PL223055B1 - Sposób otrzymywania erytrytolu - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy dwustopniowego prowadzenia procesu biosyntezy erytrytolu przez drożdże Yarrowia lipolytica, w pożywkach zawierających w swoim składzie fosfolipidy, jako główny składnik śluzów otrzymywanych w procesie degummingu olejów roślinnych, oraz dodatkowo glicerol, w bardzo niskim pH.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania erytrytolu. Wynalazek może znaleźć zastosowanie w przemyśle spożywczym.

Znane są sposoby otrzymywania erytrytolu z czystej glukozy, sacharozy i mieszaniny glukozy i fruktozy przy udziale drożdży w hodowlach okresowych i okresowych zasilanych.

Jednym ze sposobów jest produkcja erytrytolu z glukozy przez szczep Torula sp. Produkcję przy udziale tego szczepu prowadzi się na wstrząsarce w 250 ml kolbach stożkowych w podłożu o składzie: (g/l) glukoza 400; ekstrakt drożdżowy 20. Po 138 godzinach hodowli wstrząsanej uzyskuje się 196 g/l erytrytolu z wydajnością 0,49 g/g (Jung-Kul Lee, Suk-Jin Ha, Sang-Yong Kim, Deok-Kun Oh, Biotechnology Letters. 2000, 22, str. 983).

Znany jest również sposób okresowej produkcji erytrytolu zasilanej syropem glukozowym przez szczep Trichosporon sp. W hodowli wgłębnej w 5-litrowym bioreaktorze, w temperaturze 35°C, przy szybkości mieszania równej 600 obr/min otrzymywano do 240 g/l erytrytolu z wydajnością od 0,40 do 0,45 g/g. (Jinbyung Park, Byungcheol Seo, Jungryul Kim, Yongkun Park. Journal of Fermentation and Bioengineering. 1998, 86 (6), str. 577).

W innym sposobie produkcji erytrytolu z glukozy przez drożdże z rodzaju Moniliella, znany jest proces hodowli okresowej prowadzony w bioreaktorze, gdzie zastosowano wysokie stężenie początkowe glukozy równe 300 g/l. Po 144 godzinach hodowli okresowej uzyskano 111 g/l erytrytolu z w ydajnością 0,37 g/g (Shie-Jea Lin, Chiou-Yen Wen, Jian-Ching Liau, Wen-Shen Chu. Process Biochemistry. 2001, 36, str. 1249).

Znany jest również proces okresowej produkcji erytrytolu w pożywkach syntetycznych zawierających jedynie glicerol jako źródło węgla i energii przez drożdże z gatunku Yarrowia lipolytica (Rymowicz W., Rywińska A., Marcinkiewicz M. Biotechnology Letters. 2009. 31, str. 377). Po 170 godzinach hodowli uzyskano 170 g/l erytrytolu z szybkością objętościową produkcji erytrytolu 1 g/lh.

Nieznane są natomiast sposoby produkcji erytrytolu w pożywkach zawierających w swoim składzie fosfolipidy, jako główny składnik śluzów otrzymywanych w procesie degummingu olejów roślinnych, oraz dodatkowo glicerol. Nieoczekiwanie okazało się, że drożdże Yarrowia lipolytica potrafią syntetyzować erytrytol z powyższych substratów, w procesie dwustopniowym i w bardzo niskim pH.

Śluzy otrzymywane są w procesie odśluzowania (degummingu - oddzielane a następnie usuwane są substancje przypominające swoją konsystencją gumę) olejów roślinnych za pomocą wody i kwasu fosforowego. Zawierają głównie zhydratowane fosfolipidy, głównie fosfatydylocholinę (lecyt ynę) i fosfatydyloetanolaminę (kefalinę) oraz nieznaczne ilości sacharydów i peptydów. Proces ten przeprowadza się w przypadku olejów o dużej zawartości fosfolipidów.

Na skalę przemysłową proces degummingu przeprowadza się zazwyczaj dwuetapowo. Pierwszy etap to poddanie oleju działaniu wody oraz niewielkiej ilości kwasu fosforowego. Po przejściu przez separator wirówkowy, zawartość fosforu w oleju, spada poniżej 60 ppm. Drugim etapem jest poddanie oleju działaniu ługu co powoduje zmydlanie wolnych kwasów tłuszczowych usuwanych w drugim przejściu przez separator wirówkowy, co powoduje obniżenie zawartości fosforu poniżej 20 ppm. Pozostałością tego procesu są substancje odpadowe - śluzy.

Istotą wynalazku jest to, że przygotowuje się podłoże w taki sposób, że na 1 litr objętości miesza się śluzy otrzymywane w procesie degummingu olejów roślinnych za pomocą wody i kwasu fosf orowego, zawierające głównie zhydratowane fosfolipidy. Śluzy te dodaje się w ilości od 10 do 60 g, niejonowe surfaktanty w ilości od 0,1 do 3,0 g, ekstrakt drożdżowy w ilości od 0,1 do 5,0 g, baktopepton od 0,5 do 5 g, oraz pozostałą ilość wody. Następnie ustala się pH na poziomie od 5 do 6, po czym tak przygotowane podłoże wprowadza się do naczynia w ilości od 20 do 30% jego objętości, całość sterylizuje się, chłodzi się do temperatury pokojowej a następnie zaszczepia się podłoże czystą kulturą drożdży Yarrowia lipolityca, wytrząsa z prędkością od 150 do 200 obr./min., w temperaturze co najmniej 26°C przez co najmniej dwie doby. Tak uzyskane inokulum wprowadza się do bioreaktora, korzystnie w ilości 10% objętości roboczej, gdzie pozostałą objętość stanowią (NH₄)₂SO₄ w ilości od 1,0 do 9,0 g/L, MgSO₄-7H₂O w ilości od 0,2 do 2 g/L, NaCI w ilości od 1 do 30 g/L oraz śluzy, niejonowe surfaktanty, ekstrakt drożdżowy w ilościach jak poprzednio oraz pozostałą ilość woda. Hodowlę prowadzi się w temperaturze co najmniej 26°C, przy obrotach mieszadła na minutę od 400 do 1200, szybkości napowietrzania od 100 do 800 ml/min. Po upływie co najmniej dwóch dób, do pożywki dodaje się glicerol w ilości maksymalnie 20% wagowych, przy czym poziom pH utrzymuje się na poziomie 2,5-3,0 przez cały czas prowadzenia procesu biosyntezy erytrytolu, do momentu wyczerpania

PL 223 055 B1 glicerolu z pożywki. Następnie oddziela się biomasę drożdży od cieczy poprzez filtrację, brzeczkę pofermentacyjną poddaje się dekoloryzacji na węglu aktywnym a jony usuwa na wymieniaczach. Płyn zawierający erytrytol zatęża się do około 50% suchej masy na wyparce próżniowej a powstałe w temperaturze pokojowej kryształy, oddziela się poprzez filtrację, przemywa wodą i suszy.

Korzystnie jest, gdy na wyhodowaną biomasę dodatkowo dodaje się od 1 do 3% wagowych NaCI na 1 litr pożywki produkcyjnej znajdującej się w bioreaktorze.

Korzystnie także jest, gdy po dodaniu glicerolu utrzymuje się pH na poziomie 2,8-2,9.

Korzystnie również jest, gdy glicerolem jest gliceryna odpadowa z produkcji biodiesla.

Zaletą sposobu według wynalazku, jest możliwość otrzymywania dużych ilości erytrytolu z odnawialnych surowców roślinnych oraz z surowców będących odpadami poprzemysłowymi. Ponadto dodawanie glicerolu do pożywki dopiero w 48 godzinie hodowli, znacznie zwiększa stężenie końcowe erytrytolu w płynie pofermentacyjnym. Zaletą jest również to, że wydajność produkcji erytrytolu osiąga poziom 0,3-0,45 g/g, natomiast końcowe stężenia erytrytolu wynosi od 30 do 100 g/l. Dodatkowo otrzymuje się od 15 do 25 g/l suchej biomasy drożdży.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest na przykładach.

P r z y k ł a d 1. Podłoże inokulacyjne o objętości 50 ml zawierające: śluzy - 20 g/l; ekstrakt drożdżowy - 2 g/l; bakto-pepton - 3 g/l; niejonowe surfaktanty w formie preparatu Span20 - 0,25 g/l, wodę wodociągową do 1 litra, zaszczepia się szczepem Yarrowia lipolytica A-311 i prowadzi hodowlę przez 72 godziny w kolbie stożkowej o objętości 300 ml, w temperaturze 29°C na wstrząsarce rotacyjnej przy 160 obr./min. Hodowla ta stanowi materiał szczepienny właściwej hodowli produkcyjnej, którą przeprowadza się w 5-litrowym bioreaktorze, zawierającym 2 litry podłoża produkcyjnego o składzie: śluzy - 60 g/l, Span20 - 0,25 g/l, (NH4)₂SO4 - 3 g/l; MgSO4'7H₂O - 1 g/l; NaCI - 20 g/l; ekstrakt drożdżowy - 1 g/l; woda wodociągowa do 1 litra. Do utrzymania pH środowiska hodowlanego na poziomie 2,5 stosuje się 10 M NaOH. W trakcie procesu utrzymuje się stałą temperaturę 30°C, szybkość obrotową mieszadła 800 obr./min i szybkość napowietrzania 0,6 litra powietrza/min. Po 48 godzinach prowadzenia hodowli w podłożu ze śluzami jako źródłem węgla i fosforu dodaje się 100 g/l glicerolu. Po 90 godzinach prowadzenia procesu biosyntezy w 1 litrze pożywki, otrzymuje się 40 g/l erytrytolu oraz dodatkowo 21 g/l suchej biomasy drożdży.

P r z y k ł a d 2. Przygotowuje się inokulum i prowadzi proces jak w przykładzie 1, z tym, że biosyntezę erytrytolu prowadzi się szczepem Yarrowia lipolytica A-6 w pH równym 2,8, natomiast hodowlę w podłożu ze śluzami przy pH 5,5, prowadzi się przez 48 godzin oraz dodaje się 150 g/l glicerolu. Po 96 godzinach prowadzenia procesu biosyntezy w 1 litrze pożywki otrzymuje się 60 g/l erytrytolu oraz dodatkowo 20 g/l suchej biomasy drożdży. Proces biosyntezy erytrytolu rozpoczyna się w 48 godzinie hodowli. Całkowita objętościowa szybkość produkcji erytrytolu wynosi 0,31 g/lh.

P r z y k ł a d 3. Przygotowuje się inokulum i prowadzi proces jak w przykładzie 1, z tym, że biosyntezę erytrytolu prowadzi się ze szczepem Yarrowia lipolytica A-8 w pH równym 2,8, natomiast hodowlę w podłożu ze śluzami przy pH 6,0, prowadzi się przez 48 godzin oraz dodaje się 200 g/l glicerolu. Po 100 godzinach prowadzenia procesu biosyntezy w 1 litrze pożywki otrzymuje się 100 g/l erytrytolu oraz dodatkowo 25 g/l suchej biomasy drożdży. Proces biosyntezy erytrytolu rozpoczyna się w 50-godzinie hodowli. Całkowita objętościowa szybkość produkcji erytrytolu wynosi 1,0 g/lh.

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania erytrytolu drogą biosyntezy z wykorzystaniem kultur drożdży Yarrowia lipolytica, znamienny tym, że przygotowuje się podłoże w taki sposób, że na 1 litr objętości miesza się śluzy otrzymywane w procesie degummingu olejów roślinnych za pomocą wody i kwasu fosforowego, zawierające głównie zhydratowane fosfolipidy, które to śluzy dodaje się w ilości od 10 do 60 g, niejonowe surfaktanty w ilości od 0,1 do 3,0 g, ekstrakt drożdżowy w ilości od 0,1 do 5,0 g, baktopepton od 0,5 do 5 g, oraz wodę w ilości do 1 litra, po czym ustala się pH na poziomie od 5 do 6, n astępnie tak przygotowane podłoże wprowadza się do naczynia w ilości od 20 do 30% jego objętości, całość sterylizuje się, chłodzi się do temperatury pokojowej, a następnie zaszczepia się podłoże czystą kulturą drożdży Yarrowia lipolityca, wytrząsa z prędkością od 150 do 200 obr./min., w temperaturze co najmniej 26°C, przez co najmniej dwie doby, po czym tak uzyskane inokulum wprowadza się do bioreaktora, korzystnie w ilości 10% objętości roboczej, gdzie pozostałą objętość stanowią (NH₄)₂SO₄ w ilości od 1,0 do 9,0 g/L, MgSO₄-7H₂O w ilości od 0,2 do 2 g/L oraz śluzy, niejonowe surfaktanty,

   PL 223 055 B1 ekstrakt drożdżowy w ilościach jak poprzednio oraz pozostałą ilość woda i prowadzi hodowlę w temperaturze co najmniej 26°C, przy obrotach mieszadła na minutę od 400 do 1200, szybkości napowietrzania od 100 do 800 ml/min, zaś po upływie co najmniej dwóch dób, dodaje się do pożywki glicerol w ilości maksymalnie 20% wagowych, przy czym poziom pH utrzymuje się na poziomie 2,5-3,0 przez cały czas prowadzenia procesu biosyntezy erytrytolu, do momentu wyczerpania glicerolu z pożywki, po czym oddziela się biomasę drożdży od cieczy poprzez filtrację, brzeczkę pofermentacyjną poddaje się dekoloryzacji na węglu aktywnym a jony usuwa na wymieniaczach, następnie płyn zawierający erytrytol zatęża się do około 50% suchej masy na wyparce próżniowej a powstałe w temperaturze pokojowej kryształy, oddziela się poprzez filtrację, przemywa wodą i suszy.
2. 2. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że na wyhodowaną biomasę dodaje się także od 1 do 3% wagowych NaCI na 1 litr pożywki produkcyjnej znajdującej się w bioreaktorze.
3. 3. Sposób, według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że po dodaniu glicerolu utrzymuje się pH na poziomie 2,8-2,9.
4. 4. Sposób, według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że glicerolem jest gliceryna odpadowa z produkcji biodiesla.