinflußt.
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Die Bildung des Neomycin wird vorzugsweise in einer submersen Kultur
des Streptomyces fradiae 3535 in einem wäßrigen Medium unter aerobischen Bedingungen
durchgeführt. Ein geeignetes Gärungsnährmedium enthält außer der obenerwähnten Kombination
der erforderlichen Bestandteile ein Puffermittel, ein Salz, wieNatriumchlorid, und
gewöhnlich eine kleine zusätzliche Menge eines anderen proteinhaltigen Stoffs. Zum
Beispiel kann eine kleine Menge Bierhefe zur Ergänzung des Sojabohnenmehls vorteilhaft
verwendet werden.
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Bei Verwendung eines der genannten Gärungsnährmedia kann der pH-Wert
anfänglich schwach sauer sein, d. h. zwischen etwa 6 und 7 liegen. Im Verlaufe der
Fermentation wird der pH-Wert des Mediums auf etwa 5,2 bis 5,6 herabgesetzt. Da
die Neomycinausbeute sich verschlechtert, wenn der pH-Wert des Mediums unter 5,5
liegt, so ist es zweckmäßig, ein Hilfsmittel, wie Calcium-, Natrium- oder Kaliumcarbonat,
zuzugeben, um den pH-Wert in den Anfangsstufen der Fermentation auf der geeigneten
Höhe zu halten. Die Menge dieses Stoffs hängt von dem jeweils verwendeten Medium
ab, sollte jedoch ausreichend sein, um den pH-Wert über etwa 5,2 zu halten. Die
optimale Menge schwankt hierbei zwischen etwa 0,2 und 1,0 Gewichtsprozent.
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Die Fermentation wird vorzugsweise unter aerobischen Bedingungen durchgeführt.
Die Belüftung erfolgt in irgendeiner geeigneten Weise, und zwar mit einer Geschwindigkeit
von vorzugsweise etwa 0,028 bis 0,084 m3 Luft je Stunde pro 3,781 Kulturmedium.
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Zur Erzielung höchster Neomycinausbeuten wird die Fermentationstemperatur
auf etwa 24 bis 37°, vorzugsweise 32 bis 35°, gehalten.
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Das zum Impfen von Kulturen des Streptomyces fradiae 3535 zur Herstellung
von Neomycin verwendete Impfmaterial kann aus schräg angelegten Agarkulturen gewonnen
werden. Da jedoch die besten Ausbeuten erhalten werden, wenn die Menge des Impfmaterials
etwa 1 bis 5 Volumprozent des Gesamtvolumens des Mediums beträgt, so ist eine größere
Menge an Impfmaterial erforderlich, als aus den Agarkulturen erhalten werden kann.
Zur Herstellung der gewünschten Menge Keimkultur, werden ).,Schüttelgefäße«, die
ein geeignetes Nährmedium (das jedoch nicht notwendigerweise Neomycin erzeugt) für
das Wachstum des Streptomyces fradiae 3535 enthalten, mit Kulturen geimpft, die
auf schräg angelegten Nährböden gehalten werden. Der in diesem flüssigen Medium
entstandene Organismus wird dann zum Impfen größerer Behälter für das Wachstum der
Keimkultur verwendet, die ihrerseits zum Impfen der bei der industriellen Herstellung
benutzten größeren Behälter verwendet werden.
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Die Fermentation läßt man etwa 60 bis 144, vorzugsweise 72 bis 120
Stunden, laufen.
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Das Neomycin wird nach einer Abwandlung des Verfahrens von Loo et
a1., J. Bact. 50, S. 701 (1945), geprüft, bei dem die Bodenschicht des Nähragars
weggelassen und das den B.subtilis enthaltende Nähragar direkt in eine Petrischale
gegossen wird. Man legt eine Papierscheibe auf das gekühlte Nähragar, auf die das
zu untersuchende Neomycinpräparat in verdünnter Form gegossen wird, worauf man nach
18 Stunden die Wachstums- oder Verhinderungszone bestimmt. Dieses Prüfverfahren
ergibt die Neomycinmenge mit Bezug auf eine Neomycinsulfatnorm (1,ug Neomycinsulfat
= 0,2 Waksman-Einheiten oder 0,7 ,ug Neomycinbase). In der gesamten Beschreibung
wird die Neomycinmenge in ,ug Neomycinsulfat per ccm angegeben.
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Die nachstehend angegebenen Verfahren, Tabellen, Beispiele und allgemeinen
Erklärungen dienen lediglich der Erläuterung und schränken die Erfindung in keiner
Weise ein. Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich die Teile und die Prozentsätze
auf das Gewicht.
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Beispiel 1 In sechs jeweils 500 ccm fassende Erlenmeyer-Kolben wurden
jeweils 100 ccm des folgenden Mediums gegeben:
| Cerelose (Glukosemonohydrat) .............. 10 g |
| Pepton ...............................:.. 5 g |
| Fleischextrakt ............................ 10 g |
| Natriumchlorid ........................... 5 g |
| Leitungswasser ............... aufgefüllt zu 1 1 |
Die Kolben wurden sterilisiert, indem man sie 30 Minuten lang bei 250° in einem
Autoklav behandelte. Anschließend wurden sie mit einer wäßrigen Sporensuspension
des Streptomyces fradiae, Waksman Stamm 3535X, der' auf folgendem Medium
| Cerelose (Glukosemonohydrat) .............. 10 g |
| Bierhefe ................................. 10 g |
| Schlamparückstände der Aceton-Butanol- |
| Gärung ................................ 5 g |
| Kaliumchlorid ............................ 4 g |
| Calciumcarbonat .......................... 1 g |
| Agar .................................... 15 g |
| Leitungswasser ................. aufgefüllt zu 1 1 |
gezüchtet war, geimpft und 3 Tage lang bei 28° auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert.
Der Schüttler führte 90 Bewegungen zu je 10 cm in der Minute aus.
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600 ccm des so erhaltenen, vorgekeimten Mediums wurden verwendet,
um 3001 des folgenden, sterilen Mediums zu impfen, das durch 30minütiges Erhitzen
bei 121' sterilisiert worden war
| Dextrose................................ 25 g |
| feines Sojabohnenmehl ................... 25 g |
| Bierhefe ................................ 2,5 g |
| Ammoniumsulfat ........................ 5 g |
| Calciumcarbonat ........................ 8 g |
| Natriumchlorid ......................... 4 g |
| primäres Kaliumphosphat ................ 0,4 g |
| Leitungswasser ............... aufgefüllt zu 1 1 |
Die Fermentation wurde in einem auf 32° gehaltenen, mit Harz überzogenen, eisernen
Behälter durchgeführt. Das Rühren erfolgte durch ein Saugrohrpropeller-Rührwerk
mit 200 U/min. Sterile Luft wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,27 m3/min zugeführt.
Zur Regelung der Schaumbildung wurden 300 ccm eines Entschäumers zu Beginn und weitere
2100 ccm im Verlaufe der Fermentation zugegeben. Die Fermentation wurde 45 Stunden
lang fortgesetzt.
Mehrere j eweils 3801 fassende, aus nichtrostendem
Stahl bestehende Gärtanks, die 2501 eines sterilen Mediums der in Tabelle I und
den nachfolgenden Tabellen angegebenen Zusammensetzung enthielten, wurden jeweils
mit 121 des in dieser Weise erhaltenen Impfmaterials geimpft. Die geimpften Tanks
wurden auf einer Temperatur von 32° gehalten, mit steriler Luft bei einer Geschwindigkeit
von 2,83 m3/h belüftet und der Inhalt mittels Saugrohrpropeller bei 280 U/min gerührt.
Nach den angegebenen Stunden wurden Proben entnommen. Zur Regelung der Schaumbildung
wurden dem Medium zu Beginn 300 ccm Schmalzöl und eine Lösung von
10/, Octadecanol
in Schmalzöl in den angegebenen Mengen zugegeben. Die Fermentation wurde 114 Stunden
lang fortgesetzt.
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Tabelle I Wirkung des Stärkegehalts in Medien mit hohem Gehalt an
Sojabohnenmehl
| Tank |
| A I B.1 C (, D I E |
| Medium: g/1 |
| I |
| Dextrose ........... 20 I 20 : 20 I 20 20 |
| Stärke ........... 0 10 20 , 30 40 |
| Sojabohnenmehl.... 50 50 j 50 50*)j 50 |
| Hefe ............. 5 5 5 5 5 |
| Natriumchlorid ..... 5 ; 5 5 5 ! 5 |
| Calciumcarbonat .... 2 i 2 2 2 I 2 |
| Entschäumer in ccm**) 800i 2350 ' 600 2000i 600 |
| pH-Werte I I |
| 0 Stunden ........ 6,30I 6,25i 6,30 6,30i 6,30 |
| 18 ........ 5,42 , 5,40 5,68I 6,05 5,70 |
| 42 ........ 7,50 ; 7,10 ! 6,90i 7,10 6,75 |
| 66 ........ 8,15i 7,70 7,50I 7,10 6,90 |
| 90 ........ 8,40 7,80 8,00 7,60 7,25 |
| 114 ........ 8,70 7,95 8,20 7,90 7,75 |
| i |
| Neomycinsulfat,ug/ml |
| 42 Stunden ........ 1913 2200i 2638 1 2150 11 1988 |
| 66 ........ 2500I 2875 ; 4275 4850 I 3700 |
| 90 ........ 2700 ' 3375 1 4575 ! 5000 5725 |
| 114 ........ . 2500 4000 @ 4850 6250j 7450 |
| *) Ausgezogenes Sojamehl. |
| **) Zur Regelung der Schaumbildung während der Sterilisation |
| wurden außerdem zu Beginn jedem Medium in den Tanks jeweils |
| 300 ccm Schmalzöl zugegeben. |
Die Ergebnisse zeigen, daß bei einem hohen Gehalt an Sojabohnenmehl in Verbindung
mit 20 g Dextrose und einer beträchtlichen Menge Stärke (20 g) hohe Ausbeuten an
Neomycin erhalten werden. Wird die Stärkemenge auf 40 g erhöht, so erhält man noch
bedeutend höhere Neomycinausbeuten. Enthält das Medium dagegen überhaupt keine oder
unzureichende Mengen (10 g) Stärke, so werden nur geringe Ausbeuten an Neomycin
erhalten.
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Der Ersatz des Sojabohnenmehls durch ausgezogenes Sojabohnenmehl,
zu Feinmehl gemahlen, das durch eiii Sieb Nr. 41 geht, ist günstig im Vergleich
zu den Ausbeuten, die bei Verwendung von Sojabohnenmehl in Verbindung mit Dextrose
und Stärke erhalten werden.
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Beispiel 2 Fünf aus nichtrostendem Stahl bestehende Gärtanks mit Prallplatten,
die 2501 eines sterilen Mediums (durch 30minütiges Erhitzen bei 121' sterilisiert)
der in Tabelle Ir angegebenen Zusammensetzung enthielten, wurden jeweils 12l Impfmaterial
(hergestellt gemäß Beispiel 1) geimpft. Die geimpften Tanks wurden auf einer Temperatur
von 32° gehalten und mit steriler Luft bei einer Geschwindigkeit von 2,83 m3/h belüftet.
Der Tankinhalt wurde mittels Turbinen mit vier flachen Schaufeln bei einer Drehzahl
von 280 U/min gerührt. Die Schaufeln waren 5 cm breit, 8,9 cm lang und radial zur
Welle bei einer Neigung von 90° angeordnet. Die Schaumbildung wurde wie im Beispiel
l geregelt.
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Tabelle II Wirkung des Dextrosegehalts in Medien mit hohem Gehalt
an Sojabohnenmehl; ohne Stärke
| Tank |
| F I G I $ i I I J |
| Medium: g/1 |
| I |
| Dextrose........... 20 30 40 60 I100 |
| Sojabohnenmehl.... 50 50 I 50 50 50 |
| Hefe ............. 5 5 5 5 5 |
| Natriumchlorid ... . . 5 5 5 5 5 |
| Calciumcarbonat .. 2 2 2 2 2 |
| I |
| Entschäumer in ccm*) 330013500 2300 2600 5100 |
| pH-Werte |
| 0 Stunden ........ 6,30 6,20 6,17 6,08 6,05 |
| 18 ........ 6,16 5,20 5,25 5,20 5,40 |
| 42 ........ 7,52 7,20 6,80 5,10 5,08 |
| 66 ........ 8,01 7,68 7,44 6,05 5,20 |
| 90 ........ 7,90 7,98I 7,90 7,18 5,35 |
| 114 ........ 8,03 7,73 7,86 7,61I 5,91 |
| i |
| Neomycinsulfat ßg/ccm |
| 42 Stunden ........ 25631 1725 787i < 2001
< 200 |
| 66 ........ 3250 3175, 2625 1351< 100 |
| 90 ........ 3200 32253500 1040 < 50 |
| 114 ........ 3275 3825! 3800 2060< 5** |
| *) Zu Beginn wurde im Medium (wie im Beispiel 1) zusätzlich |
| Schmalzöl verwendet. |
| **) Der Tank J blieb (auf Grund mikroskopischer Unter- |
| suchung) bis zu 90 Stunden ohne Verunreinigung. Bei |
| 116 Stunden zeigten sich Verunreinigungen. |
Diese Werte zeigen, daß Dextrose bei etwa 30 g/1 eine schädliche Wirkung auszuüben
beginnt und daß oberhalb 40 g/1 diese Wirkung sehr deutlich ist. In Anbetracht des
niedrigen pH-Wertes bei 18 Stunden und der geringen Ausbeute während der ersten
42 Stunden bei Verwendung von 30 und 40 g Dextrose pro Liter sollte die Dextrosekonzentration
zweckmäßig etwa 30 g111 nicht überschreiten.
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Nachstehende Tabelle zeigt die Wirkung auf die Neomycinausbeuten,
wenn die Menge des Sojabohnenmehls in dem Medium von 25 auf 50 g/1 erhöht wird,
wobei der Dextrose- und Stärkegehalt konstant bleibt. Die Fermentation wurde in
Gärtanks mit Saugrohrpropeller durchgeführt, die auf einer Temperatur von 32° gehalten
und mit einer Geschwindigkeit von 2,83 m3,/h belüftet wurden.
Tabelle
III Wirkung des Sojabohnenmehlgehalts bei konstantem Dextrose- und Stärkegehalt
| Durch- |
| Tank schnitt |
| von |
| 18 Ver- |
| K I L 1 M 1 N 1 0 suchen |
| Medium: g/1 |
| Dextrose .. 20 20 20 20 20 20 |
| Stärke..... 40 40 I 40 40 40 40 |
| Sojabohnen- ' |
| mehl .... 25 30 1@ 35 50 50 50 |
| Hefe....... 5 5 5 5 5 5 |
| Natrium- |
| Chlorid .. 5 5 5 5 5 5 |
| Calcium- |
| carbonat. 2 2 2 2 2 2 |
| Entschäumer |
| in ccm ..... 800 700 700 800 900 - |
| pH-Werte |
| 18 Stunden 6,12 6,24 6,00 5,75 5,40 - |
| 42 7,20 7,08 6,90 6,80 6,50 - |
| 66 7,40 7,25 7,20 6,85 6,80 - |
| 90 7,30 7,30 7,30 7,30 7,45 - |
| 114 7,40 7,60 7,60 7,90 7,45 - |
| Neomycin- |
| sulfat |
| pg/ccm |
| 42 Stunden 17251 1738 1663 1250 2000 - |
| 66 2250 ' 2550 2950I 3275 3900 - |
| 90 362514400 4475 5050 5050 - |
| 114 3975 15075. 4875 # 5150 8775 6500 |
Die Ergebnisse zeigen, daß ausgezeichnete Ausbeuten erhalten werden, wenn in den
20 g Dextrose und 40 g Stärke enthaltenden Medien 50 g Sojabohnenmehl pro Liter
anwesend sind.
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Die folgende Tabelle zeigt die Wirkung auf die Neomycinausbeuten,
wenn das Medium außer einer großen Menge Sojabohnenmehl und Dextrose einen langsam
assimiherbaren Zucker, wie Dextrin, enthält. Die Fermentationen wurden in Gärtanks
mit Turbinenschaufelrädern durchgeführt, wobei die Tanks auf einer Temperatur von
32° gehalten und mit einer Geschwindigkeit von 2,83 m3 belüftet wurden. Tabelle
IV Zugabe von Dextrin zu einem Medium, das Dextrose sowie eine große Menge Sojabohnenmehl
enthält
| Tank |
| P 1 Q R I s |
| Medium: g/1 |
| Dextrose ............... 20 20 20 20 |
| Dextrin ................. 0 10 20 40 |
| Sojabohnenmehl ......... 50 50 50 50 |
| Hefe ................... 5 5 5 5 |
| Natriumchlorid .......... 5 5 5 5 |
| Calciumcarbonat ......... 2 i 2 2 2 |
| Entschäumer in ccm ........ 800 2350 600 600 |
| pH-Werte |
| 18 Stunden ............. 5,42I 5,40' 5,68 5,70 |
| 42 ............. 7,50 ' 7,10 6,90 6,75 |
| 66 ............. 8,15I7,70 7,50 6,90 |
| 90 ............. 8,40 7,80 8,00 7,25 |
| 114 ............. 8,70 7,95 8,20 20 7,75 |
| Neomycinsulfat yg/ccm |
| 42 Stunden ............. 1913 2200 2638 1988 |
| 66 ............. 2500 2875 4275 3700 |
| 90 ............. 2700 3375'4575 5725 |
| 114 ............. 2500 400014850 7450 |
Die Ergebnisse zeigen, daß die Zugabe von Dextrin in zunehmenden Mengen zu einem
Medium, das 50 g Sojabohnenmehl und eine ausreichende Menge (d. h. 20 g) Dextrose
enthält, zu einer entsprechenden Erhöhung der Neomycinausbeuten führt.